從細胞材料分離核酸的簡化方法

2023-12-10 10:00:47 6

專利名稱：從細胞材料分離核酸的簡化方法
相關申請的交叉參考本申請是申請人的共同未決申請的部分繼續申請，所述共同未決申請是2003年11月17日提交的美國申請序列第10/714,763號和2003年11月17日提交的美國申請序列第10/715,284號。
發明領域
本發明涉及用於捕獲和分離核酸的簡化方法，特別地從生物來源的材料捕獲和分離總基因組核酸。

背景技術：

分子診斷學和分子生物學中的現代技術(包括反轉錄、克隆、限制性分析、擴增和序列分析)，要求提取核酸。在其中發現有目標核酸的複雜的樣品基質使得獲取核酸被複雜化。此類樣品包括例如來自組織的細胞、來自體液的細胞、血液、培養中的細菌細胞、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠或從目標核酸擴增得到的溶液。樣品基質經常含有顯著量的汙染物，在感興趣的核酸被用於分子生物學或分子診斷技術之前所述汙染物必須從所述核酸中去除。

從上述細胞和組織產生的混合物中獲得目標核酸的常規技術，需要使用有害化學品例如酚、氯仿以及溴化乙錠。酚/氯仿提取被用於此類步驟，以從目標核酸和多種汙染物的混合物中抽提掉汙染物。可選地，根據本領域中熟知的方法，使用氯化銫-溴化乙錠梯度。參見例如Molecular Cloning，由Sambrook等編著(1989)，Cold Spring HarborPress，pp.1.42-1.50。通常，該在後方法之後，通過將乙醇或2-丙醇加入水相以沉澱核酸來沉澱保留在抽提的水相中的核酸物質。通常，通過離心從溶液中移出沉澱物，並且在水或緩衝溶液中重懸以作進一步使用之前，允許乾燥所得到的沉澱物小球。

已經開發出更簡單和更快的方法，其採用各種類型的固相，以從細胞裂解液或核酸和汙染物的其它混合物中分離核酸。此類固相包括各種形狀和形式例如纖維的層析樹脂、聚合物和二氧化矽基或玻璃基物質，過濾器以及包被的容器。當為小顆粒的形式時，有時提供磁芯，以幫助實現分離。

已經開發出含有固體結合支持材料的試劑盒，並可以在商業上獲得，用於從細菌培養物和從人全血分離基因組的方法中。製造商提供的步驟總是詳細說明，在開始核酸的移除和純化之前必須裂解細胞。在使用固體支持物之前，有時也利用額外的沉澱步驟(例如K.Smith等，J.Clin.Microbiol.，41(6)，2440-3(2003)；P.Levison等，J.ChromatographyA，827，337-44(1998))。

在分離核酸中使用的一種類型的固相包括設計用於高效液相色譜(HPLC)的多孔矽膠顆粒。用陰離子交換劑對多孔矽膠顆粒的表面進行官能化，以在某一鹽和pH條件下與質粒DNA交換。參見，例如美國專利4,699,717和5,057,426。在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結合到這些固相材料的質粒DNA。從那裡洗脫的核酸溶液在其被用於下遊過程之前必須被進一步處理，以除去鹽。

其它矽基固相材料包括可控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)、包埋有二氧化矽顆粒的濾器、矽膠顆粒、硅藻土、玻璃纖維或上述的混合物。在存在離液劑例如碘化鈉(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情況下，在含有核酸的樣品中，每一矽基固相材料可逆地結合核酸。此類固相結合併保持核酸物質，同時該固相經受離心或真空過濾以從殘餘樣品成分中分離基質和結合於其上的核酸物質。然後，通過用水或低鹽洗脫緩衝液洗脫，從固相釋放出該核酸物質。商業上可得的用於核酸分離的矽基固相材料包括例如WizardTM DNA純化系統產品(Promega，Madison，WI)、QiaPrepTM DNA分離系統(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFX Micro Plasmid Kit(Amersham)。

顆粒形式的聚合樹脂也被廣泛用於核酸的分離和純化。羧酸鹽改性的聚合顆粒(Bangs，Agencourt)是已知的。歐洲專利申請公開第EP1243649A1中公開了含有季銨首基(head group)的聚合物。該聚合物是具有共價連接的線性非交聯聚合物的惰性載體顆粒。該類型的聚合固相一般是指觸角樹脂(tentacle resin)。線型聚合物摻入四烷基季銨基團。該烷基基團被指定為甲基或乙基基團(第4欄，第52-55行)。較長的烷基被認為是不期望的。

基於陰離子交換原理的其它用於結合核酸的固相材料目前正在使用中。這些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化矽-NucleoBond AX(Becton Dickinson，Roche-Genopure)的矽基材料，這基於在EP0496822B1中描述的層析載體。具有聚合的三烷基銨基團的聚合物樹脂被描述於EP 1243649(GeneScan)。用於DNA分離的羧基改性聚合物可以從眾多的供應商獲得。在高鹽條件下核酸被吸引，而在低離子強度條件下核酸被釋放。具有陽離子三甲胺外部的聚合微載體珠被描述在美國6,214,618中。該珠具有相對大的直徑並且作為培養中細胞粘附和生長的支持物是有用的。

含有三丁基(tributylphosphonium)首基的聚合珠已經被描述用於三相體系中的相轉移催化劑。由交聯的聚苯乙烯製備該珠。(J.Chem.Soc.Perkin Trans.II，1827-1830，(1983))。具有通過亞烷基鏈和亞烷基醚鏈(alkylene ether chain)連接至交聯的聚苯乙烯樹脂的側鏈三烷基基團的聚合物珠也已被描述(Tomoi，et al.，Makromolekulare Chemie，187(2)，357-65(1986)；Tomoi，et al.，Reactive Polymers，Ion Exchangers，Sorbents，3(4)，341-9(1985))。基於交聯的聚苯乙烯樹脂的混合季銨/不溶性聚合物作為催化劑和生物殺傷劑被公開(Davidescu，et al.，Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara，40(54)，63-72(1995)；Parvulescu，et al，.Reactive & Functional Polymers，33(2，3)，329-36(1997)。

磁響應性顆粒也已經被開發用作核酸分離中的固相。設計用於核酸分離的若干種不同類型的磁響應性顆粒在本領域中是已知的，並且可以從若干來源商業獲得。可逆地直接結合核酸材料的磁性顆粒包括MagneSilTM顆粒(Promega)。也已知，磁性顆粒通過共價連接的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白可逆地結合mRNA，其中抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白具有用於與mRNA的聚腺苷酸尾雜交的連接的寡dT尾。

已知多種類型的磁響應性矽基顆粒被用作核酸結合分離法中的固相。一個這樣的顆粒類型是磁響應性玻璃珠，優選具有受控孔尺寸的磁響應性玻璃珠，其作為Magnetic Porous Glass(MPG)顆粒可以從CPG，Inc.(Lincon Park，NJ)獲得；或者在美國專利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337號中描述的多孔磁玻璃顆粒。在核酸的結合和分離中有用的另一類型的磁性顆粒是通過將磁性材料摻入聚合的二氧化矽化合物基質中而產生的(德國專利DE4307262A1)。包含包埋在具有季銨基的纖維素基質中的氧化鐵納米顆粒的磁顆粒由CortexBiochem(San Leandro，CA)作為MagaCell-QTM商業化生產。

具有可誘導磁性性質的顆粒或珠包括過渡金屬的小顆粒，例如鐵、鎳、銅、鈷和錳，以形成金屬氧化物，在磁體存在下可以使該金屬氧化物具有暫時的磁性。這些顆粒被稱為順磁性的或超順磁性的。為形成順磁或超順磁珠，已用在水中相對穩定的聚合物包被金屬氧化物。美國專利4,554,088公開了順磁顆粒，其包括被高分子矽烷包被層包圍的金屬氧化物芯。美國專利5,356,713公開了可磁化的微球體，其包括被疏水乙烯基芳族單體外殼包圍的可磁化顆粒芯。美國專利5,395,688公開了已經用混合的順磁金屬氧化物-聚合物層包被的聚合物芯。另一種方法採用聚合物芯以吸收金屬氧化物，例如諸如在美國專利第4,774,265號中。包含用順磁金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒的磁性顆粒被公開於美國專利5,091,206中。然後，用另外的聚合層進一步包被該顆粒，以保護金屬氧化物層並提供反應性包被層。美國專利5,866,099公開了在用於配位金屬鹽並包載(entrap)混合的金屬氧化物顆粒的蛋白存在的情況下，通過兩種金屬鹽的混合物共沉澱製備磁性顆粒。許多示例性金屬鹽對被描述。美國專利5,411,730描述了相似的方法，其中沉澱的混合的金屬氧化物顆粒被包載在葡聚糖——一種寡糖中。

用於不可逆地捕獲DNA和RNA的氧化鋁(Alumina)(氧化鋁(aluminum oxide))顆粒被公開於美國專利6,291,166中。用於固相擴增法例如PCR的結合的核酸是可得的。

在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結合到這些固相材料的DNA。從那裡洗脫的核酸溶液在其可以被用在下遊過程之前必須被進一步處理以除去鹽。相反，通過用水或低鹽洗脫緩衝液洗脫，從固相釋放結合至矽基材料的核酸。美國專利5,792,651描述了用於核酸的色譜分離的組合物，其增強核酸在細胞中轉染的能力。該組合物包括含有2-丙醇和任選地含有鹽和緩衝物質的水溶液。

據報導，還有其它包括含有磁微粒芯的瓊脂糖或纖維素顆粒的磁性固相材料在用含有高濃度鹽和聚亞烷基二醇的組合物處理後結合併保持核酸(例如美國專利5,898,071，和PCT公開WO02066993)。隨後，通過用水或低離子強度緩衝液處理釋放核酸。

申請人的共同在審美國申請序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880公開了新穎的固相核酸結合材料，包括可切割的材料，和結合併釋放核酸的方法，這兩個申請併入本文作為參考。
發明概述
本發明的第一個目標是提供在無化學裂解步驟的情況下，使用固相核酸結合材料從生物材料捕獲核酸的方法。

本發明的另一個目標是提供從生物材料分離核酸的方法，所述方法通過在無化學裂解步驟的情況下，使用固相核酸結合材料捕獲核酸，並且隨後釋放捕獲的核酸來進行。

本發明的一個目標是使用具有可裂解的連接體基團的固相核酸結合材料，從生物和細胞材料捕獲和分離核酸的方法。

本發明的一個目標是使用具有陽離子基團的固相核酸結合材料，從生物和細胞材料捕獲和分離核酸的方法，所述陽離子基團選自基、銨基和鋶基基團。
附圖簡述


圖1示意性地描述了根據本發明的核酸從血樣的分離。

圖2A是凝膠圖像，顯示了使用實施例1的顆粒從人血樣分離的DNA。圖2B是凝膠圖像，顯示了如圖2A中分離的基因組DNA的區域的擴增。

圖3是凝膠圖像，顯示了根據本發明方法分離的基因組DNA的區域的擴增，使用實施1或實施例4的顆粒和各種添加劑。

圖4是凝膠圖像，顯示了根據本發明方法分離的基因組DNA的區域的擴增，使用實施例5-7的顆粒。

圖5A是凝膠圖像，顯示了使用實施例1或2的顆粒從人血樣分離的DNA，用各種濃度的NaOH洗脫。圖5B是凝膠圖像，顯示了如5A顯示分離的基因組DNA的區域的擴增。
發明詳述 定義
烷基(alkyl)——含有1-20個碳原子的支鏈、直鏈或環狀烴基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。本文中所使用的低級烷基是指那些含有高達8個碳的烷基基團。

芳烷基(aralkyl)——用芳基取代的烷基基團。

芳基(aryl)——含有1至5個碳環芳香環的含芳香環的基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。

細胞材料(cellular material)——完整細胞或材料，包括組織，含有動物、植物或細菌來源的完整細胞。

細胞核酸內含物(cellular nucleic acid content)——指在細胞材料內發現的核酸，可以是基因組DNA和RNA，和其他核酸，諸如來自感染源的核酸，包括病毒和質粒。

磁性顆粒(maganetic particle)——顆粒、微粒或珠，其對外部的磁場有響應。該顆粒本身可以是磁性的、順磁性的或超順磁性的。如當使用鐵磁材料時，其可以被吸引到外部磁體或被施加磁場。顆粒可以具有固體芯部分，該固體芯部分是磁響應性的，並且被一層或多層非磁響應性層包圍。可選地，磁響應性部分可以是周圍的層或者可以是布置在非磁響應性芯內的顆粒。

寡聚物、寡核苷酸(oligomer，oligonucleotide)——如本文所使用的，將是指含有核苷酸間磷酸二酯鍵(phosphodiester internucleotidelinkage)和5′-端單磷酸基團的化合物。核苷酸可以是正常發生的核糖核苷酸A、C、G和U或脫氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。

核酸(nucleic acid)——多核苷酸，可以是DNA、RNA或合成的DNA類似物，如PNA。任何這三類鏈的單鏈化合物和雙鏈雜交體也都在該術語的範圍內。

釋放、洗脫(release，elute)——通過與溶液或組合物接觸，除去結合至固相材料的表面或孔的大部分材料。

樣品(sample)——含有或疑似含有核酸的流體。可以用在本發明的方法中的典型的樣品包括體液，例如血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞培養物、組織提取液和類似物。其它類型的樣品包括溶劑、海水、工業水樣、食物樣品和環境樣品例如土壤或水、植物材料、原核生物來源的細胞、真核生物、細菌、質粒和病毒。

固相材料(solid phase material)——具有可以將核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。

取代的(substituted)——是指用非氫原子基團置換某個基團上的至少一個氫原子。應該注意到的是，關於取代的基團，其意圖是可以存在多點取代，除非明確另外指出。

通過各種技術，從不同的樣品類型提取、分離並另外純化核酸。這些技術的許多依賴於選擇性吸附到對核酸具有一些親和力的材料的表面上。在除去其它較弱結合的成分的洗滌步驟之後，用溶液處理固相，以除去或洗脫結合的核酸(多種核酸)。從細胞材料的一部分提取和分離基因組核酸常常是必需的。如此獲得的核酸被用於隨後的過程中，包括擴增、診斷試驗、突變分析、基因表達型分析和克隆。通過本發明的方法從其可以分離出核酸的樣品包括細菌培養物、體液、全血和血液組分、組織提取物、植物材料以及含有細胞材料的環境樣品。

細胞核酸內含物的去除需要破裂或穿透細胞膜或細胞壁，以便進入細胞內部。對於該目的，現有的方法利用細胞裂解步驟，該步驟使用導致裂解的試劑。根據使用的裂解方法，有兩類裂解溶液。一類是高pH的含水溶液，用於鹼裂解。另一類利用一種或多種表面活性劑或去汙劑來破壞細胞膜。裂解溶液也可以含有消化酶如蛋白酶，以便幫助將細胞的核酸內含物釋放出來。申請人已經開發出使用固相結合材料從細胞材料樣品分離核酸的方法，該方法避免使用裂解液。固相結合材料意料不到地允許細胞的核酸內含物被釋放並被直接捕獲，而且在一個步驟中完成。因為免除了對裂解液的使用，該新方法在簡單、便利和易於自動化方面代表著顯著的提高。

在本發明的一個方面，提供了從細胞材料的樣品分離核酸的方法，包括 a)提供固相，該固相包括連接有核酸結合部分的基質； b)在不存在任何添加的裂解液下，將所述固相與含有核酸的細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結合至所述固相； c)從所述固相分離所述樣品；和 d)從所述固相釋放結合的核酸。

與本發明的方法一起使用的、用於結合核酸的固相材料包括基質，該基質限定了它的尺寸、形狀、孔隙度和機械性能，以及共價連接的核酸結合基團，並可以是顆粒、微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。該材料在表面上或表面附近進一步包括核酸結合部分，其允許捕獲和結合不同長度的核酸分子。表面不但指固相材料的外圍，而且指固相材料內任何可及的多孔區的表面。

基質材料可以是任何合適的物質。優選的基質材料選自二氧化矽、玻璃、不溶性的合成聚合物和不溶性的多糖。示例性的材料包括用共價結合的表面官能團包被或官能化的矽基材料，所述共價結合的表面官能團用於破壞細胞並吸引核酸。也包括被合適地表面官能化的碳水化合物基材料，和具有該表面官能度的聚合材料。申請人的共同未決美國申請序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880描述了眾多具體的材料和它們的製備。充當核酸結合基團的表面官能團包括能夠破壞細胞的結構完整性並導致核酸吸引至固體支持物的任何基團。此基團不受限制地包括描述於下的季銨和鹽和三元鋶鹽((ternarysulfonium salt)類材料。

固相還可以包括磁響應部分，其通常將是磁微顆粒的形式——可以被磁場吸引並操作的顆粒。此類磁微顆粒包括磁金屬氧化物或金屬硫化物芯，其通常被吸附性或共價性的結合層包圍，該吸附性或共價性的結合層共價結合核酸結合基團，從而包覆表面。磁金屬氧化物芯優選是氧化鐵或硫化鐵，其中鐵是Fe2+或Fe3+或兩者。如美國4,654,267所述，磁性顆粒也可以通過在多孔聚合物存在下沉澱金屬顆粒以捕獲磁響應性金屬顆粒而形成。可製備的磁性金屬氧化物從而包括Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性顆粒也可以如美國5,411,730所述通過在寡糖葡聚糖存在下沉澱金屬氧化物顆粒以捕獲磁響應性金屬顆粒而形成。前述的美國專利5,091,206公開了另一種磁性顆粒。該顆粒包括用順磁性金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒以及另外的聚合層，以保護金屬氧化物層並提供反應性包被層。含有氯甲基化的Merrifield樹脂的磁鐵礦(四氧化三鐵，magnetite)的製備被描述於出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。

商業可得的磁性二氧化矽或磁性聚合顆粒可以被用作製備在本發明中有用的磁固相結合材料的原材料。具有表面羧基基團的聚合顆粒的合適類型已知為商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化矽磁性顆粒的合適類型已知為商品名MagneSilTM(Promega)。在表面上具有羧基或氨基的二氧化矽磁性顆粒可以從Chemicell GmbH(Berlin)獲得。

當固相結合材料包括不溶性合成聚合物部分時，有用的聚合物是一種或多種烯鍵式不飽和單體單元的均聚物或共聚物，並且可以是交聯的或非交聯的。優選的聚合物是聚烯烴，包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。後者包括多種取代的丙烯酸、醯胺和酯的聚合物，其中丙烯酸單體在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。

包含在可用於本發明的方法中的固相結合材料中的核酸結合(nucleic acid binding，NAB)基團表現出具有雙重效用。NAB基團吸引並結合具有各種長度和鹼基組成或鹼基序列的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。它們也具有一些將核酸從細胞包膜中釋放出來的能力。核酸結合基團包括例如羧基、胺和三元或四元基(ternary or quaternaryonium groups)。胺基團可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基團。三元或四元基包括三烷基季銨基團(-QR3+)、基(-QR3+)包括三烷基或三芳基或混合的烷基芳基基、以及三元鋶基(-QR2+)。固相可以含有一種以上類型的核酸結合基團，如本文中所述。含有其中R基團是具有至少4個碳的烷基的三元或四元基-QR2+或-QR3+的固相材料在結合核酸中特別有效，但少至1個碳的烷基基團也如芳基那樣有用。此類固相材料以高的韌度保持結合的核酸並在現有技術中已知用於洗脫的大多數條件下阻止核酸的去除或洗脫。大部分已知的低和高離子強度的洗脫條件對於除去結合的核酸是無效的。不同於含有DEAE和PEI基團的傳統陰離子交換樹脂，三元或四元固相材料保持帶正電，無論反應介質的pH如何。

在本發明另外的實施方案中，提供了從樣品中分離核酸的方法，包括 a)提供固相，所述固相包括 選自二氧化矽、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質，和結合至所述基質表面上的基，所述基選自式QR2+X-的三元鋶基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基；式NR3+X-的季銨基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基；以及季基PR3+X-，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，並且其中X是陰離子； b)在不存在任何添加的裂解液下，將所述固相與含有核酸的細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結合至所述固相； c)從所述固相分離所述樣品；和 d)從所述固相釋放所述結合的核酸。

將固相與含有核酸的細胞材料的樣品混合的步驟，涉及將樣品材料與固相結合材料混合，和任選地，機械攪拌混合物以將固相均勻分散在樣品體積內，所用時間為有效地破壞細胞材料並將核酸結合至固相。樣品的所有核酸內含物不必都結合至固相，然而儘可能多地結合是有利的。對樣品/固相混合物的攪拌可以採用任何便利的形式，包括搖動、使用機械振蕩器或搖擺器(rocker)、旋轉、超聲波攪拌和類似形式。在該步驟中結合核酸所需要的時間通常在數分鐘的水平，但是可通過常規實驗進行實驗性地確認。

從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空抽吸、過壓空氣或其它氣體以使液體通過多孔膜或例如過濾氈片(filter mat)。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。就其它組分的除去不完全而言，可以進行一種或多種洗滌，以幫助它們完全被去除。用於去除樣品組分如鹽、細胞碎片、蛋白質和血紅蛋白的洗滌劑包括水和含水緩衝溶液，並可以含有表面活性劑。

從固相釋放結合的核酸的步驟，涉及將所述固相材料與溶液接觸以從所述固相釋放結合的核酸。溶液應該溶解並充分保護釋放的核酸。該溶液可以是試劑組合物，其包括pH約7-9的含水緩衝液，任選地含有0.1-3M的緩衝鹽、金屬滷化物或醋酸鹽以及任選地含有0.1-50％的有機助溶劑、或表面活性劑。

用於裂解後從固相釋放核酸的試劑可以選擇性的是強鹼含水溶液。濃度至少為10-4M的鹼金屬氫氧化物或氫氧化銨的溶液有效地將核酸從裂解的固相洗脫出來。應該認識到，此強鹼性溶液對於RNA的穩定性是有害的。當想要獲得RNA時，與強鹼性溶液的接觸應該被避免或保持最小的時間。強鹼性溶液可用於聯合固相結合材料，在其中，核酸結合部分通過基團被連接到基質，所述基團可以通過共價鍵的斷裂(breakage)而被斷裂(fragment)或裂解(cleave)。此類材料描述於下和前述共同未決美國專利申請序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880中。

某些優選的實施方案利用固相結合材料，在其中，NAB基團通過可以被選擇性斷裂的鍵連接到基質。斷裂該連接有效地將任何結合的核酸與固相「分開」。所述連接可以通過任何化學、酶法、光化學或特異性斷裂可裂解接頭中的鍵(許多鍵)但也不破壞感興趣的核酸的其他方法而裂解。此類可裂解固相材料包括固體支持部分(solid supportportion)，所述固體支持部分包括選自二氧化矽、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶多糖的基質，在其表面上連接有核酸結合部分(nucleicacid binding portion，NAB)，用於吸引和結合核酸，所述核酸結合部分由可裂解的連接體部分連接到固體支持部分。


或

在一個實施方式中，NAB是式QR2+X-的三元基，或四元基QR3+X-，如上所述。


一種類型的可裂解固相來源於商業可得的聚苯乙烯型聚合物例如被稱為Merrifield樹脂(交聯的)的那些類型。在這些聚合物中，一定百分比的苯乙烯單元含有反應性基團，通常為氯甲基或羥甲基，作為共價連接的工具。通過與硫化物(R2S)或三元胺或膦反應，置換一些氯，產生本發明的固相材料。當所有的反應性氯甲基基團已經被轉化成三元或四元基時，根據本定義製備的聚合物可以用下面的式(1)描繪。對於所有此類基團，不必須都被轉化，使得本發明的聚合固相將經常含有基和氯甲基基團的混合物。

在上式中，m、n和o表示聚合物中每一單體單元的摩爾百分數，並可以取值為m從0.1％至100％、n從0至99％、以及o從0至10％。更優選地，m從1％至20％、n從80至99％、以及o從0至10％。

在另一個實施方式中，可裂解固相來源於商業可得的交聯的Merrifield樹脂，其一定百分比的苯乙烯單元含有反應性氯乙醯基或氯丙醯基，用於共價連接。許多其它本領域已知的聚合樹脂可以被用作製備可裂解固相材料中的固體基質。聚合樹脂可以從商業供應商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)和NovaBiochem獲得。該樹脂通常基於具有反應性官能團的交聯的聚合顆粒。用在如Advanced ChemTech2002 Catalog，pp.105-140中所述的固體支持的肽合成中的許多合適的聚合樹脂是適宜的原材料。具有反應性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、醯基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀醯亞胺酯基團的聚合物每一個都是商業可得的，用於製備本發明的聚合固相。如在下面的多個例子和前述共同未決專利申請中所示，提供將前體聚合樹脂共價接合到三元或四元基的方法有時是必需或期望的。這將通常包括選自亞烷基、亞芳基或亞芳烷基(aralkylene)基團的1-20個原子的鏈或環基團。該鏈或環還可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、醯胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黃原酸酯、脲、亞胺、肟、亞碸和硫酮形式的羰基基團。

可裂解連接體部分優選選自直鏈、支鏈和環的有機基團，並包括1至100個原子並更優選1至約50個原子。該原子優選選自C、H、B、N、O、S、Si、P、滷素和鹼金屬。示例性的連接體基團是通過水解裂解的水解可裂解基團。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二醯亞胺、磺醯胺和磺醯亞胺是代表性的，如同磺酸酯也是代表性的。連接體基團的另一個示例性類別是經受還原性裂解的那些基團，如二硫(S-S)鍵，所述二硫鍵通過硫醇例如乙硫醇、巰基乙醇和DTT被裂解。另一個代表性基團是含有過氧化物(O-O)鍵的有機基團。過氧化物鍵可以通過硫醇、胺和膦裂解。另一代表性的基團是光化學可裂解連接體基團如硝基取代的芳族醚和酯，式為
其中Rd為H、烷基或苯基。鄰硝基苄基酯根據下面熟知的反應被紫外光裂解。


另一代表性的可裂解基團是可酶法裂解連接體基團。示例性的基團包括通過酯酶和水解酶裂解的酯、通過蛋白酶和肽酶裂解的醯胺和肽、通過糖苷酶裂解的糖苷基團。

另一代表性的可裂解基團是可裂解的1，2-二氧雜環丁烷(dioxetane)部分。此類材料包含可以被熱分解或由化學劑或酶劑引發成片段的二氧雜環丁烷部分。除去保護基以產生氧陰離子，促進二氧雜環丁烷環的分解。根據熟知的方法，通過裂解過氧化物的O-O鍵以及C-C鍵而發生斷裂(fragmentation)。可裂解的1，2-二氧雜環丁烷描述於眾多專利和出版物中。代表性的例子包括美國專利4,952,707、5,707,559、5,578,253、6,036,892、6,228,653和6,461,876。

可選地，連接的基可以被結合到芳基Ar或結合到可裂解的基團Y。進一步可選地，與固相和三元或四元基的連接從所示出的方向被顛倒。

另一可裂解的連接體基團是可以轉化成不穩定的1，2-二氧雜環丁烷部分的多電子的C-C雙鍵。在該雙鍵上的至少一個取代基利用O、S或N原子被結合到雙鍵上。多電子雙鍵與單態氧的反應產生不穩定的1，2-二氧雜環丁烷環基團，其在環境溫度下自發斷裂(fragment)，以產生兩個羰基片段。由多電子的雙鍵形成的不穩定的1，2-二氧雜環丁烷描述於許多專利和出版物中，例子是A.P.Schaap和S.D.Gagnon，J.Am.Chem.Soc.，104，3504-6(1982)；W. Adam，Chem.Ber.，116，839-46，(1983)；美國專利5,780,646。


具有可裂解連接體基團的另一組固相材料具有乙烯酮二硫縮醛(ketene dithioacetal)作為可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公開。乙烯酮二硫縮醛經受通過與過氧化物酶和過氧化氫的酶氧化導致的氧化性裂解。

可裂解部分具有所示的結構，包括在9，10-二氫化吖啶環上具有取代的類似物，其中Ra、Rb和Rc每一個都是有機基團，該有機基團含有1至約50個選白C、N、O、S、P、Si和滷素原子的非氫原子，並且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成環。無數的其他可裂解基團對技術人員而言將是明顯的。

固相核酸捕獲的方法可以投入無數用途中。如在下面的特定實施例中所顯示，單鏈和雙鏈核酸都可以被捕獲並釋放。DNA、RNA和PNA可以被捕獲並釋放。

優選的用途是從全血中分離DNA。用通常使用的技術從白細胞提取DNA。通常，處理血液，以選擇性裂解紅細胞，並且在沉澱或離心步驟之後，單獨裂解完整的白細胞以暴露核酸內容物。消化蛋白質，並且得到的DNA用固相分離，隨後用於序列多態性的測定、序列分析、RFLP分析、突變檢測或其它類型的診斷試驗。

另一用途是從DNA和RNA的混合物分離DNA。本發明的方法涉及強鹼性洗脫條件，特別是使用高溫的那些條件，可以在使DNA保留完整而同時降解或破壞存在的RNA。涉及強鹼性裂解反應的方法類似地起作用。

另外的用途包括從其他樣品——土壤、植物、細菌和廢水中提取核酸材料，以及為了存檔的目的對核酸材料進行長期保存。

本方法的重要優勢是它們與許多下遊的分子生物學過程相容。在很多情況下，本方法分離的核酸可以在進一步的過程中被直接使用。擴增反應例如PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(Ligation of Multiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以採用此類核酸洗脫液。通過常規技術、尤其是從細菌細胞培養物或從血樣中分離的核酸，採用沉澱步驟。加入高體積百分比的低分子量醇，以從水溶液中沉澱核酸。然後，在使用前，沉澱的物質必須被分離、收集並重溶於合適的介質中。通過使用本方法，從本發明的固相結合材料洗脫核酸，這些步驟可以被免除。將含有釋放的核酸的溶液直接用於核酸擴增反應中，從而用聚合酶或連接酶-介導的反應擴增核酸或其片段的數量，這是優選的實踐。
實施例
當存在於下面的實施例中時，結構圖旨在僅僅說明固相材料的可裂解連接體部分。所述圖不代表固相材料的完整定義。
實施例1.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、並含有三丁基基和可裂解芳基硫酯鍵(arylthioester linkage)的磁性二氧化矽顆粒的合成。


將磁性的羧酸官能化的二氧化矽顆粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，1.5g)置於20mL亞硫醯氯中並回流4小時。減壓下除去過量的亞硫醯氯。將該樹脂重懸於25mL CHCl3中並通過超聲分散該懸浮液。蒸發溶劑並重複超聲洗滌處理。真空下乾燥該顆粒，待進一步使用。

醯基氯官能化的顆粒與388mg二異丙基乙胺一起被懸於38mLCH2Cl2中。加入4′-羥苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(524mg)並將密封的反應瓶置於搖床上過夜。將顆粒轉移至50mL塑料管，並用若干份CH2Cl2、CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH，然後用CH2Cl2反覆洗滌，伴隨以磁分離。通過TLC監測洗滌溶液中未反應的可溶性原材料的去除。在進一步使用前風乾該固體。

在氬下，將該樹脂(1.233g)懸於20mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(395mg)並搖動該漿液7天。將顆粒轉移至50mL塑料管，並用40mLCH2Cl2洗滌4次，隨後用40mL MeOH洗滌4次以及用40mL CH2Cl2洗滌4次。然後，風乾該樹脂，得到1.17g淺棕色固體。
實施例2.用含有三丁基基的可裂解的連接體官能化的二氧化矽顆粒的合成。


將3-氨丙基三乙氧基矽烷(13.2mL)在75mL庚烷和13mL乙醇中的溶液置於Ar下，並用5.5g的琥珀酸酐攪拌。回流反應4.5h，然後冷卻至室溫過夜。除去溶劑，產生醯胺產物，為清澈的油。

將EDC氫氯化物(4.0g)和2.86g上述產物在100mL CH2Cl2中的溶液放置在Ar下，並攪拌1h，然後加入5.5g的4′-羥基-苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(chloromethylthiobenzoate)中的4.16g。反應過夜攪拌。將反應混合物層析到150g的二氧化矽上，用1-2％EtOH/CH2Cl2洗脫，產生1.84g偶聯的產物，為白色固體。

在Ar覆蓋下，將在50mL乾燥甲苯中的前面步驟的產物(1.84g)通過套管加入到含有3.83g烘箱乾燥的二氧化矽的瓶中。反應回流過夜。在冷卻至室溫之後，過濾出二氧化矽，用500mL的CH2Cl2洗滌，真空乾燥4h。

將在50mL的CH2Cl2中的具有氯苄基末端基團的衍生化的二氧化矽(2.0g)與8.0g的三丁基膦混合。反應混合物在Ar下攪拌2天。過濾出二氧化矽，用CH2Cl2和己烷洗滌，真空乾燥幾小時。
實施例3.用含有三丁基基的可裂解的連接體包被的磁性二氧化矽顆粒的合成。

通過被動地將可裂解的核酸結合基團吸附到二氧化矽顆粒表面，製備核酸結合材料。

將100.9g 4-氯甲基-苯甲酸和1.2L的SOCl2裝載入3L瓶中。回流反應4小時，之後，在減壓下除去亞硫醯氯。通過加入CH2Cl2和減壓下蒸發，除去殘留的SOCl2。

向含有113.1g的4-氯甲基苯甲酸氯化物的3L瓶中裝載入98.17g4-羥基苯硫酚和1.5L CH2Cl2。吹掃入(purged in)氬，並加入67.75mL吡啶。在攪拌過夜後，用1L CH2Cl2稀釋反應混合物並用5L水萃取。水層用CH2Cl2反萃取。合併的CH2Cl2溶液經硫酸鈉乾燥，並濃縮至固體。用500mL CH2Cl2洗滌該固體，過濾並風乾。1H NMR(丙酮-d6)δ4.809(s，2H)，6.946-6.968(d，2H)，7.323-7.346(d，2H)，7.643-7.664(d，2H)，8.004-8.025(d，2H)。

將硬脂酸(1.33g)在10mL的SOCl2中回流2h。減壓下，去除過量的SOCl2，產生硬脂醯氯，為棕色液體。

將硬脂醯氯溶解在10mL的CH2Cl2中，並加入到於30mLCH2Cl2中的1.0g4′-羥苯基4-氯-甲基硫代苯甲酸酯和1.56mL二異丙基乙胺的溶液中，並將混合物攪拌過夜。去除溶劑，將殘留物進行柱層析，使用1∶1己烷/CH2Cl2作為洗脫液。分離硬脂醯酯(1.43g)，為白色固體。

在Ar氣氛下，將上面的產物(1.43g)和三丁基膦(1.27mL)在30mL的CH2Cl2中的溶液攪拌2天。除去CH2Cl2之後，殘留物用6×50mL的醚洗滌，重新溶解在CH2Cl2中，並用醚沉澱，產生1.69g的鹽產物。發現該材料在水中是不溶的。


將鹽(0.6g)溶解在6mL的CH2Cl2中，並伴隨著攪拌加入到6.0g的矽膠中。蒸發溶劑，產生核酸結合材料。
實施例4.具有含聚乙烯基苄基三丁基基團的聚合物層的磁性顆粒的合成。


在玻璃瓶中，將磁性Merrifield肽樹脂(Chemicell，SiMagChloromethyl，100ng)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL)，並在室溫下搖動漿液3天。在該瓶下放置磁體，並用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗滌固體4次(洗滌液也通過磁體/移液管步驟除去)。風乾該樹脂(93mg)。
實施例5.含三丁基基團和可裂解芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物顆粒的合成。


將聚(甲基丙烯醯氯)顆粒(1.0meq/g，1.5g)置於含2.45g二異丙基乙胺的75mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入4′-羥苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(4.5g)，並將密封的反應混合物在室溫下攪拌過夜。過濾該漿液，並用10mL CH2Cl2、200mL丙酮、200mL MeOH、2×100mL 1∶1的THF/CH2Cl2、250mLTHF、250mL CH2Cl2、250mL己烷洗滌樹脂。風乾該樹脂，待進一步使用。

在氬下，將該樹脂(1.525g)懸於25mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(1.7g)並攪拌該漿液4天。過濾該樹脂，並用225 mL CH2Cl2，隨後用175mL己烷洗滌4次。然後，風乾該樹脂，得到1.68g固體。
實施例6.含三丁基基的聚苯乙烯聚合物的合成。


在氬填塞(argon pad)下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其為交聯的氯甲基化聚苯乙烯。加入過量的三丁基膦(48.1g，10當量)，並在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液，並用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下乾燥樹脂(21.5g)。元素分析觀察到的(Found)P 2.52％，Cl 3.08％；期望的(Expected)P 2.79％，Cl 3.19％P/Cl比率為0.94。
實施例7.含三丁基銨基團的聚苯乙烯聚合物的合成。


在氬填塞下，在150mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入過量的三丁基胺(25.6g，4當量)，並在室溫下攪拌漿液8天。過濾該漿液，並用250mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下乾燥樹脂(28.9g)。元素分析觀察到的N 1.18％，Cl3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％N/Cl比率為0.88。
實施例8.用三丁基基團官能化的二氧化矽顆粒的合成。


將在Ar下於110℃乾燥1小時的矽膠(4.82g)與2.79g的Et3N一起加入到50 mL的CH2Cl2中。將混合物攪拌20分鐘，這之後，加入2.56g的3-溴丙基三氯矽烷，引起放熱。將混合物攪拌24h，過濾，並用3×40mL的CH2Cl2、4×40mL的MeOH和2×40mL的CH2Cl2依次洗滌固體。過夜空氣乾燥固體，稱重，為6.13g。

將於50mL的CH2Cl2中的上面製備的官能化的二氧化矽(5.8g)與5.33mL的三丁基膦一起攪拌10天。過濾混合物，並用7×50mL的丙酮洗滌固體。空氣乾燥固體，產生5.88g的產物。
實施例9.在實施例3的NAB材料中的連接體的可控裂解。

將實施例3的包被的二氧化矽材料(70mg)懸浮在1.0mL的D2O中，並通過旋轉混合3分鐘。通過1H NMR對水溶液的分析顯示，沒有材料釋放到溶液中。

用40μL的40％NaOD處理二氧化矽懸浮液，旋轉3分鐘，並對上清液進行NMR分析，顯示連接體裂解並從二氧化矽釋放到溶液。
實施例10.從人全血捕獲DNA。

在管中，將實施例1-8中每一個實施例的10mg份的顆粒與70μL的人全血混合。對管旋轉混合15秒，在室溫中放置5分鐘，並再次旋轉混合15秒。用300μL pH8.0的10mM tris緩衝液稀釋混合物，當利用磁響應性顆粒時，在磁體的幫助下，從顆粒去除液體。
實施例11.從人全血分離DNA。

根據前面實施例的程序而捕獲在固相結合材料上的核酸用500μL pH8.0的10mM tris緩衝液洗滌三次，每次丟棄上清液。通過在37℃，用100μL的0.1M NaOH洗脫5分鐘，從顆粒移去核酸。NaOH的其他濃度也有效，如圖5A和5B所示。
實施例12.基因組DNA的PCR擴增
在0.1M NaOH中的前面實施例的洗脫的DNA(1μL)用一對24個鹼基的引物進行PCR擴增，產生200bp的擴增子。PCR反應混合物含有下表列出的組分。
組分 體積(μL) 10×PCR緩衝液 2 引物1(100ng/μL) 2 引物2(100ng/μL) 2 2.5mM dNTPs 2 50mM MgCl21.25 Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25 模板 1 去離子水 9.5 總計 20 陰性對照用1μL水替換反應混合物中的模板。一個另外的反應使用1μL以1∶10稀釋於水中的模板。反應混合物經受30個循環94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，30秒。反應產物在1.5％瓊脂糖凝膠上跑膠。圖3說明了從珠洗脫的DNA是完整的。
權利要求
1.從細胞材料的樣品分離核酸的方法，包括
a)提供固相，該固相包括連接有核酸結合部分的基質；
b)在不存在任何添加的裂解液下，將所述固相與含有核酸的細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結合至所述固相；
c)從所述固相分離所述樣品；和
d)從所述固相釋放該結合的核酸。
2.權利要求1所述的方法，其中所述細胞材料選自動物、植物或細菌來源的完整細胞和含有動物、植物或細菌來源的完整細胞的組織。
3.權利要求1所述的方法，其中所述樣品選自細菌培養物、體液、全血和血液組分、組織提取物、植物材料以及含有細胞材料的環境樣品。
4.權利要求1所述的方法，其中所述樣品是全血。
5.權利要求1所述的方法，其中所述核酸選自DNA和RNA。
6.權利要求5所述的方法，其中所述核酸是生物體的基因組DNA。
7.權利要求5所述的方法，其中所述核酸是獲自全血的人基因組DNA。
8.權利要求1所述的方法，其中所述基質選自二氧化矽、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖。
9.權利要求1所述的方法，其中所述固相的所述基質是二氧化矽。
10.權利要求1所述的方法，其中所述固相還包括磁響應部分。
11.權利要求1所述的方法，其中所述核酸結合部分選自三元鋶基、季銨基和季基。
12.權利要求1所述的方法，其中所述核酸結合部分通過可以被選擇性地裂解的鍵連接到所述基質。
13.權利要求1所述的方法，其中所述結合的核酸在強鹼性溶液中從所述固相釋放。
全文摘要
公開了從細胞材料的樣品分離核酸的方法，該方法使用固相結合材料並避免使用裂解液。固相結合材料的使用出人意料地允許細胞的核酸內含物被釋放並直接被捕獲，而且是在一個步驟中。相對於現有方法，新方法表現出明顯的簡化。用於本發明的方法和組合物的優選的固相材料包括季核酸結合部分。
文檔編號C07H21/04GK101107365SQ200580036628
公開日2008年1月16日 申請日期2005年7月1日 優先權日2004年9月16日
發明者H·阿哈萬-塔夫第 申請人:耐克斯勁診斷公司