半夏人工種莖的生產方法
2023-12-08 13:00:01 2
專利名稱：半夏人工種莖的生產方法
技術領域：
本發明屬於植物組織培養技術領域。具體涉及一種半夏人工成熟種莖的離體快速繁殖方法。
背景技術：
半夏(屍z'恥"/" ^""加e.(Thunb.)BreiO，屬天南星科植物，草本，株高15-30cm。幼苗常為單葉， 卵狀心形，2-3年後生3小葉的複葉，葉片全緣；葉柄長10-25cm,基部有珠芽。花單性同株，花序柄長 於葉柄，佛焰苞綠色，下部細管狀雌花生於花絮基部，雄花生於上端，肉穗花序下部雌花序與佛焰苞合 生達隔膜，單側著花，雄花序位於隔膜之上，頂部具延長、線形的附屬體，超出佛焰苞很長；漿果長圓狀 卵形，綠色。花期5-7月，果期8-9月。半夏野生資源主要分布在東北、華北及長江流域，主產四川、湖 北、貴州、河南、安徽、山東、浙江等省，適生於中等偏酸性沙質壤土和海拔2500tn以下的陰生環境，不 耐乾旱、喜弱光怕強光、喜溫，塊莖珠芽膨大期地溫以18 2(TC最為適宜。由此看來，野生半夏分布面積 和生長的適宜環境較有限，生長期短，生物量小，但市場需求量大，半夏屬於緊缺而極其珍貴的藥用植物。
半夏以塊莖入藥，性味辛、溫，有毒。能燥溼化痰，降逆止嘔，消痞散結。治溼痰冷飲，嘔吐，反胃， 咳喘痰多，胸膈脹滿，頭暈不眠，外消痛腫。由於半夏有性繁殖係數低，主要靠塊莖進行無性繁殖，因些 土傳病害如病毒病和根腐病等極易發生，導致產量低下、品質退化，由於其自然繁殖係數低、產量又不高， 規模化種植受到種源供給不足的影響，加之對野生資源的亂採濫挖，已使半夏野生資源瀕臨枯竭。
目前，在實驗室條件下，已經有通過組培快速繁殖半夏苗，並移栽大田成活的成熟技術(張振媛，荊 半夏不同品系的組織培養技術研究，2008碩士論文；郝會軍等，半夏組培苗煉苗技術研究，安徽農業科學 2008, 36 (5): 1918-1919和2018),但此法需要進行生根、煉苗、移栽等多步程序，獲得半夏塊莖的周 期長，生長慢。本發明，為解決這一不足，通過組培技術，改變外植體的誘導發育、生長途徑，通過添加 相應的生長調節物質，引導生長發育途徑由器官發生途徑轉向胚狀體發生途徑，直接通過離體培養獲得大 量成熟的半夏人工種莖，用於播種進一步生長膨大，來收穫並提高半夏產量。
發明內容
本發明的目的是提供半夏人工種莖生產技術，大量繁殖半夏離體成熟的種莖，作為播種繁殖材料。克 服半夏組培苗在生產應用上的需要生根練苗移栽、不耐儲藏和運輸等缺點，緩解市場種源緊缺。 本發明是這樣實il的，一種半夏的人工種莖生產方法，其步驟如下
(l)無菌苗培養:將野生半夏植株的幼嫩葉片或葉柄滅菌後，將葉片切成0.5-1.0cm2,葉柄切成0.8-lcm
長，接種到無菌苗培養基上，該無菌苗培養基組分及配比為MS基本培養基+ 0.2mg/L萘乙酸(NAA) +
0.5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)十活性炭(AC)0-3.0g/L,蔗糖30g/L，瓊月旨6-8g/L，調pH至5.8-6.0,培養基的
滅菌採ffl常規方法，即121-126。C下溼熱蒸汽滅菌30min,備用'下同。接種後的培養是在2000ux光下培
養，12h/d,培養溫度27士rC，得到脫毒無菌苗；(2) 胚狀體誘導將步驟(1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-1.0cm2,葉柄切成0.8-lcm，接到 胚狀體誘導培養基上，所述的胚狀體誘導培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+ 0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.1 mg/L吲哚乙酸((IAA) + 0.1-0.2 mg/L脫落酸(ABA) +30g/L聚乙二醇(PEG), 蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L,調pH辛.5.8-6.0，或MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5 mg/L6-節基氨基嘌 呤，蔗糖30g/L，瓊月旨6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在20001ux光下培養，12h/d，培養溫度27土rC，獲得半 夏胚狀體(見圖1-2);
(3) 種莖誘導將未產生新芽之前的半夏胚狀體，轉移至誘導培養基上，使其胚狀體增殖並發育形成 幼小種莖，所述的種莖誘導培養基的組分及配比為MS基本培養基+ 0.1 mg/L萘乙酸+3.0g/L活性炭 +15^聚乙二醇，蔗糖30g/L,瓊脂6-8g/L,調pH至5.8-6.0，在20001ux光下培養，12h/d，培養溫度27 ±rc,得到半夏幼小種莖(見圖3);
(4) 種莖成熟培養將步驟(3)得到的半夏幼小種莖轉移至種莖成熟培養基上，使其培養至成熟， 所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+ 0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤 +0.2-1.0mg/L脫落酸或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，瓊S旨6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在20001ux光 下培養，12h/d，培養溫度27士TC，使成熟種莖直徑達到3mm以上。在本發明中判定半夏成熟種莖的標 準是半夏種莖上端中間有芽點，直徑大小為3mm以上，種莖的外觀顏色為深綠色或略帶褐色(見圖5-6)。
作為優選方案之一，其中步驟(4)中所述的種莖成熟培養基組分及配比可以設計為MS基本培養基
+0.2 mg/L萘乙酸十0.5 mg/L6-節基氨基嘌呤+.3-0.9mg/L脫落酸，蔗糖30g/L,瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0。
也可以設計為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28-40g/L聚乙二醇，蔗糖
50g/L，瓊月旨6-8g/L,調pH至5.8-6.0。
本發明將成熟分離的半夏人工種莖直接播種於基質上(一般為通用的蛭石，商購)，置於半陰生長環 境條件，溫度13 3CTC,萌發成苗率可達卯％。
本發明的效果
1. 平夏生育期短，鮮嫩外植體獲取受時間限制，本發明以獲得健壯的脫毒無菌苗為外植體，備用，
接種，可隨時取材而不受生長季節變化的限制；
2. 半夏組培快繁殖獲得的組培苗移栽前需要進行生根、煉苗等多步程序，獲得半夏塊莖的周期長， 生長慢，本發明的這種半夏人工種莖培養至成熟僅需60-80天，生命力與抗逆性強，含水量降至 65-75%時即可耐貯藏，不需要經這特殊馴化就可以直接用於播種，適合工廠規模化常年生產。
3. 本發明所獲得的半夏人工種莖單粒直徑更大(見圖7)，發育更成熟'萌發率高。
4. 本發明克服了自然條件下半夏有性繁殖係數低、繁殖周期長、品質易退化、組培苗移栽程序麻煩、 離體塊莖不成熟易感病、難萌發等缺點，為工廠化快速生產半夏人工種莖提供了實用技術，可緩 解市場種源的緊缺現狀。
圖1:是本發明誘導的半夏胚狀體I ;圖2:是本發明誘導的半夏胚狀體II;
圖3:是半夏胚狀體增殖並發育形成小種莖；
圖4:是半夏小種莖逐漸成熟；
圖5:是成熟的半夏人工種莖I ;
圖6:是成熟的半夏人工種莖II;
圖7:是成熟的半夏人工種莖單粒直徑次數分布；
具體實施例方式
實施例1
一種半夏的人工種莖生產方法，其步驟如下
(1) 無菌苗培養將湖南桂東縣野生半夏植株的幼嫩葉片或葉柄滅菌後，將葉片切成0.5-l.Ocm2，葉 柄切成0.8-lcm長，接種到無菌苗培養基上，該無菌苗培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘 乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤+活性炭1.0-3.0g/L，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，培養基的滅 菌採用常規方法，即121-126'C下溼熱蒸汽滅菌30min，備用，下同。接種後的培養是在20001ux光下培養， 12h/d，培養溫度27土rc，得到脫毒無菌苗；
(2) 胚狀體誘導將步驟(1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-l.Ocm2，葉柄切成0.8-lcm，接種 到胚狀體誘導培養基上，所述的胚狀體誘導培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.05-0.1mg/L吲哚乙酸+ 0.1-0.2 mg/L脫落酸+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L,瓊脂 6隱8g/L,調pH至5.8-6.0，在2000lux光下培養，12h/d，培養溫度27土rC,獲得半夏胚狀體，其胚狀體外 觀曾綠色球形狀(見圖1);
(3) 種莖誘導將未產生新芽之前的半夏胚狀體，轉移至誘導培養基上，使其胚狀體增殖並發育形成 幼小種莖，所述的種莖誘導培養基的組分及配比為MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨 基嘌呤+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L,瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在20001ux光下培養，12h/d，培養 溫度27士rC，得到半夏幼小種莖(見圖3);
(4)種莖成熟培養將步驟(3)得到的半夏幼小種莖轉移至種莖成熟培養基上，使其培養至成熟， 所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+ 0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤 十0.2mg/L脫落酸，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L,調pH至5.8-6.0，在20001ux光下培養，12h/d,培養溫度27 士rC，使成熟種莖直徑達到3mm以上。成熟種莖的判定標準半夏種莖的頂端中心有莖痕，直徑大小為 3mm以上，種莖的外觀顏色為深綠色或略帶褐色。 實施例2
根據實施例1所述的基本步驟，其中
5步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤+30g/L聚乙二醇，其他相同。 實施例3
根據實施例1所述的基本步驟，其中
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤+50g/L聚乙二醇，其他成分及條件同實施例1。 實施例4
根據實施例1所述的基本步驟，其中
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤+28g/L聚乙二醇，其他成分及條件同實施例1。 實施例5
根據實施例1所述的基本步驟，其中
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤+0.3mg/L脫落酸，其他成分及條件同實施例1。 實施例6
根據實施例1所述的基本步驟，其中
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤++0.9111§^脫落酸，其他成分及條件同實施例1。 實施例7
根據實施例1所述的基本步驟，其中 '
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤++01.0111^脫落酸，其他成分及條件同實施例1。 實施例8
根據實施例1所述的基本步驟，其中
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-節基 氨基嘌呤+40g/L聚乙二醇，其他成分及條件同實施例1。
實施例9
根據實施例1所述的基本歩驟，其中
步驟(1)所述的無菌苗培養中，其外植體材料選取中國湖北省荊州地區野生半夏植株，所述的無菌 苗培養基組分及配比為MS基本培養基+ 0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤，其他成分及培養條件 同實施例1。
步驟(2)所述的胚狀體誘導中，所述的胚狀體誘導培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，誘導獲得胚狀體(見圖2)，其他成分及條件同實施例1 。
步驟(3)所述的種莖誘導中，所述的種莖誘導培養基的組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘
乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.5-1.0mg/L脫落酸，其他成分及培養條件同實施例1。
步驟(4)的成熟種莖培養中，所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+1.0mg/L6-苄
基氨基嘌呤+50g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，培養獲得成熟人工種莖(見圖5)，其他成分及培養條件同實施例1。
實施例10
根據實施例3所述的基本步驟，其中
步驟(2)所述的胚狀體誘導培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5 mg/L6-苄 基氨基嘌呤+0.1mg/L吲哚乙酸+0.2mg/L脫落酸+15g/L聚乙二醇，其他成分及培養條件同實施例1。
步驟(4)所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基 氨基嘌呤+0.8mg/L脫落酸，蔗糖30g/L，培養獲得成熟半夏人工種莖(見圖6)，其他成分及培養條件同實 施例1。
本發明的實施效果見表1和2所示
表1半夏胚狀體誘導培養基配比篩選的正交試驗(L934)
處理IAA (A)ABA (B)AC (C)PEG (D)湖北半夏的誘湖南半夏誘導率
組導率
1000077.50%78.57%
20O.lmg/L2.0g/L15.0g/L45,00%5.00%
300,2mg/L3.0g/L30,0g/L32.50%17.50%
40.05mg/L02.0g/L30.0g/L70.00%32.50%
50.05mg/LO.lmg/L3.0g/L031.25%12.50%
60.05mg/L0.2mg/L015.0g/L94.44%60,00%
70.1 mg/L03.0g/L15.0g/L32.50%35.00%
80.1 mg/LO.lmg/L030.0g/L90.00o/o100.00%
9O.lmg/L0,2mg/L2.0g/L040.63%23.33%
表2半夏胚狀體誘導培養基配比篩選的正交試驗結果分析(L934)
處理 IAA (A)ABA (B)AC (C)PEG (D)最優組合
Kl155,00180.00261.94149.38
K2195.69166.25155.63171.94
K3163.13167.5796.25192.5A2B1C1D3
R13.56334.583355.230014.3733C>D>A>B
Kl，101.07146.07238,57114.40
K2，105.00117.5060.83100.00
K3,158,33100.8365.00150.00A3B1C1D3
R,19.086715,080059.246716,6667C>A>D>B
權利要求
1、一種半夏的人工種莖生產方法，其特徵在於以下步驟(1)無菌苗培養將野生半夏植株的幼嫩葉片或葉柄滅菌後，將葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1cm長，接種到無菌苗培養基上，該無菌苗培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在2000lux光下培養，12h/d，培養溫度27±1℃，得到脫毒無菌苗；(2)胚狀體誘導將步驟(1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-1.0cm2，或將葉柄切成0.8-1cm長的莖段，接種到所述的胚狀體誘導培養基上，所述的胚狀體誘導培養基組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05-0.1mg/L吲哚乙酸+0.1-0.2mg/L脫落酸+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，或MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在2000lux光下培養，12h/d，培養溫度27±1℃，獲得半夏胚狀體；(3)種莖誘導將未產生新芽之前的半夏胚狀體，轉移至誘導培養基上，使其胚狀體增殖並發育形成幼小種莖，所述的種莖誘導培養基的組分及配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+15g/L聚乙二醇，調pH至5.8-6.0，或者MS基本培養基+0.1mg/L萘乙酸+3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在2000lux光下培養，12h/d，培養溫度27±1℃，得到半夏幼小種莖；(4)種莖成熟培養將步驟(3)得到的半夏幼小種莖轉移至種莖成熟培養基上，使其培養至成熟，所述的種莖成熟培養基組分及其配比為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2-1.0mg/L脫落酸，蔗糖30g/L，調pH至5.8-6.0，或MS基本培養基+1.0mg/L6-苄基氨基嘌呤+30-50g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0，在2000lux光下培養，12h/d，培養溫度27±1℃，使成熟種莖直徑達到3mm以上。
2、 根據權利要求1所述的生產方法，其特徵在於，步驟(4)中所述的種莖成熟培養基組分及配比 為MS基本培養基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.3-0.9mg/L脫落酸，蔗糖30g/L,瓊 脂6-8g/L，調pH至5.8-6.0。
3、 根據權利要求1所述的生產方法，其特徵在於，步驟(4)中所述的種莖成熟培養基組分及配比 為MS基本培養基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28-40g/L聚乙二醇'蔗糖50g/L'瓊 月旨6國8g/L，調pH至5.8-6.0。
全文摘要
本發明屬於植物組織培養技術領域，具體涉及半夏人工種莖生產方法。該方法包括半夏外植體的選擇與消毒，胚狀體的誘導與增殖，誘導人工種莖的形成、生長與成熟等步驟。本發明提出了半夏從野生植株到人工種莖生產的相應程序，不同階段所需要專用培養基等關鍵技術，能規模化培育生產出成熟的半夏人工種莖，其萌發率可達90％。本發明克服了自然條件下半夏有性繁殖係數低、繁殖周期長、品質易退化、組培苗移栽程序麻煩、離體塊莖不成熟難萌發等缺點，為工廠化快速生產半夏人工種莖提供了實用技術，可緩解市場種源的緊缺現狀。
文檔編號A01H4/00GK101491214SQ20091006106
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月11日 優先權日2009年3月11日
發明者葉雙鳳, 沫 王 申請人:華中農業大學