膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的幹細胞分選方法、以及分離膜的製作方法

2023-12-07 20:19:31 2

膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的幹細胞分選方法、以及分離膜的製作方法
【專利摘要】膜分選培養器1，其含有上部結構體10和下部結構體13，所述上部結構體10由至少一部分含有具有幹細胞透過用孔121的膜12的容器構成，所述下部結構體13由保持使所述上部結構體的膜浸漬於其中的量的流體的容器構成；膜分選培養試劑盒，其含有上述膜分選培養器1和細胞遷移因子；幹細胞分選方法，其包括將樣本細胞或樣本組織接種於所述上部結構體10的膜12的步驟、將含有細胞遷移因子的培養基填充於所述下部結構體13的步驟、和使所述上部結構體10的膜12與所述下部結構體13中的培養基接觸的步驟；以及分離膜，其是具備基材膜和功能層的分離膜，所述基材膜由疏水性聚合物構成，所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物通過共價鍵鍵合於所述基材膜的表面而成的功能層，構成所述功能層的親水性聚合物的重量為所述分離膜總重量的1.5重量%至35重量%。
【專利說明】膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的幹細胞分選方法、以及分離膜
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於分選任意生物種類的幹細胞和牙髓幹細胞的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的幹細胞分選方法。本發明特別涉及用於分選為了牙髓再生而填充於根管中的牙髓幹細胞或間充質幹細胞的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒和使用其的幹細胞分選方法。本發明還涉及分離膜、表面改性方法和利用其的分離膜的製造，提供不損害分離性能而將由疏水性聚合物構成的膜親水化以抑制將細胞透過分離時對膜的粘附的分離膜。因此，本發明適用於以血液淨化領域、再生醫療為中心的細胞分離純化領域中。另外，聚合物表面改性方法可以簡便地進行僅聚合物表面的改性，由於同時還可進行滅菌處理，因而與以往方法相比可有助於生產效率化。
【背景技術】
[0002]現在，拔髓治療或感染根管治療的生物學根管填充材料中所用的牙髓幹細胞是血管新生能力、神經再生能力和牙髓再生能力優異的級分。主要使用的是來源於牙髓的CD31-SP (邊緣群)細胞、CD105+細胞或CXCR4+細胞等。SP細胞是用Hoechst33342標記，並通過流式細胞儀用Hoechst Blue和Hoechst Red來對強烈排出該色素的級分進行分選，大量含有幹細胞。然而，由於H0echst33342是DNA結合色素，而且必須使用流式細胞儀，因而人們認為在細胞的安全性方面存在問題。
[0003]另ー方面，開發有在使用針對幹細胞特異性膜表面抗原的抗體時，不使用流式細胞儀而使用磁珠的方法。例如，作為骨髄幹細胞，已知CD34或CD133抗體珠，但需要一定程度的組織細胞量。所以，不適於從牙髓組織進行分選的情形。另外，人牙髓的情形中，CD34陽性細胞和CD133陽性細胞分別為牙髓樣本細胞的0.01%和0.5%，基本不存在，因而現存(市售)的磁珠法不適合。對CD105或CXCR4的抗體珠來說，由於是定製品，因而有可能非常昂貴。另外，作為從脂肪組織分離幹細胞的儀器，在臨床上已經使用了以利用酶消化法和離心分離法的細胞分離為基本的Celution 800/CRS系統，但需要大量組織，所得細胞為異源群體且多含前體細胞，而且昂貴。進而，作為從骨髄組織分離幹細胞的儀器，商品化有BoneMarrow MSC Separation Device。據說其通過用由人造絲和聚乙烯形成的纖維來捕獲骨髄間充質細胞，從而可在短時間(20分)內採集幹細胞，比較廉價，但卻需要比較大量的骨髄組織(髄液)，所得細胞仍然為異源群體且多含前體細胞。因此，不使用酶消化法而從固體的組織分選幹細胞並使之増殖的裝置尚未發明。
[0004]另外作為膜分選器，可以將作為上部結構的插入式細胞培養皿(CellcultureInsert)(聚碳酸酯膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(註冊商標)Inserts、2 X IO5孔/cm2、孔尺寸8 ii m、底面的直徑6.4 mm、開ロ部的直徑11.0 mm、高度17.5 mm) (Corning)插入作為下部結構的24孔板(直徑15.0 mm、開ロ部的直徑15.0 mm、高度22.0 mm)(Falcon)來使用。然而，對於PET膜或聚碳酸酯膜來說，細胞的附著多，無法有效地進行向下層的遷移。進而，由於是開放形狀，因而微生物所致的汙染的危險大，無法保證細胞的安全性。
[0005]因此，需要開發廉價且有效地從人牙髓組織或人牙髓細胞分選幹細胞的方法。
[0006]迄今為止，已知可以將骨髄中存在的CXCR4+細胞、C-MET+細胞或LIF-R +細胞分別利用其配體SDFl、HGF或LIF的濃度梯度，通過遷移趨化效果而濃縮為骨髄的幹細胞(非專利文獻I)。
[0007]另外，已知可以將骨髄、末梢血和臍帶血的幹細胞(CXCR4 +/IirT/⑶133 + /⑶45 +細胞的造血幹細胞和CXCR4 + /lin7⑶133 + /⑶45—細胞的間充質幹細胞)通過SDFl的濃度梯度同樣地濃縮(非專利文獻2)。此時,在現成的Costar Transwell 24-孔的5iim孔徑(孔尺寸)的濾器下部的腔室中裝入SDF-1，在上部裝入欲要濃縮的細胞。然而，考慮安全性吋，由於SDF-1還未受到藥事認可，因而期望使用替代SDF-1的安全且有效的遷移因子。
[0008]另外，作為對骨髄幹細胞的遷移有效的因子，已知來源於血小板的鞘胺醇-1-磷酸(SlP)(非專利文獻3)，作為對脂肪幹細胞的遷移有效的因子，已知原兒茶酸(非專利文獻4)。但是，仍然尚未解決安全性的問題。進而，還已知血管新生神經再生和牙髓再生能力優異的牙髓CD31_SP細胞相對於SDF-1或VEGF遷移(非專利文獻5)。但是，目前對SDF-1以外的血管新生神經再生和牙髓再生能力優異的牙髓幹細胞的分選有效的遷移因子並不明確。
[0009]能夠安全且實用地分選牙髓幹細胞的膜分選培養器和遷移因子受到需求。另外，在人幹細胞之外，各種生物種類中由幹細胞分化誘導各組織的機理的闡明在生物學研究中受到追求。伴隨再生醫療的進展，能夠簡便且穩定地分選幹細胞的膜分選培養器和遷移因子受到期待。
[0010]對於與體液、血液或細胞接觸的醫療用的分離膜，若蛋白質或血小板、細胞等附著則分離膜的性能降低、或成為引起機體反應的原因，細胞自身的吸附也受到促進等，要解決的問題多。另外，浄水器等的水處理膜中，蛋白質或有機物的附著會引起分離膜的性能降低。對於上述問題，嘗試了通過將分離膜親水化來解決，進行各種研究。例如，公開了使作為親水性高分子的聚乙烯基吡咯烷酮與由聚碸形成的膜在制膜原液的階段混合併進行成形，由此對膜賦予親水性以抑制汙垢的方法(專利文獻I)。然而，這些方法中，對表面賦予親水性時受到下述制約:需要增多制膜原液中的親水性高分子的量、或者限幹與作為基材的高分子具有相容性的親水性高分子、或者對應於材料的使用用途必需研究最適的原液組成
坐寸O
[0011]另外，專利文獻2中公開了將聚乙烯醇縮醛二乙基氨基こ酸酯和親水化試劑塗布於膜來實現親水化的方法。該方法中，有可能聚乙烯醇縮醛二乙基氨基こ酸酯被覆親水化試劑、非附著相關的效果·驟減。另外，由於使膜浸潰於聚乙烯醇縮醛二乙基氨基こ酸酯和親水化試劑的各溶液中，因而膜的分離性能也有可能降低。
[0012]公開了通過高能射線使要進行水不溶化的聚乙烯基吡咯烷酮等親水性成分水不溶化並導入所形成的膜中的方法(專利文獻3)、或使聚碸系的分離膜與聚乙烯基吡咯烷酮等親水性高分子溶液接觸後、通過放射線交聯而形成不溶化的被膜層的方法(專利文獻4)。然而，聚乙烯基吡咯烷酮等水性高分子和聚碸系高分子由於分子間的相互作用弱，因而存在難以形成被膜層的問題。
[0013]因此，公開了使一定範圍的皂化度的聚乙烯醇水溶液與聚碸系分離膜接觸，通過聚碸和こ酸乙烯酯的疏水性相互作用而有效地形成膜表面的被膜層的方法(專利文獻5)。然而，該文獻並非關於附著抑制的方法，因而本發明人的研究結果得知，若將聚乙烯醇單純地被覆於分離膜，則分離膜的性能降低顯著。另外，已知聚乙烯醇的羥基在與血液接觸時容易將補體活化。
[0014]進而，據說即使用聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇之類的親水性高分子被覆材料表面，附著抑制效果也僅能暫時性地抑制(非專利文獻6)。即，尚未確立用高性能的分離膜來滿足血液適合性的分離膜組件。
[0015]現有技術文獻 專利文獻
專利文獻1:日本特公平2-18695號公報 專利文獻2:日本特開平8-131791號公報 專利文獻3:日本特公平8-9668號公報 專利文獻4:日本特開平6-238139號公報 專利文獻5:日本特開2006-198611號公報 非專利文獻
非專利文獻 I:Kucia M., et al., Arch.1mmunol.Ther.Exp.2006
非專利文獻 2:Baumert B.et al., Folia Histochemica Et Cytobiologica 2008
非專利文獻 3:Meriane M., et al., Stem Cells 2006
非專利文獻 4:ffang H., et al., Eur.J.Pharmacol.2008
非專利文獻 5: 1hara K.et al., STEM CELLS Volume 26, Issue 9, pages2408-2418, September 2008
非專利文獻6:醫療ナ ノテクノロジー杏林圖書ppll5-116。

【發明內容】

[0016]發明要解決的技術問題
以往的流式細胞儀或磁抗體珠法無法成為滿足臨床使用基準(藥品和準藥品的製造管理和品質管理的基準相關的部令(醫薬品及び醫薬部外品の製造管理及び品質管理の基準に閨する省令)(GMP))的安全且高效、廉價的分選方法。本發明是鑑於上述問題而完成的發明，其目的在於針對牙髓再生治療和其它再生治療提供不使用流式細胞儀或磁抗體珠而由少量的組織也可以安全、高效且廉價地得到所期望的幹細胞的培養器、用於其的遷移因子以及幹細胞分選方法。進而，其目的在於提供能夠適用於所有生物種類的幹細胞(胚胎幹細胞、iPS細胞和組織幹細胞)的分選的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒和幹細胞分選方法。
[0017]本發明的進ー步的目的在於提供改良了分離膜相關的現有技術的缺點，具有能夠在通常的細胞培養用孵育器、潔淨臺中使用的緊湊性，改良了基於孔徑的過濾性能以及表面親和性的高性能的分離膜。
[0018]用於解決技術問題的方法
本發明人為了達成上述課題而進行了深入研究，結果發現，利用細胞遷移因子的濃度梯度，可以使幹細胞從膜上部至膜下部選擇性地通過，可以分選幹細胞，從而完成了本發明。所以，根據ー個方式，本發明是膜分選培養器，其含有上部結構體和下部結構體，所述上部結構體由容器構成，該容器的底面的至少一部分用具有幹細胞透過用孔的分離膜形成，所述下部結構體由容器構成，該容器保持使所述上部結構體的膜浸潰於其中的流體。
[0019]優選的是所述分離膜具備基材膜和功能層，所述基材膜由疏水性聚合物構成，所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合於所述基材膜的表面而成的功能層，構成所述功能層的親水性聚合物的重量為所述分離膜總重量的1.5重量％至35重量％。
[0020]優選的是所述孔的尺寸為3 iim~lOiim，密度為I X IO5~4X IO6孔/cm2。
[0021]優選的是具備多個所述上部結構體，並進一歩含有框體，所述框體容納於所述下部結構體中、且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件。
[0022]或者優選的是具備多個所述上部結構體，並進一歩含有框體，所述框體容納於所述下部結構體中、且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件，所述下部結構體由於所述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。
[0023]或者還優選所述多個上部結構體具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
[0024]優選進一歩含有蓋狀結構體，所述蓋狀結構體可覆設或密封上述上部結構體和下部結構體。
[0025]優選所述蓋狀結構體進ー步含有具備氣體導入口和氣體排出ロ的氣體交換裝置。
[0026]優選所述蓋狀結構體的至少一部分是由具有孔尺寸I~IOOnm的孔的膜形成的。
[0027]優選在所述蓋狀結構體和所述下部結構體之間設置有密封用的弾性體。
[0028]優選進一步具備溫度調節系統，該溫度調節系統含有溫度測定裝置和溫度調節裝置。
[0029]優選所述下部結構體進ー步含有具備培養基導入口和培養基送出ロ的培養基交換系統。
[0030]根據另一方面，本發明是膜分選培養試劑盒，其含有前述任ー項中所述的膜分選培養器、和用於注入所述下部結構體的細胞遷移因子。
[0031]優選所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-P、NGF、PDGF、BDNF、ffl)NF、EGF, VEGF, SCF, MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF, SIP、原兒茶酸、和血清中的ー種以上。
[0032]優選所述細胞遷移因子的濃度為lng/ml~500ng/ml。
[0033]優選進一歩含有用於注入所述下部結構體的血清，所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGFo
[0034]根據又一方面，本發明是使用上述任一膜分選培養器的幹細胞分選方法，其包括:將樣本細胞或樣本組織接種於所述上部結構體的膜的步驟、將含有細胞遷移因子的培養基填充於所述下部結構體的容器的步驟、和使所述上部結構體的膜與所述下部結構體中的培養基接觸的步驟。
[0035]優選所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-P、NGF、PDGF、BDNF、ffl)NF、EGF, VEGF, SCF, MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF, SIP、原兒茶酸、和血清中的ー種以上。
[0036]優選所述細胞遷移因子的濃度為lng/ml~500ng/ml。
[0037]優選將所述樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3 X IO2細胞~3 X IO4細胞進行接種。
[0038]另外，本發明為上述的幹細胞分選方法，其中，所述幹細胞為牙髓幹細胞，所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml，將所述樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3X IO2~1.5X IO3細胞進行接種，或將前述樣本組織以相對於分離膜Imm2為0.1mg~Img進行靜置，在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對於該培養基的體積為5~20vol%的血清。
[0039]另外，本發明為上述的幹細胞分選方法，其中，所述幹細胞為骨髄幹細胞或脂肪幹細胞，所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml，將所述樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3X IO2~1.5X IO3細胞進行接種，或將前述樣本組織以相對於分離膜Imm2為0.1mg~Img進行靜置，在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對於該培養基的體積為5~20vol%的血清。
[0040]進ー步地，本發明人為了實現與分離膜相關的上述課題而進行了深入研究，結果發現血液適合性優異、蛋白質或有機物的附著少的本發明的分離膜和分離膜組件通過下述的構成得以實現。
[0041]即，根據其它的方式，本發明為一種分離膜，其具備基材膜和功能層，所述基材膜由疏水性聚合物構成，
所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合於所述基材膜的表面而成的功能層，其中，構成所述功能層的親水性聚合物的重量是所述分離膜總重量的1.5重量％至35重量％。
[0042]優選的分離膜中，所述基材膜具有I~IOym的孔，並用於細胞分離。
[0043]優選所述疏水性聚合物選自碸系聚合物、醯胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和醯亞胺系聚合物中。
[0044]優選前述任一項所述的分離膜是用於將細胞透過分離。
[0045]根據其它方面，本發明是上述任一項所述的分離膜的製造方法，其具備:將吸水率為2%以下的由疏水性聚合物構成的基材膜浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的處理水溶液中的浸潰步驟、和對所述基材膜照射高能射線，將膜表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
[0046]或者，本發明是上述任一項所述的分離膜的製造方法，其具備:將吸水率超過2%的由疏水性聚合物構成的基材膜浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物的水溶液中的浸潰步驟、和對所述基材膜照射高能射線，將膜表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
[0047]優選所述疏水性聚合物選自碸系聚合物、醯胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和醯亞胺系聚合物中。
[0048]根據其它方面，本發明為成形體的表面改性方法，其具備:將吸水率為2%以下的成形體浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和こ烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的處理水溶液中的浸潰步驟、和對所述成形體照射高能射線，將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
[0049]或者本發明為成形體的表面改性方法，其具備:將吸水率超過2%的成形體浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物的水溶液中的浸潰步驟、和對所述成形體照射高能射線，將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
[0050]另外，本發明還是使用這些成形體的改性方法來製造上述任一項所述的分離膜的方法。
[0051]發明效果
根據本發明，使用膜分選培養器和細胞遷移因子，即使是由少量的細胞也可以安全、高效且廉價地分選幹細胞。另外，通過對應於細胞的大小來選擇透過用孔的適合尺寸，可以廣泛用於所有生物種類的幹細胞分選。或者，通過選擇適合的遷移因子，可以應對包括胚胎幹細胞、iPS細胞和組織幹細胞的所有幹細胞的分選。進而，通過改變膜分選培養的分離膜的數量，還可以應對各種組織細胞量。通過使上部結構體和下部結構體為完全密封型，可以對應GMP，分選能在臨床上實際使用的幹細胞。進而，本申請發明的膜分選培養器無論是作為實驗用還是作為臨床用，均可廣泛使用，極大地有助於再生醫療的發展。作為膜分選細胞的進一步的優點，特別是對於中老年人來說，膜分選的幹細胞的擴增所伴隨的表型變化(phenotypical change )少。伴隨擴增，由於難以變老、難以老化，因而在臨床使用中可以有效地發揮功能。另外，作為膜分選器的進ー步的優點，不僅可以從細胞、而且從組織也可分選幹細胞，而不用預先通過酶消化等來分散細胞，這使得可以節約酶消化的時間和通過不使用酶來確保安全性。
[0052]另外，本發明的分離膜是在分離細胞時抑制細胞發生粘附而使分離效率降低的分離膜，其特徵在幹，以聚合物狀局部化於分離膜功能層的表面。可適宜地用於抑制未向制膜原液中混合親水性聚合物而進行成型得到的分離膜、例如使電子射線透過而形成孔的膜表面的蛋白質或細胞附著性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0053][圖1]第一實施方式的膜分選培養器`的模式圖。
[0054][圖2]第二實施方式的膜分選培養器的模式圖。
[0055][圖3]示出第三實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
[0056][圖4]示出第四實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
[0057][圖5]不出第五實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
[0058][圖6]Ca)是利用TaxiScan來顯示細胞遷移因子所致的狗⑶105陽性細胞的遷移的差異、時間歷程的圖，(b)是利用TaxiScan來顯示細胞遷移因子G-CSF的各種濃度所致的狗⑶105陽性細胞的遷移的差異的圖。
[0059][圖7]Ca)是利用TaxiScan來顯示胎牛血清濃度變化所致的人牙髓樣本細胞的遷移的差異、時間歷程的圖，(b)是利用TaxiScan來顯示與胎牛血清相比的細胞遷移因子G-CSF和SDF-1 (最終濃度100ng/ml)所致的人牙髓樣本細胞的遷移的差異的圖。
[0060][圖8]Ca)是示出使用本發明的膜分選培養器(2X IO5孔/cm2、孔尺寸為3 y m)，將IX IO5細胞/250 的狗新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中於含10%狗血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，6小時後更換培養基除去G-CSF並進ー步培養I天后的牙髓幹細胞的圖，(b)是示出使用本發明的膜分選培養器(2X IO5孔/cm2、孔尺寸為3 i! m)，將I X IO5細胞/250 U I的狗新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中於含10%狗血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,6小時後更換培養基，除去G-CSF並進ー步培養7天後的牙髓幹細胞的圖，(c)是示出使用本發明的膜分選培養器(2X105孔/cm2、孔尺寸為3iim)，將I X IO5細胞/250 的狗新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體於含10%狗血清的DMEM中加入SDF-1 100ng/ml，6小時後更換培養基，除去SDF-1並進ー步培養I天后的牙髓幹細胞的圖。
[0061][圖9](a)是示出使用本發明的膜分選培養器和G-CSF進行分選培養得到的牙髓幹細胞的第5代的試驗管內的血管誘導能力的圖，(b)是示出使用本發明的膜分選培養器和G-CSF進行分選培養得到的牙髓幹細胞的第5代的試驗管內的神經球(neurosphere)形成能力的圖。[0062][圖10]Ca)是示出將使用本發明的膜分選培養器和G-CSF進行分選培養得到的牙髓幹細胞移植至狗拔髓後的根管內，14天後的牙髓再生的圖，(b)是(a)的B所示位置的高倍圖，(C)是(a)的C所示位置的高倍圖，是示出沿根管內再生牙髓的牙本質側壁分化並排列的成牙本質細胞的高倍圖。(d)是示出相同年齡、相同部位的狗的正常牙髓的圖。
[0063][圖11]是示出使用本發明的膜分選培養器(2X105孔/cm2、孔尺寸為3i!m)，將IXlO5細胞/250 Ul的人新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中於含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，6小時後更換培養基，除去G-CSF並進ー步培養8天後的人牙髓幹細胞的圖。
[0064][圖12](a)是示出使用本發明的膜分選培養器(I X IO5孔/cm2、孔尺寸為8 U m),將IX IO5細胞/IOOiil的人新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中加入含10%人血清的DMEM，22小時後更換培養基，並進ー步培養3天後的分選得到的人牙髓幹細胞的圖，(b)是示出使用相同的膜分選培養器，將I X IO5細胞/100 u I的人新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中於含10%人血清的DMEM中加入G-CSF10ng/ml，22小時後更換培養基除去G-CSF並進ー步培養3天後的人牙髓幹細胞的圖，(c)是示出使用相同的膜分選培養器，將IXlO5細胞/IOOiU的人新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中於含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，22小時後更換培養基除去G-CSF並進ー步培養3天後的人牙髓幹細胞的圖。(d)是示出(a)的10%人血清的培養7天後的人牙髓幹細胞的圖。(e)是示出(c)的G-CSF 100ng/ml的培養7天後的人牙髓幹細胞的圖。
[0065][圖13](a)是示出使用本發明的膜分選培養器(I X IO5孔/cm2、孔尺寸為8 U m),將IX IO5細胞/IOOiil的豬新鮮初代牙髓細胞接種於分離膜上部，在分離膜下部結構體中於含10%胎牛血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，22小時後更換培養基除去G-CSF並進ー步培養3天後的豬牙髓幹細胞的圖，(b)是示出替代(a)中的豬新鮮初代牙髓細胞而接種豬新鮮初代骨髄細胞，進行膜分選並培養3天後的豬骨髄幹細胞的圖，(c)是示出替代(a)中的豬新鮮初代牙髓細胞而接種豬新鮮初代脂肪細胞，並培養3天後的豬脂肪幹細胞的圖。(d)是示出接種(a)中的豬新鮮初代牙髓細胞，進行膜分選並培養8天後的豬牙髓幹細胞的圖。
[0066][圖14]是示出取決於各種遷移因子的未分選的人牙髓樣本細胞的遷移能力的比較的圖。[0067][圖15]是示出取決於製劑化的遷移因子和血清的人牙髓樣本細胞的遷移能力的比較的圖。
[0068][圖16]是示出使用各種濃度的G-CSF進行分選得到的牙髓膜分選細胞的、取決於人血清的細胞増殖能力的比較的圖。 [0069][圖17]是示出使用各種濃度的G-CSF進行分選得到的牙髓膜分選細胞的、取決於100ng/ml的G-CSF的細胞增殖能力的比較的圖。
[0070][圖18]是示出使用各種濃度的G-CSF進行分選得到的牙髓膜分選細胞的、相對於G-CSF的細胞遷移能力的比較的圖。
[0071][圖19]是示出使用100ng/ml的G-CSF進行分選得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的、相對於胎牛血清的細胞増殖能力的、與樣本細胞的比較的圖。
[0072][圖20]是示出使用100ng/ml的G-CSF進行分選得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的、相對於100ng/ml的G-CSF的細胞增殖能力的、與樣本細胞的比較的圖。
[0073][圖21]是示出使用100ng/ml的G-CSF進行分選得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的、相對於G-CSF的遷移能力的、與樣本細胞的比較的圖。
[0074][圖22]是示出第六實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
[0075][圖23](a)是示出使用本發明的膜分選培養器(I X IO5孔/cm2、孔尺寸為8 U m),將2mg/200 u I的切碎的狗新鮮牙髓組織靜置於膜上部，並在膜下部結構體中於含10%血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,24小時後的牙髓幹細胞的圖，(b)是示於與(a)同樣地將2mg/200ul的切碎的狗新鮮脂肪組織靜置於膜上部，並在膜下部結構體中於含10%血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,24小時後的脂肪幹細胞的圖。
【具體實施方式】
[0076]以下參照附圖詳細地說明本發明。但以下說明並不限定本發明。
[0077](第I實施方式)
本發明的第I實施方式的膜分選培養器I由上部結構體10和下部結構體13構成。上部結構體10是用於加入含有樣本細胞200或樣本組織的培養基100，並將樣本細胞200或樣本組織保持在分離膜12上的結構體。另ー方面，下部結構體13是用於加入含有遷移因子(未圖示)的培養基300，並接收遷移的幹細胞的結構體。
[0078]上部結構體10是由側面部11和圓形的底面部構成的容器,底面部由具有多個孔121的分離膜12形成。上部結構體10隻要其內部可以容納培養基100和樣本細胞200或樣本組織即可。本說明書中，樣本細胞是指通過酶處理從組織將細胞間的粘附解散且未進行分選的細胞。或者是指傳代並分散的細胞。例如，優選可以容納100~250iU左右的培養基100和樣本細胞200的容器。樣本組織是指切碎的但未進行酶消化處理的未分散的組織。
[0079]構成上部結構體10的底面的分離膜12具有用於使幹細胞透過的多個孔121。孔尺寸為I U m~100 V- m、優選為3 ii m~10 y m、進一步優選為5 y m~8 y m。這是為了使幹細胞能夠通過。另外，孔密度為2.5 X IO3~2.5 X IO7孔/cm2、優選為I X IO5~4X IO6孔/cm2。為了使幹細胞能夠高效地通過，開孔率可以儘可能地高。
[0080]作為分離膜12的材料，優選使用以PET、聚碳酸酷、聚碸、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚醯胺等疏水性聚合物為基材的材料。另外，分離膜12的厚度優選為10~100 u m、進ー步優選為10~25 ii m。這是為在幹細胞遷移時,特別是在幹細胞通過孔時,不對幹細胞表面造成損傷。
[0081]對於分離膜12，為了形成為細胞非粘附性，優選為利用塗覆劑對分離膜表面進行了塗覆的分離膜。特別地，可以在在接種樣本細胞200或樣本組織時，向作為與樣本細胞200或樣本組織接觸的面的、上部結構體10的內側的面適用塗覆劑。作為塗覆劑，可使用已知的細胞非粘附性的塗覆劑，例如，將環氧乙烷/環氧丙烷共聚物(旭電化工業(旭電化工業)株式會社的商品名:Pluronic F108)、聚甲基丙烯酸2-羥基こ酯以達到5mg/ml的方式溶解於 95% こ醇中而得的塗覆劑(Folkman J & Moscona A, Nature 273:345-349,1978、日本特開平8-9966號公報等)、分支聚亞烷基二醇衍生物(W02009/072590)等，但並不限定於此。可以使用任意的細胞非附著性的塗覆劑。塗層厚度只要是足以對PET、聚碳酸酷、聚偏氟乙烯等基材膜賦予細胞的非粘附特性的範圍即可。這樣的厚度也根據塗覆劑的種類而不同，例如，優選為10~100 iim，進ー步優選為10~25iim。
[0082]對分離膜12的特別優選的修飾方法進ー步進行說明。上述使用塗覆劑的方法中，由於有可能使分離膜的孔閉塞、或因水系培養液而發生溶出等有機溶劑殘存造成對細胞的不良影響，因而優選進行以下所述的利用共價鍵合法的分離膜表面修飾。
[0083]即，將所期望的孔徑且以高開孔率開ロ的由疏水性聚合物構成的基材膜浸潰於添加有乙烯基吡咯烷酮系聚合物、乙二醇系聚合物和/或乙烯醇系聚合物、和根據需要的醇的處理水溶液中後，照射高能射線，由此進行表面修飾，製造分離膜。
[0084]聚乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指選自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮こ酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它們的改性聚合物中的聚合物，乙二醇系聚合物也包括側鏈含有酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根據皂化度而獲得各種種類，並無限定。其中，這些膜表面修飾聚合物優選為水溶性。因此，例如，可以使用數均分子量為I萬至100萬的聚合物，但只要·為水溶性則並不限於上述分子量。該處理水溶液中的聚吡咯烷酮系聚合物的濃度優選為10~5000ppm。若濃度變高，則有時會閉塞孔，因而更優選為10 ~2000ppmo
[0085]另外，為了有效地進行基材膜的表面修飾，在基材膜的吸水率為2%以下時，優選在該處理水溶液中進ー步添加醇。應予說明，基材膜的吸收率是指，將IOOym以下的膜厚的基材膜浸潰於23°C水中24小時，測定重量増加量，將該重量増加率的值定義為吸水率。
[0086]作為在吸水率為2%以下時添加的醇，若考慮殘留時的安全性，則優選為こ醇，但並不限定於此。相對於處理水溶液的重量，醇的濃度優選為I重量％以下，為了安全則為0.5重量％以下、進ー步優選為0.1重量％以下。
[0087]作為高能射線，可使用UV、電子射線、Y射線中的任一者，電子射線或Y射線容易提高反應率，因而更優選。照射的射線量優選為5~35kGy，特別是將培養裝置整體用例如相當於被視為滅菌射線量的25kGy的射線量進行照射，由此還可以同時實施表面修飾和滅菌。
[0088]這樣得到的分離膜從細胞非附著性的觀點來看是有用的，可以有效地用於本實施方式中的膜分選裝置。[0089]作為上部結構體10的側面部11的材料，可以使用通常用作細胞培養器的常規材料，可以設定為聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、聚丙烯(PP)、聚碳酸酯等塑料制。
[0090]上部結構體10的尺寸並不限於特定的大小，例如，可將底面部的直徑設為5~8mm。由側面部11的上端規定的容器開ロ部的直徑可以設為例如6~10mm。從底面部12至開ロ部的高度、即容器的深度可以設為例如10~15mm。應予說明，上述值為一例，本領域技術人員可以根據樣本細胞、樣本組織的種類、或收集的幹細胞的種類等目的而適宜確定構成上部結構體10的容器的尺寸。
[0091]接著，下部結構體13是由底面部和側面部構成、且上面具有開ロ部的容器。作為下部結構體13的材料，側面和底面均可使用相同的材料，優選使用聚苯乙烯、玻璃等。這是為了賦予細胞附著性、細胞増殖性。應予說明，下部結構體不必將底面部和側面部固定而成為一體，根據實施方式，也可以用與下部結構體不同的其它構件來構成下部結構體的底面部。
[0092]下部結構體13能夠可裝卸地裝載上部結構體10。進行裝載時，構成上部結構體10的容器的分離膜12容納於下部結構體13中。這是為了在後述幹細胞分選方法中，使加入下部結構體13的培養基和構成上部結構體10的分離膜12接觸，從而細胞能夠通過分離膜的兩側。在圖示的實施方式中，分離膜12不與下部結構體13的底面相接，在分離膜12和下部結構體13的底面部之間形成有空隙。可以在該空隙填充培養基。
[0093]為了將下部結構體13與上部結構體10的裝載時的位置關係固定，可以進一歩具有未圖示的保持機構。保持機構可以設置於上部結構體10或下部結構體13的一方，也可設置於雙方。作為保持機構，例如，可以是從上部結構體10的側面上端或側面的規定高度起、向開ロ部的外側延伸的凸緣或爪狀的構件。該保持機構與下部結構體13的側面上端相接，可以將上部結構體10保持於規定的高度。作為保持機構的其它例子，可以是設置於上部結構體10，由上部結構體10的底面向下延伸的腳狀的構件。該保持機構與下部結構體13的底面相接，可以將上部結構體10保持於規定的高度。此時，在下部結構體的底面上還可以設置嵌合於上述腳狀的構件而進行固定的構件。
`[0094]作為下部結構體13的尺寸的一例，在與上述上部結構體10的尺寸的關係上，例如,可以將底面部的直徑設為7~15mm。另外，由下部結構體13的側面部的上端規定的容器開ロ部的直徑的尺寸也可以同樣設定。下部結構體13的深度優選比上部結構體10的深度更深，例如，可以設為11~20mm。
[0095]應予說明，本實施方式中，將具有圓形的底面和開ロ部、且底面的直徑比開ロ部的直徑更小的形狀的上部結構體作為一例進行說明，但底面部12的形狀並不限定於圓形，可以設為楕圓形、方形、多邊形、或任意的形狀。另外，底面部的尺寸和開ロ部的尺寸的關係也不限定於本實施方式所述，底面部和開ロ部的尺寸也可以相同。進而，對於上部結構體，只要其底面的至少一部分具有包含多個孔的分離膜，且可以在分離膜上接種並保持細胞，則可以構成為含有底面和側面連續的球體的部分面。另外，本實施方式中，下部結構體13是以圓形為一例進行說明，但底面和開ロ部的形狀並不限定於特定形狀。進而，下部結構體不必是底面與側面可以明確區別的結構體，也可以構成為含有底面和側面連續的球體的部分面。
[0096]這樣的膜分選培養器I可用於從包括哺乳類的任意的生物組織或細胞中分選幹細胞。作為可分選的幹細胞，可舉出例如:胚胎幹細胞、iPS細胞和組織幹細胞。特別地，為了再生包括人的哺乳類的牙髓，可用於從牙髓細胞或間充質細胞分選牙髓幹細胞或間充質幹細胞。間充質幹細胞包括例如:骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、臍帶血幹細胞。但是，本實施方式的膜分選培養器I的用途並不限於上述。
[0097]具體地，作為分選目標的前述牙髓幹細胞或其它組織幹細胞優選含有下述中的至少任ー種:來源於牙髓或其它組織(例如骨髄、脂肪組織、羊膜、牙根膜、滑膜、臍帶)的CD105陽性細胞、CXCR4陽性細胞、SSEA-4陽性細胞、FLK-1陽性細胞、⑶31陰性且⑶146陰性細胞、⑶24陽性細胞、⑶150陽性細胞、⑶29陽性細胞、⑶34陽性細胞、⑶44陽性細胞、⑶73陽性細胞、⑶90陽性細胞、FLK-1陽性細胞、G-CSFR陽性、和SP細胞。前述SP細胞優選為下述中的任ー種:CXCR4陽性、SSEA-4陽性、FLK-1陽性、CD31陰性且CD 146陰性、CD24陽性、⑶105陽性、CD 150陽性、CD29陽性細胞、CD34陽性細胞、CD44陽性細胞、CD73陽性細胞、CD90陽性細胞、FLK-1陽性或G-CSFR陽性。
[0098]接著，從幹細胞分選方法的觀點來說明本實施方式的膜分選培養器I。幹細胞分選方法包括:在上部結構體10的分離膜12上接種樣本細胞200或樣本組織的步驟、向下部結構體13注入含有細胞遷移因子的培養基300的步驟、和使分離膜12與培養基300接觸的步驟。通過這些步驟，利用加入下部結構體13的細胞遷移因子的濃度梯度，可以選擇性地使幹細胞從分離膜12上部通過，可以分選幹細胞。
[0099]在上部結構體10的分離膜12上接種樣本細胞200或樣本組織的步驟中，使可通過已知方法，例如，Nakashima, Archs oral Biol 36,1991獲得的樣本細胞200溶解於培養基100，並接種於上部結構體10的分離膜12上。作為用作幹細胞的分選源的樣本細胞200，可舉出牙髓細胞或間充質細胞。間充質細胞包括來源於骨髄、脂肪組織、羊膜、牙根膜、滑膜、臍帶的細胞，但並不限定於此。另外，在分選胚胎幹細胞、iPS細胞時，作為用作分選源的樣本細胞200，可以使用胚和胚泡、實施了基因導入或蛋白導入等的體細胞。使用樣本組織時，切碎後浸潰於培養基，並靜置於上部結構體10的分離膜12上。
[0100]樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3X IO2細胞~3X IO4細胞進行接種。例如，相對於直徑6.5mm的分離膜，細胞密度優選為I X IO2細胞/100 ~I X IO7細胞/100 yl，進ー步優選為I X IO4細胞/100 ill~I X IO6細胞/100 yl。這是因為若細胞密度過低則難以増殖，若過高則難以遷移。應予說明，根據要分選的幹細胞的種類，所需的樣本細胞的量有所不同，例如，分選I X IO3細胞的牙髓幹細胞時所需的來源於牙髓組織的樣本細胞極其少量，為例如I X IO5細胞左右即可。特別地，分選牙髓幹細胞時的最優選的樣本細胞的密度為3 X IO2~1.5 X IO3細胞/mm2。另ー方面，分選等量的骨髄幹細胞或脂肪幹細胞時所需的樣本細胞例如有時分別需要為3X IO5細胞和I X IO6細胞左右。另外，分選iPS細胞吋，樣本細胞200的量根據導入效率而不同。這種所需的樣本細胞的量對於本領域技術人員來說是已知的，可以適宜決定。另外，使用樣本組織時，可以將樣本組織以相對於分離膜Imm2為0.1mg~Img進行靜置。
[0101]在向下部結構體13注入含有細胞遷移因子的培養基300的步驟中，使細胞遷移因子溶解於培養基並注入下部結構體13。加入下部結構體13的添加於培養基的細胞遷移因子優選為選自下述中的至少任ー者:SDF-1、G-CSF, bFGF、TGF-^、NGF, PDGF, BDNF,⑶NF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit, GM-CSF, LIF、HGF, SIP、原兒茶酸、和血清。特別地，從遷移活性和臨床使用中的安全性的觀點出發，最優選G-CSF或bFGF。另外，前述細胞遷移因子的濃度優選為lng/ml~500ng/ml。這是因為若過於稀薄則有時會沒有遷移效果，若過濃則幹細胞有可能發生分化。特別地，將G-CSF或bFGF用作細胞遷移因子吋，G-CSF或bFGF的濃度優選為50~150ng/ml,特別優選為約100ng/ml左右、例如95~105ng/ml。這是為了能夠分選最多的幹細胞，並且在分選得到的幹細胞中，血管新生因子、神經營養因子的mRNA表達也達到高值。
[0102]作為使用的培養基，可以使用Dulbecco』 s改良Eagle培養基、EBM2等,但並不限定於此。可以是能夠在幹細胞的培養中使用的任意的培養基。培養基的量可根據下部結構體13的容量而適宜決定。在培養基中優選與細胞遷移因子一起添加血清。這是因為血清具有促進細胞遷移活性的效果。為了分選人幹細胞，優選使用人血清，也可以使用胎牛血清。相對於培養基的體積，血清的添加量優選設為5~20vol%。
[0103]在使分離膜12與培養基300接觸的步驟中，使上部結構體10層疊於下部結構體13，使分離膜12的外側與培養基300充分接觸。由此，可以產生細胞遷移因子的濃度梯度。作為其結果，樣本細胞200或樣本組織中的幹細胞通過孔121，向下部結構體13遷移，從而可進行幹細胞的分選。接觸後的作用時間優選設為40~50小吋。
[0104]應予說明，上述中，採用向上部結構體10中加入樣本細胞200或樣本組織、向下部結構體13中加入含有細胞遷移因子的培養基、然後將上部結構體10裝載於下部結構體、使分離膜12與培養基接觸的方式進行了說明，但上述三步驟的順序並無限定。組合上部結構體10和下部結構體13後，可以分別進行接種、注入，也可以實質上同時進行。
[0105]應予說明，該幹細胞培養方法也可以不依賴於特定的容器形狀而實施，此時，幹細胞培養方法包括:使樣本細胞或樣本組織與具有孔的分離膜的細胞非粘附性的面接觸的步驟、和使含有細胞遷移因子的培養基與前述分離膜的另一面接觸的步驟。
[0106]根據本實施方式的·膜分選培養器I和使用其的幹細胞分選方法，可以安全且有效地分選幹細胞。
[0107]根據第二實施方式，本發明為具備氣體交換系統和培養基交換系統的膜分選培養器。圖2是本實施方式的膜分選培養器2的概念圖。膜分選培養器2除了上部結構體20和下部結構體23之外，還含有蓋狀結構體24。
[0108]上部結構體20和下部結構體23的基本結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。本實施方式中，下部結構體23進ー步具備培養基導入口 231和培養基送出ロ 232。它們構成培養基交換系統。培養基導入口 231和培養基送出ロ 232是將下部結構體23的容器內部和外部連通的開ロ部。通過該開ロ部，可以將細胞遷移因子和/或含有分選的幹細胞的培養基在下部結構體23和外部之間連通。即，可以從培養基送出ロ 232獲得含有分選的幹細胞的培養基d，可以從培養基導入口 231送入含有細胞遷移因子的新鮮培養基C。因此，培養基導入口 231和培養基送出ロ 232可以與未圖示的管連接。通過這樣的培養基的更換機構，從而具有下述優點:通過能夠適應GMP的非開放體系(密封體系)從而避免細菌或病毒、支原體感染，安全性和效率得到提高。
[0109]另ー方面，蓋狀結構體24裝載於上部結構體20，是覆蓋上部結構體20的開ロ部和下部結構體23的開ロ部的蓋狀結構體。蓋狀結構體優選為與下部結構體23、或與上部結構體20和下部結構體23兩者密合，將膜分選培養器2密閉而隔離外界空氣。為了進行密閉，下部結構體23的側面上端可以具備橡膠或有機矽制的墊片。
[0110]蓋狀結構體24進ー步具備氣體導入口 241和氣體排出ロ 242。它們構成氣體交換系統。氣體導入口 241和氣體排出ロ 242是將蓋狀結構體的內部與外部連通的開ロ部。氣體導入口 241和氣體排出ロ 242可以與未圖示的管連接。例如，可以從氣體導入口 241向膜分選培養器2內部送入C02、N2等惰性氣體a，從氣體排出ロ 242排出含有CO2等的使用完的氣體b。
[0111]蓋狀結構體24中，可以進一歩具備設置有孔尺寸為IOOnm以下、特別為I~lOOnm、優選為10~IOOnm的多個孔的有機矽膜。在蓋狀結構體中，有機矽膜可以以覆蓋氣體導入口 241和氣體排出ロ 242的方式設置。這是為了隔絕來自外部的支原體的侵入路徑。具備這樣的氣體交換系統24具有下述優點:通過能夠適應GMP的非開放體系(密封體系)而使安全性、效率以及存活率提高。
[0112]本實施方式的膜分選培養器還可具備未圖示的溫度調節系統。溫度調節系統由測定經密封的膜分選培養器2的內部的溫度的溫度測定裝置、和從膜分選培養器2的外部對膜分選培養器2進行加熱或冷卻的加熱冷卻裝置構成。通過具備溫度調節系統，例如，對下部結構體23使用溫度敏感性的培養基系統，也可以進行溫度調節管理。
[0113]應予說明，本實施方式中，對具備培養基的更換機構和氣體交換系統24兩者的膜分選培養器2進行了說明，但本發明的膜分選培養器並不限定於此，也可以是具備任ー者的培養器。根據第2實施方式的膜分選培養器2，可以更安全、且以循環方式進行無需特別更換培養基的培養，可以高效地獲得適於組織再生的幹細胞。
[0114]根據第三實施方式，本發明是具備蓋狀結構體的膜分選培養器。圖3是示出本實施方式的膜分選培養器3的構成的概念圖。膜分選培養器3除了上部結構體30和下部結構體33之外，還含有蓋狀結構體34。
[0115]本實施方式中，上部結構體`30是由具有圓形底面的軸狀部和具有開ロ部的圓錐臺形部構成的ー個容器。上部結構體30構成為開ロ部的直徑大於底面的直徑。圓錐臺形部的開ロ部具備由向外側突出的凸緣構成的保持機構35。
[0116]圖示的下部結構體33是具備直徑相同的圓形底面和開ロ部的筒狀構件。開ロ部附近具備溝，溝中保持有密封用的弾性體331。溝可以是一條也可以是兩條。此時使用的密封用的弾性體的材質理想的是如有機矽橡膠等那樣組成明確的合成橡膠等。另外，在圓筒的中央部附近、且在設置有弾性體331的溝和底面之間，具備由從圓筒的內壁面向內側突出的凸緣構成的保持機構335。保持機構335與上部結構體30的保持機構35嚙合，將上部結構體30保持於下部結構體33內部的規定位置。
[0117]上部結構體30和下部結構體33的上述以外的基本結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。
[0118]蓋狀結構體34是可以覆設或密封前述上部結構體30和下部結構體33的構件。蓋狀結構體34隻要可以從上部結構體30的上方覆蓋上部結構體30和下部結構體33的開ロ部即可，其材質為與第一實施方式中說明的下部結構體相同的材質。理想的是蓋狀結構體34中進ー步具備氣體交換機構(未圖示)。作為該氣體交換機構，例如，可以是設置於蓋狀結構體34的整個面或一部分的孔尺寸為IOOnm以下、特別為I~lOOnm、優選為10~IOOnm的多個孔。作為其它例子，可以在蓋狀結構體34的至少一部分設置例如氣體管道濾器用的四氟乙烯(PTFE)層合膜那樣的基於高分子膜的氣體透氣膜。應予說明，蓋狀結構體34可以進ー步具備如第二實施方式中說明所述的氣體導入口和氣體排出ロ。
[0119]蓋狀結構體34與下部結構體33組合時，可以與保存於前述下部結構體33的溝的弾性體331密合。通過該構成，可簡單地實施密封，通過進一歩具備氣體交換功能(未圖示)，則提供不對幹細胞賦予壓カ變化的結構。
[0120]具備本實施方式的這種蓋狀結構體34和下部結構體33具有下述優點:在覆設的情形中降低汙染的危險率，在密封的情形中避免例如支原體等的汙染，還避免溫度變化導致的壓カ變化。
[0121]根據第四實施方式，本發明是具備多個上部結構體而成的膜分選培養器。圖4是不出本實施方式的膜分選培養器4的構成的概念圖。膜分選培養器4含有:多個前述上部結構體40、固定多個前述上部結構體40的框體45、以及下部結構體43，所述下部結構體43由容器構成，該容器共同地保持使多個前述上部結構體40的分離膜浸潰於其中的流體。
[0122]本實施方式中，各上部結構體40的結構可以與第三實施方式相同。多個上部結構體40各自可以具備不同孔尺寸和/或孔密度的分離膜，或者可以全部相同。
[0123]框體45是容納於下部結構體43中的結構體，並且將多個上部結構體40分別支持於各孔451。即，框體45是具備多個孔451的、上下開ロ的構件，所述孔451設置於通過保持機構453保持於距離下部結構體40 —定高度的板狀構件上。格子狀的隔室452將板狀構件上側的區域分割開而形成分隔，一個分隔中存在ー個孔451。框體45的材質可以與第ー實施方式中說明的下部結構體相同。另外，保持機構453是從板狀構件的邊緣向下方延伸的腳狀構件。保持機構453僅在板狀構件的邊緣以外框的形式形成，在與板狀構件上側的隔室452對應的位置，形成有狹縫(slit)。圖4示出了具有24個孔的框體45的結構，框體45的孔數可以是2孔也可以是96孔，孔數並無限定。另外，設置於框體24的板狀構件上的孔的配置也不限於圖示的方式。另外，本實施方式中的保持機構453是從板狀構件向下延伸的腳狀構件，也可以設置從下部結構體的內壁向內側延伸的凸緣而卡於其中。
[0124]能夠將上部結構體40可裝卸地插入框體45的各孔451中。插入上部結構體40時，以構成上部結構體40的底面的分離膜位於孔451與下部結構體43的底面內壁之間的方式，孔451將上部結構體40固定。即，形成為孔451的直徑大於上部結構體40的底面的直徑，且小於開ロ部的直徑。
[0125]下部結構體43是可裝卸地容納框體45的容器。下部結構體43中設置有一條溝。溝中設置有第三實施方式中說明的弾性體431。這是為了與後述的蓋狀結構體44密合，以密閉膜分選培養器4的內部。其它的下部結構體43的結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。另外，下部結構體43還可以具備培養基導入口和培養基送出ロ(未圖示)。圖示的下部結構體具有方形的底面，但下部結構體並不限於方形，也可以為例如圓形或楕圓形。
[0126]蓋狀結構體44從多個上部結構體40的上方覆蓋多個上部結構體40和下部結構體43的開ロ部。蓋狀結構體44的基本結構、材料和功能如第三實施方式中說明所述。應予說明，蓋狀結構體44可以具備第三實施方式中例示的氣體交換機構(未圖示)，也可以進一步具備氣體導入口和氣體排出ロ。
[0127]具備這樣的框體42和下部結構體43具有下述優點:例如在如iPS細胞那樣目標幹細胞的數目少的情形中，可以使用大量的組織細胞作為樣本，且可以用単一的下部結構體進行收集。
[0128]根據第五實施方式，本發明是具備多個上部結構體、和由多個容器構成的下部結構體的膜分選培養器。圖5是不出本實施方式的膜分選培養器5的構成的概念圖。
[0129]膜分選培養器5含有:多個上部結構體50、前述框體55、和下部結構體53，所述下部結構體53由多個容器構成，該多個容器分別單獨地保持使各個前述上部結構體50的分離膜浸潰於其中的流體。
[0130]上部結構體50的基本結構和功能如第四實施方式中說明所述。本實施方式中，多個上部結構體50各自可以具備不同孔尺寸和/或孔密度的分離膜，或者可以全部相同。
[0131]框體55的基本結構和功能如第四實施方式中說明所述，但本實施方式中，框體55的下部的保持機構553上設置有多個狹縫，以避免與下部結構體53的隔室532的幹擾。
[0132]另ー方面，本實施方式的下部結構體53由與前述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。具體地，下部結構體的主體由多個容器構成，該多個容器由被格子狀的隔室532所間隔形成的分隔構成。格子狀的隔室532可以與下部結構體53 —體地形成，也可以是可裝卸於下部結構體53的構件，在使用吋，以由隔室532形成的各容器間的物質無法連通的程度固定於下部結構體中。
[0133]下部結構體53中可以裝載並容納框體55。裝載時，框體52的各孔551與下部結構體53的多個容器的每ー個對應。另外，框體55的隔室552重合於下部結構體53的隔室532之上。進而，可以將多個上述結構體50的各個裝載於框體52的各孔551中。此時，下部結構體53的ー個容器與ー個上述結構體50的組合作為獨立的膜分選培養器發揮功能。所以，可以在被隔室 532所間隔的容器中分別保持使上部結構體50的分離膜浸潰於其中的流體。例如，可以將含有不同的遷移因子和/或培養基的不同種類的流體加入分別的容器，進行膜分尚。
[0134]另外，本實施方式的膜分選培養器5還可以具備未圖示的蓋狀結構體。蓋狀結構體可以具備第三實施方式中例示的氣體交換機構(未圖示)，也可以進ー步具備氣體導入口和氣體排出ロ。圖示的下部結構體53不具有密封用的溝，可以與覆設的蓋狀結構體組合使用。
[0135]通過使用第五實施方式的膜分選培養器5，例如，在對迄今為止沒有分選過的幹細胞進行分選時，配置多種孔尺寸的上部結構體，配置多種含有各種細胞遷移因子的培養基並進行組合，由此具有可以一次性進行分選條件篩選的優點。
[0136]根據第六實施方式，本發明是可以進行傳代培養的封閉體系膜分選培養器。圖22是不出本實施方式的膜分選培養器6的構成的概念圖。
[0137]膜分選培養器6除了上部結構體60、下部結構體63之外，以皿66之外必須的構成。上部結構體60的基本結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。上部結構體60的開ロ部設置有從上部結構體60的上方覆蓋開ロ部的蓋狀結構體64。蓋狀結構體64具備導入口 65。導入口 65是貫穿蓋狀結構體64而設置的優選為有機矽制的管，將上部結構體60構成的容器內部和外部連通。導入口 65主要用於在封閉體系中將切碎的牙髓組織或牙髓樣本細胞插入膜分選培養器6的內部而不受外界汙染。在封閉體系中也可以由導入口65進行培養基更換。上部結構體60所具備的膜62的結構、材料和功能與上述第一實施方式相同。另ー方面，本實施方式中的下部結構體63不存在與側面部一體地固定的底面部，而僅由側面部構成，除此之外，具有與第一實施方式相同的構成。
[0138]皿66是由底面部和側面部構成的可進行細胞培養的容器。皿66設置有培養基的回收ロ 661，可以在封閉體系中進行培養基更換、培養上清的回收或細胞回收，而不受外界汙染。在皿66的底面部、且在朝向容器內側的表面，設置有未圖示的表面處理層。表面處理層具有細胞附著和擴增性優異的特性，並且優選為可以針對熱或光、或針對這兩者發生反應並分解。根據ー個實施方式，表面處理層可以設計為針對特定波長的光照射發生反應、使構成表面處理層的物質發生分解。作為一例，可以形成使聚(N-異丙基丙烯醯胺)接枝聚合於皿66的底面部且面向容器內側的表面而成的表面處理層。該表面處理層在37°C保持疏水性，但通過將溫度降至30°C左右則發生相變而改變為親水性，由此可以使附著於層表面的細胞剝離。根據其它實施方式，表面處理層可以設計為針對特定的溫度變化發生反應，使構成表面處理層的物質發生分解。作為一例，可以形成含有膠原而成的表面處理層。此時，通過將溫度上升至膠原的改性溫度，表面處理層發生分解，可以使附著於層表面的細胞剝離。
[0139]皿66的上部進ー步具備從皿66的上方覆蓋皿66的開ロ部的蓋狀結構體67。蓋狀結構體67構成為將皿66的內部密閉，且即使上部結構體60和下部結構體63的層疊體沿垂直方向移動也會保持密閉狀態。
[0140]本實施方式中，下部結構體63設置為能夠在皿66的內部沿垂直方向移動來使用。圖22 (a)是示出進行膜 分選時的設置方式的概念圖。此時，膜62、下部結構體63的側面部、和皿66的底面部構成封閉的空間，將從上部結構體60遷移的細胞保持於空間的內部。皿66的直徑優選為下部結構體63的直徑的約7~10倍。應予說明，圖6中為了明確地表示各構件而改變比例尺進行了記載。
[0141]下部結構體63可以在垂直方向向上移動，並固定。為了培養基的更換或幹細胞的回收而使下部結構體63移動時的膜分選培養器6的概念圖不於圖22(b)。此時,蓋狀結構體67也可以將皿66密閉。
[0142]接著,從封閉體系培養方法的觀點說明第六實施方式的膜分選培養器6。封閉體系培養方法包括:進行膜分選的步驟、使幹細胞増殖的步驟、將幹細胞傳代的步驟、以及擴增並回收幹細胞的步驟。進行膜分選的步驟中，按照第一實施方式中說明的方法進行幹細胞的膜分選。該步驟中，從上部結構體60遷移至下部結構體63的細胞附著於被下部結構體63的側壁部圍住的皿66的底面。接著，在使幹細胞增殖的步驟中，使上部結構體60和下部結構體的層疊體在垂直方向向上移動，通過培養基的回收ロ 661更換為含10%血清的DMEM等増殖培養基，將遷移因子除去，使上部結構體60和下部結構體的層疊體在垂直方向向下移動，與66的底面部接觸並固定，由此使幹細胞増殖。進而，實施將幹細胞傳代的步驟。此時，使上部結構體60和下部結構體的層疊體在垂直方向向上移動、並固定。接著，通過對表面處理層賦予光或賦予熱、或者降低溫度，而使表面層分解，使増殖的幹細胞剝離。此時，下部結構體63的側壁部和皿66的底面部沒有接觸，因而幹細胞擴散於整個皿66中。接著，在擴增並回收幹細胞的步驟中，經由培養基的回收ロ 661，可以回收傳代幹細胞。此時，可以將離心管與回收ロ 661連接，在封閉體系中進行離心分離，從而回收細胞或培養上清。另外，各步驟中，培養基更換可經由培養基的回收ロ 661進行。
[0143]本實施方式中，通過在皿66設置表面處理層，可以不必將以往通常用於從培養容器剝離細胞的胰蛋白酶等酶用於細胞剝離。該細胞培養上清和細胞由於不含酶，因而可不進行離心洗滌而直接用於移植。
[0144]根據第七實施方式,本發明為膜分選培養試劑盒。膜分選培養試劑盒含有膜分選培養器和細胞遷移因子。作為膜分選培養器，可使用上述第一實施方式至第六實施方式中的膜分選培養器I~6中的任一者、或其變形形式。
[0145]細胞遷移因子優選為選自下述中的至少任ー者:SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-P、NGF、PDGF、BDNF、⑶NF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、SIit、GM-CSF、LIF、HGF、SIP、原兒茶酸、和血清。另外，前述細胞遷移因子的濃度優選為lng/ml~500ng/ml。這是為了高效地使幹細胞遷移。即，這是因為若過於稀薄則有時會沒有遷移效果，若過濃則有時為發生分化。細胞遷移因子可以添加於培養基中使用。所以，本實施方式的試劑盒還可以含有培養基。此時，培養基可以使用Dulbecco’s改良Eagle培養基、EBM2等,但並不限定於此。
[0146]特別優選本實施方式的試劑盒含有作為細胞遷移因子的、優選為50~150ng/ml的濃度的G-CSF或bFGF作為試劑盒的構成構件。另外，除了細胞遷移因子之外，作為添加於培養基中的成分，還可以含有人自體血清或胎牛血清作為試劑盒的構成構件。這些血清構成為以相對於培養基的體積為5~20vol%的濃度進行添加。試劑盒可以按照第一實施方式至第五實施方式中的裝置和方法的說明進行製造、使用。
[0147]根據本實施方式的膜分選培養試劑盒，可以使用用於膜分選培養器和分選的細胞遷移因子，更加快速地實施第一實施方式所詳述的幹細胞分選方法。
[0148]根據第八實施方式，本發明為分離膜。
[0149]本實施方式的分離膜具備基材膜和功能層，所述基材膜由疏水性聚合物構成，所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合於前述基材膜的表面而成的功能層，構成前述功能層的親水性聚合物的重量是前述分離膜總重量的1.5重量％至35重量％。
[0150]由於有可能使膜的孔閉`塞或因水系培養液而發生溶出，因有機溶劑殘存而對細胞造成不良影響，因而本發明中優選進行利用共價鍵合法的膜表面修飾。即，可以將為所期望的孔徑且以高開孔率開ロ的基材膜浸潰於添加有乙烯基吡咯烷酮系聚合物、和/或乙二醇系聚合物、和/或乙烯醇系聚合物、以及根據需要的醇的處理水溶液中後，照射高能射線，由此進行基材膜的表面修飾。
[0151]形成本發明的分離膜的基材膜的聚合物適宜使用疏水性聚合物。本發明中，疏水性聚合物是指相對於20°C的水100g的溶解度小於0.0Olg的聚合物。具體地，疏水性聚合物可以是選自碸系聚合物、醯胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和醯亞胺系聚合物中的聚合物，但並不限定於此。其中，根據這些構成基材膜的疏水性聚合物的吸水率改變表面改性條件，由此可以更有效地賦予蛋白質和細胞的附著抑制性。
[0152]基材膜只要是用於分離2個區域的膜，則不需要開有孔。例如，為了透過物質，可以使用如透析膜那樣開有40至SOnm的孔的膜，為了分離細胞，可以使用開有I至10 y m的孔的膜等，根據使用目的來選擇孔徑。特別地，本發明的分離膜可以適宜地用於利用細胞的趨化性的分離，此時3~8 y m的孔徑容易使用。
[0153]構成這些基材膜的聚合物一般疏水性強，具有大量附著蛋白質和細胞等的傾向。特別是由於活化的蛋白質或血小板、附著性細胞容易附著於膜表面，因而得到的結論是需要均勻地實施一定量以上的表面改性、即親水性聚合物的共價鍵合。
[0154]乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指選自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮こ酸こ烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它們的改性聚合物中的聚合物，乙二醇系聚合物也包括側鏈含酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根據皂化度而獲得各種種類，並無限定。本發明中將這些聚合物表述為親水性聚合物。其中，這些用於膜表面修飾的親水性聚合物優選為水溶性。因此，例如，可以使用數均分子量為I萬至100萬的聚合物，但只要為水溶性則並不限於上述分子量。
[0155]本發明中，水溶性的聚合物是指相對於2 0で的水I OOg的溶解度為I g以上、優選I 0 g以上的聚合物。從蛋白質、血小板或附著性細胞等的附著抑制的觀點出發，優選本發明的分離膜含有這種水溶性聚合物。表面的適度的親水性和疏水性的平衡被認為對於蛋白質或血小板的附著抑制是重要的。實際上，已知親水性更強的水溶性聚合物存在的情形中，蛋白質、血小板或附著性細胞等的附著抑制效果進ー步提高。
[0156]分離膜中所含有的水溶性聚合物的量是分離膜總重量的優選1.5重量％以上、更優選5重量％。另外，含量即使過多效果也不改變，因而優選為40重量％以下、更優選為35重量％。
[0157]進而，親水性聚合物只要是具有水溶性單元和酯基單元的共聚物，則可在I個分子中獲得適度的親水性和疏水性的平衡，因而適宜。因此，作為共聚物，與接枝共聚物相比，更適宜使用嵌段共聚物或交替共聚物、無規共聚物。其原因認為是接枝聚合物中，主鏈上接枝的単元部分與蛋白質等接觸的機會大，因而相比於作為共聚物的特性，接枝鏈部分的特性的影響更大。另外，相比於嵌段共聚物，更優選交替共聚物、無規共聚物。認為這是因為嵌段共聚物中，各個單元的特性明確區別。從I個分子中的親水性和疏水性的平衡的方面出發，適宜使用具有選自無 規共聚物和交替共聚物中的至少ー者的共聚物。含酯基的聚合物中的酯基單元的摩爾比優選為0.3以上且0.7以下。酯基單元的摩爾比若小於0.3，則酯基的附著抑制效果降低。另外，若超過0.7，則水溶性単元的效果降低。
[0158]作為存在於分離膜表面的表面改性聚合物的親水性聚合物的存在量可通過，例如，元素分析或核磁共振(NMR)測定、ESCA和全反射紅外分光法(以下有時記為ATR)的組合來得到。這是因為，ESCA測定表面的直至約IOnm深度的方法，ATR是表面測定，是測定直至數Pm深度的組成的方法。列舉聚碸分離膜為例子時，若將膜中的任意位置的親水性聚合物的存在量相對於聚碸單元的存在量之比作為單元量比，則只要ESCA中所得的単元量比的值比ATR中所得的值大30%以上，則可以使本發明中所述的膜表面的含酯基的聚合物的存在量比膜內部大30%以上。應予說明，各測定的值是3點的平均值。
[0159]接著，從成形體的表面改性方法的觀點出發，對本實施方式進行說明。成形體的表面改性方法具備:將由疏水性聚合物構成的成形體浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物、且含有根據需要的0.01~0.2重量％的醇的處理水溶液中的浸潰步驟；和對由浸潰步驟得到的成形體照射高能射線，將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。該成形體的表面改性方法在成形體為特定基材膜的情形中，也可以說是上述說明的分離膜的製造方法。該方法由於簡便且少量即可實施，因而是適宜的方法。
[0160]這裡所說的由疏水性聚合物構成的成形體並不限於膜，只要是具有特定形狀的成形體即可。在使用膜的情形中，可以是在上述分離膜的構成中作為基材膜進行說明的膜，此時，成形體的表面改性方法成為分離膜的製造方法。
[0161]處理水溶液是用於浸潰由疏水性聚合物構成的成形體的水溶液。處理水溶液中，優選以總濃度計為10~5000ppm、更優選為10~2000ppm的方式含有選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上的親水性聚合物。應予說明，具體的濃度有時根據親水性聚合物的種類而不同。親水性聚合物溶液的濃度若低，則有時無法充分塗布由疏水性聚合物構成的成形體。另外，若濃度過高，例如在成形體為膜時，則將孔閉塞、或溶出物增多、或引起分離膜性能降低的情況多。應予說明，通過如後所述添加醇，可進ー步有效地進行表面改性，因而可將濃度設定更低。
[0162]另外，為了有效地進行表面修飾，優選根據由疏水性聚合物構成的成形體的原材料的吸水率改變處理水溶液的組成。這裡，本發明中，由疏水性聚合物構成的成形體的吸水率是指，將成形體的原材料制為30~lOOym膜厚的膜時，用純水洗滌後，將進行了乾燥的膜在23°C的水中浸潰24小時，測定該過程中的重量増加率。該重量増加率為吸水率。另外，成形體為分離膜時，若為200 以下的膜厚，則可以直接用純水洗滌後乾燥，在23°C的水中浸潰24小時，可以由該過程中的重量増加率算出。
[0163]由疏水性聚合物構成的成形體的吸水率為2%以下時，優選在該處理水溶液中進一歩添加醇。這是因為，通過使醇共存，可以將由疏水性聚合物構成的成形體的表面均勻地被覆。制為添加的醇，若考慮殘留時的安全性，則優選為こ醇，但並不限定於此。例如，也可以使用甘油之類的多元醇。添加的醇的濃度優選為處理水溶液總重量的I重量％以下，為了安全則為0.5重量％以下，進ー步優 選為0.1重量％以下。通過預先使用醇提高吸附效率，可以有效地進行表面改性，即使是使用更低濃度的親水性聚合物也可以實現相同程度的表面改性。即，可以減少親水性聚合物的使用量，對於降低生產時的成本有效。
[0164]另ー方面，由疏水性聚合物構成的成形體的吸水率超過2%時，不必向處理水溶液中加入醇。
[0165]在進行浸潰的步驟中，可以將整個成形體浸潰於處理水溶液中，也可以僅將欲進行表面改性的成形體的一部分浸潰於處理水溶液中。
[0166]作為改性步驟中使用的高能射線，可以使用UV、電子射線、Y射線、X射線。電子射線或Y射線由於容易提高反應率，因而更優選。另外，從殘留毒性少或簡便性的觀點出發，優選使用Y射線或電子射線。照射的射線量優選為5~35kGy，特別是將培養裝置整體用例如相當於被視為滅菌射線量的25kGy的射線量進行照射，由此還可以同時實施表面修飾和滅菌。然而，照射射線量若為IOOkGy以上，則生產率變差，發生聚合物的分解等，故不優選。
[0167]應予說明，已知在照射高能射線時，若存在氧，則會產生氧自由基等，使得由疏水性聚合物構成的成形體分解。所以，理想的是照射放射射線時的成形體周圍的氧濃度為10體積％以下。
[0168]第八實施方式的分離膜具有高的附著抑制性，因而可適宜地用作水處理用分離膜或機體成分分離膜。另外，本實施方式的改性方法不僅可適用於膜，也可適用於各種成形體，可以容易地以高效率實施表面改性。該表面改性方法尤其適於血液浄化用組件。這裡，血液浄化用組件是指具有使血液循環至體外並將血中的廢物和有害物質除去的功能的組件，有人工腎臟或外毒素吸附柱等。
[0169]以下，通過實施例更具體地說明本發明，但本發明並不受以下實施例的任何限定。
[0170]實施例1
[利用TaxiScan比較對牙髓幹細胞的遷移有效的遷移因子]
實時水平趨化性分析使用了狗第4代的牙髓幹細胞⑶31—SP細胞。TAXIScan-FL(Effector Cell Institute,東京)在開有6 y m的孔的有機娃和玻璃板之間形成針對細胞的大小進行了最優化(8 ym)的通道，在通道內的一端注入細胞(IO5細胞/ml) liU。將10ng/ul的各種遷移因子各I U I加入相反側，以形成恆定濃度梯度。根據遷移的視頻圖像，每30分鐘測量一次遷移細胞數直至4小吋。圖6 (a)示出了遷移因子導致的遷移能力差異的時間歷程。對於BDNF，牙髓幹細胞非常迅速地遷移，在2小時達到穩定(plateau)。對於SDF-1和bFGF，遷移也較快地進行。對於^即、￥￡6?、麗?3、6-03?，遷移細胞均是緩慢增加，在4小時後，除了 TOGF、GM-CSF之外，達到基本相同的遷移細胞數。
[0171][由TaxiScan得到的對牙髓幹細胞的遷移有效的遷移因子的濃度]
在TAXIScan-FL的微通道中注入IO5細胞/ml的狗第4代的牙髓幹細胞⑶31_SP細胞Iu 1，在相反側將G-CSF以濃度0、0.l、l、5、10、20、40、100ng/iil各加入I yl，根據遷移的視頻圖像，每30分鐘測量一次遷移細胞數直至I個半小吋。圖6 (b)示出了 G-CSF的濃度差異導致的遷移能力的差異的時間歷程。IOng/Ul的情形中，遷移細胞數最多，隨後以5、40、20、100、1、0.lng/ U I的順序確認到遷移細胞數的減少。
[0172][由TaxiScan得到的對牙髓幹細胞的遷移有效的血清的濃度]
在TAXIScan-FL的微通道注入IO5細胞/ml的人的牙髓幹細胞I U I，在相反側以濃度為0、5、10、15、20%各加入人血清I Ul，根據遷移的視頻圖像，每3小時測量一次遷移細胞數直至24小時。進而，對使用人血清10%和20%、以及100ng/ml的GCSF和SDF-1的情形中的遷移能力進行比較。圖7 (a)示出了血清的濃度差異導致的遷移能力的差異的時間歷程。20%的情形中，遷移細胞數最多，隨後，以15、10、5%的順序確認到遷移細胞數的減少。圖7(b)示出了 G-CSF、SDF-1所致的遷移能力的時間歷程。G-CSF、SDF-1與20%血清相比，遷移細胞數更多。
[0173][牙髓幹細胞的分選] 組裝由底面安裝有包被為細胞非粘附性的插入式細胞培養皿的PET膜(2 X IO5孔/cm2、孔尺寸為3 u m)的、底面直徑6.4mm、開ロ部直徑11.0mm、高度17.5mm的PET制的上部結構體與底面直徑15.0_、開ロ部直徑15.0_、高度22.0mm的聚苯乙烯制的下部結構體構成的膜分選培養器。為了對膜部分賦予細胞附著抑制性，將PET膜表面預先浸潰於在聚乙烯基吡咯烷酮-聚こ酸乙烯酯共聚物(乙烯基吡咯烷酮/こ酸乙烯酯(6/4)共聚物(BASF社制、"Kollidon VA64「))1000ppm水溶液中添加0.1%こ醇而成的水溶液中，進行密封，然後照射Y射線25kGy進行修飾，製成分離膜。在該上部結構體的膜上部接種I X IO5細胞/250 U I的狗新鮮初代牙髓細胞，在下部結構體中於含10%狗血清的Dulbecco’s改良Eagle培養基(DMEM)中加入G-CSF或SDF-1以使最終濃度為100ng/ml。6小時後更換培養基，除去G-CSF，進而在含10%狗血清的DMEM中進行培養。圖8 (a)、(b)和(c)中示出了發生遷移、附著、進而増殖的牙髓幹細胞的相差顯微鏡圖像。在所有遷移因子的情形中，均確認到星狀且具有突起的細胞附著，並與用流式細胞儀分選CD31_SP細胞、CD105 +細胞或CXCR4 +細胞的情形相同地發生増殖。
[0174][分選的牙髓幹細胞的特徵化]
將在膜分選培養器中使用G-CSF和SDF-1進行膜分選得到的上述牙髓幹細胞傳代3代後，是細胞以I X IO6細胞/ml分散於含2%血清的DMEM中，使用各種幹細胞表面抗原標誌物的抗體(CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD150、CXCR4)在 4°C下標記 30 分鐘後，進行流式細胞儀法。即，使用小鼠IgGl陰性對照(AbD Serotec Ltd.)、小鼠IgGl陰性對照(fluorescein isothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec)、小鼠 IgGl陰性對照(Phycoerythrin-Cy5、PE-Cy5) (MCA928C) (AbD Serotec)，小鼠 IgGl 陰性對照(Alexa 647) (MRC 0X_34)(AbD Serotec)、針對下述的抗體:CD29 (PE_Cy5) (MEM-101A)(eBioscience)、CD31 (FITC) (QbendlO) (Dako)、CD34 (Allophycocyanin,APC) (1H6) (R& D Systems, Inc.)、CD44 (Phycoerythrin-Cy7, PE_Cy7) (IM7) (eBioscience), CD73(APC) (AD2) (BioLegend)，CD90 (FITC) (YKIX337.217) (AbD Serotec), ant1-humanCD105 (PE) (43A3) (BioLegend) CD146 (FITC) (sc-18837) (Santa Cruz, Biotech,Santa Cruz，CA，USA)，CD150 (FITC) (A12) (AbD Serotec)、CXCR4 (FITC) (12G5) (R& D)，在4°C下標記90分鐘。作為對照，使用了用流式細胞儀分選得到的狗牙髓⑶105+細胞。
[0175]表1是示出用上述膜分選培養器分選培養得到的牙髓幹細胞的第3代通過流式細胞儀分析的幹 細胞的表面抗原的表達的表。與狗牙髓CD105+細胞相同地，用膜分選培養器分選得到的細胞在使用G-CSF時，⑶105陽性率為95.1%，在使用SDF-1時為89.5%。另外，對於⑶29、⑶44、⑶73、⑶90，兩種級分中均為95%以上，因而可認為含有大量幹細胞前體細胞。另外，對於CXCR4，與用流式細胞儀分選得到的狗牙髓CD105 +細胞相比為一半，進而，⑶31、⑶146大致為陰性。
[0176][表 I]
【權利要求】
1.膜分選培養器，其含有上部結構體和下部結構體， 所述上部結構體由容器構成，該容器的底面的至少一部分用具有幹細胞透過用孔的分離膜形成， 所述下部結構體由容器構成，該容器保持使所述上部結構體的膜浸潰於其中的流體。
2.權利要求1所述的膜分選培養器，其中，所述分離膜具備基材膜和功能層， 所述基材膜由疏水性聚合物構成， 所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合於所述基材膜的表面而成的功能層， 構成所述功能層的親水性聚合物的重量是所述分離膜總重量的1.5重量％至35重量％。
3.權利要求1或2所述的膜分選培養器，其中，所述孔的尺寸是3y m~10 y m，密度是I X IO5 ~4X IO6 孔 /cm2。
4.權利要求1~3中任一項所述的膜分選培養器，其中，具備多個所述上部結構體， 並進一步含有框體，所述框體容納於所述下部結構體中，且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件。
5.權利要求1或2中任一項所述的膜分選培養器，其中，具備多個所述上部結構體， 並進一步含有框體，所述框體容納於所述下部結構體中，且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板·狀構件， 所述下部結構體由與所述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。
6.權利要求4或5所述的膜分選培養器，其中，所述多個上部結構體具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
7.權利要求1~6中任一項所述的膜分選培養器,其中,進一步含有蓋狀結構體,所述蓋狀結構體可覆設或密封所述上部結構體和下部結構體。
8.權利要求7所述的膜分選培養器，其中，所述蓋狀結構體進一步含有氣體交換裝置，所述氣體交換裝置具備氣體導入口和氣體排出口。
9.權利要求7或8所述的膜分選培養器，其中，所述蓋狀結構體的至少一部分是由具有孔尺寸I~IOOnm的孔的膜形成的。
10.權利要求7~9中任一項所述的膜分選培養器，其中，在所述蓋狀結構體和所述下部結構體之間設置有密封用的彈性體。
11.權利要求7~10中任一項所述的膜分選培養器，其中，進一步具備含有溫度測定裝置和溫度調節裝置的溫度調節系統。
12.權利要求1~11中任一項所述的膜分選培養器，其中，所述下部結構體進一步含有具備培養基導入口和培養基送出口的培養基交換系統。
13.膜分選培養試劑盒，其含有權利要求1~12中任一項所述的膜分選培養器、和用於注入所述下部結構體的細胞遷移因子。
14.權利要求13所述的試劑盒，其中，所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF,bFGF、TGF- P、NGF、PDGF, BDNF,⑶NF、EGF、VEGF, SCF、MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF、SIP、原兒茶酸和血清中的一種以上。
15.權利要求13或14所述的試劑盒，其中，所述細胞遷移因子的濃度為lng/ml~500ng/ml。
16.權利要求13所述的試劑盒，其進一步含有用於注入所述下部結構體的血清，所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF。
17.使用權利要求1~12中任一項所述的膜分選培養器的幹細胞分選方法,其包括: 將樣本細胞或樣本組織接種於所述上部結構體的膜的步驟、 將含有細胞遷移因子的培養基填充於所述下部結構體的容器的步驟、和 使所述上部結構體的膜與所述下部結構體中的培養基接觸的步驟。
18.權利要求17所述的方法，其中，所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF- P、NGF、PDGF, BDNF,⑶NF、EGF、VEGF, SCF、MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF、SIP、原兒茶酸和血清中的一種以上。
19.權利要求17或18所述的方法，其中，所述細胞遷移因子的濃度為lng/ml~500ng/ml o
20.權利要求17~19中任一項所述的方法，其中，將所述樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3X102細胞~3X IO4細胞進行接種。
21.權利要求17所 述的幹細胞分選方法，其中，所述幹細胞為牙髓幹細胞，所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml，將所述樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3X IO2~1.5X IO3細胞進行接種，或將所述樣本組織以相對於分離膜Imm2為0.1mg~Img進行靜置，在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對於該培養基的體積為5~20vol%的血清。
22.權利要求17所述的幹細胞分選方法，其中，所述幹細胞為骨髄幹細胞或脂肪幹細胞，所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml，將所述樣本細胞以相對於分離膜Imm2為3X IO2~1.5X IO3細胞進行接種，或將所述樣本組織以相對於分離膜Imm2為0.1mg~Img進行靜置，在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對於該培養基的體積為5~20vol%的血清。
23.分離膜，其具備基材膜和功能層，所述基材膜由疏水性聚合物構成， 所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合於所述基材膜的表面而成的功能層， 構成所述功能層的親水性聚合物的重量是所述分離膜總重量的1.5重量％至35重量％。
24.權利要求23所述的分離膜，其中，所述基材膜具有I~10的孔，並用於細胞分離。
25.權利要求23或24所述的分離膜，其中，所述疏水性聚合物選自碸系聚合物、醯胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和醯亞胺系聚合物中。
26.權利要求23~25中任一項所述的分離膜，其用於對細胞進行透過分離。
27.權利要求23~26中任一項所述的分離膜的製造方法，其具備:將吸水率為2%以下的由疏水性聚合物構成的基材膜浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的處理水溶液中的浸潰步驟、和對所述基材膜照射高能射線，將膜表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
28.權利要求23~26中任一項所述的分離膜的製造方法，其具備:將含水率超過2%的由疏水性聚合物構成的基材膜浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯燒酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物的水溶液中的浸潰步驟、和 對所述基材膜照射高能射線，將膜表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
29.權利要求27或28所述的改性方法，其中，所述疏水性聚合物選自碸系聚合物、醯胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和醯亞胺系聚合物中。
30.成形體的表面改性方法，其具備:將吸水率為2%以下的成形體浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的處理水溶液中的浸潰步驟、和 對所述成形體照射高能射線，將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
31.成形體的表面改性方法，其具備:將吸水率超過2%的成形體浸潰於含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I種以上親水性聚合物的水溶液中的浸潰步驟、和 對所述成形體照射高能射線，將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
32.使用權利要求30或32的改性方法，製造權利要求23~26中任一項所述的分離膜的方法。`
【文檔編號】C12N15/09GK103597068SQ201280016688
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月30日 優先權日:2011年3月30日
【發明者】中島美砂子, 庵原耕一郎, 山田和正, 島垣昌明, 長部真博 申請人:獨立行政法人國立長壽醫療研究中心, 東麗株式會社