Trail受體結合劑和其用途的製作方法

2023-11-08 09:28:52

專利名稱：：Trail受體結合劑和其用途的製作方法TRAIL受體結合劑和其用途發明領域本發明一般涉及TRAIL受體結合劑的製備和其用途。特別地，本發明涉及抗TRAIL受體抗體的製備，所述抗體識別TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同抗原決定簇(即，表位)，以及它們用於TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導的功能的調節的用途。
背景技術：
：TRAIL在上世紀90年代被鑑定。在TRAIL被發現後不久，人們注意到了它作為抗癌劑用於癌症治療的潛力。這是基於TRAIL選擇性地殺死腫瘤細胞而不殺死正常細胞的能力。重要地，TRAIL的抗腫瘤效力可以通過許多當前的癌症療法(例如，化療和放射治療)來顯著地增強。另一方面，TRAIL可以致敏腫瘤細胞並提高腫瘤細胞對化療和放射治療的敏感性。因此，TRAIL與化療和放射治療的組合已經被認為是將來非常有效的抗腫瘤治療方法。TRAIL是TNF蛋白質家族的成員。這個家族的一些蛋白質的特徵是它們誘導細胞凋亡的能力，例如TNF-a和Fas配體。然而，由於它們的有毒副作用，TNF-a和Fas配體沒有臨床應用的價值。相比之下，TRAIL展現對肺瘤細胞的選擇性殺傷，它的臨床價值是明顯的。迄今為止，已經鑑定了TRAIL的五種受體，其中的兩種DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)能夠轉導細胞凋亡信號，而其他三種DcRl(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和護骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)不轉導細胞凋亡信號。TRAIL的所有五種受體在它們的細胞外配體結合結構域中有顯著的同源性。DR4和DR5的細胞內片段含有保守的功能結構域，即所謂的"死亡結構域"，其負責轉導細胞凋亡信號。在幾年的研究之後，TRAIL的主要生物學功能已經是公知的。TRAIL在對肺瘤細胞的免疫監督中起到重要作用。活化的T淋巴細胞和NK細胞表達高水平的TRAIL,其為這些免疫活性細胞提供殺死腫瘤細胞的手段。動物研究表明，TRAIL的敲除導致腫瘤發生率隨年齡提高。因此，TRAIL的缺陷或不充分的表達可能是腫瘤發生的關鍵因素。由於TRAIL的細胞凋亡誘導功能是由它的受體介導的，對TRAIL受體系統已經進行了大量的研究。早期研究提示許多正常細胞可以在轉錄水平上表達TRAIL的死亡受體(TRAIL-R1和TRAIL-R2)。隨著抗死亡受體抗體的獲得，已經相信的是，正常細胞和組織表達非常低水平的細胞表面TRAIL-R1和TRAIL-R2。相比之下，正常細胞和組織可能表達高水平的TRAIL-R3和TRAIL-R4。在正常細胞中不同的TRAIL受體的這種差異表達可能是正常細胞逃脫TRAIL殺傷的關鍵保護性機制。不同於正常細胞，大多數轉化的腫瘤細胞表達高水平的TRAIL-R1和TRAIL-R2，而TRAIL-R3和TRAIL-R4的表達水平是非常低的。因而，大多數腫瘤細胞對TRAIL介導的殺傷是敏感的。在正常細胞和腫瘤細胞之間TRAIL受體的差異表達很好地解釋了TRAIL的選4奪性。許多前臨床研究確認了TRAIL是用於癌症治療的安全的和有效的治療劑。已經顯示的是，三聚化的可溶TRAIL的全身性施用在實驗動物中不產生毒性，又能夠誘導植入的腫瘤的退化。更加鼓舞人心的是，當TRAIL與化療或放射治療組合時，它的抗腫瘤效力被顯著地增強。這種協同效應已經通過許多體外和體內實驗展現。此外，TRAIL可以提高腫瘤細胞對化療和放射治療的敏感性。由於腫瘤細胞對化療和放射治療的抗性是癌症治療中的主要障礙，TRAIL阻止或逆轉化學或輻射抗性的能力可能是將來的癌症治療中顯著的進步。然而，作為治療劑，TRAIL具有幾個缺點。首先，TRAIL具有至少五種受體，包括兩種死亡受體和誘辨受體，因而缺乏對受體的選擇性。特別地，當癌細胞表達不同的死亡受體和誘何受體時，難以預測TRAIL的細胞凋亡誘導能力。第二，重組TRAIL具有非常短的體內半衰期，其限制了TRAIL的體內有效劑量和抗癌效力。患者經常地接受重複的和大劑量的TRAIL是不方便的。第三，人們擔心重組TRAIL的某些形式具有潛在的肝細月包毒性。TRAIL作為治療劑的這些局限性導致了對TRAIL的替代物的開發。單克隆抗體可以選擇性地靶向TRAIL的死亡受體，其可能是癌症治療的更有效和安全的策略。自產生第一個單克隆抗體以來的25年間，單克隆抗體已經在癌症治療中展現了很大的影響。大多數那些臨床上有效的單克隆抗體靶向在癌細胞表面高度表達的抗原或受體，並阻斷腫瘤生長所需的生長信號。這些抗體通過活化補體和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來殺死腫瘤細胞。此外，當與放射性同位素、毒素或藥物綴合時，單克隆抗體可以用作追蹤分子，將這些治療劑帶往癌症組織並增強抗癌效力。已經成功地生產了TRAIL-R1或TRAIL-R2特異性單克隆抗體來替換TRAIL用於癌症治療。幾種這樣的抗體已經進入臨床試驗。初步的結果顯示這些抗體不僅具有強的抗癌效力，與TRAIL相比也是安全的。曰本醫藥公司Sankyo首先開發了一種抗TRAIL-R2抗體，TRA-8。Ichikawa等人使用了TRAIL-R2-Fc融合蛋白作為免疫原來免疫Balb/c小鼠。雖然TRA-8不誘導正常細胞的細胞凋亡，許多腫瘤細胞對於TRA-8誘導的細胞凋亡是高度敏感的。雖然TRAIL-R2的mRNA廣泛地分布在正常的組織中，TRAIL-R2蛋白質卻在正常的組織包括肝、肺、乳腺、腎臟、脾臟、卵巢、耳和胰腺中檢測不到。然而，這些組織中的癌細胞則表達高水平的TRAIL-R2蛋白質。此外，正常的膠質細胞和外周血細胞表達極低水平的TRAIL-R2,對於TRA-8誘導的細胞凋亡不是敏感的，而膠質瘤細胞和白血病細胞的水平表達高，並且對TRA-8誘導的細胞凋亡非常敏感。在誘導腫瘤細胞的細胞凋亡方面，TRA-8也展現了比TRAIL更高几倍的細胞凋亡誘導能力。重要地，TRA-8不誘導正常肝細胞的細胞凋亡。當與化療或it射治療組合時，TRA-8的抗癌效力被顯著地增強。TRA-8當前處於I期臨床試驗中。人類基因組科學(HumanGenomeSciences)進行了抗TRAIL-R1抗體的I期試驗。初步數據表明，患者良好地耐受，在幾個患者中觀察到陽性應答，表明抗TRAIL-R1是安全和有效的治療劑。能夠誘導腫瘤細胞的細胞凋亡的許多抗體對於TRAIL-R1或TRAIL-R2是特異性的。還才艮道了針對TRAIL-R1和TRAIL-R2的雙特異性抗體。(Lynch,US2002/0155109)由於腫瘤細胞可能選擇性地表達死亡受體的僅一種類型，因而，這些抗體具有有限的譜(spectrum),不能耙向所有的腫瘤細胞。同時，由於癌細胞可能差異表達兩種類型的受體並具有優選的信號轉導，這些抗體的殺傷活性變化很大。因而，本領域需要使用其他的抗TRAIL受體抗體用於TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導的功能的調節。發明概述本發明涉及識別TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同抗原決定簇(即表位)的TRAIL受體結合劑(例如抗體)的製備，以及它們用於TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導的功能的調節的用途。在一個方面，本發明提供了結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，其中處於其可溶形式的所述TRAIL受體結合劑(例如，抗體)在低濃度下在表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞中具有體內和體外的細胞死亡誘導活性。在一個實施方式中，所述TRAIL受體結合劑(例如，抗體)結合在至少一個細胞的表面表達的多肽TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)。在一個實施方式中，所述TRAIL受體結合劑(例如，抗體)結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間具有至少約百分之九十的胺基酸同源性的多肽區域。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)結合的胺基酸同源性的區域包含胺基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44)，其中X是K或G，並且能夠誘導具有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體的細胞的細胞死亡。在另一個方面，本發明提供了具有與CGMCC登錄號1665的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003所產生的相同的表位特異性的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)。在另一個方面，本發明提供了TRAIL受體結合劑(例如，抗體)或其抗原結合片段，至少包含HITMVVGPFA(SEQIDNO:11)的重鏈CDR3胺基酸序列或具有一個或多個保守性胺基酸替換的所述序列，其中所述TRAIL受體結合劑(例如，抗體)或其片段結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2),並且在表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞中具有體內和體外的細胞死亡誘導活性。在某些實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)(或其抗原結合片段)綴合於癌症治療劑，其中所述治療劑優選地選自由胂瘤活化前體藥物(tumor-activatedprodrug)、放射性核素、化療藥物和毒素構成的在另一個方面，本發明提供了編碼本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)的分離的核酸。在另一個方面，本發明提供了包含編碼本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)的分離的核酸的宿主細胞或載體。在另一個方面，本發明提供了包含本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)和藥學上可接受的載體的組合物。在另一個方面，本發明提供了用於治療癌症的商業試劑盒，其包含處在容器中的本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，所述商業試劑盒進一步包含用於治療癌症的化療劑和/或癌症治療性TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，其中所述化療劑和/或癌症治療性TRAIL受體結合劑(例如，抗體)任選地被置入分別(separate)的容器中。在另一個方面，本發明提供了TRAIL-R1和TRAIL-R2的表位，包含胺基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44)，其中X是K或G,所述表位被能夠結合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2並且能夠誘導具有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體的細胞的細胞死亡的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)所識別。在一個實施方式中，本發明提供了通過製備含有TRAIL-R1和TRAIL-R2的表位的免疫原而產生的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，所述免疫原包含胺基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44),其中X是K或G，且所述表位被能夠結合TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2並能夠誘導具有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體的細胞的細胞死亡的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)所識別。在另一個方面，本發明提供了本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)在製備用於在表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞中選擇性誘導細月包死亡的藥物中的用途。在另一個方面，本發明提供了本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)在製備用於在表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞中增強其他化療劑的抗癌活性的藥物的用途，其中所述治療劑是化療劑，其中所述治療劑選自由博來黴素、卡鉑、苯丁酸氦芥、順鉑、秋水仙鹼、環磷醯胺、柔紅黴素、放線菌素、己烯雌酚、阿黴素(doxoribicin)、鬼臼乙叉武、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、美法侖、氨曱蝶呤、絲裂黴素C、巰嘌呤、紫杉醇、鬼臼口塞吩戒、6-硫代烏噪呤、長春新鹼和長春鹼構成的組。在另一個方面，本發明提供了藥學有效量的本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)在製備用於治療癌症的藥物中的用途，其中藥學有效量的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)選擇性地誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的癌細胞的細胞死亡。在另一個方面，本發明提供了藥學有效量的本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)作為藥物的用途。在另一個方面，本發明提供了在有需要的受試者中選擇性地誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的細胞的細胞死亡的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，從而選擇性地誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的細胞的細胞死亡。在所述方法的一個實施方式中，表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的細胞是癌細胞。在所述方法的一個實施方式中，所述癌細胞選自由乳腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞和結腸直腸癌細胞構成的組。附圖簡要說明附圖例示而不是限制性地描繪了優選的實施方式。圖1.顯示來自雜交瘤CGMCC1665的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區的核苷酸和胺基酸序列的示意圖。畫面A顯示了CTB003Vk核苷酸和胺基酸序列。畫面B顯示了CTB003VH核苷酸和胺基酸序列。CDR序列加有下劃線。圖2.顯示CTB003的特徵的圖。含有人類TRAIL-R1和TRAIL-R2的細胞外結構域的異二聚形式的重組人類IgGl-Fc融合蛋白，或含有TRAIL1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4的同二聚形式的重組人類IgGl-Fc融合蛋白被固定在ELISA平板上，與各種濃度的CTB003溫育。在與HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl反應之後，添加TMB底物來進行顯色反應。通過CTB003與每種蛋白質的OD值來測定結合能力。數據表示為OD450/650作為CTB003濃度(ng/ml)的函數。圖3.顯示在人類癌細胞的細胞凋亡誘導中CTB003的劑量應答關係的圖。人類癌細胞系的圖面圖面A.乳腺癌；圖面B.結腸癌；圖面C.胰腺癌；圖面D.卵巢癌；圖面E.前列腺癌；以及圖面F.肺癌與各種的濃度的CTB003溫育過夜。利用培養基對照作為100%細胞活力，通過ATPLite分析測定細胞活力。圖4.顯示在癌細胞的細胞凋亡誘導中CTB003的時間依賴性應答的圖。人類乳腺癌細胞(MDA231)和結腸癌細胞(Colo205)與1000ng/ml的CTB003溫育標明的時間點，通過ATPLite分析測定細胞活力。數據表示為細胞活力(％)作為溫育時間(小時)的函數。圖5.顯示CTB003和阿黴素協同誘導癌細胞死亡的圖。人類乳腺癌細胞系(BT474)在存在或不存在各種濃度的阿黴素的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細胞活力(％)的柱形圖。圖6.顯示CTB003和紫杉醇(Taxol)協同誘導癌細胞死亡的圖。將人類結腸癌細胞系(SW620)在存在或不存在各種濃度的紫杉醇的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細胞活力(％)的柱形圖。圖7.顯示CTB003和順鉑協同誘導癌細胞死亡的圖。將人類肺癌細胞系(A437)在存在或不存在各種濃度的順式鉑氨的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細胞活力(％)的柱形圖。圖8.顯示CTB003和CTP-ll協同誘導癌細胞死亡的圖。將人類結腸癌細胞系(SW1116)在存在或不存在各種濃度的CTP-ll的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細胞活力(％)的柱形圖。圖9.顯示CTB003和吉西他濱(Gemcitabine)協同誘導癌細胞死亡的圖。將人類胰腺癌細胞系(PANC1)在存在或不存在各種濃度的吉西他濱的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察的細胞活力(％)的柱形圖。圖10.顯示CTB003和抗TRAIL-R1(CTB007)協同i秀導癌細胞死亡的圖。將人類結腸癌細胞系(SW1116)在存在或不存在各種濃度的抗TRAIL-R1抗體(CTB007)的條件下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了各個處理組觀察到的細胞活力(％)的柱形圖。圖11.顯示CTB003和抗TRAIL-R2(CTB006)協同誘導癌細胞死亡的圖。將人類結腸癌細胞系(SW1116)在存在或不存在各種濃度的抗TRAIL-R2抗體(CTB006)的情況下與各種濃度的CTB003溫育過夜。通過ATPLite細胞活力分析測定細胞活力。圖面A顯示了作為CTB003濃度(ng/ml)的濃度的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B顯示了對各個處理組觀察的細胞活力(％)的柱形圖。圖12.表現CTB003的體內抗腫瘤活性的圖。Balb/c棵鼠皮下接種人類乳腺癌細胞(MDA231)。接種後10天，小鼠接受200昭CTB003的腹膜內(i.p.)注射，以三天的間隔每周兩次。處理重複進行三周。每周測量腫瘤大小。數據表示為作為處理後的時間(天)的函數的腫瘤大小(cm3)。圖13.顯示在鼠異種移植體內實驗模型中鼠TRAIL受體結合劑CTB003對人類乳腺癌細胞系MDA231的生長的影響的時間依賴性的圖。數據表示為作為治療後的時間(天)的函數的腫瘤大小改變的百分比％。圖14.顯示在鼠異種移植體內實驗模型中鼠TRAIL受體結合劑CTB003對人類肝癌細胞系7402的生長的影響的時間依賴性的圖。數據表示為作為治療後的時間(天)的函數的腫瘤大小改變的百分比％。圖15.顯示在鼠異種移植體內實驗模型中鼠TRAIL受體結合劑CTB003對人類結腸癌細胞系Colo205的生長的影響的時間依賴性的圖。數據表示為作為治療後的時間(天)的函^:的腫瘤大小改變的百分比％。圖16.顯示在鼠異種移植體內實驗模型中鼠TRAIL受體結合劑CTB003對人類胰腺癌細胞系MIAcapa的生長的影響的時間依賴性的圖。數據表示為作為治療後的時間(天)的函數的腫瘤大小改變的百分比％。圖17.顯示與阿黴素組合的CTB003的殺腫瘤活性的直方圖。Balb/c棵鼠皮下接種人類乳腺癌細胞(MDA231)。接種後10天，小鼠首先接受100昭阿黴素的腹膜內注射，一天後接受200嗎CTB003的腹膜內注射。小鼠以三天的間隔每周兩次地處理。重複進行處理兩周的時間。在最後一ii次治療後兩天測量腫瘤大小。數據表示為作為處理組(之前和之後)的函數的腫瘤大小(cm3)。顯示的處理組如下未處理(對照)；阿黴素；CTB003;和阿黴素+CTB003。圖18.顯示在人類MDA231乳腺癌異種移植模型中與抗TRAIL-R2(CTB006)組合的CTB003的殺肺瘤活性的直方圖。Balb/c棵鼠皮下接種人類乳腺癌細胞(MDA231)。接種後10天，小鼠接受200嗎CTB003和CTB006的腹膜內注射。小鼠以三天的間隔每周兩次地進行處理。處理重複進行兩周的時間。在最後一次處理後兩天測量腫瘤大小。數據表示為作為處理組(之前和之後)的函數的腫瘤大小(cm3)。顯示的處理組是未處理(對照)；CTB003;CTB006;和CTB003+CTB006。圖19.顯示CTB003識別的TRAIL-R2的抗原表位的分析的圖。利用多肽抑制測定來確定TRAIL-R2中CTB003所識別的表位。將ELISA平板用TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，並與編碼TRAIL-R2的細胞外結構域的不同部分的一系列多肽(A-G)溫育。數據表示為作為肽濃度(nM)的函數的、所觀察到的CTB003對TRAIL-R2的結合的最大結合的百分比(％)。圖20.顯示CTB003所識別的TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗原表位的實驗確認的圖。利用多肽抑制測定來確定TRAIL-R1和TRAIL-R2中CTB003所識別的表位。將ELISA平板用TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，並將其在存在或不存在各種濃度的分別編碼TRAIL-R1和TRAIL-R2的細胞外結構域的多肽(I和H)的條件下與CTB003溫育。數據表示為作為肽濃度(nM)的函數的、所觀察到的CTB003對TRAIL-Rl(圖面A)或TRAIL-R2(圖面B)的結合的最大結合的百分比(％)。圖21.顯示CTB003(鼠)和hCTB003(人源化、嵌合的)TRAIL受體結合劑的結合特徵的比較的圖。將含有TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原的細胞外結構域的重組人類IgGl-Fc融合蛋白(圖面A)、TRAIL-Rl-Fc(圖面B)、TRAIL-R2-Fc(圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖面E)或BSA(對照；圖面F)固定在ELISA平板上，與各種濃度(ng/ml)的CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)溫育。與HRP綴合的山羊抗小鼠CTB003(鼠)IgGl反應，或與HRP綴合的山羊抗人kappa反應之後，添加TMB底物來進行顯色反應。通過CTB003或hCTB003與每種蛋白質的OD值來測定結合能力。每個圖面(A-F)中的數據表示為作為抗體濃度(ng/ml)(即，CTB003濃度(ng/ml)或嵌合CTBOO3濃度(ng/ml))的函數的OD450/650。圖22.顯示CTB006(鼠)和hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合的CTB006)TRAIL受體結合劑的結合特徵的比較的圖。將含有TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原的細胞外結構域的重組人類IgGl-Fc融合蛋白(圖面A)、TRAIL-Rl-Fc(圖面B)、TRAIL-R2-Fc(圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖面E)或BSA(對照；圖面F)固定在ELISA平板上，並與各種濃度(ng/ml)的CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的)溫育。與HRP綴合的山羊抗小鼠CTB006(鼠)IgG反應，或與HRP綴合的山羊抗人kappa反應之後，添加底物來進行顯色反應。通過CTB006或hCTB006與每種蛋白質的OD值來測定結合能力。每個圖面(A-F)中的數據表示為作為抗體濃度(ng/ml)(即，CTB006濃度(ng/ml)或嵌合CTB006濃度(ng/mi))的函數的OD450/650。圖23.顯示CTB007(鼠)和hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合的CTB007)TRAIL受體結合劑的結合特徵的比較的圖。將含有TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原的細胞外結構域的重組人類IgGl-Fc融合蛋白(圖面A)、TRAIL-Rl-Fc(圖面B)、TRAIL-R2-Fc(圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖面E)或BSA(對照；圖面F)固定在ELISA平板上，並與各種濃度(ng/ml)的CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的)溫育。與HRP綴合的山羊抗小鼠CTB003(鼠)IgG反應，或與HRP綴合的山羊抗人kappa反應之後，添加底物來進行顯色反應。通過CTB007或hCTB007與每種蛋白質的OD值來測定結合能力。通過CTB007或hCTB007與每種蛋白質的OD值來測定結合能力。每個圖面(A-F)中的數據表示為作為抗體濃度(ng/ml)(即，CTB007濃度(ng/ml)或嵌合CTB007濃度(ng/ml))的函數的OD450/650。圖24.顯示hCTB003(即，人源化、嵌合的CTB003;也稱為嵌合CTB003)所識別的TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗原表位的確認的圖。利用多肽抑制測定來確定TRAIL-R1和TRAIL-R2中hCTB003所識別的表位。將ELISA平板用TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被，在存在或不存在各種濃度的分別編碼TRAIL-R1和TRAIL-R2的細胞外結構域的多肽(I和H)的條件下與CTB003溫育。數據表示為作為肽濃度(nM)的函數的、所觀察到的hCTB003對TRAIL-R1(圖面A)或TRAIL-R2(圖面B)的結合的最大結合的百分比(％)。圖25.比較本發明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結合劑對人類乳腺癌細胞系MDA231的體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖26.比較本發明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結合劑對人類結腸直腸癌細胞系Colo205的體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/m)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖27.比較本發明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結合劑對人類胰腺癌細胞系MIAcapa體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖28.比較本發明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結合劑對人類卵巢癌細胞系Caov3體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖29.比較本發明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結合劑對人類前列腺癌細胞系Dul45體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(%)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖30.比較本發明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受體結合劑對人類肺癌細胞系H2122體外生長的影響的圖。圖面A是作為CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB003)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面B是作為CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB006)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖面C是作為CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的；也稱為嵌合CTB007)的濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)的圖。圖31.顯示人類TRAIL受體的選定區域的胺基酸序列比對的示意圖。圖32.顯示在差異表達TRAIL-R1和TRAIL-R2的腫瘤細胞中CTB003的結合和細胞凋亡誘導活性的圖。圖面A所示的圖表現了針對CTB003、CTB006和CTB007與Jurkat細胞的細胞表面結合的流式細胞術分析所得的數據。圖面B所示的圖表現了針對CTB003、CTB006和CTB007與Ramos細胞的細胞表面結合的流式細胞術分析所得的數據。圖面C是顯示CTB003、CTB006和CTB007在Jurkat細胞中的細胞凋亡誘導活性的圖。圖面D是顯示CTB003、CTB006和CTB007在Ramos細胞中的細胞凋亡誘導活性的圖。圖面C和圖面D中是數據表示為作為抗體濃度(ng/ml)的函數的細胞活力(％)。發明詳述凝迷.要理解的是，下文以不同的詳略程度描述本發明的某些方面、模式、實施方式、變化形式和特徵，以提供對本發明的實質上的理解。本發明一般地提供了TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，其可以同時結合兩種類型的死亡受體來提高它的抗胂瘤語和活性。本發明公開了這樣的作用劑，它們等同地(equally)結合TRAIL-R1和TRAIL-R2，並能夠誘導任何可表達單一類型的所述受體或兩種類型的所述受體的肺瘤細胞的凋亡。特別地，本發明提供了本發明的TRAIL受體結合劑結合的TRAIL-R1和/或-R2受體的細胞外結構域中TRAIL-R1和TRAIL-R2的共有"表位"的鑑定。這個表位大約處在跨越人類TRAIL-R1的aa218到aa233的胺基酸殘基(aa218-aa233;VKDCTPWSD正CVHKE,SEQIDNO:45)的結構域中，或處在跨越人類TRAIL-R2的aal67到aal82的胺基酸殘基(aal67-aal82;VGDCTPWSDIECVHKE，SEQIDNO:46)的結構域中。從而，本發明的各個方面涉及TRAIL受體結合劑的製備、表達和表徵。本發明的TRAIL受體結合劑能夠單獨地或組合地用於^f企測測試樣品中的TRAIL受體多肽(也稱為目標多肽)，以及用於調節TRAIL受體介導的功能。TRAIL受體結合劑能夠用於在有需要的受試者中診斷、預防和/或治療TRAIL受體相關的醫學狀況。本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)提供了抗死亡受體策略的獨特的生物學功能和廣泛的抗癌活性。雖然可溶的TRAIL已經顯示在誘導體內腫瘤細胞的凋亡方面是有效的，但由於它非常短的半衰期，它的殺傷活性似乎非常低，通常需要大的(和重複的)劑量。根據本發明的結合劑與TRAIL及其他單特異性的抗TRAIL-R1或TRAIL-R2抗體相比在攜帶人類癌細胞系的動物中具有更高的藥物有效性。本發明的各個方面進一步涉及診斷方法和試劑盒，它們使用本發明的TRAIL受體結合劑來鑑定具有醫學狀況傾向的個體或者對於藥物應答性、副作用或最佳藥物劑量來對個體分類。在其他方面，本發明提供了TRAIL受體結合劑用於預防或治療TRAIL受體介導的病症以及用於篩選和/或驗證配體(例如結合TRAIL受體多肽的小分子)等用途。因而，下文將說明這些方面的各種特定的實施方式。在以下附隨的說明中將闡述本發明的一個或多個實施方式的細節。雖然類似於或等同於在此描述的那些的任何方法和材料可以被用於本發明的實踐和測試，現在描述了優選的方法和材料。根據說明書和權利要求書，本發明的其他特徵、目的和益處將是明顯的。一般地，根據製造商的說明進行酶促反應和純化步驟。技術和操作一般根據本領域的常規方法和各種——:l殳參考文獻(一;l殳參見,Sambrook等人，Afo/ecw/"rC7o"/"gv」厶"6orafto^yA/awwa/，2d五dfColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork，1989)進行，其在本申請文件全文中均有才是供。除非另外定義，此處使用的所有技術和科學術語的含義一般與本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員通常所理解的相同。在本說明書和附隨的權利要求中使用的單數形式"一種/個(a,an)"和"該(the)，，包括了複數的所指，除非文章內容明確地另有所指。例如，提及"一種細胞"包括兩種或更多細胞的組合，等等。一般地，在此使用的命名法，和本文所描述的細胞培養、分子遺傳學、有機化學、分析化學和核酸化學及雜交中的實驗方法是本領域公知和常用的。核酸和肽合成使用標準的技術。化學合成和化學分析使用標準的技術或其修改方案。在此引用的所有參考文獻在此為了所有目的通過將它們完全引用來合併在此，其程度與具體的，單獨的指示為了相同。遂^7的/,^.選用的生物化學和血液學術語的縮寫分別總結在下面的表1和表2中。表l:選用的生物化學術語ALT丙氨酸氨基轉移酶AST天冬氨酸氨基轉移酶ALP鹼性磷酸酶CK肌酸磷酸激酶Y-GTY-穀氨醯氨基醯基轉移酶BUN血液尿素氮肌酸酐Alb白蛋白TP總蛋白Tchol總膽固醇TG甘油三酯Tbil總膽紅素Glu葡萄糖Na鈉Ca鈣K鉀CI氯17表2:選用的血液學術語tableseeoriginaldocumentpage18定乂.以下提供了在本說明書中使用的某些術語的定義。其他術語的定義可以在/〃wWratoio/TwwMWo/ogy,2ndEdition(Cruse，J.M.和Lewis,R.E.,Eds.,BocaRaton，FL:CRCPress,1995)中找到。本發明中涉及的術語"DR4"和"TRAIL-R1"、"DR5，，和"TRAIL-R2，，可以互換使用。除非另外表明，在本文中使用這些術語時是指人類蛋白質和基因。如在此^(吏用的，術語本發明的TRAIL受體結合劑(例如，抗體)或TRAIL受體相關多肽的"生物學活性"，其抗體片段可以結合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2,並且在癌細胞中具有體內和體外細胞死亡誘導活性。如在此4吏用的，術語"TRAIL受體"是指TOP受體家族的成員。人類TRAIL受體是TRAIL的細胞表面受體(AP02配體)。迄今為止，已經鑑定了TRAIL的五種受體，其中的兩種DR4(TRAIL-R1;CD261或死亡受體4)和DR5(TRAIL-R2;CD262或死亡受體5)能夠轉導凋亡信號，而其他三種DcRl(TRAIL-R3;CD263或誘鉺受體1)、DcR2(TRAIL-R4;CD264或i秀何受體2)和護骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)不轉導凋亡信號。三聚的TRAIL對TRAILRl或TRAILR2的結合通過這些受體的寡聚而誘導凋亡。TRAILRl和TRAILR2由細胞外的半富胱氨酸結構域、跨膜結構域和細胞質死亡結構域組成。TRAILR3和TRAILR4也具有細胞外的富半胱氨酸結構域，但是TRAILR3缺乏細胞質死亡結構域，TRAILR4具有截短的死亡結構域。TRAIL的所有五種受體在它們的細胞外配體結合結構域中具有顯著的同源性。DR4和DR5的細胞內區段含有一種保守的功能結構域，即所謂的"死亡結構域，，，其負責轉導凋亡信號。死亡結構域對凋亡信號轉導負責。如在此使用的，向受試者施用試劑或藥物包括自我施用和由他人施用。還要理解的是，在此描述的醫學狀況的治療或預防的各種方式意圖是指"實質上的"，其不但包括完全的治療或預防，還包括不及完全的治療或預防，其中實現了某些生物學或醫學上有意義的結果。如在此使用的，術語"胺基酸"包括天然存在的胺基酸和合成的胺基酸，以及按照與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來被修飾的那些胺基酸，例如，羥脯氨酸、，羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基礎化學結構一一即結合於氫、羧基、氨基和R基的a碳一一的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、曱硫氨酸亞碸、曱硫氨酸曱基鋶。這種類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保持了與天然存在的胺基酸相同的基礎化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構、但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化合物。胺基酸在此可以通過它們公知的三字母符號或通過IUPAC-IUB生物化學術語委員會建議的單字母符號來指代。同樣地，核苷酸可以通過它們公認的單字母代碼來指代。如在此使用的，術語"抗體"是指這樣的多肽，其包含來自免疫球蛋白基因的框架區域或其片段，其特異性地結合併識別抗原，例如TRAIL受體多肽。使用術語"抗體，，意圖包括完整抗體、包括單鏈的完整抗體，以及其抗原結合片段。術語"抗體"包括雙特異性抗體和多特異性抗體，只要它們展現了期望的生物學活性或功能。如在此使用的，術語"抗體相關的多肽"是指抗原結合性抗體片段，包合的可變區抗體分子的絞鏈區、CH,、CH2和CH3結構域。本發明還包括可變區與絞鏈區、CH,、CH2和CH3結構域的任何組合。能用作本發明的結合劑的抗體相關分子包括，例如，但不限於，Fab、Fab，和F(ab，)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫橋連接的Fv(sdFv)和包含VL或VH結構域的片段。實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH!結構域組成的單價的片段；(ii)F(ab')2片段，包含由絞鏈區的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價的片段；(iii)由Vh和ell!結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的Vl和VH結構域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，Atowe341:544-546，1989)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。因而，"抗體片段"可以包含全長抗體的一部分，一般是抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。單鏈抗體分子可以包括具有多個單獨分子的聚合物，例如，二聚體、三聚體或其他聚合物。如在此使用的，術語"生物樣品，，是指源自於活細胞或被活細胞接觸過的樣品材料。術語"生物樣品"意圖包括從受試者分離的組織、細胞和生物液體，以及存在於受試者體內的組織、細胞和液體。本發明的生物樣品包括，例如，但不限於，全血、血漿、精液、唾液、淚液、尿液、糞便材料、汗液、口腔的(buccal)、皮膚、腦脊液和毛髮。生物樣品也可以從內臟的活檢或從癌症獲得。生物樣品可以從用於診斷或研究的受試者獲得，或者可以從未患病的個體獲得，作為對照或用於基礎研究。如在此使用的，術語"CDR移植的抗體，，是指這樣抗體，其中"受者"抗體的至少一個CDR被來自具有期望的抗原特異性的"供者"抗體的CDR"移植物"替換。如在此使用的，術語"嵌合抗體"是指這樣的抗體，其中利用重組DNA技術，來自一個物種的單克隆抗體的Fc恆定區(例如，小鼠Fc恆定區)被來自另一個物種的抗體的Fc恆定區(例如，人類Fc恆定區)替換。一般地，參見，Robinson等人，PCT/US86/02269;Akira等人，歐洲專利申請184,187;Taniguchi,歐洲專利申請171,496;Morrison等人，歐洲專利申請173,494;Neuberger等人，WO86/01533;Cabilly等人美國專利No.4,816,567;Cabilly等人,歐洲專利申請125,023;Better等人,Science240:1041-1043,1988;Liu等人，A^/^^/5WWSL484:3439-3443,1987;Liu等人，J/附"w"o/139:3521-3526,1987;Sun等人，戶raciVaf/爿cad84:214-218,1987;Nishimura等人，Ca"ce;ri^47:999-1005,1987;Wood等人，Nature314:446-449，1885;和Shaw等人，JA^/Ca"cer/"W80:1553-1559，1988。如在此使用的，術語"比較窗口"(comparisonwindow)是指這樣的區段，其具有選自由20到600個胺基酸或核苷酸、通常約50到約200個、更通常約100到約150個構成的組的連續位置的任一數目的連續位置，某一序列與具有相同數目的連續位置的參考序列最佳比對之後，可以在該窗口中與參考序列相比較。如在此使用的，術語"共有FR"是指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗體區域。抗體的FR區域不接觸抗原。如在此使用的，術語"共有序列"是指由在相關序列的家族中最經常出現的胺基酸(或核苷酸)所形成的序列(參見，例如，Winnaker,toC/owejrVerlagsgesellschaft，Weinheim,Germany1987)。也就是說，在蛋白質的家族中，共有序列中的每個位置均被家族中在該位置上最常出現的胺基酸所佔據。如果兩個胺基酸出現頻度相等，則其中任一個均可以被包括在共有序列中。如在此使用的，術語"接觸，，當用於細胞時是指將本發明的TRAIL受體結合劑、抗體、抗體組合物、細胞毒性試劑或細胞毒性模塊(moiety)、基因、蛋白質和/或反義序列遞送給目標細胞或置於目標細胞的緊密鄰近處的過程。這種遞送可以是體外或體內的，可以涉及重組載體系統的使用。如在此使用的，術語"細胞毒性模塊"是指當接近細胞或被細胞吸收時抑制細胞生長或促進細胞死亡的模塊。就此來說適合的細胞毒部分包括放射性戰劑或同位素(放射性核素)、化學毒性試劑，例如分化誘導物、抑制劑和小的細胞毒性藥物、毒素蛋白和其衍生物，以及核苦酸序列(或它們的反義序列)。因此，細胞毒性部分可以是，作為非限制性的例子，化療劑、光活化的毒素或放射性試劑。如在此使用的，術語"雙抗體，，是指具有兩個抗原結合位點的小的抗體片段，該片段在相同的多肽鏈中含有相互連接的輕鏈可變域(VL)和重鏈可變域(VH)(Vh-Vl)。通過使用過短而不容許在同一鏈上兩個結構域之間配對的接頭，結構域被迫與另一鏈的互補結構域配對，並產生兩個抗原結合位點。雙抗體在例如EP404,097;W093/11161和30Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更詳細的描述。如在此使用的，術語"效應物細胞"是指免疫應答的效應物階段——與免疫反應的認知和活化階段相對——中涉及的免疫細胞。示例性的免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如，淋巴細胞(例如，B細胞和T細胞，包括細胞溶解性T細胞(CTL))、殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸細胞、嗜中性細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜鹼性細胞。效應物細胞表達特定的Fc受體並進行特定的免疫功能。效應物細胞可以誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，例如，能夠誘導ADCC的嗜中性細胞。例如，表達FcaR的單核細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、嗜酸細胞和淋巴細胞參與目標細胞的特異性殺傷，並向免疫系統的其他成分呈遞抗原，或結合呈遞抗原的細胞。效應細胞也可以吞噬目標抗原、目標細胞、轉移性癌細胞或微生物。如在此使用的，術語"表位"是指能夠特異性結合到抗體的蛋白質決定簇。表位通常由化學活性的表面分子群集(grouping)例如胺基酸或糖類側鏈組成，並且通常具有特定的三維結構特性，以及特定的電荷特徵。構象和非構象的表位的區別在於在變性溶劑的存在下與前者的結合會喪失，而與後者的結合不會喪失。在一個實施方式中，TRAIL-R1和TRAIL-R2的"表位"是本發明的TRAIL受體結合劑結合的、TRAIL-R1和/或R2受體的細胞外結構域中的共有的區域。在本發明的一個實施方式中，這個表位大約處在跨越SEQIDNO:45的TRAIL-R1的aa218到aa233的胺基酸殘基的結構域中，或處在跨越SEQIDNO:46的TRAIL-R2的aal67到aal82的胺基酸殘基的結構域中。為了篩選結合表位的TRAIL受體結合劑，可以進行常規的交叉阻斷(cross-blocking)測定，例^t口在Antibodies,^a6orafto^yAfowwa/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane(1988)中描述的。這種分析可以用於確定測試的TRAIL受體結合劑是否結合與本發明的TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2抗體相同的位點或表位。或者/並且，可以通過本領域已知的方法進行表位作圖(epitopemapping)。例如，可以通過丙氨酸掃描來誘變抗體序列，以鑑定接觸殘基。在另一種方法中，與TRAIL-Rl和TRAIL-R2的不同區域相應的肽可以用於與測試抗體、或與測試抗體及具有已被表徵的或已知的表位的抗體進行竟爭測定。如在此使用的，術語組合物的"有效量"或"藥學有效量"或"治療有效量，，，是足以實現期望的治療和/或預防效果的量，例如，引起與被治療的疾病相關的症狀的防止或減少的lt量，所述疾病例如與目標多肽相關的疾病。施用給受試者的本發明的組合物的量將取決於疾病的類型和嚴重度，以及取決於個體的特徵，例如一般健康狀態、年齡、性別、體重和對藥物的耐受性。還將取決於疾病的程度、嚴重度和類型。技術人員將能夠取決於這些和其他因素確定合適的劑量。本發明的組合物也可以相互組合、或與一種或多種其他的治療化合物組合地施用(例如，本發明的多特異性TRAIL受體結合劑可以與一種或多種單特異性TRAIL受體結合劑組合使用。如在此使用的，"表達"包括但不限於下面的一項或多項基因轉錄成前體mRNA;前體mRNA的剪接和其他加工來產生成熟mRNA;mRNA穩定性；成熟mRNA翻譯成為蛋白質(包括密碼子利用和tRNA可用性)；以及翻譯產物的糖基化和/或其他修飾，如果對於適合的表達和功能是需要的。如在此使用的，"融合多肽"包括TRAIL受體多肽其與之可操作連接的多肽，所述多肽具有與所述TRAIL受體多肽基本上不同源的多肽(例如，不同於TRAIL受體多肽、且來源於相同或不同生物體的多肽)相應的胺基酸序列。如在此使用的，術語"基因"是指這樣的一段DNA,其含有RNA產物的受調節的生物合成的所有信息，包括啟動子、外顯子、內含子和控制表達的其他翻譯的區域。如在此使用的，術語"基因型"是指在個體中一對同源染色體上的基因座中，存在於一個或多個多態性或突變位點中的、不分相的(unphased)5'到3'核香酸對序列。如在此使用的，基因型包括完全基因型和/或亞基因型(sub-genotype)。如在此使用的，術語"人類序列抗體"包括具有來自人類種系(germline)免疫球蛋白序列的可變區和恆定區(如果存在)的抗體。本發明的人類序列抗體可以包括不被人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，通過體外的隨機或定點誘變或通過體內的體細胞突變而引入的突變)。這23些抗體可以在非人類轉基因動物中產生，例如如PCT/^布NO.WO01/14424和WO00/37504中所描述的。然而，如在此使用的，術語"人類序列抗體"不意圖包括這樣的抗體，其中源自另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的CDR序列被移植到人類框架序列上(例如，人源化抗體)。如在此使用的，術語非人類(例如鼠)抗體的"人源化，，形式，是含有最少的來自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。大體上，人源化的抗體是人免疫球蛋白，在其中受者的高變區殘基被來自非人物種(供者抗體)一一例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類一一的、具有期望的特異性、親和性和接受力(capadty)的高變區殘基所替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區(FR)殘基被相應的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含既不在受者抗體中存在也不在供者抗體中存在的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能，例如結合親和力。一般地，人源化抗體將包括至少一個可變域，一般地是兩個可變域的基本上全部(substantiallyall)，其中，所有的或基本上所有的高變環均對應於非人免疫球蛋白的高變環，而所有的或基本上所有的FR區均是具有人免疫球蛋白序列的FR區，但FR區域可以包括一個或多個胺基酸替換以改善結合親和力。在FR區域中這些胺基酸替換的數目一般是在H鏈中不超過6個，在L鏈中不超過3個。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恆定區的至少一部分。進一步的細節參見Jones等人，Nature321:522畫525(1986);Reichmann等人，Nature332:323-329(1988);andPresta,Curr.Op.Struct,Biol.2:593-596(1992)。本發明考慮了在此處描述的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合抗體的"胺基酸序列修飾"。例如，可能希望改善抗體的結合親和力和/或其他生物學性質。通過向抗體核酸中導入合適的核苷酸變化或通過肽合成來製備TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合抗體的胺基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，刪除、和/或插入和/或替換TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合抗體的胺基酸序列內的殘基。只要獲得的抗體具有希望的性質，可進行刪除、插入和替換的任何組合來獲得感興趣的抗體。修飾還包括蛋白質的糖基化模式的改變。一種有用的優選誘變位置鑑定方法稱為"丙氨酸掃描i秀變"，如Cunningham和Wellsin>SWe"ce,244:1081-1085(1989)所描述的。然後篩選突變的抗體的希望的活性。本發明包括具有CGMCC登錄號1665的雜交瘤CTB003所定義的胺基酸序列中添加、刪除和/或替換了一個或多個胺基酸的抗體變體，只要所述抗體變體具有希望的性質。如在此使用的，術語"高變區，，是指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區一般包含來自"互補決定區"或"CDR，，(例如，Vl中的殘基23-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)左右，和VH中的殘基31-35B(Hl)，50-65(H2)和95-102(H3)左右)(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))的胺基酸殘基；和/或來自"高變環，，(例如，VL中的殘基26-32(LI)，50-52(L2)和91-96(L3)和VH中的26-32(HI)，53-55(H2)和96-101(H3))(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))的那些殘基。如在此使用的，術語"同一性，，或百分比"同一性"，當在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中使用時，是指這樣的兩個或更多個序列或子序列過人工比對或目視檢查(參見例如NCBI網站)所測定的，這些序列是相同的，或者具有指定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即，當以整個比較窗口或指定區域上的最大對應度來進行比較和比對時，在指定的區域(例如，編碼本文所述抗體的核苷酸序列，或本文所述抗體的胺基酸序列)上有約60%同一性、優選的65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。然後這些序列被稱為"基本上同一的"。該術語還指，或者說可以用於，測試序列的互補序列(complement)。該術語還包括具有刪除和/或添加的序列，以及那些具有替換的序列。如下所述，優選的算法可以考慮缺口等等。優選地，同一性存在於至少約25個胺基酸或核苷酸長度的區域上，或者更優選地，50-100個胺基酸或核苷酸長度的區域上。"分離的"或"純化的"多肽或其生物學活性部分基本上不含來自該TRAIL受體結合劑所來源的細胞或組織的細胞材料或其他汙染多肽，或者，當它們為化學合成時，基本上不含化學藥品前體或其他化學藥品。例如，作為分離的TRAIL受體結合劑的抗TRAIL受體抗體將不含有幹擾該試劑的診斷或治療用途的材料。這樣的幹擾材料可以包括酶、激素和其他蛋白質性的或非蛋白質性的溶質。如在此使用的，用語"誘導細胞死亡，，或"能夠誘導細胞死亡"是指本發明的TRAIL受體結合劑使有活力的細胞變得沒有活力的能力。細胞死亡和細胞活力可以通過本領域的各種方法，例如錐蟲藍排出測定和其他細胞活力分析來測定。在本發明中，細胞死亡特別地由"凋亡，，或稱"細胞程序死亡"所誘導，其根據下列現象判定膜聯蛋白V的結合、DNA的片段化、細胞皺縮、內質網的擴張、細胞破碎、和/或膜嚢(稱為凋亡體)的形成。有很多方法可用於評估與凋亡相關的細胞事件。例如，磷脂醯絲氨酸(PS)轉位可以通過膜聯蛋白結合來測量；DNA片段化可以通過DNA梯狀化(laddering)來評估；核/染色質縮合以及DNA片段化可以通過亞二倍體細胞的任何提高來評估。目標細胞是表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的細胞，優選的，細胞是腫瘤細胞，例如，乳腺、結腸、卯巢、胃、子宮內膜、內皮、肝臟、腦、唾液腺、肺、腎臟、甲狀腺、胰腺或膀胱細胞。如在此使用的，術語"完整抗體"是指具有由二硫鍵互連的至少兩個重(H)鏈多肽和兩個輕(L)鏈多肽的抗體。每個重鏈由一個重鏈可變區(在此縮寫為HCVR或vh)和一個重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個結構域，CH,、CH2和CH3構成。每個輕鏈由一個輕鏈可變區(在此縮寫為LCVR或Vl)和一個輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域d構成。Vh和V^區域可以進一步分成高可變性的區域，稱為互補決定區(CDR)，這些互補決定區中間間隔著更為保守的區域，稱為框架區域(FR)。每個Vh和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基末端到羧基末端按以下順序排列FR!、CDR,、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白對宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如效應物細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。如在此使用的，術語"免疫應答"是指淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和上述細胞或肝臟產生的可溶大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的協同動作，引起人體的癌性細胞、轉移性腫瘤細胞、惡性黑色素瘤、侵入的病原體、病原體感染的細胞或組織的選擇性的損害、破壞或消滅；或者，在自體免疫或病理性炎症的情況下，正常的人類細胞或組織的選擇性的損害、破壞或消滅。如在此使用的，術語"免疫交叉反應性"和"免疫反應性"可互換地使用，26是指與抗體特異性地反應的抗原，所述抗體是利用相同的("免疫反應性，，)或不同的("免疫交叉反應性")抗原產生的。一般地，抗原是TRAIL受體多肽，其變體或子序列。如在此使用的，術語"免疫反應條件，，是指這樣的條件，其容許針對抗原的特定表位而產生的抗體結合該表位，其結合的程度可檢測地大於(detectablygreaterthan)基本上所有結合其他表位的抗體，一般至少高於背景結合至少兩倍、優選的高於背景至少五倍。免疫反應條件取決於抗體結合反應的模式，一般是在免疫分析方案中利用的那些條件。免疫分析模式和條"f牛臺々4苗述可參見,Harlow和Lane，^wf/6o(i/es，丄"6or"/o^yA/b"wa/(ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988)。如在此使用的，術語"淋巴細胞"是指血液、淋巴和淋巴組織中存在的任何單核的、非巨噬細胞的白細胞，例如，B淋巴細胞和T淋巴細胞。如在此使用的，術語"醫學狀況"包括，但不限於，希望對其治療和/或預防的、表現為一種或多種生理和/或心理學的症狀的任何狀況或疾病，包括早先和新近鑑定的疾病和其他病症。如在此使用的，術語"調節物"包括抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，結合於、部分地或全部地阻斷刺激、降低、阻止、延遲活化、滅活、去致敏、或下調TRAIL受體多肽的活性的試劑，例如拮抗劑。活化物是，例如，結合於、刺激、提高、開放、活化、易化、增強活化、致敏或上調TRAIL受體多肽的活性的試劑，例如激動劑。調節物包括，例如，改變TRAIL受體多肽與下列物質的相互作用的試劑結合活化劑或抑制劑的蛋白質，受體，包括蛋白質、肽、類脂、碳水化合物、多糖或上述物質的組合，例如脂蛋白、糖蛋白等等。調節物包括天然存在的TRAIL受體多肽的遺傳修飾的型式，例如，活性改變的遺傳修飾型式，以及天然存在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學分子等等。此處使用的術語"單克隆抗體"是指這樣的抗體，它獲自基本上同質的抗體群體，即除了可能以少量存在的可能自然發生的突變之外，構成所述群體的抗體個體是相同的。例如，單克隆抗體可以是衍生自單個克隆，包括任何真核、原核或噬菌體克隆的抗體，而不是來自產生該抗體的方法。單克隆抗體成分顯示對特定表位的單一的結合特異性和親和力。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個的抗原性位點。此外，與常規的(多克隆的)抗體製品"~一它們通常包含對不同決定簇(表位)的不同抗體一一形成對照的是，每種單克隆抗體針對的是抗原上的單個決定簇。修飾語"單克隆"表明了抗體"是從實質上同質的抗體群體獲得的"這一特性，不能解釋為要求通過任何特別的方法生產抗體。單克隆抗體可以使用本領域已知的多種多樣的技術來製備，例如但不限於，雜交瘤、重組和噬菌體展示技術。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等人，A^/wre256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法製備，或可以通過重組DNA方法製備(參見，例如，美國專利No.4,816,567)。"單克隆抗體，，也可以利用，例如，Clackson等人，A^wre352:624-628(1991)和Marks等人，J！Mo/.歷o/.222:58卜597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體庫中分離。如在此使用的，術語"中和抗體"是指能夠消除或顯著地降低TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的至少一種(l種)生物學功能的抗體分子。如在此使用的，術語"核苦酸對，，是指在兩條核苷酸鏈之間相互結合的兩個核苷酸。如在此使用的，用術語"藥學上可接受的載體"意圖包括與藥物施用相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌化合物、等滲和吸收延遲化合物，等等。如在此使用的，術語"多克隆抗體，，是指來自至少兩種(2種)不同的抗體生產細胞系的抗體的製品。這個術語的使用包括至少兩種(2種)抗體的製品，其含有與抗原之不同表位或區域特異性結合的抗體。如在此使用的，術語"多核苷酸，，是指任何RNA或DNA,其可以是未修飾或修飾的RNA或DNA。多核普酸非限制性地包括單鏈和雙鏈DNA,單鏈和雙鏈區域混合物的DNA;單鏈和雙鏈RNA,單鏈和雙鏈區域的混合物的RNA;以及包含DNA和RNA的雜交分子，其可以是單鏈，或更一般地是雙鏈，或是單鏈和雙鏈區域的混合物。此外，多核苦酸指包含DNA或RNA或DNA與RNA兩者的三鏈區域。術語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾的鹼基的DNA或RNA,以及具有為了穩定性或其他理由修飾的骨架。在特定的實施方式中，多核苷酸含有來自TRAIL受體基因的多核苷酸序列。如在此使用的，術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在此可互換地用來指包含通過肽鍵或修飾的肽鍵連接在一起的兩個或更多個胺基酸的聚合物，即，肽電子等排體。多肽既指短的鏈，通常稱為肽、糖肽或寡聚體；也指較長的鏈，一般稱作蛋白質。多肽可以含有20種基因編碼的胺基酸之外的胺基酸。多肽包括通過翻譯後加工等自然過程所修飾的，或通過本領域公知的化學修飾技術所修飾的胺基酸序列。這些修飾在基礎教科書以及在更詳細的專著中，以及在大量研究文獻中有詳盡的記載。在特定的實施方式中，多肽含有來自TRAIL受體蛋白的多肽序列。如在此使用的，術語"重組"當用來指例如細胞、或核酸、蛋白質或載體時，表明該細胞、核酸、蛋白質或載體已經通過導入異源核酸或蛋白質或天然核酸或蛋白質的改變而被修飾，或者所述材料來自這樣修飾的細胞。因而，例如，重組細胞表達在該細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因，或表達本應異常表達、少量表達或根本不表達的天然基因。如在此使用的，用語"拯救受體結合表位"是指IgG分子(例如，IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區域的一種表位，其是提高IgG分子的體內血清半衰期的原因。為了提高抗體的血清半衰期，可以例如象美國專利5,739,277所描述的那樣向抗體(特別是抗體片段)中引入拯救受體結合表位。如在此使用的，術語"單鏈抗體"或"單鏈Fv(scFv)"是指Fv片段的兩個結構域VL和VH的抗體融合分子。雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由不同的基因編碼，但可以使用重組方法通過合成接頭來連接它們，所述接頭允許它們作為單一蛋白鏈產生，在該鏈中Vl和VH區域配對形成單價的分子(稱為單鏈Fv(scFv))。參見，例如，Bird等人,5We聰242:423-426，1988;andHuston等人，屍rac.iVaf/.爿cad5W.C/5^，85:5879-5883,1988)。對術語"抗體，，片段的提述包括了這種單鏈抗體。這種單鏈抗體可以通過重組技術或完整抗體的酶學或化學裂解來製備。如在此使用的，術語"小分子"是指這樣的一種成分(composition)，其具有低於約5kDa,更優選低於約2kDa的分子量。小分子可以是，例如，核酸、肽、多肽、糖肽、擬肽、碳水化合物、類脂、脂多糖、這些物質的組合，或其他有機或無機分子。如在此使用的，術語"特異性結合"是指TRAIL受體結合劑和抗原之間結合親和力為至少10"M的接觸。優選的結合劑以至少約10々M、優選1(T8M到1(T9M、10_1GM、1(T"M或10"2M的親和力結合。如在此使用的，用語"嚴格雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下，探針將與其目標子序列(其一般處於複雜的核酸混合物中)雜交，而不與其他的序列雜交。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環境中是不同的。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。對於核酸雜交的廣泛的指導可以在Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中找到。一般地，嚴格條件選4奪為比在確定的離子強度pH下特定序列的熱熔點(Tm)低約5-10°C。Tm可以是這樣的溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)，在該溫度下，在平衡狀態，與目標互補的探針有50o/。與目標序列雜交(由於目標序列過量存在，在Tm時，平衡狀態下有50%的探針被佔據)。嚴格條件也可以通過添加去穩定劑例如曱醯胺來達到。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號可以是至少兩倍於背景的雜交，優選的10倍於背景的雜交。示例性的嚴格雜交條件可以是如下50%曱醯胺、5xSSC和1%SDS,在42。C溫育，或5xSSC、1%SDS、在65。C溫育，在0.2xSSC和0.1。/。SDS中在65。C洗滌。如在此使用的，術語"受試者"是指優選所述受試者是哺乳動物，例如人類，但也可以是其他動物，例如家養動物(例如，狗、貓等等)、農畜(例如，牛、羊、豬、馬，等等)以及實驗動物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠，等等)。如在此使用的，術語"替換"是指在本領域中通用的突變之一。這些替換變體在TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合性抗體分子中至少一個胺基酸殘基被不同的殘基替換。替換突變的最感興趣的位點包括高變區，但也考慮FR改變。在以下表格中"優選替換"的標題下列出了"保守性替換"。如果這種替換引起生物學活性的變化，則可以引入更為實質性的改變(如表3中稱為"示例替換"的那些，或者如下文按胺基酸類型進一步描述的)，並篩選產物。表3:胺基酸替換初始殘基示例替換優選替換Ala(A)val;leu;ilevalArg(R)lys;gin;asnlysAsn(N)gin;his;asp，lys;arggin30表3:胺基酸替換tableseeoriginaldocumentpage31特別優選的替換變體類型包括對親本抗體的一個或多個高變區殘基的替換。一種方便地產生這種替換變體的方法包括利用噬菌體展示的親和成熟(affinitymaturity)。特別地，將幾個高變區位點(例如，6-7個位點)突變來在每個位點產生所有可能的胺基酸替換。由此產生的抗體變體作為與封裝在每個顆粒中的、與M13的基因III產物的融合物，以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上。然後篩選噬菌體所展示的變體的本文所公開的生物學活性(例如，結合親和力)。為了鑑定用於修飾的候選的高變區位點，可以進行丙氨酸掃描誘變來鑑定對於抗原結合性TRAIL-R1和/或-R2受體有顯著貢獻的高變區。或者/並且，分析抗原抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體和TRAIL-R1和/或-R2受體之間的接觸點可能是有益的。這類接觸殘基和鄰近殘基是根據在此描述的技術的進行替換的候選對象。一旦產生了這類變體，則對一組變體如本文所述進行篩選，在一種或多種相關的測定中具有相似或更優性質的抗體可以選擇用於進一步的開發。本發明包括具有對CGMCC登錄號1665的雜交瘤CTB003所定義的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的高變結構域的一個或多個胺基酸替換、特別是保守性替換的抗體變體，只要該抗體變體具有希望的性質。如在此使用的，術語"目標細胞，，是指受試者(例如，人類或動物)中的任何細胞，其可以被本發明的TRAIL受體結合劑所靶向。如在此使用的，術語"治療劑"意圖指這樣的化合物，當以有效量存在時，其對需要它的受試者產生期望的治療效果。如在此使用的，術語"治療(treating)"或"治療(treatment)，，或"緩解，，(alleviation)是指治療處理(therapeutictreating)以及預防或防範4晉施，其中的目標是阻止或減緩(減輕)作為目標的病理狀況或失調。如果受試者在根據本發明的方法接受治療量的本發明的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合抗體之後，顯示該特定疾病的一個或多個體徵和症狀的可觀察的和/或可測量的降低或缺如，則稱受試者被成功地"治療"了表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌症。例如，對於癌症，癌細胞的數目的降^f氐或癌細胞的不存在；肺瘤大小的降低；腫瘤轉移的抑制(即，減慢一定程度，優選停止)；，腫瘤生長在一定程度上的抑制；與該特定癌症相關的一種或多種症狀的症狀的緩解時間的延長和/或在一定程度上的減輕；發病率和死亡率的降低，以及生活質量的改善。如在此使用的，術語"可變，，是指在抗體之中可變區的某些片段在序列上廣泛地不同的事實。V結構域介導抗原結合，並決定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變區的整個胺基酸跨度上(acrosstheaminoacidspan)不是均勻分布的。相反，V區域的組成是這樣的幾個相對不變的、約15-30個胺基酸長的序列段，稱為框架區(FR)，以及將這些框架區分隔開來的、可變性極高的較短區域，稱為"高變區"，每個高變區長度約9-12個胺基酸。天然重鏈和輕鏈的每個可變區都包含四個FR，這些FR主要採取(3-片層結構，通過三個高史區相互連接，這些高變區形成環，所述環連接所述beta-片層結構，在某些情況下形成所述beta-片層結構的部分。每個鏈中的高變區被FR緊密維繫在一起，並且與來自另一個鏈的高變區一道對抗體的抗原結合位點的形成起貢獻(參見Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))。恆定域不直接涉及抗體與抗原的結合，但是顯示出各種效應物功能，例如對抗體依賴細胞細胞毒性(ADCC)的參與。本發明的組合物本發窮的7TL4/丄愛沐碧合^/.在一個方面，本發明提供了TRAIL受體結合劑組合物，也稱為結合劑。在一個實施方式中，本發明的結合劑是針對TRAIL受體多肽、其同源物或衍生物的完整抗體。感興趣的結合劑可以是特異性結合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的、但"基本上"不結合其他TRAIL受體，例如TRAIL-R3或TRAIL-R4的試劑。也就是說，感興趣的抗體可不與其他TRAIL受體，例如TRAIL-R3或TRAIL-R4顯著地交叉反應。在這種實施方式中，如通過螢光活化的細胞分選(FACS)分析、ELISA或放射免疫沉澱(RIA)所測定的，本發明的結合劑對這些蛋白質的結合程度將是低於約10%，優選的，低於5%、低於1%。對於本發明的結合劑，可以就其所識別或特異性結合的本發明多肽的表位或部分，例如TRAIL受體多肽的位於多肽表面的區域(例如親水性區域)來對其進行描述或規定。在一個實施方式中，本發明提供了TRAIL受體結合劑，例如針對包含胺基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44)的TRAIL受體多肽(也稱為目標多肽)的抗體或抗體相關多肽，其中胺基酸X優選的選自K或G。這種結合劑具有獨特的功能特徵。通過識別TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同表位，所述結合劑能夠結合TRAIL-R1或TRAIL-R2中的一種類型，或TRAIL-R1和TRAIL-R2兩種類型。在本發明的一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑所結合的TRAIL-R1或TRAIL-R2受體多肽在一種或多種細胞的表面表達。所述結合劑在體內和體外選擇性地誘導腫瘤細胞的凋亡。癌細胞可以單獨表達TRAIL-R1或TRAIL-R2，或共表達兩者。根據它廣泛的抗癌活性，本發明作為用於凋亡信號傳導研究的試劑、以及作為有效針對表達TRAIL受體的細胞的治療劑具有實用性，所述細胞例如包括廣泛的癌細胞種類。在優選實施方式中，本發明提供了表4中概述的TRAIL受體結合劑。表4:優選的TRAIL受體結合劑結合劑類型說明表4:優選的TRAIL受體結合劑tableseeoriginaldocumentpage34在表4(上文)中總結的與TRAIL受體結合劑相關的生物材料保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),中國微生物菌種保藏管理委員會，北京郵政信箱2714，10080，中華人民共和國。詳見下面的表5。表5:生物保藏tableseeoriginaldocumentpage34表5:生物保藏保藏物名稱材料曰期保藏號hCTB006LC(pcDNAIII-hCTB006畫LC)人類CTB006輕鏈的質粒DNA2007年4月13日2002hCTB006HC(pcDNAIII-hCTB006-HC)人類CTB006重鏈的質粒DNA2007年4月13曰2003hCTB007LC(pcDNAIII-hCTB007-LC)人類CTB007輕鏈的質粒DNA2007年4月13曰2004hCTB007HC(pcDNAIII-hCTB007畫HC)人類CTB007重鏈的質粒DNA2007年4月13曰2005在另一個實施方式中，本發明提供了一種闡明TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的其他拮抗性表位的方法，這些表位可以用於通過與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合來產生凋亡誘導抗體。針對所述表位的結合劑可以具有不同的可變區或CDR區域，但應當具有本發明的抗體的結合特徵和功能特徵。作為產生靶向抗體的手段，可以生成顯示親水性和疏水性的區域的親水性分布圖，這樣的分布圖可以通過任何本領域公知的方法來生成，包括，例如，KyteDoolittle或HoppWoods方法，有或者沒有傅立葉變換(參見，例如Hopp和Woods,Jcad78:3824-3828(1981);Kyte和Doolittle，JMo/.5fo/.157:105-142(1982))。表位或多肽部分可以如本文中描述的那樣來具體指定，例如指定其N-末端和C-末端位置、大小(以連續胺基酸殘基數計)。本發明包括特異性結合本發明的多肽並容許其排除的結合劑。本發明包括特異性結合表位的結合劑，其中所述表位是構象表位或非構象表位。如上所述，構象和非構象表位的區別在於在存在變性溶劑的情況下與前者的結合會喪失，而與後者的結合不會喪失。本發明的結合劑也可以基於它們的交叉反應性來描述或具體指定。本發明包括不結合本發明的目標多肽的任何其他類似物、直系同源物(ortholog)或同源物的結合劑。不結合與本發明的多肽具有低於95%、低於90%、低於85%、低於80%、低於75%、低於70%、低於65%、低於60%、低於55%以及低於50%的同一性(利用本領域已知的和在此描述的方法計算的)的結合劑也被包括在本發明內。本發明進一步包括這樣的結合劑，其僅結合在嚴格雜交條件下(如在此描述的)與本發明的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽。一個方面，本發明提供TRAIL受體結合劑(例如，抗體)，其結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽，其中所述結合劑(抗體)以它的可溶形式在低濃度下在表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的癌細胞中具有體內和體外的細胞死亡誘導活性。在一個實施方式中，所述TRAIL受體結合劑結合在至少一個(種)細胞(atleastonecell)的表面表達的TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽。也就是說，本發明的TRAIL受體結合劑可以結合在單個(種)細胞上表達的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體多肽，或結合在超過一個(種)細胞(例如，兩個(種)細胞)上表達的TRAIL-R1/-R2多肽。在一個實施方式中，所述TRAIL受體結合劑結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間至少百分之90胺基酸同源性(例如，同一性)的多肽區域。在一個實施方式中，所述TRAIL受體結合劑結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間具有至少百分之95胺基酸同源性(例如，同一性)的多肽區域。在一個實施方式中，所述TRAIL受體結合劑結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受體2(TRAIL-R2)之間具有至少百分之98胺基酸同源性(例如，同一性)的多肽區域。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑結合TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽之間同源的區域，其中所述區域包含胺基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44)，其中X是K或G。胺基酸同源性(例如，同一性)可以使用本領域已知的和在此描述的方法計算。本發明的結合劑也可以就它們的結合親和力來描述或具體指定。優選的結合親和力包括具有低於5xl(T6M、1(T6M、5xl(T7M、10—7M、5xl(T8M、10—8M、5xl(T9M、1(T9M、5xl(T1M、10-1M、5xl0-uM、10"M、5xl(T12M、1(T12M、5xl0-13M、1(T13M、5xl(T"M、IO國"M、5xlO"5M和10"5M的離解常數或Kd的那些。在一個實施方式中，本發明提供這樣的TRAIL受體結合劑，其以不高於lxl0-s的Kd值，優選的不高於約lxl0一的Kd值至少結合人類TRAIL-R1和/或TRAIL-R2。本發明的範圍內的TRAIL受體結合劑包括，例如但不限於，特異性結合目標多肽、其同源物、衍生物或片段的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合36抗體、人源化抗體、雙抗體，以及人類單克隆抗體和人類多克隆抗體。如在此使用的，"TRAIL受體樣多肽"是指不同於TRAIL受體多肽但與本發明的TRAIL受體結合劑具有免疫反應性的多肽。TRAIL受體樣多肽可以來自與TRAIL受體多肽相同的生物體或不同的生物體。TRAIL受體樣多肽可以由與TRAIL受體多肽相同的基因或不同的基因編碼。作為本發明的結合劑有用的抗體包括，例如但不限於，IgG(包括IgGj、IgG2、IgG""gG4)、IgA(包4舌IgA!和IgA2)、IgD、IgE或IgM,以及IgY。在另一個實施方式中，本發明的結合劑是針對TRAIL受體多肽其同源物或衍生物的抗體相關的多肽。一般地，結合劑的抗原結合區域，例如抗TRAIL受體結合區域，是本發明的結合劑的結合特異性和親和力中最關鍵的。在某些實施方式中，TRAIL受體結合劑是抗TRAIL受體多肽抗體，例如抗TRAIL受體多肽單克隆抗體、抗TRAIL受體多肽嵌合抗體和抗TRAIL受體多肽人源化抗體，它們已經^^修飾，例如通過刪除、添加或替換抗體的一部分而被修飾。例如，抗TRAIL受體多肽抗體意圖提高抗體的半衰期，例如，血清半衰期、穩定性或親和力。在一個實施方式中，通過產生雜交瘤來便利化對TRAIL受體多肽的特定結構域特異性的抗體的選擇，所述雜交瘤結合具有這種結構域的TRAIL受體多肽的片段。因而，本文也提供這樣的TRAIL受體結合劑，它們是對TRAIL受體多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物內期望的結構域具有特異性的抗體。本發明進一步包括這樣的抗體，它們是針對本發明的結合劑的抗獨特型。本發明的結合劑可以是單特異性、雙特異性、三特異性的，或更多特異性的。多特異性結合劑可以特異於本發明的TRAIL受體多肽的不同的表位，或可以既特異於本發明的TRAIL受體多肽，又特異於異源組分(compositions),例如異源多肽或固相支持材料。參見，例如，WO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793;Tutt等人，//wmw"o/.147:60-69(1991);美國專利Nos.5,573,920,4,474,893，5,601,819，4,714,681，4,925,648;6,106,835;Kostelny等人，《//wmw"o/.148:1547-1553(1992)。本發明的結合劑可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優選的，結合劑是人類、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的。本發明的結合劑適合於在有需要的場合(利用用於調節TRAIL受體多肽功能)向受試者施用。因而，本發明的進一步的目的是提供TRAIL受體結合劑組合物(compositions)，它們是TRAIL受體調節物，例如TRAIL受體多肽的功能拮抗劑或功能激動劑。本發明的目的還在於提供這樣的TRAIL受體結合劑成分，它們是TRAIL受體多肽的部分拮抗劑(partialantagonist)或部分激動劑(partialagonist)。同樣地，本發明包括抗TRAIL受體中和抗體，其結合TRAIL受體多肽。在優選的實施方式中，本發明的結合劑將純化至(a)抗體如Lowry方法(Lowry等人，J歷o/.O^w.265.1951)所測定的超過95%重量；(2)達到通過使用旋轉杯測序儀足以獲得至少15個N-末端或內部胺基酸序列的程度，或(3)達到利用考馬斯藍或優選的銀染色在還原或非還原條件下SDS-PAGE的均一。分離的結合劑包括原位存在於重組細胞內的多肽，這是因為抗體的天然環境的至少一種成分將不會存在。然而通常地，TRAIL受體結合劑，例如分離的抗TRAIL受體抗體，將通過至少一個純化步驟來製備。本發明進一步涉及在可用於鑑定、設計和生產作為TRAIL受體多肽的調節物起作用的化合物的、基於結構的方法。本發明的結合劑可以單獨地或與其他組合物(compositions)組合地使用。例如，本發明的TRAIL受體結合劑可以與本領域已知的一種或多種抗TRAIL受體單克隆抗體，例如但不限於Zhou等人，US2003/0198637;Zhou等人，US2003/0190687所描述的那些；以及抗TRAIL-R2抗體TRA-8(Sankyo)組合地使用。本發明的TRAIL受體結合劑可以進一步在N或C末端重組地融合到異源多肽，或化學地綴合(包括共價和非共價地綴合)到多肽或其他組合物(compositions)。例如，本發明的TRAIL受體結合劑可以重組地融合或綴合到可在4企測分析中作為標記的分子和效應分子，例如異源多肽、藥物或毒素。參見，例如，WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;美國專利No.5,314,995;和EP0396387。在某些實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑是抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體相關多肽，它們偶聯或綴合到一種或多種治療性或細胞毒性模塊來產生本發明的TRAIL受體結合劑綴合蛋白質。本發明的TRAIL受體結合劑綴合蛋白質可以用於修飾給定的生物應答或產生生物應答(例如，以募集效應物細胞)。治療性模塊不應被為限於經典的化學治療劑。例如，治療性模塊可以是具有期望的生物學活性的蛋白質或多肽。這些蛋白質可以包括，例如，酶活性毒素，或其活性片段，如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，例如腫瘤壞死因子或幹擾素-a;或生物應答修飾物，例如，淋巴因子、白細胞介素-1("IL-r)、白細胞介素-2("IL-2")、白細胞介素-6("IL-6")、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子("GM-CSF，，)、粒細胞集落刺激因子("G-CSF,)、或其他生長因子。本發明的TRAIL受體結合劑的製備方法一疾/乾迷.首先，選擇目標多肽，針對它可以產生(raise)本發明的結合劑(例如抗TRAIL受體抗體)。產生針對目標多肽的結合劑的技術是本領域技術人員公知的。這樣的技術的實例包括，例如但不限於，涉及展示庫、人抗體轉基因小鼠(xenomouse)或人單抗轉基因小鼠(humabmouse)、雜交瘤等等的那些。在本發明的範圍內的目標多肽包括能夠展現抗原性的任何多肽或多肽衍生物。實例包括但不限於，蛋白質(例如，受體、酶、激素、生長因子)、肽、糖蛋白、脂蛋白、TRAIL受體多肽，等等。示範性的目標多肽還包括細菌、真菌和病毒病原體，其引起人類疾病，例如HIV、肝炎(曱型、乙型和丙型)、流感、皰瘮、賈第鞭毛蟲、瘧疾、利什曼蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。其他目標多肽是表達水平或組成與人類疾病或其他表型相關的人類蛋白質。感興趣的其他目標多肽包括腫瘤細胞抗原和病毒顆粒^元原。來使用，而且重組地工程化的抗體和抗體片段，例如，針對TRAIL受體多肽的抗體相關的多肽也是適合的。可以進行在此闡述的技術的結合劑，例如，抗TRAIL受體抗體，包括單克隆的和多克隆的抗體，和抗體片段，例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd、scFv、雙抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或抗體片段。已經描述了對於含抗體Fv的多肽，例如Fab，和F(ab，)2抗體片段的高產量產生有用的方法。參見美國專利No.5,648,237。一般地，結合劑從來源物種獲得。更特別地，獲得對目標多肽抗原具有特異性的來源物種抗體的輕鏈、重鏈或兩者的可變部分的核酸或胺基酸序列。來源物種是任何對於產生本發明的結合劑或結合劑的文庫有用的物種，例如大鼠、小鼠、兔、雞、猴、人類，等等。在優選的實施方式中，TRAIL受體結合劑是抗TRAIL受體抗體。噬菌體或噬菌粒展示技術是得到本發明的結合劑的有用的技術。在本發明中有用的抗TRAIL受體抗體是"人類抗體，，(例如，分離自人類的抗體)或"人類序列抗體"。人類抗體可以通過本領域已知的多種方法包括噬菌體展示方法來產生。也參見，美國專利4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318;以及WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741。已經描述了用於通過篩選多聚噬菌體(polyphage)顆粒來鑑定多聚體多肽複合物中的成員的編碼核酸序列的方法。Rudert等人，美國專利6,667，150。另外，可以產生重組免疫球蛋白。Cabilly,美國專利4,816,567;Cabilly等人，U.S.6,331,415和Queen等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA86:10029-10033,1989。產生和克隆單克隆抗體的技術是本領域技術人員公知的。本發明的TRAIL受體結合劑優選的具有高免疫反應性，也就是說，正確摺疊從而能特異性結合目標抗原的抗體分子的百分比。編碼結合劑，例如本發明的抗體的序列的表達可以如下文所述在大腸桿菌(E.coli)中進行。這樣的表達通常產生至少80%、90%、95%或99%的免疫反應性。這些蛋白質或基因的某些截短物能行使完整序列蛋白質或基因的調節功能或酶功能。例如，可以通過能提供功能上等同的蛋白質或基因的替換、添加、刪除或多聚體表達來改變編碼它們的核酸序列。由於核酸編碼序列的簡併性，編碼與天然存在的蛋白質的序列基本上相同的胺基酸序列的其他序列可以在本發明的實踐中使用。這些序列包括但不限於包括編碼上述多肽的核酸序列的全部或部分的核酸序列，這樣的核酸序列的改變是通過用編碼序列內的功能等同胺基酸殘基的不同密碼子進行替換，由此產生沉默的改變(silentchange)。要理解的是，根據本發明的免疫球蛋白的核苦酸序列可以容忍最多達25%的序列同源性變異_一按照通過標準方法所計算的("CurrentMethodsinSequenceComparisonandAnalysis,"MacromoleculeSequencingandSynthesis,SelectedMethodsandApplications,pp.127-149,1998，AlanR.Liss,Inc.)——只要這種變體形成識別TRAIL-R1和TRAIL-R2的起作用的抗體。例如，多肽序列內的一個或多個胺基酸殘基可以被替換40為作為功能等同物的、具有類似極性的其他胺基酸，從而產生沉默的改變。用於替換序列內的胺基酸的胺基酸可以從被替換的胺基酸所屬的類別的其他成員中選擇。例如，非極性的(疏水性)胺基酸包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和曱硫氨酸。極性的中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電的(鹼性的)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性的)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。本發明的範圍還包括在翻譯期間或之後被差異地修飾——例如通過糖基化、蛋白酶切割、與抗體分子或其他細胞配體連接等方式——的蛋白質或其片段或衍生物。另外，可以對抑制劑的編碼核酸序列進行體外或體內突變來產生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或在編碼區域中產生變異，和/或形成新的限制性內切酶位點，或破壞先前存在的限制性內切酶位點，來促進進一步的體外修飾。可以使用本領域已知的用於誘變的任何技術，包括但不限於體外定點誘變J.Biol.Chem.253:6551,Tab接頭(Pharmacia)的使用等等。;^聲我A清和名瘦^的賴備.產生本發明的抗體或抗體片段的方法一般包括用純化的TRAIL受體多肽或用表達TRAIL受體多肽的細胞免疫受試者(一般是非人類受試者，例如小鼠或兔)。TRAIL受體多肽的任何免疫原性部分都可以被採用作為免疫原。合適的免疫原性製備物可以含有，例如，重組表達的TRAIL受體多肽或化學合成的TRAIL受體多肽。可以使用分離的TRAIL受體多肽或其部分或片段作免疫原，利用多克隆和單克隆抗體製備的標準技術來產生結合TRAIL受體多肽或其部分或片段的TRAIL受體結合劑。可以使用全長TRAIL受體多肽，或者，作為選擇，本發明提供了TRAIL受體多肽片段作為免疫原的用途。TRAIL受體多肽包含SEQIDNO:1所示胺基酸序列的至少四個胺基酸殘基，並包括TRAIL受體多肽的表位，從而針對所述肽產生的抗體與所述TRAIL受體多肽形成特異性免疫複合物。優選地，抗原肽包含至少5、8、10、15、20或30個胺基酸殘基。取決於用途並根據本領域技術人員公知的方法，更長的抗原肽有時比較短的抗原肽是更優選的。一般地，免疫原將是長度至少約8個氨基醯殘基，優選的至少約IO個醯基殘基長度。給定表位的多聚體有時比單體更有效。如果需要，TRAIL受體多肽(或其片段)的免疫原性可以通過融合或綴合於半抗原例如鑰孔血藍蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)來提高。許41多這類半抗原是本領域已知的。人們也可以組合TRAIL受體多肽和常規的佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑來提高受試者對所述多肽的免疫反應。用於提高免疫反應的各種佐劑包括，但不限於，弗氏(完全和不完全的)、礦物質凝膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性物質(例如，溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、二硝基苯酚，等等)、人類佐劑例如卡介苗和短小棒狀桿菌(Cw7"eZwc&Ww/w;"rv"w)，或相似的免疫刺激性化合物。這些技術是本領域標準的。為了方便起見，在本發明中免疫應答常常被描述為"初次"或"二次"免疫反應。初次免疫應答，其也被描述為"保護性"免疫應答，是指作為對於特定抗原(例如TRAIL受體多肽)的某種初次暴露(例如初次"免疫")的結果，在個體中產生的免疫反應。這種免疫可以，例如，作為對抗原(例如，來自某些展現或呈遞抗原的病原體的初次感染)的某種天然的暴露的結果而發生，也可以來自個體中某些腫瘤(例如惡性黑色素瘤)的癌細胞所呈遞的抗原。做為選擇，免疫的發生可以是用含有抗原的疫苗接種個體的結果。例如，疫苗可以是包含來自TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的一種或多種抗原的TRAIL受體疫苗。初次免疫應答可以隨著時間減弱或衰減，甚至可以消失或至少變得太衰弱而不能被檢測。因而，本發明還涉及"二次，，免疫反應，其在此還被描述為"記憶免疫反應，，。術語二次免疫反應是指在已經產生初次免疫應答之後在個體中引發的免疫反應。因而，可以引發二次或免疫應答，例如，來增強已經變得減弱或衰減的現有免疫應答，或來重建消失的或不能再被檢測的早先的免疫應答。作為實例而不是為了限制，二次免疫應答可以通過向個體重新導入引發初次免疫應答的抗原，例如TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽(例如，通過重新施用疫苗)來引發。然而，針對抗原的二次免疫應答也可以通過施用不含有實際的抗原的其他試劑來引發。例如，本發明提供了通過向個體施用TRAIL受體結合劑來強化二次免疫應答的方法。在這樣的方法中，實際的抗原不必與TRAIL受體結合劑一起施用，含有TRAIL受體結合劑的組合物不必含有抗原。二次或記憶免疫應答可以是體液的(抗體)應答或細胞的應答。二次或記憶體液反應在抗原的初次呈遞時產生的記憶B細胞受到刺激時發生。延遲型超敏反應(DTH)反應是一種細胞的二次或記憶免疫應答，其由CD4+細胞介導。對於抗原的第一次暴露致敏免疫系統，另外的暴露引起DTH。在合適的免疫之後，可以從受試者的血清製備TRAIL受體結合劑，例如，抗TRAIL受體多克隆抗體。如果需要，可以從哺乳動物(例如，從血液)分離針對TRAIL受體多肽的抗體分子，並進一步通過公知的技術，例如多肽A層析來進一步純化，以獲得IgG級分。卓^發我伴.在本發明的一個實施方式中，所述結合劑是抗TRAIL受體單克隆抗體。在本發明的一個實施方式中，所述抗TRAIL受體單克隆抗體是人類抗TRAIL受體單克隆抗體。對於針對特定的TRAIL受體多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物的單克隆抗體的製備，可以利用任何通過連續細胞系培養來提供抗體分子的產生的技術。這些技術包括，但不限於，雜交瘤技術(參見,例如Kohler和Milstein,1975.Nature256:495-497);三源雜交瘤(trioma)技術；人類B細胞雜交瘤技術(參見，例如Kozbor等人，1983.Immunol.Today4:72)和EBV雜交瘤技術，來產生人類單克隆抗體(參見，例如Cole等人，1985.MONOCLONALANTIBOD正SANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss，Inc.,pp.77-96)。人類單克隆抗體可以在本發明的實踐中利用，可以通過使用人類雜交瘤(參見例如Cote等人，1983.ProcNatlAcadSciUSA80:2026-2030)或通過用EB病毒體外轉化人類B細胞(參見例如Cole等人，1985.MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)來產生。例如，可以分離編碼抗體的區域的核酸的群體。利用來自編碼抗體的保守區域的序列的引物進行PCR，從群體擴增編碼抗體的部分的序列，然後從擴增的序列重建編碼抗體或其片段(例如可變域)的DNA。這種擴增的序列還可以融合於編碼其他蛋白質(例如，噬菌體包殼，或細菌細胞表面蛋白質)的DNA，用於融合多肽在噬菌體或細菌上的表達或展示。然後可以將擴增的序列加以表達，並根據，例如，所表達的抗體或其片段對TRAIL受體多肽上呈現的抗原或表位的親和力來加以進一步選擇或分離。作為選擇，表達抗TRAIL受體單克隆抗體的雜交瘤可以通過免疫受試者，然後利用常規方法從受試者的脾臟分離雜交瘤來製備。參見，例如，Milstein等人(Galfre和Milstein,M"/zocfe五"zjmo/(1981)73:3-46)。利用標準方法篩選雜交瘤將產生具有不同的特異性(即，針對不同的表位)和親和力的單克隆抗體。具有希望的性質(例如TRAIL受體結合)的選定的單克隆抗體可以如雜交瘤所表達的來使用，可以將它結合到聚乙二醇(PEG)等分子來改變它的性質，或可以分離編碼它的cDNA,對其加以測序並以各種方式操作。可以向合成的杉於型體(dendromeric)樹添加反應性的胺基酸側鏈，例如賴氨酸，來增強TRAIL受體多肽的免疫原性性質。並且，CPG二核苷酸技術可以用於增強TRAIL受體多肽的免疫原性性質。其他操作包括替換或刪除對於保存期間或在向受試者施用之後的抗體不穩定性有貢獻的特定氨基醯基殘基，以及親和成熟技術來改善TRAIL受體多肽的抗體的親和力。染i^f^j.在一個實施方式中，本發明的結合劑是通過雜交瘤產生的抗TRAIL受體單克隆抗體，所述雜交瘤包括從轉基因非人動物，例如轉基因小鼠獲得的、具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組、融合到永生細胞的B細胞。雜交瘤技術包括本領域已知的那些，在Harlow等人，爿Z^fZ)ora/or>>Mawwa/ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,349(1988);Hammerling等人，Mowoc/owa/爿w幼cxto爿mf!T-CW///y6nWomos,563-681(1981)中有所教導。產生雜交瘤和單克隆抗體的其他方法是本領域技術人員公知的。^霧謬看^^^.如上所述，本發明的結合劑可以通過應用重組DNA和噬菌體展示技術來產生。例如，本發明的結合劑，例如，抗TRAIL受體抗體，可以使用本領域已知的各種噬菌體展示方法來製備。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結構域被展示在噬菌體顆粒的表面，噬菌體顆粒攜帶編碼它們的多核苦酸序列。通過直接用抗原(一般是結合或被捕獲到固體表面或珠子上的抗原)進行選擇，可以從抗體庫或組合抗體文庫(例如，人類或鼠的)選擇具有希望的結合性質的噬菌體。這些方法中使用的噬菌體一般是絲狀噬菌體，包括fd和M13，.而Fab、Fv或二硫化鍵穩定化的Fv抗體結構域重組融合於噬菌體基因III或基因VIII蛋白質。此外，方法可以調適用於構建Fab表達庫(參見，例如Huse等人，Science,246:1275-1281,1989)來容許快速而有效地鑑定對TRAIL受體多肽(例如，多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物)具有希望的特異性的單克隆Fab片段。可以用來產生本發明的結合劑的噬菌體展示方法的其他實例包括在Huston等人，/Voc.A^/.爿cadt/,SJ.，85:5879-5883,1988;Chaudhary等人，/Voc.iVa"^cadSc/C/.S.A，87:1066-1070,1990;Brinkman等人，/mmw"o/.MeAoA182:41-50，441995;Ames等人，《//mww"o/.MeAoA184:177-186，1995;Kettleborough等人，五wr//廳畫/.24:952-958,1994;Persic等人，G騰187:9-18，1997;Burton等人，A/va"caw."/mmw"o/ogy57:191-280，1994;PCT/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;WO96/06213;WO92/01047(MedicalResearchCouncil等人)；WO97/08320(Morphosys);WO92/01047(CAT/MRC);W091/17271(Affymax);和美國專利5，698，426、5,223,409、5，403，484、5,580,717、5,427，卯8、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5，427，908、5,516,637、5,780,225、5，658，727和5,733,743中公開的那些。對於通過用二硫鍵連接多肽而在噬菌體顆粒的表面上展示多肽的方法已經在Lohning,美國專利6，753，136中有所描述。如在上述參考文獻中描述的，在噬菌體選擇之後，可以從噬菌體分離抗體編碼區並用於產生完整的抗體，包括人類抗體、或任何其他希望的抗原結合片段，並在任何希望的宿主中表達，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌。例如，也可以利用重組產生Fab、Fab，和F(ab，)2片段的技術，這些技術利用本領域已知的方法，例如在WO92/22324;Mulli腿等人，腸rec/zm々腦12:864-869,1992;和Sawai等人，JJi/34:26-34，1995;和Better等人，5We"ce240:1041-1043,1988中公開的那些。一般地，為了鑑定出維持了良好的結合活性的變體，可以將克隆到展體或抗體片段將存在於噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上。參見，例如，BarbasIII等人，屍/zageZ)/5^/ay，Z^360n3/or7A/a"wa/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，2001)。然而，這個過程可以使用其他載體模式，例如，將抗體片段文庫克隆到裂解性噬菌體載體(修飾的T7或LambdaZap系統)中用於選擇和/或篩選。#逸的7TM/丄憂謬潛合豸的^這.如上所述，本發明的結合劑可以通過重組DNA技術的應用來產生。編碼本發明的TRAIL受體結合劑的重組多核芬酸構建體一般包括與抗TRAIL受體抗體鏈的編碼序列可操作地連接的表達控制序列，包括天然相關的或異源的啟動子區域。因而，本發明的另一個方面包括含有一個或多個編碼本發明的TRAIL受體結合劑的核酸序列的載體。對於本發明的一種或多種多肽的重組表達，通過本領域公知的重組DNA技術，並如以下詳述地，將含有編碼TRAIL受體結合劑的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入合適的克隆載體或表達載體(即，含有用於轉錄和翻"^所插入的多肽編碼序列的必需元件的載體)中。產生多樣性的載體群體的方法已經由Lerner等人，美國專利No.6,291,160;6,680,192描述了。'一般地，在重組DNA技術中有用的表達載體通常是質粒的形式。在本說明書中，"質粒，，和"載體"可互換地使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明意圖包括行使等同功能的、從技術上說不屬質粒的其他形式的表達載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷性逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。這種病毒載體可用於感染受試者和在受試者中表達化合物。優選地，表達控制序列是能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統。一旦載體被摻入到合適的宿主中，宿主維持在適合於編碼TRAIL受體結合劑的核苷酸序列的高水平表達、以及TRAIL受體結合劑(例如交叉反應性抗TRAIL受體抗體)的收集和純化的條件下。參見，一般地，美國申請No.20020199213。這些表達載體一般能夠在宿主生物體中作為游離體或作為宿主染色體DNA的組成部分進行複製。通常，表達載體含有選擇標記物，例如，氨千青黴素抗性或潮黴素抗性，以允許檢測被希望的DNA序列轉化了的那些細胞。載體還可以編碼對於指導細胞外抗體片段的分泌有用的信號肽，例如果膠酸裂合酶。參見美國專利5,576,195。本發明的重組表達載體包含編碼具有TRAIL受體結合性質的核酸，該核酸處於適合於該核酸在宿主細胞中表達的形式，意思是所述重組表達載體包括一種或多種基於表達用宿主細胞而選擇的、與要表達的核酸序列可操作連接的調節序列。在重組表達載體內，"可操作連接的"意指感興趣的核芬酸序列以允許所述核苷酸序列表達的方式與調節序列連接(例如，在體外轉錄/翻譯系統中，或者，當載體導入宿主細胞中時，在宿主細胞中)。術語"調節序列，，意圖包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如，多聚腺香酸信號)。例如，在Goeddel，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中描述了這些調節序列。調節序列包括在許多種類的宿主細胞中指導核苷酸序列的組成型表達的調節序列，和僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的調節序列(例如，組織特異性調節序列)。本領域技術人員要理解46的是，表達載體的設計可能取決於一些因素，例如要轉化的宿主細胞的選擇、希望的多肽表達水平，等等。作為重組多肽(例如，TRAIL受體結合劑)表達的啟動子有用的典型的調節序列包括，例如但不限於，3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導型的酵母啟動子包括，尤其是，來自乙醇脫氬酶、異細胞色素C和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。在一個實施方式中，編碼本發明的TRAIL受體結合劑的多核苷酸與araB啟動子可操作地連接，並可以在宿主細胞中表達。參見美國專利5,028,530。本發明的表達載體可以被導入宿主細胞，從而產生多肽或肽，包括由在此描述的核酸編碼的融合多肽(例如，TRAIL受體結合劑，等等)。本發明的另一個方面涉及表達TRAIL受體結合劑的宿主細胞，其含有編碼一種或多種TRAIL受體結合劑的核酸。本發明的重組表達載體可以被設計用於TRAIL受體結合劑在原核或真核細胞中的表達。例如，TRAIL受體結合劑可以在細菌細胞例如大腸桿菌、昆蟲細胞(利用杆狀病毒表達載體)、真菌細胞例如酵母、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。在Goeddel,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185，AcademicPress,SanDiego，Calif.(1990)中進一步討論了適合的宿主細胞。作為選擇，重組表達載體可以體外轉錄和翻譯，例如，使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。已經描述了通過隨機地產生的多核苷酸序列的表達，對製備篩選具有預定性質的多肽例如TRAIL受體結合劑有用的方法。參見美國專利5,763,192、5，723，323、5,814,476、5，817,483、5，824，514、5,976,862、6,492,107、6,569,641。原核生物中的多肽表達最常見地在帶有載體的大腸桿菌中進行，所述載體含有指導融合或非融合多肽表達的組成型或可誘導啟動子。融合載體向其中編碼的多肽添加許多胺基酸，通常添加到重組多肽的氨基末端。這些融合載體一般服務於三個目的(i)提高重組多肽的表達，(ii)提高重組多肽的溶解度，以及(iii)通過作為親和純化中的配體來幫助重組多肽的純化。通常，在融合物表達載體中，將蛋白酶水解位點導入到融合模塊和重組多肽的連接處，以允許在融合多肽的純化之後從融合模塊分離重組多肽。這些酶和它們的同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括,例如，pGEX(PharmaciaBiotechInc;SmithandJohnson,1988.Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，N丄)，其分別將穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合多肽或多肽A融合到目標重組多肽。適合的誘導型非融合大腸桿菌載體的實例包括pTrc(Amrann等人，(1988)Gene69:301-315)和pETlid(Studier等人，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。通過多肽融合來靶向組裝具有不同活性的肽或蛋白質結構域以產生多功能多肽的方法已經由Pack等人，美國專利6,294,353;6,692,935所描述。一種使大腸桿菌中的重組多肽(例如TRAIL受體結合劑)的表達最大化的策略是在蛋白水解該重組多肽的能力受損的宿主細菌中表達該重組多肽。參見，例如，Gottesman，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128。另一個策略是改變要插入表達載體中的核酸的核酸序列，從而每個胺基酸的各自密碼子是在表達宿主(例如大腸桿菌)中優先被利用的密碼子(參見，例如，Wada等人,1992.Nucl.AcidsRes.20:2111-2118)。本發明的這種核酸序列的改變可以通過標準的DNA合成技術來進行。在另一個實施方式中，TRAIL受體結合劑表達載體是酵母表達載體。用於在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerivisae)中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari等人，1987.EMBOJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Ce//30:933-943，1982)、pJRY88(Schultz等人，54:113-123，1987)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)和picZ(InVitrogenCorp,SanDiego,Calif.)。作為選擇，TRAIL受體結合劑可以使用杆狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達。可用於在培養的昆蟲細胞(例如，SF9細胞)中表達多肽(例如TRAIL受體結合劑)的杆狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，Mo/.CW/.歷o/.3:2156-2165，1983)和pVL系歹'J(LucklowandSummers,1989.Wra/，170:31-39)。在又一個實施方式中，編碼本發明的TRAIL受體結合劑的核酸使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括但不限於，pCDM8(Seed，.A^wre329:840,1987)和pMT2PC(Kaufinan等人，6:187-195，1987)。當在哺乳動物細胞中使用時，通常由病毒調節元件來提供表達載體的控制'功能。例如，常用的啟動子來源於多瘤48病毒(polyoma)、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。對於本發明的TRAIL受體結合劑的表達有用的原核和真核細胞的其他適合的表達系統。參見，例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,第16和17章，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989.在另一個實施方式中，重組哺乳動物表達載體能夠指導核酸優先地在特定細胞類型中表達(例如，使用組織特異性調節元件來表達核酸)。組織特異性調節元件是本領域已知的。適合的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝臟特異性；Pinkert等人，Dev.1:268-277,1987)、淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton,A/v./mm43:235-275,1988)、特別是T細胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore,EMBOJ.8:729-733,1989)和免疫球蛋白的啟動子(Banerji等人，1983.Ce〃33:729-740;Queen和Baltimore,Ce//33:741-748,1983.)、神經元特異性啟動子((例如，神經絲啟動子；Byrne和Ruddle，屍TOc.A^/.爿cad86:5473-5477,1989)、胰腺特異性啟動子(Edlund等人，1985.Science230:912-916)，和乳腺特異性啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利4,873,316和歐洲申請公開264,166)。還包括發育性調節的啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gmss,Scz'e"ce249:374-379,1990)和曱胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman，.Ge腦Dev.3:537-546,1989)。本發明進一步提供重組表達載體，其包含以反義方向克隆到表達載體中的本發明的編碼TRAIL受體結合劑的DNA分子。也就是說，DNA分子以這樣的方式與調節序列可操作地連接，從而能夠表達(通過DNA分子的轉錄)TRAIL受體結合劑mRNA的反義RNA分子。至於與按反義方向克隆的核酸可操作連接的調節序列，可以選擇指導反義RNA分子在各種細胞類型中的連續表達的調節序列，例如病毒啟動子或增強子，或可以選擇指導反義RNA的組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達的調節序列。反義表達載體可以是重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調節區域的控制下產生，其活性可通過導入了該載體的細胞類型來測定。對於利用反義基因調節基因表達的論述。參見，例如，Weintraub等人，"AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,"Reviews-TrendsinGenetics,Vol.1(1)1986。本發明的另一個方面涉及其中導入了本發明的重組表達載體的宿主細胞。術語"宿主細胞，，和"重組宿主細胞，，在此可互換地使用。要理解的是，該術語不僅僅指特定的受試者細胞，而且指這種細胞的子代或可能的子代。由於在後代中可能因突變或環境影響而出現某些改變，這種子代實際上可能不與母細胞完全相同，但仍然包括在此處使用的該術語的範圍內。宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。例如，TRAIL受體結合劑可以在細菌細胞例如大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞中表達。哺乳動物細胞是用於表達編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸區段的優選的宿主。參見Wi腿cker,F謂(7e廳7bC/o廳，(VCHPublishers，NY，1987)。本領域已經開發了能夠分泌完整的異源蛋白質的許多適合的宿主細胞系，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、各種COS細胞系、HeLa糹田胞、L細胞和骨髓瘤細胞系。優選地，所述細胞是非人類的。這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，例如複製起點，啟動子，增強子和必需的加工信息位點，例如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸位點，和轉錄終止子序列。Queen等人，/mmww/.Aev.89:49,1986。優選的表達控制序列是來自內源的基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等等的啟動子。Co等人，J7mm朋o/.148:1149，1992.其他適合的宿主細胞是本領域技術人員公知的。可以通過常規轉化或轉染技術將載體DNA導入到原核或真核細胞中。如在此使用的，術語"轉化"和"轉染"意指各種本領域已知的用於將外源核酸(例如DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化釣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體轉染或電穿孔，基因槍(biolistics)或基於病毒的轉染可以用於其他細胞宿主。用於轉化哺乳動物的其他方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射(一般參見，Sambrook等人，Mo/ecw/orC/o"/"g)。可以在Sambrook等人(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)和其他實驗手冊中找到轉化或轉染宿主細胞的適合的方法。根據細胞宿主的種類，含有感興趣的DNA片段的載體可以通過公知的方法轉移到宿主細胞中。對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知的是，取決於使用的表達載體和50轉染技術，僅小部分細胞可能將外源DNA整合到它們的基因組中。為了鑑定和選擇這些整合體，一般將編碼選擇標記(例如，抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起導入宿主細胞。各種選擇標記包括提供對藥物，例如G418、潮黴素和氨曱蝶呤的抗性的那些選擇標記。編碼選擇標記的核酸可以在編碼TRAIL受體結合劑的相同載體上導入宿主細胞，或可以在單獨的載體上導入。可以通過藥物選擇來鑑定導入的核酸穩定轉染的細胞(例如，納入了選擇標記基因的細胞將生存，而其他細胞將死亡)。包括本發明的TRAIL受體結合劑的宿主細胞，例如培養中的原核或真核宿主細胞，可以用於生產(即表達)重組TRAIL受體結合劑。在一個實施方式中，所述方法包括在適合的培養基中培養本發明的宿主細胞(其中已經導入了編碼TRAIL受體結合劑的重組表達載體)，從而產生TRAIL受體結合劑。在另一個實施方式中，所述方法進一步包括從培養基或宿主細胞分離TRAIL受體結合劑的步驟。一旦被表達，從培養基和宿主細胞中純化TRAIL受體結合劑(例如抗TRAIL受體抗體pRNA抗TRAIL受體抗體相關多肽)的收集物(collections)。TRAIL受體結合劑可以根據本領域的標準方法來純化，包括HPLC純化、柱層析、凝膠電泳，等等。在一個實施方式中，TRAIL受體結合劑通過Boss等人，美國專利4,816,397的方法在宿主生物體中產生。通常，抗TRAIL受體抗體鏈與信號序列一起表達，因而4皮釋放到培養基中。然而，如果宿主細胞天然地不分泌抗TRAIL受體抗體鏈，可以通過用溫和洗滌劑處理來釋^L抗TRAIL受體抗體^^連。重組多肽的純化是本領域公知的，包括硫酸銨沉澱、親和層析純化技術、柱層析、離子交換純化技術、凝膠電泳等等(一般參見Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。編碼TRAIL受體結合劑的多核苦酸，例如抗TRAIL受體抗體編碼序列，可以摻入轉基因中，用於導入轉基因動物的基因組，隨後在該轉基因動物的乳汁中表達。參見，例如，美國專利5,741,957、5,304,489和5,849,992。適合的轉基因包括與來自乳腺特異性基因，例如酪蛋白或P-乳球蛋白的啟動子和增強子可操作連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。為產生轉基因動物，可以將轉基因顯微注射到受精的卵母細胞中，或可以摻入胚胎幹細胞的基因組中，並這些細胞的核轉移到去核的卵母細胞中。#鏈我#.在一個實施方式中，本發明的結合劑是單鏈抗TRAIL受體抗體。根據本發明，可以將一些技術加以調適用於生產對TRAIL受體多肽特異性的單鏈抗體(參見，例如，美國專利4,946,778)。可以用於產生本發明的單鏈Fv和抗體的技術的實例包括在美國專利4,946,778和5,258,498;Huston等人，MdW""五，膨/ogy，203:46-88,1991;Shu，L.等人，屍rac.A^/.Jc^/.C/5L4，90:7995-7999，1993;和Skerra等人，5We"ce240:1038-1040,1988中公開的那些。嵌合我沐和人源化我謬.在一個實施方式中，本發明的結合劑是嵌合的抗TRAIL受體抗體。在一個實施方式中，本發明的結合劑是人源化的抗TRAIL受體抗體。在本發明的一個實施方式中，供者抗體和受者抗體是來自不同物種的單克隆抗體。例如，受者抗體是人類抗體(以使得它在人類中的抗原性最小化)，在這種情況下，如此產生的CDR移植的抗體被稱為"人源化，，抗體。可以使用標準重組DNA技術產生的重組抗TRAIL受體抗體，例如包含人類和非人類部分的嵌合和人源化單克隆抗體，處在本發明的範圍之內。對於某些應用，包括本發明的結合劑在人體中的體內使用以及這些試劑用於體外檢測分析的應用，優選的是使用嵌合的、人源化的或人類抗TRAIL受體抗體。這些嵌合的和人源化的單克隆抗體可以通過本領域已知的重組DNA技術產生。這些有用的方法包括，例如但不限於，在國際申請PCT/US86/02269;美國專利5,225,539;歐洲專利184187,歐洲專利171496;歐洲專利173494;PCT國際公開WO86/01533;美國專利4,816,567;5,225,539;歐洲專利125023;Better等人，1988.5We"ce240:1041-1043;Liu等人，1987.屍rac,Ato/.v4cat/.S",.USA84:3439-3443;Liu等人，1987./wmw"o/.139:3521-3526;Sun等人，1987.屍rac.Ato/.5W.USA84:214-218;Nishimura等人，1987.CancerRes.47:999-1005;Wood等人，1985.Nature314:446-449;Shaw等人，1988./A^/.Ca"cw/""80:1553-1559);Morrison(1985)Science229:1202-1207;Oi等人(1986)腸!Tec—腦4:214;Jones等人，1986.Atowe321:552-525;Verhoeyan等人，1988.5We"ce239:1534;Morrison,5We"ce229:1202,1985.，Oi等人，倫rec—腦4:214，1986;Gillies等人，V./mmw"o/.MeAc^s,125:191-202,1989;美國專利No.5，807，715;和Beidler等人，1988,乂/附ww"o/.141:4053-4060中描述的方法。例如，抗體可以使用各種技術，包括CDR移植(EP0239400;WO91/09967;美國專利5,530,101;5,585,089;5,859,205;6,248,516;EP460167)、飾面(veneering)或表面重修(resurfacing)(EPO592106;EP0519596;PadlanE.A.，Mo/ecw/a〃聽畫/ogv，28:489-498，1991;Studnicka等人，iV她/w五"&恥en'"g7:805-814,1994;Roguska等人，91:969-973,1994)和鏈改組(chainshuffling)(美國專利NO.5,565,332)來人源化。在一個實施方式中，編碼鼠抗TRAIL受體單克隆抗體的cDNA用限制性內切酶消化，所述限制性內切酶被特別地選擇來移動編碼Fc恆定區的序列，替換編碼人類Fc恆定區的cDNA的相當的部分(參見Robinson等人，PCT/US86/02269;Akira等人，歐洲專利申請184,187;Taniguchi，歐洲專利申請171,496;Morrison等人，歐洲專利申請173,494;Neuberger等人，WO86/01533;Cabilly等人，美國專利4,816,567;Cabilly等人,歐洲專利申請125,023;Better等人(1988)Science240:1041-1043;Liu等人(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:3439-3443;Liu等人(1987)JImmunol139:3521-3526;Sun等人(1987)iVocAto/爿cad5W84:214-218;Nishimura等人(1987)Owcwi&s47:999-1005;Wood等人(1985)A^wre314:446-449;andShaw等人(1988)/扁C眞er/"^80:1553-1559);美國專利6,180,370;美國專利6,300,064;6，696，248;6,706,484;6,828,422。在一個實施方式中，本發明容許構建人源化的抗TRAIL受體抗體，其不太可能誘導人類抗d、鼠抗體(以下稱為"HAMA")應答，而仍然具有有效的抗體效應物功能。如在此使用的，術語"人類，，和"人源化的"，就抗體而言，涉及任何預計在人類受試者中引發治療上可耐受的弱免疫原性反應的抗體。在一個實施方式中，本發明提供了人源化的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2雙特異性抗體，CTB003或hCTB003重鏈和輕鏈免疫J求蛋白。CDi我體.在一個實施方式中，本發明的結合劑是抗TRAIL受體CDR抗體。一般地，用於產生抗TRAIL受體CDR抗體的供者和受者抗體是來自不同物種的單克隆抗體；一般受者抗體是人類抗體(以使它在人體中的免疫原性最小化)，在這種情況下，如此產生的CDR移植的抗體被稱為"人源化的"抗體。移植物可以是受者抗體的單個Vh或VL內的單個CDR(或甚至單個CDR的一部分)，或可以是Vh和Vt之一或兩者之內的多個CDR(或其部分)。很多時候，受者抗體的所有可變域中的所有三個CDR都將被相應的供者CDR替換，儘管人們只需要替換必需數目的CDR以允許產53生的CDR移一直抗體對MetAp3的充分結合。產生CDR移4直的抗體和人源化抗體的方法在Queen等人，美國專利5,585,089，美國專利5,693,761;美國專利5,693,762;和WinterU.S.5,225,539;以及EP0682040中有所教導。制各Vh和Vi多肽的有用方法在Winter等人，美國專利4,816,397;6,291,158;6,291,159;6,291,161;6，545，142;EP0368684;EP0451216;EPO120694中有所教導。在從同一家族和/或同一家族成員選擇了適合的候選框架區域之後，通過將來源物種的CDR移植到雜合框架區域中來產生重鏈和/或輕鏈可變區。，具有雜合(就上述兩個方面中的任一個而言)的可變鏈區域的雜合抗體或雜合抗體片段的組裝可以使用本領域技術人員已知的常規方法來實現。例如，編碼在此描述的雜合可變域(即，基於目標物種的框架和來源物種的CDR)的DNA序列可以通過寡核苷酸合成和/或PCR來產生。也可以使用適合的限制性內切酶從來源物種抗體分離編碼CDR區域的核酸，並通過用適合的連接酶連接來將其連接到目標物種框架中。作為選擇，可以通過定點誘變來改變來源物種抗體的可變鏈的框架區域。由於雜合體是從對應於各個框架區域的多個候選物之中的選擇來構建的，存在著許多可以依照本文描述的原則來進行構建的序列組合。因而，可以組裝雜合體的文庫，這樣的文庫的成員具有單個框架區域的不同組合。這種文庫可以是序列的電子資料庫集合或雜合體的實體集合。這個過程一般不改變位於被移植的CDR側面的受者抗體的FR。然而，相應的供者抗體的FR，來改善產生的抗TRAIL受體CDR移植抗體的抗原結合親和力。優選的替換位置包括鄰近CDR的胺基酸殘基，或者能夠與CDR相互作用的殘基(參見，例如，US5,585,089，特別是第12-16欄)。或者本領域技術人員可以從供者FR開始，對它進行修飾來使它更類似於受者FR或人類共有FR。產生這些修飾的技術是本領域已知的。特別地，如果產生的FR在該位置符合人類共有FR,或與這種共有FR有至少90%或更高的同一性，那麼這樣做可能不會使得到的修飾的抗TRAIL受體CDR抗體的抗原性與具有完全人類FR的相同抗體相比發生顯著提高。融合蛋^.在一個實施方式中，本發明的結合劑是融合蛋白。本發明的TRAIL受體結合劑當與第二種蛋白質融合時，可以用作抗原標籤。可以融54合到多肽的結構域的實例不僅包括異源信號序列，還包括其他異源功能區域。融合不一定需要是直接的，可以通過接頭序列來融合。此外，本發明的融合蛋白也可以被工程化來改善TRAIL受體結合劑的特徵。例如，可以將由其他胺基酸，特別是帶電胺基酸構成的區域添加到TRAIL受體結合劑的N-末端，來改善在從宿主細胞純化或後續的處理和保存期間的穩定性和持久性。並且，可以將肽模塊添加到TRAIL受體結合劑以便於純化。這些區域可以在TRAIL受體結合劑的最終製備之前予以去除。添加肽模塊以便於多肽的處理是本領域慣用的和常規的技術。本發明的TRAIL受體結合劑可以融合到標記物序列，例如，便於融合多肽的純化的肽。在優選的實施方式中，標記物胺基酸序列是六聚組氨酸肽，例如在pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,Calif.，91311)等中提供的標籤，它們中許多是商業上可獲得的。如Gentz等人，/Voc.Ato/.Jcad6^486:821-824，1989中描述的，六聚組氨酸使得純化融合蛋白易於進行。對於純化有用的另一個肽標籤，"HA，，標籤，對應於來自流感血凝素蛋白質的表位。Wilson等人，CW/37:767，1984。因而，這些上述融合物的任一種可以利用本發明的多核苷酸或多肽來工程化。並且，融合蛋白可以顯示增加的體內半衰期。具有二硫鍵連接的二聚結構(由於IgG)的融合蛋白，與單獨的單體型分泌蛋白質或蛋白質片段相比，在結合和中和其他分子方面可能是更有效的。Fountoulakis等人，J!歷0c/7e肌270:3958-3964，1995.類似地，EP-A-0464533(對應於加拿大的2045869)公開了一些融合蛋白，它們包含免疫球蛋白的恆定區的不同部分以及另一種人類蛋白質或其部分的。在很多情況下，融合蛋白中的Fc部分對於治療和診斷是有益的，因而可以產生，例如，改善的藥物動力學性質。參見EP-A0232262。作為選擇，可能希望在表達、檢測和純化了融合蛋白之後刪除Fc部分。例如，如果融合蛋白被用作免疫的抗原，Fc部分可能阻礙治療和診斷。在藥物發現中，例如，人類蛋白質，如hlL-5已經與Fc部分融合，為了高通量篩選分析來鑑定hIL-5的拮抗劑。Bennett等人，/Mo/ecw/wiecog"z'"o"8:52-58，1995;Johanson等人，7!所o/.Ozem.，270:9459-9471,1995。遞d7細應4/i發謬的治《f冷l的4名瘦fcfe"www2/z加'o",臨床使用中的許多治療蛋白質已經顯示了引發不希望的抗體應答，這些應答在某些情況下伴隨著不良事件。在本發明的一個實施方式中，通過鑑定重組抗TRAIL受體抗體、TRAIL受體多肽或TRAIL受體結合劑的胺基酸序列中對於給定物種的T細胞的一個或多個潛在的表位，並修飾所述胺基酸序列來消除至少一個T細胞表位，使得所述抗體、多肽或結合劑對於給定的物種具有非免疫原性或較低的免疫原性。這樣就消除了或降低了多肽或蛋白質暴露於給定物種的免疫系統時所述多肽或蛋白質的免疫原性。這樣的去免疫化對單克隆抗體和其他免疫球蛋白樣分子可能特別有益，例如，可以對小鼠衍生的免疫球蛋白加以去免疫以用於人類治療用途。對於去免疫多肽或蛋白質的方法，參見，例如，Carr等人，美國專利申請20030153043;和DeGroot等人，AK^ias.朋d//wm朋7dravZms^13:539-541(1997);Schafer等人，Fac"'"e16:1880-1884(1998);DeGroot等人，Dev.112:71-80(2003);DeGroot等人，J^cc/we19:4385-4395(2001);Reijo腿andKwokMeAo&29:282-288;Novak等人，J/www"o/ogy166:6665-6670(2001)。在一個實施方式中，使用編碼作為融合蛋白的一部分的候選結合劑(其中這些融合蛋白在宿主細胞中表達時形成包涵體)的基因組DNA或EST來製備本發明的TRAIL受體結合劑。這種編碼作為融合蛋白的一部分的候選結合劑(其中這些融合蛋白在宿主細胞中表達時形成包涵體)的基因組DNA或EST的製備方法已經有所描述，參見專利6,653,068;U.S.S.N.20040157291。例如，包涵體可用於產生特異性結合目標(多)肽的結合配偶體，例如TRAIL受體結合劑。7TL4/丄f體潛合^/綴合f冷如上所述，在某些優選的實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑是抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體相關多肽，其偶聯或綴合於一種或多種治療性或細胞毒性模塊來產生本發明的TRAIL受體結合劑綴合蛋白。任選地，本發明的TRAIL受體結合劑可用作TRAIL受體結合劑-細胞毒素綴合分子，例如用於腫瘤疾病治療的施用。一般地，治療模塊可以綴合於本發明的TRAIL受體結合劑，例如，通過任何合適的技術，同時適當地考慮藥物動力學穩定性和降低對受試者的總體毒性的需要。治療性、細胞毒性、或標記/顯象試劑(即，"模塊")可以直接或間接(例如通過接頭基團)偶聯於適合的TRAIL受體結合劑。當模塊和TRAIL受體結合劑各自具有能夠相互起作用的功能基團時，模塊和TRAIL受體結合劑之間的直接反應是可能的。例如，親核基團，例如氨基或巰基基團，能夠與含有羰基的基團例如肝或酸性滷化物(acidhalide)反應，或與含有良好的離去基團(例如滷素)的烷基(alkylgroup)反應。作為選擇，可以使用適合的化學接頭基團。接頭基團可以起間隔區的作用，使所述模塊遠離所述TRAIL受體結合劑，以避免對結合能力的幹擾。接頭基團也可以用來提高所述模塊或TRAIL受體結合劑上的取代基的化學反應性，並從而提高偶聯效率。化學反應性的提高也可以使得本不可能使用的模塊或模塊上的功能基團變得容易使用。適合的連接化學包括馬來醯亞胺基接頭和烷基卣接頭(其與抗體模塊上的巰基反應)和琥珀醯亞胺基接頭(其與抗體模塊上的伯胺反應)。幾個伯胺和巰基基團存在於免疫球蛋白上，其他的基團可以設計到重組免疫球蛋白分子中。對於本領域技術人員明顯的是，各種雙官能或多官能試劑，包括同官能和異官能的(例如，在PierceChemicalCo.,Rockford，Ill.的目錄中描述的那些)，可以用作接頭基團。結合可以例如通過氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基來進行(參見，例如，美國專利4,671,958)。作為備選的偶聯方法，可以，例如，經由糖基化位點處的氧化的糖基團將模塊偶聯到本發明的TRAIL受體結合劑上，如在美國專利5,057,313和5,156,840中描述的。結合TRAIL受體結合劑到所述部分上的又一個可選擇的方法是通過使用非共價結合配對，例如，鏈黴抗生物素蛋白/生物素，或抗生物素蛋白/生物素。在這些實施方式中，將所述配對的一個成員共價結合到TRAIL受體結合劑，結合配對的另一個成員共價結合到所述模塊上。^T襲,fb/eavaWe)如果本發明的免疫綴合物的細胞毒性或治療模塊在沒有TRAIL受體結合劑部分時效力更強，則可能希望是使用這樣的接頭基團，其在內在化到細胞中的期間或當時可裂解，或在細胞外環境中可隨著時間逐漸地裂解。已經描述了許多不同的可裂解接頭基團。在細胞內將細胞毒性模塊從這些接頭基團上釋放的實例包括，例如，但不限於，通過二硫鍵的還原來裂解(例如，美國專利4,489,710)、通過對光不穩定鍵的照射(例如，美國專利4,625,014)、通過衍生化的胺基酸側鏈的水解(例如，美國專利4,638,045)、通過血清補體介導的水解(例如，美國專利4,671,958),和酸催化的水解(例如，美國專利4,569，789)。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與超過一種治療性、細胞毒性和/或顯像模塊結合。通過多衍生化(poly-derivatizing)本發明的TRAIL受體結合劑，可以同時地實現幾種細胞毒策略，可以將TRAIL受體結合劑製成對幾種可視化技術有用的造影劑，或可以對治療性抗體加以標記以用於通過可視化技術來追蹤。在一個實施方式中，將細胞毒性模塊的多個分子連接到一個TRAIL受體結合劑上。在一個實施方式中，將本發明的TRAIL受體結合劑與至少兩種模塊的混合物偶聯，所述模塊選自由細胞毒性模塊、治療模塊、和標記/顯像模塊構成的組。也就是說，多於一種類型的模塊可以連接到一個TRAIL受體結合劑上。例如，治療模塊，例如多核苷酸或反義序列，可以與細胞毒性或放射毒性模塊一起綴合於TRAIL受體結合劑，以提高化學或放射毒性治療的有效性，以及降低獲得希望的治療效果所必需的劑量。不考慮特定的實施方式，可以以各種方式製備與多於一種模塊所成的免疫綴合物。例如，可以將多於一種模塊直接偶聯到TRAIL受體結合劑上，或者可以使用提供多個附接位點的接頭(例如，樹枝狀聚合物(dendrimers))。作'為選擇，可以使用具有容納多於一種細胞毒模塊的容量的載體。如上文說明的，TRAIL受體結合劑可以以各種方式攜帶所述模塊，包括直接或經由接頭基團的共價鍵合，和非共價的締合。在一個實施方式中，TRAIL受體結合偶聯的蛋白質可以與封裝載體組合。這在化學毒性治療實施方式中是特別有用的，因為它們可以容許治療組合物隨著時間逐漸地釋放TRAIL受體結合劑化學毒性模塊，同時將它濃縮在目標細胞的附近。與放射###綏合的7TL4/丄f沐潛合遊.在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與細胞毒性模塊偶聯，所述細胞毒性模塊是放射性核素。優選用作本發明的細胞毒性模塊的放射性核素是適合於藥理學施用的放射性核素。這些放射性核素包括'231、125I、131I、9GY、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb、和212Bi。碘和砹同位素是用於本發明的治療組合物中的更優選的放射性核素，關於它們的用途已經積累了大量的文獻。1311是特別優選的，其他的P-輻射發射性核素也是，它們具有幾毫米的有效範圍。123I、125I、1311或^At可以與TRAIL受體結合劑綴合，用於利用幾種已知的綴合試劑的組合物和方法中，所述已知的綴合試劑包括非水溶性跌化試劑(lodogen)、3-[^At]砹代苯曱酸(astatobenzoate)N-琥珀醯亞胺酯、3-[1311]碘代苯曱酸N-琥珀醯亞胺酯(SIB)和5-[1311]碘-3-吡啶羧酸N-琥珀醯亞胺酯(SIPC)。可以在上述珙代試劑中利用任何碘同位素。其他放射性核素可以通過核醫學領域的技術人員已知的適合的螯合試劑綴合到本發明的TRAIL受體結合劑上。化夢毒'/i禊塊.在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與化學毒性模塊偶聯。在本發明中有用的優選的化學毒性試劑包括，但不限於，小分子藥物，例如氨曱蝶呤，和嘧啶和"票呤類似物。優選的化學毒素分化誘導物包括佛波醇酯和丁酸。化學毒性模塊可以直接綴合於本發明的TRAIL受體結合劑。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑經由化學接頭綴合於細胞毒性模塊。在另一個實施方式中，模塊被封裝在載體中，載體則偶聯於本發明的TRAIL受體結合劑。蛋力,#^在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與蛋白質毒素模塊偶聯。用作本發明的細胞毒性模塊的優選的毒素蛋白質包括，例如但不限於，放線菌或鏈黴菌抗生素、duocarmycin、紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素(cytochalasin)B、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙4定(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂黴素C(mitomycin)、鬼臼乙叉甙(etoposide)、鬼臼p塞口分戒(tenoposide)、長春新石威(vincristine)、長春石成(vinblastine)、-火水仙石威(colchicin)、阿黴素(doxorubicin),柔紅黴素(daunorubicin)、二鞋炭疽菌素二酉同(dihydroxyanthracindidne)、米4乇蒽酉昆(mitoxantrone)、光鬥申黴素(mithramycin)、》文線菌素D(actinomycinD)、1-去氫睪酉同(1-dehydrotestosterone)、津唐皮質;敫素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤黴素(puromycin)和其類似物或同源物。用作細胞毒性模塊的優選的毒素蛋白質進一步包括蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、霍亂毒素(choleratoxin)、白樹毒素(gelonin)、假單胞菌外毒素(Pseudomonasexotoxin)、志賀氏菌毒素(Shigellatoxin)、商P^^t病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)和醫學生物化學領域已知的其他毒素蛋白質。由於這些毒素試劑可能在受試者中引發不希望的免疫應答，如果血管內注射尤為如此，因此優選是將它們封裝在載體中用於偶聯到本發明的TRAIL受體結合劑，例如本發明的抗TRAIL受體抗體和抗體相關多肽。躇活'/^毒,在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與酶活性毒素結合。酶活性毒素可以是細菌或植物來源的，或這種毒素的酶活性片段("A鏈")。在本發明中有用的的酶活性毒素和其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a-帚曲菌素(a-sarcin)、油桐(」/ewn'tes1》ra^')蛋白質、石竹素(dianthin)蛋白質、美洲商陸/acc"麵eWc畫)蛋白質(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(M9monfcac/zara^'a)抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、月巴皂草(Sa/7ao加n》q^cz'"a/W抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素、酚黴素和伊諾黴素本發明的TRAIL受體結合劑與細胞毒性模塊的綴合物可以使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備。這些試劑的實例有SPDP;IT;亞氨酸酯(諸如鹽酸二曱基己二醯亞胺酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯曱醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯曱醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。毒素的溶解性部分(lysingportion)可以與抗體(例如TRAIL受體結合劑)的Fab片段連接。治^V^^塊.在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與治療模塊偶聯。本發明的治療部分包括，例如但不限於，抗代謝物(例如，氨曱蝶呤(methotrexate)、巰噤呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥。票呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine)),烷化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派瘤可寧(thioepachlorambucil),美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)和洛莫司汀(lomustine,CCNU)、環石舞醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈唑黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycinC)禾口"頃式二氯二胺4白(cis畫dichlorodiamineplatinum)(II)(DDP)順鈾)，蒽環類抗生素(anthracyclines)(例如，柔紅黴素(daunorubicin)(舊稱道諾黴素(daunomycin))和阿黴素(doxorubicin))，抗生素(例如,放線菌素D(dactinomycin)(舊稱放線菌素(actinomycin))、博來黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)和氨茴黴素(anthramycin)(AMC))、阿黴素(doxorubicin)(亞德裡亞黴素(adriamycin))、順鉑、硫酸博來黴素(bleomycinsulfate)、卡莫司汀(carmustine)、瘤可寧(chlorambucil)、環碌醯胺鞋基脲(cyclophosphamidehydroxyurea)或蓖麻毒蛋白A(ricinA)，和抗有絲分裂試齊'J(例如，長春新石威(vincristine)和長春石鹹(vinblastine))。60將這種治療模塊綴合到本發明的TRAIL受體結合劑的技術是公知的，參見,侈寸嗦口,Arnon等人，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(編)，pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellst醒等人，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd,)，Robinson等人(編)，pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(編)，pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(編)，pp.303-16(AcademicPress1985),和Thorpe等人，"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",/wmw朋/.iev.,62:119-58(1982)。標記的7TM/丄f沐潛合教在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑與標記模塊，即可檢測基團結合。綴合於本發明的TRAIL受體結合劑的特定的標記物或可檢測基團不是本發明的關鍵方面，只要它不顯著地影響本發明的TRAIL受體結合劑對TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的特異性結合。可檢測基團可以是具有可檢測的物理或化學性質的任何材料。這些可檢測標記在免疫分析和顯像領域已經得到了良好的開發，一般地，在這些方法中有用的幾乎任何標記物都可以用於本發明中。因而，標記物是可由分光的、光化學的、生物化學的、免疫化學的、電的、光學的或化學的手段檢測的任何組合物(composition)。在本發明中有用的標記物包括磁性珠子(例如，DynabeadsTM)、螢光染料(例如，異硫氰酸螢光素、Texas紅、羅丹明，等等)、放射性標記物(例如，3H、14C、35S、125I、121I、112In、"mTc),其他的顯像試劑，例如微泡(microbubbles)(用於超聲波顯像)、18F、"C、150、(用於正電子發射層析成像)、99mTC、'"In(用於單光子發射層析成像)、酶(例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶和其他通常在ELISA中使用的酶)，和量熱標記物，例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等等)珠子。描述了這些標記物的用途的專利包括美國專利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4，275，149和4,366,241,為了所有目的通過引用將它們每一個完全併入本文。也參見HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals(6thEd.，MolecularProbes,Inc.,EugeneOR.)。標記物可以才艮據本領域公知的方法直接或間接地偶聯到測定系統的希望組分上。如上所指出，可以使用各種各樣的標記物，標記物的選擇取決於需要的敏感性、與化合物綴合的便利性、穩定性要求、可用的測試設備和處置規定。非放射性標記通常通過間接的方式來附接。一般地，配體分子(例如生物素)共價地結合於分子。配體然後連接於抗配體(例如，鏈黴抗生物素蛋白)分子，抗配體本身可被檢測或者共價結合於信號系統，例如，可檢測的酶、螢光化合物，或化學發光化合物。可以使用多種配體和抗配體。當配體具有天然的抗配體時，例如，生物素、曱狀腺素和可的松，它可以與標記的、天然存在的抗配體結合使用。作為選擇，任何半抗原性或抗原性化合物可以用於與抗體，例如抗TRAIL受體抗體組合。分子也可以直接綴合於信號發生化合物，例如，與酶或螢光基團綴合。作為標記物感興趣的酶將主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。作為標記模塊有用的螢光化合物包括但不限於，例如，螢光素和它的衍生物，羅丹明和它的衍生物、丹磺醯、傘形酮，等等。作為標記模塊有用的化學發光化合物包括，但不限於，例如，螢光素和2,3-二氫酞漆二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如，魯米諾。對於可以使用的各種標記和信號產生系統的綜述，參見，美國專利4,391,904。才企測標記物的方法是本領域4支術人員公知的。因而，例如，當標記物是放射性標記時，檢測的手段包括閃爍計數器或放射自顯影中的感光膠片。當標記物是螢光標記物時，它可以通過用合適波長的光線激發螢光染料並檢測產生的焚光來檢測。螢光可以通過目視、通過感光膠片、通過使用電子探測器例如電荷耦合器件(CCD)或光電倍增器等等來檢測。類似地，筒單的比色標記物可以僅通過觀察與標記物相關的顏色來檢測。因而，在各種浸漬測定中，綴合的金常常呈現粉色，而各種綴合的珠子呈現珠子的顏色。某些測定模式不需要使用標記的成分。例如，凝集測定可以用於檢測目標抗體，例如抗TRAIL受體抗體的存在。在這種情況下，抗原包被的顆粒通過包含目標抗體的樣品來凝聚。在這種形式中，沒有組分需要被標記，目標抗體的存在通過筒單的目測檢查來檢測。藥#*合#^潔賴身.本發明的TRAIL受體結合劑可以摻入適合於施用的藥物組合物中。藥物組合物一般包含至少一種TRAIL受體結合劑和處於適合於向受試者施用的形式的藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體部分地根據要施用的特定組合物，以及根據用於施用組合物的特定方法來確定。因而，存在著各種各樣的適合的藥物組合物的製劑用於施用所述4元體糹且合4勿(參見,例^口，ie/mV2gto"，s屍/zarmacew"'ca/<Sc/e"c&,MackPublishingCo.,Easton，PA18thed.,1990)。藥物組合物一般地被配製為無菌的，基本上等滲的，並完全符合美國食品和藥品管理局的所有的優質生產規範(GMP)規則。術語"藥學上可接受的"、"生理學上可耐受的"和其語法上的變體，當涉及組合物、載體、稀釋劑和試劑時，可互換使用，表明所述材料能夠施用給受試者而不產生阻止所述組合物的施用的程度的不良生理影響。例如，"藥學上可接受的賦形劑"是指在製備一般安全、無毒、可取的藥物組合物中有用的賦形劑，並且包括對於獸醫學用途以及人類藥物用途可接受的賦形劑。這些賦形劑可以是固體、液體、半固體，或對於氣霧劑組合物來說，是氣體。"藥學上可接受的鹽和酯，，是指藥學上可接受的並具有希望的藥理學性質的鹽和酯。這些鹽包括在酸性質子存在於TRAIL受體結合劑中時可以形成、並能夠與無機或有機鹼反應的鹽。適合的無機鹽包括與鹼金屬，例如鈉和鉀、鎂、鈣和鋁形成的無機鹽。適合的有機鹽包括與有機鹼，例如胺i成，例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-曱基葡糖胺等等形成的有機鹽。這些鹽還包括與無機酸(例如，鹽酸和氫溴酸)和有機酸(例如，乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸和烷烴和芳烴-磺酸，例如曱磺酸和苯磺酸)形成的酸加成鹽。藥學上可接受的酯包括從存在於TRAIL受體結合劑上的羧基、磺醯氧基、和膦羧基(phosphonoxy)基團形成的酯，例如，d.6烷基酯。當存在兩個酸性基團時，藥學上可接受的鹽或酯可以是單酸單鹽或酯，或二鹽或酯；類似地，當存在超過兩個酸性基團時，某些或者所有這些基團可以被鹽化或酯化。本發明中述及的TRAIL受體結合劑可以以未鹽化或未酯化的形式存在，或處於鹽化和/或酯化形式，對這樣的TRAIL受體結合劑的提述意圖包括最初的(未鹽化和未酯化的)化合物和它的藥學上可接受的鹽或和酯。並且，本發明中提述的某些TRAIL受體結合劑可以以超過一種立體異構形式存在，這種TRAIL受體結合劑的提述意圖包括所有單立體異構體和這些立體異構體的所有混合物(無論是外消旋的還是相反)。對於本發明的特定藥物和組合物，本領域的普通技術人員將不難確定施用的合適的時間、順序和劑量。這些載體或稀釋劑的優選的實例包括，但不限於，水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質體和非水媒介物，例如不揮髮油。這些介質和化合物用於藥學活性物質的用途是本領域公知的。除非任何常規的介質或化合物與TRAIL受體結合劑不相容，本發明考慮其在治療組合物中的使用。補充的活性化合物也可以摻入到組合物中。本發明的藥物組合物被配製以適合於它預期的施用途徑。本發明的TRAIL受體結合劑組合物可以通過胃腸外的、表面的、靜脈內的、口服的、皮下的、動脈內的、皮內的、穿表皮的、直腸的、顱內的、腹膜內的、鼻內的、肌肉內的途徑，或作為吸入物來施用。免疫原性劑如TRAIL受體多肽的最典型的施用途徑是皮下途徑，而其他途徑可以是同樣有效的。第二最常規的途徑是肌內注射。這種類型的注射最一般地在手臂或腿部肌肉中進行。在本發明的某些方法中，試劑被直接注射到積累了沉積物(deposits)特定的組織中，例如顱內注射。靜脈內輸注或肌肉內注射(intramuscularinjectiononintravenousinfusion)對於TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體的施用是優選的。在某些方法中，本發明的特定的TRAIL受體結合劑直接注射到顱骨中。在某些方法中，本發明的TRAIL受體結合劑作為持續釋放組合物或裝置，例如MedipadTM設備來施用。本發明的TRAIL受體結合劑任選地可以與其他試劑組合地施用，所述其他試劑在治療各種疾病，包括各種TRAIL受體相關疾病中是至少部分有效的。在向受試者的中樞神經系統施用的情況下，本發明的TRAIL受體結合劑也可以與提高本發明的試劑對血腦屏障的跨越的其他試劑一起施用。用於胃腸外的、皮內的或皮下施用的溶液或懸浮液可以包括以下的成分無菌的稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不揮髮油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗菌化合物例如苯曱醇或對羥基苯曱酸曱酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氬鈉；螯合化合物例如乙二胺四乙酸(EDTA);緩衝劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調整張度的化合物例如氯化鈉或葡萄糖。使用酸或鹼，例如鹽酸或氫氧化鈉，可以調節pH值。胃腸外的製品可以封裝到由玻璃或塑料製成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。適合於可注射使用的藥物組合物一般包括無菌水溶液(在水可溶時)或分散體，以及用於無菌可注射溶液或分散體的臨時製備的無菌粉劑。對於靜脈內施用，適合的載體包括，生理鹽水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF;Parsippany，N丄)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應當是無菌的，並應當具有易於通針(easysyringeability)的程度的流動性。它在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須保持不受抗微生物例如細菌和真菌的汙染作用。載體可以是溶劑或分散介質，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等等)、以及其適合的混合物。適當的流動性可以通過下述方式維持例如，通過使用包衣例如卵磷脂；在分散體的情況下通過維持所需的粒子大小；以及通過使用表面活性劑。可以通過各種抗菌和抗真菌化合物，例如，對羥苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，來實現對微生物作用的防護。在很多情況下，組合物中優選包括等滲化合物，例如，糖類、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的化合物，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以實現可注射組合物的延長的吸收。可以通過將TRAIL受體結合劑以所需的量摻入到具有一種上文列舉的成分或上文列舉的成分的組合的適合的溶劑中，根據需要，繼之以過濾滅菌，來製備無菌可注射溶液。一般地，通過將結合劑摻入到含有基礎分散介質以及來自以上列舉那些的其他所需成分的無菌運載體中，來製備分散體。對於用於製備無菌可注射溶液其無菌粉劑來說，製備方法是通過真空乾燥和凍乾產生粉劑，這樣的粉劑包含活性成分以及任何期望的成分，後者來自所述成分的事先經無菌過濾的溶液。本發明的試劑可以以儲庫注射劑(depotinjection)或植入製劑的形式施用，這樣的試劑可以配製成允許活性成分的持續或脈衝釋放的形式。口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以包裝入膠嚢中或壓縮成片劑。對於口服治療施用來說，粘合劑可以與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠嚢的形式使用。口服組合物也可以施用液體載體製備來用作漱口水，其中所述液體載體中的化合物口服地應用並被吸入和吐出或吞咽。可以包括藥學上相容的結合化合物、和/或佐劑材料作為組合物的一部分。片劑、藥丸、膠嚢、錠劑等等可以含有任何以下的成分，或性質類似的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖，崩解化合物，例如海藻酸、乙醇酸澱粉鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或氫化植物油(STEROTES);助流劑，例如膠體二氧化矽；甜味化合物，例如蔗糖或糖精；調味化合物，例如薄荷、水楊酸曱酯或橙味劑。對於通過吸入施用，TRAIL受體結合劑來自壓縮容器或分配器的氣溶膠噴霧來施用，所述容器或分配器含有適合的推進劑，例如氣體，如二氧化碳，或來自噴霧器。全身性施用也可以通過穿黏膜或穿表皮的方式。對於穿黏膜或穿表皮施用，適合於需透過的障礙物的滲透劑可以用於製劑中。這種滲透劑一顧二是本領域已知的，包括，例如，對於穿黏膜施用，洗滌劑、膽汁鹽、和夫西地酸衍生物。穿黏膜施用可以通過使用鼻噴霧或栓劑來實現。對於穿表皮施用，如本領域一般已知的，將TRAIL受體結合劑配製到軟膏劑(ointments)、油膏劑(salves)、凝膠劑或乳膏劑中。TRAIL受體結合劑也可以製備為用於直腸遞送的栓劑(例如，具有常規的栓劑基質，例如可可脂和其他甘油酯)或滯留灌腸劑(retentionenemas)的形式的藥物組合物。在一個實施方式中，使用載體製備TRAIL受體結合劑，所述載體將保護所述TRAIL受體結合劑對抗機體的快速清除，例如控釋製劑，包括植入物和微封裝的遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。這類配製劑的製備方法對於本領域技術人員是顯而易見的。這些才才並牛也可以自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc商購。月旨質體懸液(包括帶有針對病毒抗原的單克隆抗體的、靶向受感染細胞的脂質體)也可以用作藥學上可接受的載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法來製備，例如，如美國專利No.4,522,811中描述的。特別有利的是以單位劑型配置口服的或胃腸外的組合物，以便於施用和劑量的均勻化。在此使用的單位劑型是指適合作為單位劑量用於要治療的受試者的、物理上離散的單位；每個單位含有經過計算可產生期望治療效果的預定量的結合劑以及與之結合的藥物載體。本發明的單位劑型的規格由下列因素決定並且直接依賴於它們結合劑的獨特特徵和要實現的特定治療效果、以及用於治療受試者的TRAIL受體結合劑配製技術的固有限制。本發明的核酸分子可以插入到載體中，用作基因治療載體。可以通過，例如，靜脈內注射、局部施用(參見，例如，美國專利5,328,470)或通過立體定向(stereotactic)注射(參見，例如Chen等人，1994.7Va//.^co^.5W.USA91:3054-3057)將基因治療載體遞送給受試者。基因治療載體的藥物製劑可以包括處在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或可以包含內部包埋有基因遞送載體的緩釋基質。作為選擇，當可以從重組細胞完整地產生整個基因遞送載體時，例如，逆轉錄病毒載體，藥物配製劑可以包括一個或多個產生該基因遞送系統的細胞。所述藥物組合物可以與施用說明書一起裝入容器、包裝袋或分配器中。本發明的TRAIL受體結合劑的鑑定和表徵,;t和/威謬遂本發'效的潛合遊的才法.對於鑑定和篩選結合劑一一例如具有對TRAIL受體多肽的期望的特異性的抗TRAIL受體抗體和抗TRAIL受體抗體相關多肽一一有用的方法，包括本領域已知的任何免疫介導的技術。免疫應答的成分可以通過本領域普通技術人員^^知的各種方法體外地檢測。例如，(1)可以將細胞毒T淋巴細胞與放射活性標記的目標細胞溫育，通過放射性的釋放檢測這些目標細胞的裂解；(2)可以將輔助T淋巴細胞與抗原和抗原呈遞細胞溫育，通過標準方法測量細胞因子的合成和分泌(WindhagenA;等人，7mmwmXy，2:373-80，1995);(3)可以將抗原呈遞細胞與完整的蛋白質抗原溫育，通過T'淋巴細胞活化分析或生物物理學方法檢測所述抗原在MHC上的呈遞(Harding等人，iVoc.Ato/.5W.，86:4230-4,1989);(4)可以將肥大細胞與能交聯它們的Fc-epsilon受體的試劑溫育，並通過酶免疫分析來測量組胺釋放(Siraganian等人，TIPS,4:432-437,1983);和(5)酶聯免疫吸附測定(ELISA)。類似地，在模型生物(例如，小鼠)或人類受試者中免疫應答的產物可以通過本領域普通技術人員7>知的各種的方法來糹企測。例如，(l)響應於疫苗接種的抗體產生可以通過當前臨床實驗室中使用的標準方法，例如ELISA來容易地;險測；(2)免疫細胞向炎症部位的遷移可以通過在皮膚表面劃痕並置於無菌容器上來捕獲劃痕部位上的遷移細胞來檢測(Peters等人，5/ood，72:1310-5,1988);(3)響應於促細胞分裂劑或者混合淋巴細胞反應的外周血單個核細胞增殖可以使用3H-胸腺嘧啶核苷來測定；(4)PBMC中粒細胞、巨噬細胞和其他吞噬細胞的吞噬力可以通過將PMBC與標記的顆粒一起置於孔中來測量(Peters等人，72:1310-5，1988);和(5)免疫系統細胞的分化可以通過用針對CD分子例如CD4和CD8的抗體標記PBMC並測量表達這些標記物的PBMC的級分來測量。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑利用候選結合劑在可複製的遺傳包裝體(replicablegeneticpackages)的表面上展示來選擇。參見，例如，美國專利5,514,548;5,837,500;5,871,907;5，885，793;5，969，108;6,225,447;6,291,650;6,492,160;EP585287;EP605522;EP616640;EP1024191;EP589877;EP774511;EP844306。已經描述了可用於生產/選擇含有編碼具有希望特異性的結合分子的噬菌粒基因組的絲狀噬菌體顆粒的方法。參見，例如，EP774511;US5871907;US5969108;US6225447;US6291650;US6492160。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑利用候選結合劑在酵母宿主細胞的表面上展示來選擇。可用於通過酵母表面展示分離scFc多肽的方法已經由Kieke等人，PraW"1997Nov;10(11):1303-10描述了。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑利用核糖體展示來選擇。利用核糖體展示鑑定肽庫中的配體的方法已經由Mattheakis等人，Proc.A^/.爿cac/.Sc/.tZSJ91:9022-26,1994;和Hanes等人，iVoc.Ato/.爿cac/.5W.USA94:4937-42,1997描述了。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑利用候選結合劑的tRNA展示來選擇。利用tRNA展示體外選擇配體的方法已經由Merryman等人，Chem.Biol.,9:741-46，2002描述了。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑利用RNA展示來選擇。利用RNA展示選擇肽和蛋白質的方法已經由Roberts等人Prac.iVaf/爿cadS"',L^SL4，94:12297-302,1997;和Nemoto等人，F五^S丄故.，414:405-8，1997描述了。利用非天然RNA展示庫選擇肽和蛋白質的方法已經由Frankel等人，Cwr.(9/7/".所o/.，13:506-12，2003描述了。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑在革蘭氏陰性細菌的周質中表達，並與標記的TRAIL受體多肽混合。參見WO02/34886。在表達具有對TRAIL受體多肽的親和力的重組多肽的克隆中，與結合劑結合的標記的TRAIL受體多肽的濃度被提高，從而可以將細胞與文庫的其餘部分分離，如在Harvey等人，屍rac.淑/」c^.>SW.22:9193-982004和美國專利7>開2004/0058403中描述的。在選擇希望的TRAIL受體結合劑之後，考慮可以通過本領域技術人員已知的任何技術，例如，原核或真核細胞表達等等來大規衝莫地產生它。TRAIL受體結合劑(例如但不限於抗TRAIL受體雜合抗體或片段)可以通過利用常規技術來構建編碼這樣的抗體重鏈的表達載體來產生，所述重鏈中，為保持原始物種抗體的結合特異性所必需的CDR和(如有必要的話)可變區框架的最小部分(根據在此描述的技術來工程化)來自於來源物種抗體，而抗體的其餘部分來源於目標物種免疫球蛋白(其可以如本文所述的加以操作)，從而產生用於表達雜交抗體重鏈的載體。7T"/丄f傳潛合的^/量在一個實施方式中，TRAIL受體結合測定是指一種測定模式，其中將TRAIL受體多肽和TRAIL受體結合劑在適合於TRAIL受體多肽和TRAIL受體結合劑之間的結合的條件下混合，並評估TRAIL受體多肽和TRAIL受體結合劑之間的結合的量。將結合的量與合適的對照進行比較，其中所述對照可以是在不存在TRAIL受體多肽的情況下的結合量、存在非特異性免疫球蛋白組合物(composition)的情況下的結合量，或二者皆是。結合量可以通過任何適合的方法來評估。結合測定方法包括，例如，ELISA、放射受體結合測定、閃爍迫近測定、細胞表面受體結合測定、螢光能量轉移測定、液相層析、膜過濾測定，等等。用於結合TRAIL受體結合劑的TRAIL受體多肽的直接測量的生物物理學測定有，例如，核磁共振、螢光、螢光偏振、表面等離子體共振(BIACOR晶片)等等。通過本領域已知的標準測定方法測定特異性結合，例如，放射性配體結合測定、ELISA、FRET、免疫沉澱、SPR、NMR(2D-NMR)、質譜法，等等。如果候選TRAIL受體結合劑的特異性結合比不存在候選TRAIL受體結合劑的情況下觀察到的結合大至少百分之一，則候選TRAIL受體結合劑作為本發明的TRAIL受體結合劑是有用的。69本發明還提供了TRAIL受體多肽和TRAIL受體結合劑的共結晶(co-crystals)作為測定分子間相互作用的方法。適合於TRAIL受體結合劑和TRAIL受體多肽之間結合的條件將取決於化合物和它的配體，可以由本領域普通技術人員容易地測定。f傳潛合^/^#夢活遂的^/量本發明的TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體和抗TRAIL受體抗體相關多肽，可以被具體指定為生物學活性的激動劑或拮抗劑，其含有本文所公開的特定活性。例如，作為TRAIL受體結合劑的TRAIL受體激動劑和拮抗劑可以利用本領域已知的方法來產生。參見，例如，WO96/40281;美國專利No.5,811,097;Deng等人，祝ood92:1981-1988，1998;Chen等人，Ca訓rL,58:3668-3678,1998;Harrop等人，《//www"o/.161:1786-1794,1998;Zhu等人，Ca"cer^es.，58:3209-3214，1998;Yoon等人，J/mmw"o/.，160:3170-3179，1998;Prat等人，JCW/.5W.，111:237-247,1998;Pitard等人，//wmw"o/.Mef/zoA,205:177-190,1997;Liautard等人，C^ofe.w&，9:233-241,1997;Carlson等人，J所o/.CAew.，272:11295-11301,1997;Taryman等人，iVeww,14:755-762，1995;Muller等人，lw"匿,6:1153-1167，1998;Bartunek等人，Qvtoh>7em，8:14-20，1996。生物學活性，即TRAIL受體結合劑的激動劑或拮抗劑性質，可以利用任何被開發用於測量TRAIL受體多肽的生物學活性的常規體內和體外測定來表徵。本發明的TRAIL受體結合劑的用途y潔迷.本發明的結合劑在涉及TRAIL受體多肽的定位和/或定量的本領域已知方法中是有用的(例如，用於測量適合的生物學樣品中的TRAIL受體多肽的水平，用於診斷方法，用於為所述多肽顯像，等等。)。在一個實施方式中，含有抗體衍生的結合結構域的TRAIL受體結合劑作為藥理學活性組合物(以下稱"治療劑")是有用的。本發明的結合劑對於通過標準淨支術，例如親和層析或免疫沉澱來分離TRAIL受體多肽是有用的。本發明的TRAIL受體結合劑可以有助於純化來自生物樣品例如細胞的天然的免疫反應性TRAIL受體多肽或免疫反應性TRAIL受體樣多肽、以及在宿主系統中表達的重組產生的免疫反應性TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽。此外，TRAIL受體結合劑可以用於才全測免疫反應性TRAIL受體多肽或免疫反應性TRAIL受體樣多肽(例如，在細胞溶胞產物中或細胞上清液中)以評估免疫反應性多肽的表達豐度和表達模式。本發明的TRAIL受體結合劑可以用於診斷來監視組織中免疫反應性TRAIL受體和/或免疫反應性TRAIL受體樣免疫反應性多肽的水平，作為臨床測試程序的一部分，用來，例如，確定給定治療方式的效力。如上所述，通過偶聯(即，物理地連接)本發明的TRAIL受體結合劑到可檢測的物質，可以使檢測更容易。7TM/丄^沐/應^這的^^刺.一種示例性的用於檢測生物樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的有無的方法包括從測試受試者獲得生物樣品，使所述生物樣品接觸能夠檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的本發明的TRAIL受體結合劑，從而4企測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽在所述生物樣品中的存在。TRAIL受體結合劑的實例是能夠結合TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的、針對SEQIDNO:1產生的抗體，優選的具有可^r測標記的抗體。術語"標記的"對於結合劑而言意圖包括通過將結合劑與可檢測物質偶聯(即，物理連接)而直接標記該結合劑，以及通過與直4妻被標記的另一個化合物反應而間接標記該結合劑。間4妄標記的實例包括使用螢光標記的第二抗體檢測第一抗體，和用生物素對DNA的末端標記，使得它可以用螢光標記的鏈黴抗生物素蛋白加以;險測。本發明的檢測方法可以用於體外和體內檢測生物樣品中的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽。用於檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的體外技術包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡、免疫沉澱和免疫螢光。此外，用於檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的體內技術包括向受試者中導入標記的TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體。例如，可以用放射性標記物標記抗體，所述放射性標記物在受試者中的存在和位置可以通過標準顯像技術來檢測。在一個實施方式中，所述生物樣品含有來自測試受試者的多肽分子。^^溯Z;t和i謬.本發明的TRAIL受體結合劑可以用來利用基於抗體的技術分析生物樣品中TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽水平。例如，可以用標準的免疫組織學方法來研究組織中的蛋白質表達。Jalkanen,M.等人，/CW/.歷o/.101:976-985,1985;Jalkanen，M.等人，/Ce〃.Ao/,105:3087-3096，1987。對於檢測蛋白質基因表達有用的其他基於抗體的方法包括免疫分析，例如，酶聯免疫吸附分析(ELISA)和》t射免疫分析(RIA)。適合的抗體分析標記物是本領域已知的，包括酶標記物，例如，葡萄糖氧化酶，和放射性同位素或其他放射性試劑，例如，碘(1251,1211)、碳("C)、硫(35S)、氖(3H)、銦(1I2In)和鎝(99mTc),以及螢光標記物，例如螢光素和羅丹明，以及生物素。除了分析生物樣品中的分泌的TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽水平之外，分泌的TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽水平也可以通過顯像來體外檢測。用於TRAIL受體多肽水平或TRAIL受體樣多肽的體內顯像的TRAIL受體結合劑，例如，抗TRAIL受體抗體標記物或標示物包括可通過X射線照相術、NMR或ESR檢測的那些。對於X射線照相術，適合的標記物包括放射性同位素，例如鋇或銫，其產生可檢測的輻射，但對受試者不是明顯有害的。NMR和ESR的適合的標示物包括具有可檢測的特徵性自旋的標示物，例如，氘，其可以通過標記相關scFv克隆的營養物來摻入到TRAIL受體結合劑中。將已經用合適的可檢測顯像模塊一一例如放射性同位素(例如，mI、112In、"mTc)、放射不透明物質、或可通過核磁共振檢測的材料一一標記的TRAIL受體結合劑導入(例如，通過胃腸外、皮下或腹膜內導入)受試者中。本領域中要理解的是，受試者的體格(size)和使用的顯像系統將決定產生診斷圖像所需的顯像模塊的量。對於放射性同位素模塊來說，對於人類受試者，注射的放射性的量通常範圍將是約5到20毫居裡的"mTc。標記的TRAIL受體結合劑然後將優先地積累在細胞中含有特異性目標多肽的"j立置。侈'H口,在S.W.Burchiel等人，7"wmor7wag/wg.'77zei^flfi/oc/zem/ca/Defect"o/Ca"cer13(1982)中描述了體內腫瘤顯像。因而，本發明提供了醫學狀況的診斷方法，其涉及(a)通過測量個體的細胞或體液中本發明的TRAIL受體結合劑的結合來測定多肽的表達；(b)將基因表達的水平與標準的基因表達水平相比較，與標準表達水平相比所分析的多肽基因表達水平方面的提高或降低指示醫學狀況。,街^it:本發明的TRAIL受體結合組合物(compositions)在診斷方法中是有用的。因而，本發明提供了利用在診斷受試者中TRAIL受體相關醫學狀況中有用的本發明的結合劑的方法。可以這樣地選擇本發明的結合劑，使得它們對TRAIL受體多肽具有任何水平的表位結合特異性以及非常高的結合親和力。一般地，結合劑的結合親和力越高，在免疫測定中可以實施越嚴格的洗滌條件，來除去非特異性結合的材料而不移除目標多肽。因而，在診斷測定中有用的本發明的TRAIL受體結合劑通常具有至少108、109、10，IO"或1012M"的結合親和力。進一步地，理想的是用作診斷試劑的TRAIL受體結合劑具有足夠的動力學啟動速率(kineticon-rate)以在至少12小時、優選的至少五(5)小時、更優選的至少一(1)小時中在標準條件下達到平衡。本發明的某些方法採用了本發明的抗TRAIL受體抗體的多克隆製備物以及抗TRAIL受體抗體組合物(compositions)作為診斷試劑，其他方法採用了單克隆分離物。相比由一種單克隆抗TRAIL受體抗體組成的組合物(composition),多克隆混合物的使用具有許多優勢。通過結合到TRAIL受體多肽、多克隆抗TRAIL受體抗體或其他多肽上的多個位點，可以產生比結合到TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽上單個位點的單克隆更強的(用於診斷的)信號。進一步地，多克隆製備物可以結合到原型目標序列的多種變體(例如，等位變體、種間變體、抹系變體、藥物誘導的逃逸變體(escapevariant))，而單克隆抗體僅可以結合原型序列或較上述範圍為窄的變體。然而，在存在或潛在存在近相關抗原的情況下，單克隆的抗TRAIL受體抗體對於檢測單一抗原是有利的。在採用根據上述方法製備的多複製人類抗TRAIL受體抗體的方法中，製備物一般包含具有針對目標多肽的不同表位特異性的TRAIL受體結合劑(例如抗體)的配列(assortment)。在某些採用單克隆抗體的方法中，理想的是具有不同的表位結合特異性的兩種抗體。表位結合特異性上的差異可以通過竟爭性結合測定法來測定。雖然作為人類抗體的TRAIL受體結合劑可以用作任何類型的樣品的診斷試劑，它們作為對於人類生物樣品的診斷試劑是最有用的。TRAIL受體結合劑可以用於在各種標準的測定模式中檢測給定的TRAIL受體多肽。這些才莫式包括免疫沉澱、Western印跡、ELISA、放射免疫測定和免疫測定分析(immunometricassay)。參見Harlow&Lane,J油'6oW&y，^Z^60rafo"7TWam^/(ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988);美國專利3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,879,262;4,034,074，3,791,932;3,817,837;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3，935，074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;和4,098,876。生物樣品可以從受試者的任何組織或體液獲得。利4,376,110，4,486,530,5,914,241和5,965,375。這些分析使用固定到固相上的一種TRAIL受體結合劑，例如，抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體的群體，以及另一種抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體的群體。一般地，對溶液抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體的群體加以標記。如果使用抗體群體，所述群體一般含有結合於目標多肽的不同表位特異位點的抗體。因而，對於固相和溶液抗體可以4吏用相同的群體。如果使用抗TRAIL受體單克隆抗體，則對於固體和液相使用具有不同的結合特異性的第一和第二TRAIL受體單克隆抗體。固相和溶液抗體可以順序地或同時地與目標抗原接觸。如果固相抗體首先接觸，則分析稱為正向分析。反之，如果溶液抗體首先接觸，則分析稱為反向分析。如果目標與兩種抗體同時地接觸，則分析稱為同時分析。在使抗TRAIL受體抗體接觸TRAIL受體多肽之後，將樣品溫育一定時期，通常從約10分鐘到約24小時，通常是約1小時。然後進行洗滌步驟來除去樣品中沒有特異性地結合於用作診斷試劑的抗TRAIL受體抗體的成分。當固相抗體和溶液抗體在不同的步驟中結合時，可以在任一或兩個結合步驟之後進行洗滌。在洗滌之後對結合加以定量，定量一般通過檢測連接到固相上的標記物來進行，其中所述標記物是通過被標記的溶液抗體的結合而連接到固相的。通常，對於給定的一對抗體或一對抗體群體，以及給定的反應條件，從含有已知濃度的目標抗原的樣品製備標準曲線。然後通過標準曲線的內插來讀取被測試的樣品中TRAIL受體多肽的濃度。被分析物可以根據在平衡狀態結合的標記溶液抗體的量，或通過在達到平〗耔之前一系列時間點上結合的標記溶液抗體的動力學測量來測量。這種曲線的斜率是樣品中TRAIL受體多肽的濃度的度量。用於上述方法的適合的支持物包括，例如，硝酸纖維素膜、尼龍膜和衍生化的尼龍膜，以及顆粒，例如瓊脂糖、基於葡聚糖的凝膠、浸漬片(dipsticks)、顆粒、微球體、磁性顆粒、試管、微量滴定孔、SEPHADEX(AmershamPharmaciaBiotech,PiscatawayN.J,)等等。固定可以通過吸附或通過共價附接來實現。任選地，抗TRAIL受體抗體可以連接到接頭分子，例如，生物素，用於附接於結合在表面上的接頭，例如抗生物素蛋白上。^^W屋夢.本發明還涉及預測醫學(predictivemedicine)的領域，其中為了預後(預測)目的使用診斷分析、預後分析、藥物基因組學以及監控臨床試驗等來預防性地處理個體。因而，本發明的一個方面涉及用於確定生物樣品(即，血液、血清、細胞、組織)中TRAIL受體多肽表達的診斷分析，以確定受試者是否患有與異常的TRAIL受體多肽表達相關的疾病或病症，或具有發生這樣的病症的風險。本發明還提供了預後(或預測)分析，用於確定個體是否存在發展出與TRAIL受體多肽表達或活性相關的病症的風險。這些分析可以用於預後或預測目的，以便在以TRAIL受體多肽為特徵、或與TRAIL受體多肽相關的病症發作之前預防性地處理個體。此外，在本發明的TRAIL受體結合劑對TRAIL受體多肽相對於對其多態型具有更高親和力的情況下(反之亦TRAIL受體多肽的多態型。在受試者的特定組織中(或在血液中)某些多肽的水平可能是當給定藥物施用給受試者時該藥物的毒性、效力、清除速率或代謝速率的指示。在此描述的方法也可以用於測定這樣的多肽在受試者中的水平以幫助預測這些受試者對這些藥物的反應。本發明的另一個方面提供了一種方法來測定個體中TRAIL受體多肽的表達，從而為該個體選擇合適的治療性或預防性化合物(在此稱為"藥物基因組學")。利用藥物基因組學，可以根據個體的基因型選擇用於個體的治療或預防性處理的化合物(例如藥物)(例如，檢查個體的基因型來確定個體對於特定化合物的響應能力)。本發明的TRAIL受體結合劑與TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的結合，例如，可以被利用來鑑定具有發生與TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達或活性相關的病症(如上文描述的)的風險的受試者。作為選擇，可以利用預後分析來鑑定具有或存在風險發生所述疾病或病症的受試者。因而，本發明提供了一種方法來鑑定與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達或活性相關的疾病或病症，其中從受試者獲得測試樣品，檢測TRAIL受體結合劑，其中TRAIL受體結合劑的改變的存在是受試者具有或有風險發生與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達或活性相關的疾病或病症的診斷依據。如在此使用的，"測試樣品"是指從感興趣的受試者獲得的生物樣品。此外，在此描述的預後分析可以用於確定受試者是否可以施用化合物(例如,激動劑、拮抗劑、擬肽(peptidomimetics)、多肽、肽、核酸、小分75子或其他藥物候選物)來治療與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達或活性相關的疾病或病症。例如，這種方法可用於確定是否可以用化合物有效地治療受試者的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽相關的病症。因而，本發明提供了確定是否可以用化合物有效地治療受試者的與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達或活性相關的病症的方法，其中獲得測試樣品，利用TRAIL受體結合劑才全測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽(例如，其中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的存在是可以施用所述化合物來治療該受試者的與異常的TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽表達或活性相關的病症的診斷依據)。從受試者獲得血液或組織樣品，測定其中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的水平，並與獲自沒有所述疾病的個體的血液樣品或相同組織類型的樣品中存在的水平相比較。與獲自健康受試者的樣品相比，在獲自懷疑患有TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽相關疾病的受試者的樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的過高豐度(或過低豐度)是在被測試的受試者中與TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽相關的疾病的指示。作出陽性診斷可能需要進一步的測試。在許多疾病中，某些TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽分子的過量表達(或減量表達)的程度是受試者是否患有可能響應於特定種類的治療或處理的疾病的指示。因而，；險測樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的方法可以用作預後的方法，例如，來評估受試者所述治療或處理應答的可能性。測定來自所述受試者的適合的組織或血液樣品中相關的預後性多肽的水平，並與適合的對照——例如患有相同疾病但是對治療應答良好的受試者中的水平一一相比較。與對照相比在樣品中預後性多肽過量表達(或減量表達)的程度可以是受試者將不會良好地應答處理或治療的可能性的預示。相對於對照的過量表達(或減量表達)越多，受試者將對治療有應答的可能性越小。已經知道，在多種疾病中，本文中稱為"預測性多肽"的某些目標多肽的過量表達(或減量表達)的程度是受試者是否將發病的指示。因而，檢測樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的方法可以用作預測受試者是否將發生疾病的方法。測定來自處於發生疾病的風險中的受試者的適合的組織或血液樣品中相關的預測性多肽的水平，並與適合的對照——例如76不具有發生所述疾病的風險的受試者中的水平一一相比較。與對照相比在樣品中預測性多肽過量表達(或減量表達)的程度可以是受試者將發生疾病的可能性的預示。相對於對照的過量表達(或減量表達)越多，受試者將發生疾病的可能性越高。在此描述的方法可以，例如，通過利用包含在此描述的至少一種探針試劑(例如TRAIL受體結合劑)的預包裝的診斷試劑盒來進行，所述試劑盒可以在例如臨床醫療設施中方便地使用來診斷表現涉及TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的疾病或病狀的症狀或家族史的受試者。此外，其中表達TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的任何細胞類型或組織均可以在本文描述的預後分析中加以利用。TRAIL受體結合劑的預防性和治療性用途.凝迷.本發明的TRAIL受體結合劑對於預防或治療疾病是有用的。具體地，本發明提供了用於治療有患病症的風險(或對病症易感)，或患有病症的受試者的預防性和治療性方法，其中所述病症與異常的TRAIL受體結合劑表達或活性相關。因而，本發明提供了預防和/或治療受試者中TRAIL受體相關的醫學狀況的方法，包括向需要的受試者施用有效量的TRAIL受體結合劑。例如，可以給受試者施用本發明的TRAIL受體結合劑組合物，以替代(replace)TRAIL受體多肽(例如胰島素)的缺乏或降低的水平，來補充另一種多肽(例如抗TRAIL受體抗體)的缺乏或降低的水平，來抑制多肽(例如癌基因)的活性，來活化TRAIL受體多肽的活性(例如通過與受體結合)，來通過與膜結合受體竟爭游離的配體(例如消炎中使用的可溶TNF受體)而降低膜結合受體的活性，來產生期望的應答(例如血管生長)。本發明的TRAIL受體結合劑在涉及受試者中的多種病症的預防性和治療性應用中是有用的，這些病症包括但不限於涉及骨細胞的發育、分化和活化的病症；血液循環中的細胞例如紅細胞和血小板的疾病或病理；各種免疫學病症和/或病理；肺部的疾病和病症；自身免疫和炎症性疾病；心血管疾病；代j射疾病；生殖疾病、腎臟疾病、4唐尿病、腦外傷、癌症生長和轉移；病毒感染、癌症治療、牙周疾病；組織再生；急性淋巴母細胞性白血病；膠質瘤；神經疾病；神經變性病症；阿爾茨海默氏病；帕金森氏病；和造血功能障礙。在本發明的優選的實施方式中，使藥學有效量的抗TRAIL-R1和TRAIL-R2抗體通過與目標細胞接觸來誘導細胞死亡。識別TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗體或識別TRAIL-R1和TRAIL-R2的人源化抗體的藥學有效量是施用給個體足以引起期望效果的量。施用藥學上有效量的TRAIL-R1和TRAIL-R2識別抗體的期望效果包括目標細胞的死亡、目標細胞的生長抑制、TRAIL-R1和TRAIL-R2的刺激、以及在目標細胞中與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的結合。目標細胞是表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的細胞，包括異常生長的細胞，例如人類癌瘤細胞(carcinomacell)和白血病細胞。還包括具有病理狀況的細胞，這樣的病理狀況包括細胞增殖異常或失調的病理狀況，例如惡性癌症或良性癌症(benigncancer)。從而，在本發明的某些實施方式中，本發明的抗TRAIL受體結合劑在預防或治療有需要的受試者中癌症的生長和/或轉移的方法中是有用的，所述癌症例如但不限於，乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、腦癌、胰腺癌、以及結腸直腸癌。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑具有體外凋亡誘導活性，其中所述結合劑可以在等於或低於10嗎/ml的濃度下誘導至少30%的細胞死亡，優選的至少50%、70%、90%,更優選100%的細胞死亡。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑具有體內凋亡誘導活性，其中結合劑當用等於或低於10mg/kg體重的劑量治療時可以在人類癌症異種移植模型中降〗氐至少30%腫瘤大小，優選的，至少50%、70%、90%,更優選100%的肺瘤大小。當體內用於治療時，本發明的TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體以有效量(即，具有期望的治療效果的量)施用給所述受試者。它們通常將胃腸外地施用。劑量和給藥方案將取決於TRAIL受體相關疾病或病症的程度、使用的特定TRAIL受體結合劑的特徵，例如它的治療指數，受試者和受試者的病史。有利的是，TRAIL受體結合劑在l-2周的時間內連續地進行靜脈內施用來治療血管系統中的細胞，以及皮下和腹膜內施用來治療局部的淋巴結。任選地，在輔助治療的過程中進行施用，輔助治療例如聯合放射、化療的循環，或腫瘤壞死因子、幹擾素或其他細胞保護或免疫調節試劑的施用。因而，本發明的結合劑和在輔助治療中有用的化合物可以向需要其施用的受試者同時地和連續地施用。在一個實施方式中，本發明的TRAIL受體結合劑可以用於增強治療性抗體，特別是抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2單特異性抗體的治療效力。本發明的抗體還與致敏劑(sensitizer)共同起作用。在此使用的致敏劑被定義為包括任何誘導凋亡的刺激物，包括有機分子，例如化療劑和放射試劑，其可以顯著地增強本發明的抗體的效力。另一方面，本發明的抗體可以用於增強化療和放射治療的治療效力。並且，它可以用於預防或逆轉(reverse)腫瘤細胞對化療和放射治療的抗性的發展。本發明的抗體還作為致敏劑起作用，以促進由TRAIL-R1或TRAIL-R2的單特異性抗體誘導的癌細胞的凋亡。在惡性腫瘤治療的情境中，本發明的抗體，特別是CTB003和hCTB003,能夠誘導大多數TRAIL敏感腫瘤細胞的凋亡。CTB003展現體內的強殺腫瘤活性。在此詳述的大部分腫瘤細胞表達細胞表面TRAIL-R1和/或TRAIL-R2,它們對CTB003或hCTB003誘導的細胞死亡的敏感性與它們對TRAIL的敏感性相似(parallel)。CTB003或hCTB003繞過了誘餌受體來誘導凋亡。產生本發明的抗體的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003已經:帔保藏，分配了登錄號CGMCC1665。理解的是，對於論爭的人類TRAIL-R1和/或TRAIL-R2雙特異性單克隆抗體CTB003和hCTB003詳述的技術和結果完全可以擴展到並適用於類似種類的雙特異性抗體。這種優點一般地擴展到本發明的人源化雙特異性抗體。對於胃腸外施用，TRAIL受體結合劑將與藥學上可接受的胃腸外賦形劑相結合配製成單位可注射劑型(溶液，懸浮液，乳劑)。這些賦形劑是本身無毒的，並且無治療性。使用抗TRAIL受體IgM抗體對於某些應用是優選的。然而，IgG分子由於更小，比IgM分子更有能力定位到某些類型的感染細胞。有證據表明，體內的補體激活產生了多種生物學效果，包括炎症性反應的誘導和巨噬細月包的活4b(Unanue禾口Benecerraf，TextbookofImmunology,2ndEdition,Williams&Wilkins，p.218(1984))。伴隨炎症的提高的血管舒張可以提高各種試劑定位到受感染細胞中的能力。因此，本發明指定的類型的TRAIL受體抗體組合可以通過多種方式治療性地-使用。另外，抗原，例如純化的TRAIL受體多肽，其片,殳或類似物(Hakomori，力朋.iev./mwww/.2:103，1984)或與這些抗原相關的抗獨特型抗體(Nepom等人，Proc.A^/.爿cadSc/.t/6L481:2864，1985;Koprowski等人，Prac.7V^/.^cad81:216,1984)可以用於在人類受試者中誘導主動免疫應答。這樣的應答包括形成能夠活化人類補體的抗體，以實現期望的生物學效果，例如破壞目標細胞。疾4々4症.對於以TRAIL受體多肽水平或生物學活性提高(相對於不患有所述疾病或病症的受試者)為特徵的疾病和病症，可以用拮抗(即，降低或抑制)活性的基於TRAIL受體結合劑的治療化合物來加以治療，所述化合物可以以治療性或預防性的方式施用。可以利用的治療化合物包括，但不限於(i)前述的TRAIL受體結合劑；和(ii)編碼TRAIL受體結合劑的核酸。對於以TRAIL受體多肽水平或生物學活性降低(相對於不患有所述疾病或病症的受試者)為特徵的疾病和病症，可以用提高TRAIL受體活性(即，是TRAIL受體活性激動劑)的基於TRAIL受體結合劑的治療化合物來加以治療劑包括但不限於，提高生物利用率的TRAIL受體結合劑。提高或降低的水平可以容易地通過定量TRAIL受體結合劑誘導的肽和/或RNA來檢測，定量是通過獲得受試者的組織樣品(例如來自活檢組織)並體外分析它的RNA或肽水平，表達的TRAIL受體多肽的結構和/或活性(或前述多肽的mRNA)。本領域公知的方法包括但不限於，免疫測定(例如通過Western印跡分析，免疫沉澱、繼而十二烷基石克酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳，免疫細胞化學，等等)和/或雜交測定來^r測mRNA的表達(例如Northern測定、斑點印跡、原位雜交，等等)。^^才法.在一個方面中，本發明提供了一種方法，通過向所述受試者施用調節TRAIL受體多肽表達或至少一種TRAIL受體多肽活性的TRAIL受體結合劑，來預防受試者中與異常的TRAIL受體表達或活性相關的疾病或狀況。處於由異常的TRAIL受體多肽表達或活性引起或促發的疾病的風險中的受試者可以通過例如在此描述的診斷或預後分析的任何或組合來鑑定。在預防性的應用中，針對有風險發生或易感於疾病或狀況(即免疫疾病)的受試者施用TRAIL受體結合劑的藥物組合物或藥物，施用的量以足夠消除或降低疾病風險、降低疾病嚴重度、或延遲疾病的發作，包括疾病的生物化學、組織學和/或行為症狀，疾病的併發症，以及在疾病的發展期間呈現的中間病理表型。預防性TRAIL受體結合劑的施用可以發生在出現異常的特徵症狀之前，從而預防疾病或病症，或者延遲其發展。取決於異常的類型，例如，可以用TRAIL受體結合劑作為TRAIL受體激動劑或TRAIL受體拮抗劑來治療所述受試者。合適的化合物可以根據在此描述的篩選分析來確定。本發明的另一個方面包括為治療目的調節受試者中TRAIL受體多肽表達或活性的方法。本發明的調節方法包括用本發明的TRAIL受體結合劑接觸細胞，所述試劑調節與細胞相關的TRAIL受體多肽活性中的一種或多種活性。在治療應用中，對懷疑患有或已經患有疾病的受試者施用組合物或藥物，施用的量足夠治癒、或至少部分地延滯所述疾病的症狀(生物化學的、組織學的和/或行為的)，包括它的併發症和疾病的發展中的中間病理表型。足夠實現治療或預防性治療的量被定義為治療或預防有效量。在此描述了調節TRAIL受體多肽活性的化合物，可以包括，例如編碼TRAIL受體結合劑或TRAIL受體結合劑相關多肽的核酸。在一個實施方式中，TRAIL受體結合劑刺激一種或多種TRAIL受體多肽活性。這種刺激性化合物的實例包括TRAIL受體結合劑和已經被導入細胞中、編碼TRAIL受體結合劑的核酸分子。在另一個實施方式中，TRAIL受體結合劑抑制一種或多種TRAIL受體多肽活性。這些調節方法可以在體外進行(例如通過將細胞和TRAIL受體結合劑一起培養)，或作為選擇，在體內進行(例如通過向受試者施用所述TRAIL受體結合劑)。因而，本發明提供一種方法來治療患有TRAIL受體相關疾病或病症的個體，所述疾病或病症以TRAIL受體多肽或編碼TRAIL受體多肽的核酸分子的異常的表達或活性為特徵。在一個實施方式中，所述方法包括施用TRAIL受體結合劑(例如通過在此描述的篩選分析方法鑑定的化合物)，所述結合劑調節(例如上調或下調)TRAIL受體多肽表達或活性，或組合TRAIL受體結合劑。在另一個實施方式中，所述方法包括施用TRAIL受體結合劑或編碼TRAIL受體結合劑的核酸分子，作為補償降低的或異常的TRAIL受體多肽表達或活性的療法。在TRAIL受體多肽被異常下調的情況中，對TRAIL受體多肽活性的刺激是期望的。差於77M/￡受體錯合效的治《刺的i^學效耒的確;t在本發明的各81種實施方式中，進行適合的體外或體內測定來確定基於特異性TRAIL受體結合劑的治療劑的效果，並確定受試者中受影響組織的治療是否需要使用所述治療劑。在各種實施方式中，可以使用受試者的病症中涉及的代表性的細胞類型來進行體外測定，以確定給定的基於TRAIL受體結合劑的治療劑是否對所述細胞類型發揮期望的效果。在人類受試者中測試之前，用於治療的化合物可以在適合的動物模型系統中測試，包括但不限於大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔，等等。類似地，對於體內測試，在向人類受試者施用之前，可以使用本領域已知的任何動物模型系統。治#才襲和|放遊#某些組合物包括多種(例如兩種或更多)本發明的TRAIL受體結合劑的組合。在某些組合物中，組合物的每一種TRAIL受體結合劑都是結合一種或多種TRAIL受體多肽的獨特的、預先選擇的表位的單克隆抗體或人類序列抗體。對於本發明的TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體或抗TRAIL受體抗體—細胞毒素綴合物而言，其用於治療本文所述的TRAIL受體相關狀況和疾病的有效劑量取決於許多不同的因素而變化，包括施用的方式、目標部位、受試者的生理狀態、受試者是人類還是動物、使用的其他藥物、以及治療是預防性還是治療性的。通常，受試者是人類，但非人哺乳動物包括轉基因哺乳動物也可以被治療。治療劑量需要被滴定以優化安全性和效力。一般地，本發明的組合物(compositions)的足以實現治療或預防效果的有效量，範圍為從約0.000001mg/千克體重/天到約10,000(100)mg/千克體重/天。優選的，劑量範圍從約0.0001mg/千克體重/天到約100mg/千克體重/天。對於施用TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體，劑量範圍從約0.0001到100mg/kg宿主體重，更通常地0.01到5mg/kg宿主體重每周、每兩周或每三周。例如劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重每周、每兩周或每三周，或在1-10mg/kg每周、每兩周或每三周的範圍內。在一個實施方式中，抗體的單個劑量的範圍是0.1-10,000微克/千克體重。在一個實施方式中，載體中的抗體濃度為每個遞送的立方釐米0.2到2000微克。示範性的治療方式需要每兩周施用一次，或每月一次，或每3到6個月一次。在某些方法中，具有不同的結合特異性的兩種或更多TRAIL受體結合劑同時地施用，在這種情況下，施用的每種抗體的劑量落入所標明的範圍內。TRAIL受體結合劑，例如抗TRAIL受體抗體通常在多種場合施用。單次給藥之間的間隔可以是每周、每月或每年。間隔也可以是不規則的，通過測量受試者中抗體的血液水平來指示。在某些方法中，調節劑量來實現血漿TRAIL受體結合劑(例如抗TRAIL受體抗體)濃度為1-1000嗎/ml,在某些方法中25-300|ig/ml。作為選4爭，TRAIL受體結合劑(例如抗TRAIL受體抗體)可以作為持續釋放配製劑施用，在這種情況下需要的施用頻率較低。劑量和頻率取決於受試者中TRAIL受體結合劑的半衰期而變化。一般地，人類抗TRAIL受體抗體顯示的半衰期最長，接著是人源化抗TRAIL受體抗體、嵌合抗TRAIL受體抗體、和非人類抗TRAIL受體抗體。施用的應用中，用一段較長的時間以相對低頻率的間隔施用相對低的劑量。某些受試者終身持續接受治療。在治療應用中，有時是需要相對短間隔的相對高劑量，直到疾病的發展被降低或終止，優選地，直到受試者顯示疾病的症狀的部分或完全改善。此後，本專利可以施用預防性的方案(thepatentcanbeadministeredaprophylacticregime)。編碼TRAIL受體免疫原的核酸的劑量範圍是從約10ng到1g、100ng到100mg、1嗎到10mg或30-300嗎DNA每位受試者。傳染性病毒載體的劑量為每劑10-100或更多個病毒顆粒不等。毒#.優選地，在此描述的有效量(例如劑量)的TRAIL受體結合劑將提供治療益處而不產生對受試者的實質上的毒性。在此描述的TRAIL受體結合劑的毒性可以在細胞培養或實驗動物中利用標準藥學程序，例如通過測定LDso(對50%的群體致死的劑量)或LD咖(對100%的群體致死的劑量)來確定。毒性作用的和治療作用之間的比例是治療指數。利用這些細胞培養測定和動物研究獲得的數據，可制定對人類使用無毒的劑量範圍。在此描述的TRAIL受體結合劑的劑量優選地處於一定範圍的循環濃度內，所述濃度包括毒性很小或沒有毒性的有效劑量。取決於採用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個範圍內變動。可以由醫師個人根據受試者的狀況選擇確切的配方、給藥途徑和劑量。參見，例如Fingl等人，In:77^/Vzarmaco/ogica/o/7T7era/eiz/7'cs，Ch.1(1975)。試,i/盆本發明的範圍還涵蓋包含本發明的TRAIL受體結合劑組合物(compositions)(例如抗體細胞毒素綴合物、單克隆抗體、人類序列抗體、人類抗體、多特異性和雙特異性分子)和使用說明書的試劑盒。所述試劑盒對於檢測生物樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的存在是有用的。例如所述試劑盒可包含能夠結合生物樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的、經標記的TRAIL受體結合劑；用於測定樣品中TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的量的手段；以及用於將TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的量與標準品比較的手段。試劑盒成分(例如試劑)可以包裝在適合的容器中。所述試劑盒可以進一步包括使用該試劑盒檢測TRAIL受體多肽或TRAIL受體樣多肽的說明。在一個實施方式中，本發明的組合物試劑盒(compositionkit)包含本發明的抗體與疾病抑制化合物的組合，其中所述化合物是抗腫瘤藥物，例如放射性同位素、化療劑、治療性抗體或細胞因子。提供以下實施例以進一步說明本發明的優選的實施方式。這些實施例決不應看作是限制本發明的範圍，本發明的範圍由附隨的權利要求確定。實施例實施例1.本發明的鼠TRAIL受體結合劑的製備和表徵的一般方法具體而言，可以通過培養雜交瘤獲得TRAIL-R1和/或TRAIL-R2雙特異性單克隆抗體CTB003,所述雜交瘤是通過用人類TRAIL-R1和/或TRAIL-R2免疫小鼠，隨後使來自該小鼠的脾臟細胞或淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合來獲得雜交瘤。單克隆抗體的製備涉及以下步驟1.用作抗原的蛋白質的純化；2.抗體產生細胞的製備在最後免疫動物之後，收集血清樣品，分析特異性抗體產生的滴度以確定是否已經產生了抗體生產細胞。3.骨髓瘤細胞的製備；4.使所述抗體生產細胞和骨髓瘤細胞融合；5.選擇產生期望的抗體的雜交瘤；6.製備單細胞克隆(克隆)；7.培養雜交瘤細胞用於單克隆抗體的大規模製備；8.純化所述單克隆抗體9.分析單克隆抗體的生物學活性和特異性。以下參照上述步驟詳述了本發明的抗體的製備過程。用於製備本發明的抗體的這種方法意圖僅是製備方法的說明，而不是對其的限制。可以遵循其他已知的過程。A.抗原的製備本發明利用了包含TRAIL-R1和TRAIL-R2的細胞外結構域的異二聚化重組蛋白質作為免疫原來誘導同時識別這兩種受體的抗體。將編碼TRAIL-R1和TRAIL-R2的細胞外結構域的cDNA與編碼人類IgGl的Fc部分的cDNA融合。將融合的cDNA進一步克隆到表達載體pcDNAIII(Invitrogen)中。用表達載體pcDNAIII-TRAIL-Rl-Fc和pcDNAIII-TRAIL-R2-Fc共轉染QBI-293A細胞。轉染後48小時，通過蛋白A層析來純化培養上清液中分泌的融合蛋白質。作為選擇，包含SEQIDNO:15和/或SEQIDNO:16的胺基酸序列的肽，可以通過已知的方法例如Sanger方法化學合成，並用作抗原。B:單克隆抗體的製備a:小鼠的免疫將步驟(a)中製備的免疫原與佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑混合。其他適合的實驗動物可以包括大鼠、豚鼠、兔、犬、雞、馬、豬、牛和綿羊。免疫實驗動物的適合的給藥途徑包括皮下、腹膜內、靜脈內、皮內和肌肉內注射，其中皮下的和腹膜內注射是優選的。免疫任選地可以通過單次劑量，或通過合適的間隔的幾次重複劑量來進行。免疫的動物的抗體生產可以通過抗原特異性抗體的血清水平來確定。當達到高的抗體滴度時，動物可以用作抗體生產細^^的製備的來源。一般地，抗體生產細胞可以在免疫原的最後注射之後3-5天時收集。分析血清抗體滴度的方法包括各種公知的技術，例如放射免疫測定(在下文中稱為"RIA")、固相酶免疫測定(下文中稱為"ELISA")、螢光抗體測定和^C動凝集測定，出於^r測靈敏度、速度、精確性和自動化的潛力的原因，RIA和ELISA是優選的。通過ELISA測定抗體滴度首先，使純化或部分純化的TRAIL-Rl-Fc/TRAIL-R2-Fc吸附到固相表面，例如96孔ELISA平板的表面上。在封閉任何剩餘的表面之後，使孔表面與經過連續稀釋的小鼠血清樣品接觸。添加作為第二抗體的酶標記的抗小鼠抗體，來結合小鼠抗體。通過測定由於底物等等的改變產生的顏色顯示的吸光度變化來評估抗體滴度。b:骨髓瘤細胞的製備用來自確立的小鼠細胞系的細胞充當骨髓瘤細胞的來源，這些細胞包括P3X63Ag8U.1(P3畫U1)、P3/NSI/l-Ag4隱l(NS-1)、Sp2/0陽Ag14(SP-2)、P3X63Ag8.653和P3X63Ag8(X63)，它們可以從ATCC獲得。將選擇的細胞系連續轉移到合適的培養基例如8-氮烏嘌呤培養基中。8-氮鳥嘌呤培養基包括Iscove'sModifiedDulbecco's培養基(以下稱為"IMDM，，)或Dulbecco'sModifiedEagle培養基(以下稱為"DMEM，，)。RPMI-1640培養基補充有穀氨醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素、胎牛血清(以下稱為"FCS，，)和8-氮鳥噤呤。c:糹田月包禹蟲合獲自動物的任何適合部分的淋巴細胞和漿細胞是產生抗體的前體細胞。淋巴細胞或漿細胞來源包括脾臟、淋巴結、外周血，或其任何適合的組合，脾臟細胞是最常見的來源。在最後一次強化注射之後，從存在抗體生產細胞的淋巴組織製備單一的淋巴細胞懸浮液。融合技術包括用無血清培養基(例如RPMI1640)或磷酸鹽緩衝鹽水(以下稱為"PBS")洗滌脾臟和骨髓瘤細胞，使得脾臟細胞與骨髓瘤細胞的數量比例大約在5:1和10:1之間，然後離心。在棄去上清液之後，充分地疏鬆沉降的細胞，在攪拌下滴加含有50%(w/v)聚乙二醇(m.w.1,000到4,000)1ml的無血清培養基。隨後，慢慢地添加10ml的無血清培養基，然後離心。再次棄去上清液，將離心沉降的細胞懸浮在適量的含有次黃噤呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(以下稱為"HAT，，)的HAT培養基中。d:雜交瘤的選擇在融合之後，任何未融合的骨髓瘤細胞和任何骨髓瘤-骨髓瘤融合物均不能在HAT培養基中存活。另一方面，抗體生產細胞相互的融合物以及抗體生產細胞與骨髓瘤細胞的雜交瘤均可以存活，但前者僅具有有限的壽命。因而，在HAT培養基中繼續溫育，可導致僅期望的雜交瘤被選擇。所得的雜交瘤生長成菌落，然後轉移到缺乏氨基蝶呤的HAT培養基(HT培養基)中。此後，從培養上清液耳又出等分來測定抗體滴度，例如通過ELISA。e:雜交瘤的克隆然後，通過利用步驟b中描述的類似的方法測定抗體滴度，將已經顯示產生特異性抗體的雜交瘤轉移到另一個平板用於克隆。適合的克隆方法包括有限稀釋方法，其中雜交瘤被稀釋到平板的每個孔含有一個細胞，然後加以培養；軟瓊脂方法，其中在軟瓊脂培養基中培養之後回收集落；利用微型機械手來分離單個細胞用於培養的方法；和"分選-克隆，，，其中通過細胞分選儀分離單個細胞。例如，對展現抗體滴度的每個孔，重複2-4次根據限制稀釋方法的克隆操作，選擇具有穩定的抗體滴度的克隆作為抗體生產雜交瘤。作為本發明的抗體的基礎的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003於2006年3月28曰在CGMCC保藏，登錄號CGMCC1665。f:單克隆抗體的製備和純化通過細胞培養的單克隆抗體的製備在獲得穩定的抗體生產雜交瘤之後，可以對所選的雜交瘤培養物擴大培養。然後收穫來自大規模培養的上清液，通過適合的方法純化，例如親和層析和凝膠過濾。雜交瘤還可以在同基因的小鼠(例如BALB/c小鼠或nu/nu小鼠)的腹膜內生長，來獲得大量地含有抗TRAIL-R1和TRAIL-R2單克隆抗體的腹水。g:單克隆抗體的表徵單克隆抗體的同種型和亞類可以通過ELISA來測定。抗體濃度的測定可以通過Folin-Lowry方法進行，或根據280nm的吸光度/1.4(OD280)=免疫球蛋白lmg/ml)來計算。.C:單克隆抗體的特異性的分析為了獲得結合TRAIL-R1和TRAIL-R2而不結合其他TRAIL受體例如TRAIL-R3和TRAIL-R4的單克隆抗體，用以下重組蛋白質包被ELISA平板1.TRAIL-R1和TRAIL-R2異二聚體抗原，2.TRAIL-Rl-Fc融合抗原，3)TRAIL-R2-Fc融合抗原，4.TRAIL-R3-Fc融合抗原，5.TRAIL-R4-Fc融合抗原，和BSA作為陰性對照。在與各種濃度的純化抗體溫育之後，添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgG。在TMB底物反應之後，在ELISA酶標儀中記錄光密度。利用光密度值評估抗體與相應的抗原的結合。CTB003展現了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原以及TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合抗原的劑量依賴性結合，但是不結合TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原和BSA,表明CTB003是識別TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的抗體。87D.單克隆抗體的功能的分析a:體外的人類惡性腫瘤細胞凋亡的誘導將一組人類癌細胞系與各種濃度的抗體溫育過夜，利用抗體處理之後的細胞活力來確定殺傷活性。b:體內的CTB003殺腫瘤活性在人類腫瘤細胞異種移植模型中評估CTB003的殺腫瘤活性。用人類癌細胞皮下接種棵鼠。在可見的腫瘤生長之後，對帶有腫瘤的小鼠腹膜內注射CTB003。用處理之後腫瘤大小的降低程度評估體內殺肺瘤活性。E.抗體序列的分析從雜交瘤細胞分離總RNA用作模板。利用逆轉錄酶合成cDNA。利用一組15個VH5'引物和一個CH3'引物進行PCR來獲得編碼免疫球蛋白重鏈的可變區的cDNA。利用一組8個VK5，引物和一個CK3，引物進行PCR來獲得編碼免疫球蛋白輕鏈的可變區的cDNA。將PCR產物進一步克隆到TA克隆載體(Invitrogen)中。挑取五個獨立的克隆並測序。通過CDR1、CDR2和CDR3序列的高變異性和它們在重鏈中的位置來確定CDR1、CDR2和CDR3序列。F.抗體識別表位的的鑑定一系列抗原的製備抗原組包含抗體識別的全部或部分抗原表位。這些抗原可以通過多肽的化學合成或通過重組DNA技術來獲得。在確定了含有表位的區域之後，通過進一步縮短含有表位的多肽來實現精確的作圖。此外，可以通過使用含有表位的多肽的竟爭性抑制測定來確認表位。實施例2.TRAIL-R1和TRAIL-R2抗原的異二聚形式的製備1.TRAIL-R1和TRAIL-R2cDNA的克隆通過以下RT-PCR方法克隆編碼人類TRAIL-R1和TRAIL-R2蛋白質的DNA，該方法使用a)模板利用TRIzol試劑(GibcoBRL)提取HeLa細胞的總RNA。利用第一鏈cDNA合成試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech),根據試劑盒提供的使用手冊來獲得PCR反應的模板。b)PCR引物合成以下寡核苷酸引物用於PCR:885'-gacgatgcccgatctactttaaggg扁3'(DR5pl:SEQIDNO.:49);5'-ccactgggtgatgttggatggg誦3'(DR5p2:SEQIDNO.:50);5'-gacgatgcccgatctactttaaggg畫3'(DR4pl:SEQIDNO.:51);5'-gacgatgcccgatctactttaaggg畫3'(DR4p2:SEQIDNO.:52);c)PCR反應PCR反應溶液的組成模板cDNA,總共33pi的反應物中的5引物DR5pl，10pmol;引物DR5p2，10pmol;lOx.濃縮的PCR緩衝液(試劑盒提供的)，lOpl;dNTPs(各2.5mM),4以及Taq聚合酶(Promega),5單位。添加無菌蒸餾水到溶液中達到100^的總體積。如下進行PCR反應。首先將溶液在94。C加熱2分鐘，之後將加熱到94°C30秒、52°C1分鐘和72。C3分鐘的循環重複40次。在這個過程完成之後，將反應溶液在72。C加熱10分鐘。由此獲得的擴增的DNA片段在含有0.25嗎/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上予以分離。確定條帶含有期望的DNA片,殳，利用GeneClean試劑盒(BIO101)回收。d)PCR產物的TA克隆'DNA片段使用TA克隆試劑盒(Invitrogen，CA)克隆。如下進行將從PCR反應溶液回收的DNA片段，與TA克隆試劑盒提供的50ngpCR2.1載體一起，與1(il的10x連接酶反應緩衝液(6mMTris-HCl(pH7.5)、6mM氯化鎂、5mM氯化鈉、7mM.(3-巰基乙醇、O.lmMATP、2mMDTT、1mM亞精胺、和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合，該緩衝液中已經添加了4單位的T4DNA連接酶(1pl)。混合物的總體積用無菌去離子水調整到10|_il,所得的連接酶溶液在14。C溫育15小時。在這段時間以後，將2pl的連接酶反應溶液添加到50pi的感受態大腸桿菌菌林TOP10F中，該菌林由TA克隆試劑盒提供，並根據使用手冊製備為感受態，產生的混合物在冰上保持30分鐘，然後在42。C30秒，再次在冰上5分鐘。然後，將含有2%v/v胰蛋白腖、0.5%(w/v)酵母提取物、0.05%w/v氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖的500pl培養基(以下稱為"SOC"培養基)添加到培養物中，將混合物在37。C搖動培養1小時。在這之後，將培養物塗布在含有100嗎/ml的L-肉湯瓊脂平板(1%v/v胰蛋白腖、0.5%w/v酵母提取物、0.5%w/v氯化鈉、0.1%w/v葡萄糖和0.6%w/v細菌瓊脂(Difco))上。選擇平板上出現的氨千青黴素抗性菌落，用鉑接種環刮下，在含有100嗎/ml氨千青黴素的L-肉湯培養基中200rpm振蕩下37。C培養過夜。溫育之後，通過離心收穫細胞，用鹼法從中製備質粒DNA。將編碼TRAIL-R1或TRAIL-R2的細胞外結構域的cDNA進一步克隆到含有編碼人類IgGl的Fc部分的cDNA的pcDNA3表達載體(Invitrogen,CA)中。從而，獲得了編碼TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的融合cDNA。2.TRAIL-Rl-Fc和TRAIL-R2-Fc融合蛋白的表達和純化用pcDNAIII-TRAIL-Rl-Fc和pcDNAIII-TRAIL-R2-Fc共轉染QBI-293A細胞。在轉染48小時之後收穫培養基。將收集自上述轉染的細胞的總共500ml上清液用於蛋白A-SepharoseCL-4B親和層析(Pharmacia)。流速是2ml/分鐘。在培養物上清液通過之後，用50mlPBS洗滌柱子。用洗脫緩衝液(O.IM甘氨酸(PH2.4)、0.15MNaCl)來洗脫蛋白質。在OD280nm測量每個洗脫級分(1ml)的光密度。收集OD280〉0.1的級分。在添加100^的中和緩衝液(1MTris-HCLpH8.5)之後，將洗脫物單獨地置於透析管中，洗脫物在4。C相對於l升的PBS(pH7.5)透析。透析緩衝液更換兩次。將純化的蛋白質濃縮到lmg/ml，在-80。C保存。蛋白質的純度通過SDS-PAGE測定大於95°/。。在非還原條件下，純化的蛋白質的分子量是90kD,而在還原條件下，分子量是45kD。3.重組TRAIL-Rl-Fc和TRAIL-R2融合蛋白的表徵ELISA平板用PBS中的2昭/ml山羊抗人IgG在4。C過夜來包被。在用PBS洗滌三次之後，平板用3。/。BSAPBS在室溫下封閉1小時。添加10嗎/ml純化的融合蛋白，在37。C溫育1小時。在用PBS洗滌三次之後，添加2jig/ml單克隆抗丁RAIL-R1和抗TRAIL-R2抗體在37。C再過一個小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結合的抗體，然後在37。C添加HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG30分鐘。在用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物緩衝液10分鐘，然後通過添加2NH2S04停止反應。在ELISA酶標儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。結果總結在表6中。抗TRAIL-R1和抗TRAIL-R2單克隆抗體與純化的90融合蛋白反應，但不與人類IgG反應。表6tableseeoriginaldocumentpage91異二聚的TRAIL-R1和TRAIL-R2融合物的表徵將ELISA平板用1嗎/ml的抗TRAIL-R1(CTB007)或抗TRAIL-R2(CTB006)在4°C包被過夜。用PBS洗滌三次之後，用3。/。BSAPBS封閉平板。然後在37。C添加100ng/ml的純化的二聚TRAIL-R1/TRAIL-R2融合蛋白1小時。用PBS洗滌三次之後，添加100ng/ml的HRP綴合的抗TRAIL-R1和抗TRAIL-R2抗體另一小時。用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物緩衝液IO分鐘，然後通過添加2NHzS04停止反應。在ELISA酶標儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。表7中的結果顯示，當包被抗體是抗TRAIL-R1時，HRP綴合的抗TRAIL-R2與融合蛋白反應。類似地，當包被抗體是抗TRAIL-R2時，HRP綴合的抗TRAIL-R1與融合蛋白也反應。相比之下，與抗體對TRAIL-R1/TRAIL-R1或TRAIL-R2/TRAIL-R2的反應表現為弱反應。這些結果表明大部分純化的蛋白質是處於TRAIL-R1/TRAIL-R2的異二聚形式。tableseeoriginaldocumentpage91實施例3.針對人類TRAIL-R1和TRAIL-R2的單克隆抗體的產生1.免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,Me.)用親和純化的人類TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白免疫。對於初次爪墊免疫，將融合蛋白(50呢)在弗氏完全佐劑(Difco,Detroit,Mich.)中乳化。然後不含佐劑的50jig融合蛋白注射四次來強化免疫小鼠，注射每兩天進行一次。在最後一次注射之後三天，收集來自局部淋巴結的淋巴細胞。2.細胞融合從淋巴結製備單細胞懸浮液，以2:1的比例與NS1骨髓瘤細胞混合。產生的混合物用PRMI-1640洗滌三次。然後將一毫升37。C預熱的50%(w/v)聚乙二醇1500(BoehringerManheim)緩慢地添加到試管中，使用移液管的尖端一直攪動沉澱。隨後，慢慢地添加預熱到37。C的50ml無血清RPMI培養基。然後將產生的混合物離心，棄去上清液，添加含有12%(v/v)FCS的50mlHAT培養基，同時用移液管的尖端輕輕地攪動。懸浮液以100pi/孔分配到96孔細胞微量培養板上，在5%(v/v)C02的氣氛中37。C溫育7-10天。3.單克隆抗體的篩選將ELISA平板用1嗎/ml的異二聚TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白在4。C包被過夜。用PBS洗滌三次之後，用3。/。BSAPBS在室溫下封閉平板l小時。然後添加100)il雜交瘤培養上清液，在37。C經過1小時。用PBS洗滌三次之後，添加HRP綴合的抗小鼠IgG抗體，經過30分鐘。用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物緩衝液，經過10分鐘，然後通過添加2NH2S04終止反應。在ELISA酶標儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度值。對所有陽性克隆進行二次確認篩選來排除TRAIL-R1或TRAIL-R2單特異性克隆以及與人類IgGl反應的假陽性克隆。將ELISA平板分別用1嗎/ml的異二聚TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白、TRAIL-Rl-Fc、TRAIL-R2-Fc或人類IgGl在4°C包被過夜。用PBS洗塗三次之後，用3%BSAPBS在室溫下封閉平板1小時。然後添加100^雜交瘤培養上清液，37。C經過1小時。用PBS洗滌三次之後，然後添加HRP偶聯的抗小鼠IgG抗體，經過30分鐘。用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物緩沖液，經過10分鐘，然後通過添加2NH2S04終止反應。在ELISA酶標儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度值。在所有的250個陽性克隆中，大約40%與TRAIL-Rl-Fc反應，25%與TRAIL-R2-Fc反應，其餘的與人類IgGl反應。僅僅一個稱為CTB003的克隆與異二聚的TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白、TRAIL-Rl-Fc、TRAIL-R2-Fc反應，而不與人類IgGl反應。因此，選擇CTB003作為針對TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的雙特異性克隆。4.通過有限稀釋克隆最初的CTB003雜交瘤細胞用含有12%FCS的RPMI-1640稀釋到每ml0.3個細胞，在存在105個Balb/c小鼠的胸腺細胞作為飼養細胞的情況下在兩個96孔平板中培養。7-10天後，收集100pl的培養上清液，如上所述通過ELISA測定抗體產生。通過有限稀釋來將陽性克隆亞克隆三次。克隆的CTB003保持了與TRAIL-R和TRAIL-R2的反應性，而不與人類IgGl反應，因而確認了它的雙特異性反應性。CTB003雜交瘤克隆已經保藏到GCMCC，登錄號GCMCC1665。通過小鼠免疫球蛋白同種型測試試劑盒，CTB003的同種型被確定為鼠的IgGlkappa。5.CTB003單克隆抗體的純化從培養上清液純化CTB003:將培養上清液加到蛋白G-SepharoseCL-4B親和層析(Pharmacia)。流速是2ml每分鐘。在培養物上清液通過之後，用50mlPBS洗滌柱子。用洗脫緩衝液(0.1M甘氨酸(pH2.4)、0.15MNaCl)來洗脫蛋白質。在OD280nm測量每個洗脫級分(1ml)的光密度。收集OD280>0.1的級分。在添加100pl的中和緩沖液(1MHis-HCLpH8.5)之後，洗脫物單獨地置於透析管中，洗脫物在4。C相對於l升的PBS(pH7.5)透析。透析緩衝液更換兩次。純化的蛋白質濃縮到1mg/ml，滅菌並在-4。C保存待用。實施例4.CTB003對TRAIL受體的結合特異性由於針對TRAIL和針對TNFR家族的其他蛋白質的所有受體有顯著的同源性，通過ELISA來測定示例性抗體CTB003對TRAIL-R1和TRAIL-2的特異性，其中使用一組以上描述的可溶形式的TRAIL受體作為抗原。ELISA平板用含1|ig/ml的下列重組蛋白質的PBS在4°C包^皮過夜1.TRAIL-R1和TRAIL-R2異二聚抗原，2.TRAIL-Rl-Fc融合抗原，3.TRAIL-R2-Fc融合抗原，4.TRAIL-R3-Fc融合抗原，5.TRAIL-R4-Fc融合抗原，或BSA作為陰性對照。在用PBS洗滌三次之後，平板用3%BSAPBS在室溫下封閉1小時。平板用各種濃度的純化的CTB003在37。C溫育一小時。用PBS洗滌三次，然後添加HRP綴合的抗小鼠IgG抗體，經過30分鐘。用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物緩衝液，經過10分鐘，然後通過添加2NH2S04終止反應。在ELISA酶標儀中使用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。CTB003展現了與TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原以及TRAIL-Rl-Fc或TRAIL-R2-Fc融合抗原的劑量依賴性結合。在測試的抗體濃度的範圍內，CTB003不與TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原和BSA反應(圖2)。實施例5.CTB003的體外凋亡i秀導活性1.人類癌細胞系使用一組人類癌細胞系評估CTB003的體外凋亡誘導活性，包括三種人類乳腺癌細胞系(圖3,圖面A);三種人類結腸癌細胞系(圖3，圖面B);三種人類胰腺癌細胞系(圖3，圖面C);三種人類卵巢癌細胞系(圖3,圖面D);三種人類前列腺癌細胞系(圖3，圖面E);三種人類肺癌細胞系(圖3,圖面F)。通過流式細胞計測試，所有的細胞系都是TRAIL-R1和TRAIL-R2細胞表面表達陽性的。(所有的細胞購自ATCC)。2.ATPLite分析來測定細胞活力在96孔平板中將每孔1,000個目標細胞在存在七種濃度的10倍稀釋CTB003的條件下培養，其中CTB003最高濃度是1000ng/ml，最低濃度0.01ng/ml。在37。C培養過夜之後，根據廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite試劑盒測定細胞活力添加50pl的細胞裂解緩衝液，然後添加50pl的底物緩衝液。將反應物在發光讀數器中計數。細胞活力計算為(處理細胞的cmp/對照細胞的cmp)xl00%。3.CTB003對腫瘤細胞的劑量依賴性殺傷這些結果表明，CTB003對大多數測試的人類肺瘤細胞展現了可變的殺傷活性。在三種測試的人類乳腺癌細胞系中，兩種細胞系的活力在處理之後被降低到低於10°/。(圖3，圖面A)。所有三種結腸細胞系的活力低於10%(圖3，圖面B)。雖然所有人類胰腺癌細胞系對於CTB003是敏感的，三種人類胰腺癌細胞系中的兩種對於CTB003是更加敏感的。在用1000ng/ml的CTB003處理之後，存在的活細胞低於5%(圖3，圖面C)。雖然所有的人類卵巢癌細胞對於CTB003是敏感的，三種人類卵巢癌細胞中的兩種是更加敏感的(圖3，圖面D)。所有三種人類前列腺癌系對CTB003是敏感的(圖3,圖面E)。三種人類肺癌系中的兩種對於CTB003處理是敏感的，而另外一種細胞系似乎對CTB003有抗性。結果表明，CTB003在測試的大多數類型的人類癌細胞中具有殺傷活性。4.CTB003對腫瘤細胞的時間依賴性殺傷將人類結腸癌細胞(Colo205)或人類乳腺癌細胞(MDA231)以每孔1000個細胞在存在1000ng/mlCTB003的情況下在96孔平板中培養標明的時間點。在每個時間點結束時通過ATPLite分析測定細胞活力。用1000ng/mlCTB003處理細胞之後，在4、8、12和24小時的時點測定處理的Cok)205和MDA231的細胞活力。結果表明CTB003的殺傷活性是時間依賴性的。兩種細胞系的活細胞在處理後4h降低到低於50%,處理後24小時低於5%(圖4)。實施例6.CTB003與化療藥物的協同殺傷1.人類癌細胞系''為了確定CTB003與化療劑的協同殺傷活性，挑選了一組與其他癌細胞系相比對CTB003介導的殺傷的敏感性較低的人類癌細胞系。選擇用於研究的細胞系包括人類乳腺癌細胞(BT474)、人類結腸癌細胞(SW620)、人類肺癌細胞(A437)、人類結腸癌細胞(SW1116)和人類胰腺癌細胞(Pane1)。所有的細胞購自ATCC。2.化療藥物測試的化療藥物包括阿黴素、紫杉醇(Taxol)、順鉑和CTP-11和吉西他濱。3.ATPLite分析來測定細胞活力在96孔平板中，將每孔l，OOO個目標細胞在存在四種濃度的10倍稀釋CTB003的情況下與三種不同濃度的化療藥物培養，CTB003的最高濃度是1000ng/ml，最低濃度10ng/ml。在37。C培養過夜之後，根據廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden，Conn.M吏用ATPLitei式劑盒測定細月包活力添加50pl的細胞裂解緩衝液，然後添加50^的底物緩衝液。將反應物在發光讀數器中計數。細胞活力計算為(處理細胞的cmp/對照細胞的cmp)xl00%。4.CTB003和阿黴素對人類乳腺癌細胞(BT474)的協同殺傷在不存在阿黴素的情況下，CTB003展現對BT474細胞的弱的殺傷活性。使用單獨的1000ng/mlCTB003，細胞活力僅降低20%。然而，阿黴素以劑量依賴性方式協同地增強CTB003殺傷。在存在O.l^M阿黴素的情況下，細胞活力降低到低於25%，而用更高濃度的阿黴素(0.5和l.OpM),細胞活力在相同濃度的CTB003下低於5%(圖5，圖面A)。圖5、圖面B中呈現了CTB003與阿黴素的協同效應。以從培養基對照孔獲得的ATPLite計數作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。5.CTB003和紫杉醇(Taxol)對人類結腸癌細胞(SW620)的協同殺傷在不存在紫杉醇的情況下，CTB003展現了對SW620細胞的弱的殺傷活性。使用單獨的1000ng/mlCTB003，細胞活力僅降低20%。然而，紫杉醇以劑量依賴性方式協同地增強CTB003殺傷。在存在0.2紫杉醇的情況下，細胞活力降低到低於25%，而用更高濃度的阿黴素(1.0[xM)，細胞活力在相同濃度的CTB003下低於5%(圖6,圖面A)。CTB003與紫杉醇的協同效應在圖6、圖面B中呈現。利用從培養基對照孔獲得的ATPLite計數作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。6.CTB003和順鉑對人類肺癌細胞(A437)的協同殺傷在不存在順鉑的情況下，CTB003對A437細胞不具有殺傷活性。相比之下，順鉑以劑量依賴性方式協同地增強CTB003殺傷。在存在50jLiM順鉑的情況下，細胞活力降至低於20%(圖7,圖面A)。CTB003與順鉑的協同效應在圖7、圖面B中呈現。以從培養基對照孔獲得的ATPLite計數作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。7.CTB003和CTP-11對人類結腸癌細胞(SW1116)的協同殺傷在不存在CTP-ll的情況下，CTB003展現對SW1116細胞的弱的殺傷活性。使用單獨的1000ng/mlCTB003，細胞活力僅降低10%。然而，CTP-ll96以劑量依賴性方式協同地增強CTB003殺傷。在存在5|iMCTP-ll的情況下，細胞活力降低到50%,而用更高濃度的CTP-ll(20pM),細胞活力在相同濃度的CTB003下低於25%(圖8,圖面A)。CTB003與CTP-ll的協同效應在圖8、圖面B中呈現。以從培養基對照反應孔獲得的ATPLite計數作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。8.CTB003和吉西他濱對人類胰腺癌細胞(Panc-1)的協同殺傷在不存在吉西他濱的情況下，CTB003不能殺傷Panc-l細^>。然而，吉西他濱以劑量依賴性方式協同地增強CTB003殺傷。在存在1吉西他濱的情況下，細胞活力降低25%，而用更高濃度的吉西他濱(10pM),細胞活力在相同濃度的CTB003下低於25%(圖9，圖面A)。CTB003與吉西他濱的協同效應在圖9、圖面B中呈現。以從培養基對照孔獲得的ATPLite計數作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。實施例7.CTB003與抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2單特異性單克隆抗體的協同殺傷活性1.人類癌細胞係為了測定CTB003與抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2單特異性抗體的協同殺傷活性，選擇人類結腸癌細胞系(SW1116)。單獨的CTB003或抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2不誘導SW1116細胞中的細胞殺傷。2.單特異性抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2抗體CTB007是針對TRAIL-R1的單克隆抗體，其誘導表達TRAIL-R1的腫瘤細胞的凋亡。CTB006是針對TRAIL-R2的單克隆抗體，其誘導表達TRAIL-R2的腫瘤細胞的凋亡。3.ATPLite分析來測定細胞活力在96孔平板中，將每孔1,000個目標細胞在存在四種濃度的10倍稀釋CTB003的情況下與三種不同濃度的抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2抗體培養，CTB003的最高濃度是1000ng/ml，最低濃度10ng/ml。在37。C培養16h之後，根據廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.H吏用ATPLite試劑盒測定細胞活力添加50jil的細胞裂解緩衝液，然後添加50^的底物緩衝液。將反應物在發光讀數器中計數。細胞活力計算為(處理細胞的cmp/對照細胞的cmp)x100%。4.CTB003和CTB007對人類結腸癌細胞(SW1116)的協同殺傷在不存在CTB007的情況下，CTB003展現對SW1116細胞的弱的殺傷活性。使用單獨的1000ng/mlCTB003,細胞活力僅降低10%。然而，CTB007以劑量依賴性方式協同地增強了CTB003殺傷。在存在10ng/mlCTB007的情況下，細胞活力降低到50%，而用更高濃度的CTB007(100ng/ml)，細胞活力在相同濃度的CTB003下低於25%(圖10,圖面A)。CTB003與CTB007的協同效應在圖10、圖面B中呈現。以從培養基對照孔獲得的ATPLite計^t作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。5.CTB003和CTB006對人類結腸癌細胞(SW1116)的協同殺傷在不存在CTB007的情況下，CTB003展現對SW1116細胞的弱的殺傷活性。使用單獨的1000ng/mlCTB003,細胞活力僅降低10%。然而，CTB006以劑量依賴性方式協同地增強了CTB003殺傷。在存在10ng/mlCTB006的情況下，細胞活力降低到50%，而用更高濃度的CTB006(100ng/ml)，細胞活力在相同濃度的CTB003下低於25%(圖11，圖面A)。CTB003與CTB006的協同效應在圖11、圖面B中呈現。以從培養基對照孔獲得的ATPLite計數作為100%細胞活力，如下計算處理孔中細胞活力的百分比處理的反應孔的計數除以對照孔的計數，然後乘以100%。結果表示為三個復孔的平均值。實施例8.體內的CTB003殺腫瘤活性1.人類癌細胞系用於產生人類癌症的鼠異種移植模型的人類癌細胞系是a)MDA231人類乳腺癌細胞系；b)7402人類肝癌細胞系；c)Colo205人類結腸癌細胞系；和d)MIAcapa人類胰腺癌細胞系。所有細胞購自ATCC,在補充有10%FCS的DMEM中培養。2.異種移植模型用&107個人類癌細胞皮下接種六(6)至8周齡的Balb/c棵鼠。在腫瘤接種後7-14天(因接種的腫瘤細胞系而不同)，超過90%的小鼠長出了活肺瘤塊。將荷瘤小鼠隨機地分成兩個組一個是未處理的對照組，另一個是CTB003處理的組。人類癌症腫瘤生長通過腫瘤的大小來評估。在接種之後，每周地測量腫瘤大小。3.用CTB003處理異種移植小鼠對荷瘤小鼠以三天的間隔每周兩次腹膜內注射200嗎的CTB003。治療在三周內重複六次。4.人類乳腺癌異種移植模型中CTB003的體內抗腫瘤活性在未處理的組中，胂瘤倍增時間(tumordoublingtime)是約7天。在用CTB003處理之後，腫瘤大小快速地降低。在兩個劑量的處理之後，在處理組中七隻小鼠中的三隻發生了完全的腫瘤消退。在另外三隻和一隻小鼠中分別觀察到腫瘤大小的超過70%和50%的降低。在四個劑量的處理之後，所有七隻小鼠中發生了完全的腫瘤'消退。相比之下，在未處理的對照組的所有小鼠中腫瘤大小繼續增長。這些結果表明，CTB003具有強的抗腫瘤效力(圖12)。在另一個實驗中，評估MDA231異種移植模型中CTB003的抗腫瘤效力直到癌細胞接種後的49天，未處理組中100%(8/8)的小鼠顯示了腫瘤大小的繼續增長，而CTB003處理的小鼠的大多數(7/8)顯示了腫瘤的完全消退(圖13)。因而，在人類癌症(例如人類乳腺癌)的體內模型中，當給受試者施用本發明的TRAIL受體結合劑時，本發明的TRAIL受體結合劑顯示了治療效益(例如腫瘤生長的抑制)。因而，本發明的TRAIL受體結合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)，當以有效量施用於有需要的受試者時，在預防或治療人類癌症(例如人類乳腺癌)的方法中是有用的。5.人類肝癌異種移植模型中CTB003的體內抗腫瘤活性在7402人類肝癌異種移植模型中，CTB003展現了顯著的抑制活性。在未處理組中腫瘤倍增時間是約10天，相比之下，CTB003處理組中是35天(圖14)。因而，在人類癌症(例如人類肝癌)的體內模型中，本發明的TRAIL受體結合劑當施用於受試者時顯示了治療效益(例如腫瘤生長的抑制)。因而，本發明的TRAIL受體結合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),當以有效量施用於有需要的受試者時，在預防或治療人類癌症(例如人類肝癌)的方法中是有用的。6.人類結腸癌異種移植模型中CTB003的體內抗胂瘤活性在Colo205人類結腸癌異種移植模型中，與未處理組中100%的肺瘤進展相比，CTB003實現了100%的完全腫瘤消退(圖15)。因而，在人類癌症(例如人類結腸癌(例如結腸直腸癌))的體內模型中，本發明的TRAIL受體結合劑當施用於受試者時顯示了治療效益(例如肺瘤生長的抑制)。因而，本發明的TRAIL受體結合劑，以及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)，當有效量施用於有需要的受試者時，在預防或治療人類癌症(例如人類結腸癌)的方法中是有用的。7.人類胰腺癌異種移植模型中CTB003的體內抗腫瘤活性在MIAcapa人類胰腺癌異種移植模型中，CTB003展現顯著的抑制活性。在未處理的組中觀察到的腫瘤倍增時間為約14天，相比之下，CTB003處理的組中為70天(圖16)。因而，在人類癌症(例如胰腺癌)的體內才莫型中，本發明的TRAIL受體結合劑當施用於受試者時顯示了治療效益(例如胂瘤生長的抑制)。因而，本發明的TRAIL受體結合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)當以有效量施用於有需要的受試者時，在預防或治療人類癌症(例如人類胰腺癌)的方法中是有用的。總的來說，在多種人類癌症(例如人類乳腺癌；人類肝癌；人類結腸癌；人類胰腺癌)的體內模型中，本發明的TRAIL受體結合劑當施用給受試者時顯示了治療效益(例如與未處理的對照受試者中觀察到的肺瘤生長相比，腫瘤細胞生長的降低)。這些癌症共有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽表達的生物學特徵。如以上討論的，細胞(包括癌細胞)上功能性TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的活化可以導致細胞死亡(例如凋亡性細胞死亡)。因而，本發明的TRAIL受體結合劑及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),當以有效量施用於有需要的受試者時，在預防或治療表達表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的人類癌細胞的方法中是有用的，所述癌細胞包括但不限於乳腺癌；肝癌；結腸癌；胰腺癌。實施例9.CTB003和阿黴素的協同的體內抗腫瘤效力1.人類癌細胞系人類乳腺癌細胞系(MDA231)用於棵鼠中異種移植模型的製備。2.異種移植模型用1>0.1的級分。添加100pi的中和緩衝液(1MHis-HCLpH8.5)之後，將洗脫物單獨地置於透析管中，洗脫物在4T:相對於1升的PBS(pH7.5)透析。透析緩衝液更換兩次。純化的蛋白質濃縮到1mg/ml，滅菌並在-4。C保存待用。通過10Q/。SDS-PAGE測定，人類嵌合抗體的純度大於95%。II.嵌合的CTB003、CTB006和CTB007對TRAIL受體的結合特徵通過ELISA將嵌合的CTB003、CTB006和CTB007對TRAIL受體的結合活性與它們的親本鼠抗體相比較。ELISA平板用含1pg/ml以下重組蛋白質的PBS在4。C包被過夜1.TRAIL-R1和TRAIL-R2異二聚抗原，2.TRAIL-Rl-Fc融合抗原，3.TRAIL-R2-Fc融合抗原，4.TRAIL-R3-Fc融合抗原，5.TRAIL-R4-Fc融合抗原，或BSA作為陰性對照。在用PBS洗滌三次之後，平板用3。/。BSAPBS在室溫下封閉1小時。平板與各種濃度的純化的嵌合或親本鼠抗體在37。C溫育一小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結合的抗體，然後對於鼠抗體添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl，或對於人類嵌合抗體添加HRP綴合的山羊抗人kappa，在37。C經過30分鐘。用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物糹爰衝液經過10分鐘，然後通過添加2NH2S04終止反應。在ELISA酶標儀中用450nm/650nm的雙波長記錄光密度的值。嵌合的CTB003展現了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原(圖21，圖面A)以及TRAIL-Rl-Fc(圖21，圖面B)或TRAIL-R2-Fc(圖21,圖109面C)融合抗原的劑量依賴性結合，且其結合動力學與對親本鼠CTB003所觀察到的結合特徵幾乎不能區分。在測試的抗體濃度的範圍內，嵌合的CTB003不與TRAIL-R3-Fc(圖21,圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖21,圖面E)融合抗原或BSA(圖21,圖面F)反應。嵌合的CTB006和嵌合的CTB007的特徵分別總結在圖22和23中。這些結合劑的人源化嵌合形式的結合特徵基本上不能與它們對應的鼠親本對應物相區別。也就是說，嵌合的CTB006展現了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原(圖22，圖面A)以及TRAIL-R2-Fc(圖22，圖面C)融合抗原的劑量依賴性結合，結合動力學非常類似於親本CTB006。在測試的抗體濃度的範圍內，嵌合的CTB006不與TRAIL-Rl-Fc(圖22，圖面B)、TRAIL-R3-Fc(圖22，圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖22，圖面E)融合抗原或BSA(圖22,圖面F)反應。嵌合的CTB007展現了對TRAIL-R1/TRAIL-R2異二聚體抗原(圖23,圖面A)以及TRAIL-Rl-Fc(圖23,圖面B)融合抗原的劑量依賴性結合，結合動力學非常類似於親本CTB007的那些。在測試的抗體濃c的範圍內，CTB007不與TRAIL-R2-Fc(圖23，圖面C)、TRAIL-R3-Fc(圖23，圖面D)、TRAIL-R4-Fc(圖23，圖面E)融合抗原或BSA(圖23，圖面F)反應。類似於在實施例12中描述的研究，在互反實驗中用TRAIL-R1和TRAIL-R2融合多肽進行竟爭性抑制ELISA來進一步對人類嵌合CTB003的表位特異性加以定位。如圖24，圖面A所示，肽H或I都以劑量依賴性方式抑制了人源化嵌合的CTB003對TRAIL-R1的結合。同樣地，如在圖20，圖面B中所示，肽H或I以劑量依賴性方式抑制人源化嵌合的CTB003對TRAIL-R2的結合。因而，人源化嵌合的CTB003所識別的表位位於TRAIL-R2的aa167到aa182和TRAIL-R1的aa218到aa233之間(即，TRAIL-R1和TRAIL-R2之間具有序列同源性的區域)。顯著地，人源化嵌合的CTB003結合劑的結合特徵基本上不能與鼠CTB003相區別。為了確定這些結合劑是否共有相同的生物學性質，如下所述在許多癌細胞系中將嵌合的CTB003的體外凋亡誘導活性與鼠CTB003進行了比較。III。嵌合^CriMj、CT80M和亡謬爭話'/S使用一組人類癌細胞系來於評估嵌合的CTB003、CTB006和CTB007的體外凋亡誘導活性，包括人類乳腺癌細胞系，MDA231;人類結腸癌細胞系，Colo205;人類胰腺癌細胞系，MIAcapa;人類卵巢癌細胞系，CaOvc3;人類前列腺癌細胞系，Dul45;和人類肺癌細胞系，H2122。用ATPLite分析測定細胞活力和每種抗體的IC50。在96孔平板中，將每孔1,000個目標細胞在存在七種濃度的10倍稀釋嵌合抗體或它們的相應親本鼠抗體的情況下培養，抗體最高濃度是1000ng/ml，最低濃度0.01ng/ml。在37。C培養過夜之後，根據廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite試劑盒測定細胞活力添加50的細胞裂解緩衝液，然後添加50pl的底物緩衝液。反應物在發光讀數器中計數。細胞活力計算為(處理細胞的cmp/對照細胞的cmp)xl00%。產生了劑量依賴性殺傷曲線。IC50通過線性回歸來計算。結果表示為三個重複培養物的平均值士SD。表8.嵌合抗體與親本鼠抗體的殺傷活性的比較tableseeoriginaldocumentpage111所有六種測試的人類癌細胞系，包括MDA231人類乳腺癌細胞(圖25)、Colo205人類結腸癌細胞(圖26)、MIAcapa人類胰腺癌細胞(圖27)、Caov3人類卵巢癌細胞(圖28)、Dul45人類前列腺癌細胞(圖29)和H2122人類肺癌細胞，對於鼠CTB003和人類嵌合CTB003(圖面A)或鼠CTB006和嵌合的CTB006(圖面B)或鼠CTB007和嵌合的CTB007(圖面C)所誘導的凋亡是同樣地敏感的。重組嵌合抗體展現了與它們相應的親本鼠抗體相似的劑量應答關係。這些結果表明，所有工程化的嵌合抗體保持了它們的鼠親本抗體的凋亡誘導活性。人類嵌合的和鼠抗體的凋亡誘導活性在表8中以IC50表示，其顯示在所有測試的人類癌症細胞中，重組嵌合的CTB003、CTB006和CTB007展現了與它們的鼠親本抗體非常相似的IC50。根據在人源化嵌合CTB003和鼠CTB003之間觀察到的共有的結合特徵和體外生物學應答，我們認為，本領域普通技術人員將認識到，人源化的嵌合CTB003也將如鼠CTB003—樣產生體內的腫瘤生長抑制作用。因而，本發明的結合劑(例如hCTB003)當以有效量施用給有需要的受試者(包括人類受試者)時在抑制腫瘤生長的方法中是有效的。實施例14.CTB003在非人靈長類中的臨床前毒性研究在北京國家藥物安全評估和研究中心(中國北京)在非人靈長類中評估了CTB003的全身毒性。對體重4.5kg的4-5月齡的雄性恆河猴以40mg/kg劑量靜脈內輸注CTB003。CTB003以3mg/ml溶於PBS中，總輸注體積是每kg體重20ml。輸注速率是每分鐘5滴，輸注在90分鐘內完成。從處理前第7天開始到處理後15天止，每天^r查受處理動物的一般生理狀況。在處理前第7天和在處理後0、3、7和14天衝企查體重、體溫、EKG、血液學參數、血液生物化學參數。在處理之後，動物的一般身體狀況看起來是正常的。體重稍有增高，體溫保持在正常範圍之內(表9)。表9.CTB003的靜脈內施用對體重和體溫的影響tableseeoriginaldocumentpage112在處理後所有測試的血液學參數(表10)沒有顯著的改變，生物化學測量值在處理後保持正常(表ll)。結果表明，CTB003以40mg/kg的全身性施用在恆河猴中得到了良好的耐受。表10.CTB003的靜脈內施用對血液學參數的影響天RBC(1012/L)Hb(g/1)Hct(%)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/1)RDW(%)-75.471330.42377.324.331513.4I5.561470.43076.726.234212.245.441400.42377.725.733112.785.431390.41776.825.633312.7155.291330.40576.625.132812.7天Plat(l(^/L)MPV(fl)PDW(%)Ret%(%)Ret#(109/L)WBC(109/L)NE陽74937.415,91.240.07147.51913548.015.70.670.03978.32943748.015.60.690.03928.02683598.216.21.210.06827.817153988.115.60.850.04657.028天LYMOEOBA———-771811————1630—--—46740————8693110———1564260———_表l1.CTB003的靜脈內施用對生物化學參數的影響^Ii7IE7ISTcholBUN113tableseeoriginaldocumentpage114常的。體重沒有改變，體溫保持在正常範圍之內(表12)。表12.CTB006或CTB007的全身性施用對體重和體溫的影響tableseeoriginaldocumentpage115在用CTB006(表D)或CTB007(表")處理後所有測試的血液學參數沒有顯著改變，所有的生物化學測量值(表15和16)保持正常，只是在處理後血漿ALT和AST中輕微和短暫的增加，其在處理後7天回到正常。表13.CTB006的全身性施用對血液學參數的影響tableseeoriginaldocumentpage115tableseeoriginaldocumentpage11637930o———77571o———146230o———表l5.CTB006的靜脈內施用對生物化學參數的影響天ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)TP(g/1)Alb(g/1)Tchol(mmol/1)BUN(mmol/1)-7722922380.545,24.687.690451418576.644.64.267.9419816217272.241.43.777.413833815973.642.03.928.137672318274.743.04.277.6414482011269.943.53.476.54天Tbil((xmo1/1)Glu(mmol/1)Grea(pmol/l)CK(U/L)Na(mmol/1)K(mmol/1)CI(mmol/1)-74.65.2249.01841405.69904.04.8849.21831455.110014.74.3548.74461455.41076.76.1351.44521508.41076.85.3350.61581474.1105144.75.8042.11371464.3110天TG(mmol/1)G-GT(U/L)——————70.4732—一一———00,2130——————10.4827—————30.5635—————70.3935—————140.2041———————表16.CTB007的靜脈內施用對生物化學參數的影響天ALTASTALPTPAlbTcholBUNtableseeoriginaldocumentpage118聚丙烯醯胺凝月交電泳("SDS-PAGE")中在還原條件下分離。在電泳之後，將凝膠中的蛋白質轉移到聚乙二烯二氟化物膜("PVDF")上。在轉移之後，用洗滌緩衝液25mMNaCl、10mM硼酸鈉緩衝液(pHS.0)洗滌PVDF膜，然後在染色溶液(50%v/v曱醇、20%v/v乙酸和0.05%(w/v)考馬斯亮藍)中洗滌5分鐘來確定蛋白質條帶的位置。然後用90%(v/v)含水曱醇脫色PVDF膜，將早先在PDVF膜上定位的與重鏈相應的條帶(具有較低泳動能力的條帶)和與輕鏈相應的條帶(具有較高泳動能力的條帶)切下，並用去離子水洗滌。利用蛋白質測序儀(PROCISE491,ABI，USA)通過Edman自動化方法來測定重鏈和輕鏈的N-末端胺基酸序列。測得與CTB003的重鏈相應的N-末端胺基酸序列為Glu陽Val-His-Leu-Val-Glu畫Ser-Gly-Gly-Gly畫Leu畫Val-Arg畫Pro畫Gly-Gly-Ser(SEQIDNO.:84)測得與CTB003的輕鏈相應的條帶的N-末端胺基酸序列為Ala-Thr-Met-Arg-Leu-Pro-Ala-Gln-Leu-Leu-Gly-Leu-Leu-Met-Leu-Trp-Val-Ser(SEQIDNO.:85)測得與CTB006的重鏈相應的N-末端胺基酸序列為Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Pro-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser(SEQIDNO.:86)測得與CTB006的輕鏈相應的條帶的N-末端胺基酸序列為Asp-Ile-Val畫Met-Thr-Gln國Ser畫His畫Lys-Phe畫Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly(SEQIDNO.:87)測得與CTB007的重鏈相應的N-末端胺基酸序列為Glu-Val-Gln國Leu畫Gln陽Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala畫Ser(SEQIDNO.:88).測得與CTB007的輕鏈相應的條帶的N-末端胺基酸序列為Asp-Ile網Gln-Met-Thr-Gln-Ser畫Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Val-Ser-Val(SEQIDNO.:89),實施例17.CTB003相關的序列以下提供了CTB003相關的序列。鼠CTB003輕鏈可變區核酸序列在下文的表17中顯示。表17.鼠CTB003輕鏈可變區核酸序列tableseeoriginaldocumentpage120鼠CTB003輕鏈可變區核酸和胺基酸序列在下文的表19中顯示。表19.鼠CTB003輕鏈可變區核酸和胺基酸序列GACATCCAGATGACCCAATCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACC~DI(JMT(JSSSSFSVSLGDRVTATTACTTGCAAGGCAGGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAITCKAGEDIYNRLAWYQKPGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAATTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAGNAPRLLISGATNLETGVPSAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTRFSGSGSGKDYTLSITSLQTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCSEQIDNO.:1EDVATYYCQQYWSTPLSEQIDNO.:2鼠的CTB003輕鏈CDR1核酸和胺基酸序列在下文的表20中顯示。表20.~鼠CTB003輕鏈CDR1胺基酸序列KAGEDIYNRLASEQIDNO.:3鼠的CTB003輕鏈CDR2核酸和胺基酸序列在下文的表21中顯示。表21.鼠CTB003輕鏈CDR2胺基酸序列GATNLETSE(JIDNO.:4鼠的CTB003輕鏈CDR3核酸和胺基酸序列在下文的表22中顯示。表22.~~鼠CTB003輕鏈CDR3胺基酸序列QQYWSTPLSEQIDNO.:5鼠CTB003重鏈可變區核酸序列在下文的表23中顯示。表23.鼠CTB003重鏈可變區核酸序列GAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACACAATGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTSEQIDNO.:7_鼠CTB003重鏈可變區胺基酸序列在下文的表24中顯示。表24.~鼠CTB003重鏈可變區胺基酸序列EVHVESGGGLVRPGGSKSCAAsGFAFSSYDMSWVRQTPEKREWVAYISDGGGITYYPDTMKGRTISRDNAKNTSQMSSKSEDTAMYYCARHITMVVGPFASE(JIDNO.:8鼠的CTB003重鏈可變區核酸和胺基酸序列在下文的表25中顯示。表25.鼠CTB003重鏈可變區核酸和胺基酸序列GAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCEVHLVESGGGLVRPGGSLKLTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTSCAASGFAFSSYDMSWVRQTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATPEKRLEWVAYISDGGGITYYCCAGACACAATGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCPDTMKGRLTISRDNAKNTLSCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTLqMSSLKSEDTAMYYCARHIACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTSEQIDNO.:7TMVVGPFASE(jIDNO.:8_鼠的CTB003重鏈CDRl胺基酸序列在下文的表26中顯示。表26.~鼠CTB003重鏈CDRl胺基酸序列SYDMSSEQIDNO.:9鼠的CTB003重鏈CDR2胺基酸序列在下文的表27中顯示。表27.~鼠CTB003重鏈CDR2胺基酸序歹'JYISDGGGITYYPDTMKGSEQIDNO.:10鼠的CTB003重鏈CDR3胺基酸序列在下文的表28中顯示。表28.~鼠CTB003重鏈CDR3胺基酸序列HITMVVGPFASEQIDNO.:11人類嵌合CTB003輕鏈核酸序列在下文的表29中顯示。表29.人類嵌合CTB003輕鏈核酸序列ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGTGACATCCAGATGACTCAGTCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQIDNO.:12人類嵌合CTB003輕鏈胺基酸序列在下文的表30中顯示。表30.人類嵌合CTB003輕鏈胺基酸序列MRLPAQGMWVSGSSGDIQMTQSSSSFSVsGDRVTITcKAsEDIYNRAwYQQKPGNAPRISGATsETGVPSRFSGSGSGKDYTSITSLQTEDVATYYCQQYWsTLTFGAGTKEKRAVAApSVDIFPPSDEQKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAQSGNSQESVTEQDsKDSTYsSSTLTSKADYEKHKVYAcEVTHQGSSPVTKSFNRGEc*SEQIDNO.:13人類嵌合CTB003輕鏈核酸和胺基酸序列在下文的表31中顯示。表31.人類嵌合CTB003輕鏈核酸和胺基酸序列ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGTMRLPACILLGLLMLWVSGSSGGACATCCAGATGACTCAGTCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCDI(JMTQSSSSFSVSLGDRVTATTACTTGCAAGGCAAGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAITCKASEDIYNRLAWYQ(JKPGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAGNAPRLLISGATSLETGVPSAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTRFSGSGSGKDYTLSITSLQTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTEDVATYYCQYWSTPLTFGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCAGTKLELKRAVAAPSVDIFPPSDEqiKSGTASVVCLLNNFYCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGPREAKVQWKVDNALQSGNSQGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGESVTEqDSKDSTYSLSSTLTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCLSKADYEKHKVYACEVTHGCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQIDNO.:12LSSPVTKSFNRGEC*SE(jIDN0.:13人類嵌合CTB003重鏈核酸序列在下文的表32中顯示。表32.人類嵌合CTB003重鏈核酸序列ATGGGGA麗TTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACACAATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:14_人類嵌合CTB003重鏈胺基酸序列在下文的表33中顯示。表33.人類嵌合CTB003重鏈胺基酸序列MGXGLSWVFVVIEGVQCEVHVESGGGVRPGGSKScAAsGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISDGGGITYYPDTMKGRFTISRDNAKNTS123tableseeoriginaldocumentpage124tableseeoriginaldocumentpage125實施例18.CTB006相關的序列以下提供了CTB006相關的序列。鼠CTB006輕鏈可變區核酸序列在下文的表35中顯示。_表35.鼠CTB006輕鏈可變區核酸序列tableseeoriginaldocumentpage125鼠CTB006輕鏈可變區胺基酸序列在下文的表36中顯示。表36.~鼠CTB006輕鏈可變區胺基酸序列tableseeoriginaldocumentpage125tableseeoriginaldocumentpage126鼠CTB006輕鏈可變區核酸和胺基酸序列在下文的表37中顯示。表37.鼠CTB006輕鏈可變區核酸和胺基酸序列tableseeoriginaldocumentpage126鼠CTB006輕鏈CDR3胺基酸序列在下文的表40中顯示。tableseeoriginaldocumentpage126鼠CTB006重鏈可變區核酸序列在下文的表41中顯示。tableseeoriginaldocumentpage126鼠CTB006重鏈可變區胺基酸序列在下文的表42中顯示。tableseeoriginaldocumentpage1261QVQQ(JPGPEVKPGASVRM21sCKAsGYTFTSYFIHWVKQR41pGQGEWIGWIYPGNVNTKY61sEKFKGKATTADKSSSTAY81MQFSSLTSEDSAVYFCARGE101AGYFDSEQIDNO.:22鼠的CTB006重鏈可變區核酸和胺基酸序列在下文的表43中顯示。表43.鼠CTB006重鏈可變區核酸和胺基酸序列1CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATG1QVQLQQPGPELVKPGASVRM61TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGG21SCKASGYTFTSYFIHWVKOR121CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTAC41PGQGLEWIGWIYPGNVNTKY181AGTGAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC61SEKFKGKATLTADKSSSTAY241ATGCAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAG81MQFSSLTSEDSAVYFCARGE301GCTGGGTACTTTGACSEQIDNO.:21101AGYFDSE(JIDNO.:22鼠CTB006重鏈CDR1胺基酸序列在下文的表44中顯示。表44.鼠CTB006重鏈CDR1胺基酸序列SYFIHSE(jIDNO.:23_鼠CTB006重鏈CDR2胺基酸序列在下文的表45中顯示。表45.鼠CTB006重鏈CDR2胺基酸序歹'JWIYPGNVNTKYSEKFKGSE(jIDNO.:24鼠CTB006重鏈CDR3胺基酸序列在下文的表46中顯示。表46.鼠CTB006重鏈CDR3胺基酸序列GEAGYFDSE(jIDNO.:25人類嵌合CTB006輕鏈核酸序列在下文的表47中顯示。_表47.人類嵌合CTB006輕鏈核酸序列formulaseeoriginaldocumentpage128141SDEOLKSGTASVVCLLNNFY481CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG161PREAKVQWKVDNALQSGNSQ541GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG181ESVTEQDSKDSTYSLSSTLT601CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGC201LSKADYEKHKVYACEVTHQG661CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQIDNO.:26221_LSSPVTKSFNRGEC*SE(jIDNO.:27人類嵌合CTB006重鏈核酸序列在下文的表50中顯示。表50.人類嵌合CTB006重鏈核酸序列一1ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAG61GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATGTCC121TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGGCCT181GGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTACAGT241GAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG301CAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAGGCT361GGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG421GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC481CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC541GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC601CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC661GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC721AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC781CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA'CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC841GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC901GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT961GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC1021AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG1081CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC1141CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG1201GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC1261GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC1321GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC1381TCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:28人類嵌合CTB006重鏈胺基酸序列在下文的表51中顯示。表51.人類嵌合CTB006重鏈胺基酸序歹寸1MEGSWVFVVILEGVQCE21VQQQSGPEVKPGASVRMS41CKAsGYTFTSYFIHWVKQRP61GQGEWIGWIYPGNVNTKYS81EKFKGKATTADKSsSTAYM101QFSSTSEDSAVYFcARGEAmGYFDYWGQGTTTVsSASTK129tableseeoriginaldocumentpage130formulaseeoriginaldocumentpage1311381TCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:28461SLSPGK*SE(JID亂29實施例19.CTB007相關的序列以下提供了CTB007相關的序列。鼠CTB007輕鏈可變區核酸序列在下文的表53中顯示。表53.鼠CTB007輕鏈可變區核酸序列"IGACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC61ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACAG121GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA181AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT241GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGSE(jIDNO.:30鼠CTB007輕鏈可變區胺基酸序列在下文的表54中顯示。表54.鼠CTB007輕鏈可變區胺基酸序列1DIQMTQSPASSVSVGETVT21ITCRAsENIYSNEWYQQKQ41GKSPQVYAATNADGVPS61RFSGsGSGTQYSKINSLdS81EDFGsYYCQHFWGTWSEQIDNO.31鼠CTB007輕鏈可變區核酸和胺基酸序列在下文的表55中顯示。表55.鼠CTB007輕鏈可變區核酸和胺基酸序列—1GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC1DIQMT(JSPASLSVSVGETVT61ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGQG/UACAG21ITCRASENIYSNLEWYQQKQ121GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA41GKSP(JLLVYAATNLADGVPS181AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT61RFSGSGSGTdYSLKINSL(JS241GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGSEQIDNO.:30_^_EDFGSYYC(jHFWGTWSE(jIDNO.:31鼠CTB007輕鏈CDRl胺基酸序列在下文的表56中顯示。表56.鼠CTB007輕鏈CDRl胺基酸序列RASENIYSNLESEQIDNO.:32'鼠CTB007輕鏈CDR2胺基酸序列在下文的表57中顯示。表57.鼠CTB007輕鏈CDR2胺基酸序列AATNLADSE(jIDNO.:33一鼠CTB007輕鏈CDR3胺基酸序列在下文的表58中顯示。表58.鼠CTB007輕鏈CDR3胺基酸序列QHFWGTWSEQIDNO.:34鼠CTB007重鏈可變區核酸序列在下文的表59中顯示<表59.鼠CTB007重鏈可變區核酸序列1GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG61TCCTGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGG121CCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATAT181GACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTAC241CTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTAC301GTTAGTAACGCCTGGTTTACTSEQIDNO.:35鼠CTB007重鏈可變區胺基酸序列在下文的表60中顯示,表60.鼠CTB007重鏈可變區胺基酸序列lEVQLQQSGAELVKPGASVK21SCTASGFNIKDTYMHWVKQR41PEQGLEWIGRIDPANGNTKY61DPKFOGKATITADTSSNTAY81LQLSSLTSEDTAVYYCAYYY101VSNAWFTSEQIDNO.:36鼠的CTB007重鏈可變區核酸和胺基酸序列在下文的表61中顯示'表61.鼠CTB007重鏈可變區核酸和胺基酸序列1GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG1EVQLQQSGAELVKPGASVKL61TCCTGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGG21SCTASGFNIKDTYMHWVKQR121CCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATAT41PEC!GLEWIGRIDPANGNTKY181GACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTAC61DPKF(JGKATITADTSSNTAY241CTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTAC81L(!LSSLTSEDTAVYYCAYYY301GTTAGTAACGCCTGGTTTACTSEQIDNO.:35101VSNAWFTSEIDNO.:36鼠CTB007重鏈CDRl胺基酸序列在下文的表62中顯示,表62.鼠CTB007重鏈CDRl胺基酸序列tableseeoriginaldocumentpage133SEQIDNO.:38鼠CTB007重鏈CDR3胺基酸序列在下文的表64中顯示。表64.鼠CTB007重鏈CDR3胺基酸序列YYVSNAWFTSEQIDNO.:39人類嵌合CTB007輕鏈核酸序列在下文的表65中顯示。_表65.人類嵌合CTB007輕鏈核酸序列1ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT61GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC181241301GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGACGTTCGGTGGAGGC361ACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCT421GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCC481AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG541AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG601AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTG661AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGASEQIDNO.:40人類嵌合CTB007輕鏈胺基酸序列在下文的表66中顯示。表66.人類嵌合CTB007輕鏈胺基酸序歹'j1MRPAQGMwVSGSSG21DIQMTQSPASLSVsVGETVT41ITCRAsENIYSNEWYQQKQ61GKSPQVYAATNADGVPs81RFSGSGSGTQYSKINSLQs101EDFGsYYCQHFWGTWTFGGG121TKEIKRAVAAPSVDIFPPS141DEQKSGTASVVCLNNFYP161REAKVQWKVDNALQSGNSQE181SV丁EQDsKDSTYSSSTLT201SKADYEKHKVYACEVTH(JG221SSPVTK.SFNRGEC承SEQIDNO.:41人類嵌合CTB007輕鏈核酸和胺基酸序列在下文的表67中顯示。表67.人類嵌合CTB007輕鏈核酸和胺基酸序列1ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT1MRLPA(JLLGLLMLWVSGSSG61GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC21DIdMTQSPASLSVSVGETVT41ITCRASENIYSNLEWYQQKQ134tableseeoriginaldocumentpage135tableseeoriginaldocumentpage136tableseeoriginaldocumentpage1371381AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO.:42461SLSLSPGK*SE(JIDNO.:43實施例20.CTB003和hCTB003識別的表位的分析要理解的是，對於本發明的TRAIL受體結合劑(例如CTB003和hCTB003)識別的共同的表位，可以進一步分析其胺基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44)的亞區(片段)或同源物，上述序列中，X如本文規定的是K或G，當其被本發明的TRAIL受體結合劑結合時可以在體內或體外系統的表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受體多肽的細胞中誘導細胞(例如癌細胞)凋亡。通過本領域已知的方法製備選擇候選肽(selectcandidatepeptides)，它們是胺基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQIDNO:44)的片段或同源物。在如下所述的竟爭性ELISA中測試這些候選物肽抑制TRAIL受體結合劑結合TRAIL受體(例如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的能力。竟爭性抑制ELISAELISA平板用含1昭/mlTRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4。C包被過夜。用PBS洗滌三次之後，用3。/。BSAPBS在室溫下封閉平板1小時。將1pg/ml的CTB003或hCTB003(TRAIL受體結合劑)分別與各種濃度的候選物肽一起添加，在37。C經過1小時。通過用PBS洗滌三次來除去未結合的TRAIL受體結合劑，然後在37。C添加HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl,經過30分鐘。用PBS洗滌三次之後，添加TMB底物緩衝液，經過10分鐘，然後通過添加2NH2S04終止反應。在ELISA酶標儀中使用450nm7650nm的雙波長記錄光密度的值。以不存在候選肽的情況下的OD值作為CTB003(或hCTB003;TRAIL受體結合劑))對TRAIL-R1或TRAIL-R2的最大結合。各種濃度的候選肽對CTB003與TRAIL-R2的結合的竟爭性抑制計算為相對最大結合的百分比。結果和解釋如果候選肽以濃度依賴性方式抑制TRAIL受體結合劑與TRAIL-R1和TRAIL受體結合劑與TRAIL-R2兩者的結合，則該候選肽代表了TRAIL受體結合劑(例如CTB003或hCTB003)所共同識別的區域。此外，可以將候選序列作為靶標來產生抗性抗體，以誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的138癌細胞的凋亡。進一步的，可以在本發明的體外和體內模型中測試該候選肽來確定所述候選肽是否能夠抑制TRAIL受體結合劑介導的細胞生長(例如腫瘤生長)抑制。實施例21.CTB003對差異表達TRAIL-R1和TRAIL-R2的腫瘤細胞的CTB003的結合和凋亡誘導活性腫瘤細胞可能以不同的水平表達細胞表面TRAIL-R1和TRAIL-R2，因而，針對TRAIL-R1或TRAIL-R2的單特異性抗體單獨施用時，可能無法結合所有的腫瘤細胞並誘導其凋亡。為了確定CTB003是否具有比單特異性TRAIL-R1或TRAIL-R2抗體更廣泛的結合和凋亡誘導活性，在兩個代表性的細胞系人類T白血病細胞和人類B淋巴瘤細胞中進行了研究。人類T白血病細胞(Jurkat)僅表達TRAIL-R2而不表達TRAIL-R1。人類B淋巴瘤細胞(Ramos)表達高水平的TRAIL-R1，但表達低水平的TRAIL-R2。它們還展現對TRAIL-R1或TRAIL-R2單特異性抗體誘導的凋亡的不同的敏感性。CTB003的細胞表面結合的流式細胞分析從細胞培養基中收集lxl(^個單細胞，用FACS緩衝液(含有5°/。FCS，0.1%NaN3,pH7.4的PBS)洗滌兩次。用20jil的10嗎/mlCTB003、CTB006或CTB007在冰上溫育細胞30分鐘。用1mLFACS緩衝液洗滌兩次之後，將細胞進一步與PE綴合的山羊抗小鼠IgGl抗體在水上溫育30分鐘。用1mlFACS緩衝液洗滌兩次之後，將細胞重懸浮在0.5ml的FACS緩衝液中，通過FACScan流式細胞計分析10,000個活細胞。ATPLite分析來測定細胞活力在96孔平板中，將每孔l，OOO個目標細胞在存在四種濃度(最高濃度1000ng/ml，最低濃度10ng/ml)的10倍稀釋的CTB003、CTB006或CTB007的情況下培養。在37。C培養16h之後，利用ATPLite試劑盒根據廠家的說明書(PackardInstruments,Meriden,Conn.)測定每個培養物的細胞活力添加50pl的細胞裂解緩沖液，然後添加50(il的底物緩衝液。將反應物在發光讀數器中計數。細胞活力計算為(處理細胞的cmp/對照細胞的cmp)xlOO%。結果Jurkat細胞被CTB006而不是CTB007陽性染色(圖32,圖面A)，表明139Jurkat僅表達TRAIL-R2而不表達TRAIL-R1。雖然Jurkat細胞不表達TRAIL-R1,它們卻被CTB003等同地染色。相比之下，Ramos細胞被CTB007或CTB003強烈地染色，但僅被CTB006微弱地染色(圖32，圖面B),表明Ramos細胞主要地表達TRAIL-R1。這些結果表明，CTB003具有對腫瘤細胞表面的等同的結合能力，而與這些細胞的TRAIL-R1或TRAIL-R2的水平差異無關。Jurkat細胞對CTB006和CTB003誘導的凋亡的敏感性相似，但是在測試的抗體濃度範圍內對CTB007完全無應答(圖32，圖面C)。相比之下，Ramos細胞對於CTB006或CTB007誘導的凋亡不敏感(圖32，圖面D),但是對CTB003誘導的凋亡是相對敏感的。這些結果表明，CTB003能用來誘導僅差異地表達一種類型的死亡受體的腫瘤細^9包的凋亡。因而，結合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的本發明的TRAIL受體結合劑(例如CTB003或hCTB003),與僅結合TRAIL-R1或TRAIL-R2的試劑相比，在癌症患者的治療中具有更大的臨床利用的優勢，因為患者的原發肺瘤細胞中TRAIL受體的表達和功能預計將會有很大的變異。等同物本發明不被本申請中描述的具體實施方式所限制，這些實施方式是為了單獨地例示本發明的個別方面而提供的。可以進行對本發明的許多修改和變化而不背離它的精神和範圍，這對於本領域的技術人員是顯而易見的。除了在此列舉的那些，在本發明的範圍內的功能等效方法和設備根據以上的描述對於本領域技術人員是顯而易見的。這些修飾和變化意圖落入附隨的權利要求的範圍內。本發明將僅由附隨的權利要求的用語、以及這些權利要求聲明的等同物的完整範圍來限制。要理解的是，本發明不限於特定的方法、試劑、化合物組成或生物系統，這些理所當然是可以變化的。還需要理解的是，在此使用的專有名詞僅是用於描述本發明的特定實施方式的目的，不意味著限制本發明。140權利要求1.一種結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和TRAIL受體2(TRAIL-R2)的抗體，其中所述抗體以其可溶形式在低濃度下在表達TRAIL-R1或TRAIL-R2多肽的癌細胞中具有體內和體外的細胞死亡誘導活性。2.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體結合在至少一個細胞的表面表達的TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽。3.根據權利要求1的抗體，其中所述抗體結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)多肽和TRAIL受體2(TRAIL-R2)多肽之間具有至少約90%的胺基酸同源性的多肽區域。4.根據權利要求3的抗體，其中所述區域包含胺基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44),其中X是K或G,並且能夠誘導具有TRAIL-R1和TRAIL-R2受體的細胞的細胞死亡。5.—種抗體，其具有與CGMCC登錄號1665的小鼠-小鼠雜交瘤CTB003所產生抗體相同的表位特異性。6.—種抗體或其抗原結合片段，至少包含HITMVVGPFA(SEQIDNO:11)的重鏈CDR3胺基酸序列或具有一個或多個保守性胺基酸替換的該序列，其中所述抗體或其片段結合TRAIL受體1(TRAIL-R1)和TRAIL受體2(TRAIL-R2),並在表達TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌細胞中具有體內和體外的細胞死亡誘導活性。7.根據權利要求1-6的任何抗體或抗原結合片段，其與癌症治療劑綴合，其中所述治療劑優選地選自由腫瘤活化的前體藥物、放射性核素、化療藥物和毒素構成的組。8.—種分離的核酸，其編碼權利要求1-6的任一項的抗體。9.一種宿主細胞或載體，其包含權利要求8的分離的核酸。10.—種組合物，其包含權利要求1-7的任一項的抗體和藥學上可接受的載體。11.一種用於治療癌症的商業試劑盒，其在容器中包含權利要求1-7的任一項的抗體，所述商業試劑盒進一步包含用於治療癌症的化療劑和癌症治療抗體，其中所述化療劑和癌症治療抗體任選地置於分別的容器中。12.—種TRAIL-Rl和TRAIL-R2的表位，包含胺基酸序列VXDCTPWSD正CVHKE(SEQIDNO:44),其中X是K或G，並且該表位被這樣的抗體所識別，所述抗體能夠結合TRAIL-R1和TRAIL-R2，並能夠誘導具有TRAIL-R1和TRAIL-R2受體的細胞的細胞死亡。13.—種通過製備含有權利要求12的所述表位的免疫原而產生的抗體。14.權利要求1-7和權利要求10的任一項的抗體在製備用於在表達TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌細胞中選擇性誘導細胞死亡的藥物中的用途。15.權利要求1-7和權利要求10的任一項的抗體在製備用於在表達TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌細胞中增強其他治療劑的抗癌活性的藥物中的用途，其中所述治療劑是化療劑，其中所述治療劑選自由博來黴素、卡鉑、瘤可寧、順鉑、秋水仙鹼、環磷醯胺、柔紅黴素、放線菌素、己烯雌酚、阿黴素、鬼臼乙叉甙、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、美法侖、氨曱蝶呤、絲裂黴素C、巰嘌呤、紫杉醇、鬼臼噻吩甙、6-硫代鳥嘌呤、長春新鹼和長春石威構成的糹且。16.藥學有效量的權利要求l-7和權利要求10的任一項的抗體用於製備治療癌症的藥物的用途，其中所述藥學有效量的抗體選擇性地誘導表達TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的癌細胞的細胞死亡。17.藥學有效量的權利要求1-7的任一項的抗體作為藥物的用途。18.—種在有需要的受試者中選擇性地誘導表達TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的細胞的細胞死亡的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的權利要求l-7任一項的抗體，從而選擇性地誘導表達TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的細胞的細胞死亡。19.根據權利要求18的方法，其中所述表達TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽的細胞是癌細胞。20.根據權利要求19的方法，其中所述癌細胞選自由乳腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞和結腸直腸癌細胞構成的組。全文摘要本發明一般涉及TRAIL受體結合劑的製備和其用途。特別地，本發明涉及抗TRAIL受體抗體的製備，所述述抗體識別TRAIL-R1和TRAIL-R2受體共有的共同抗原決定簇(即，表位)，以及它們用於TRAIL受體檢測和TRAIL受體介導的功能的調節的用途。TRAIL受體結合劑對於在人類癌細胞中誘導細胞凋亡是有用的。這些靶標可以表達TRAIL-R1或TRAIL-R2之一或二者。本發明提供了本發明的TRAIL受體結合劑在癌症治療中的用途。文檔編號C07K16/18GK101479296SQ200780024115公開日2009年7月8日申請日期2007年4月29日優先權日2006年4月30日發明者徵餘,敏周,揚宋,沈恩允,賈冼釗申請人:北京同為時代生物技術有限公司