一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法
2023-11-08 01:55:02
專利名稱：一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法
技術領域：
本發明屬藥用和保健用多糖製備技術領域，具體地，涉及一種從發酵液中 提取靈芝多糖的方法。
背景技術：
近年來，藥理學和免疫學的多方研究表明，靈芝主要藥用有效成分是靈芝
多糖，靈芝多糖具有廣泛的藥理活性，排毒、抗》文射，提高肝臟、骨髓合成DNA、 RNA的能力，抗腫瘤增強機體免疫等效果。因此多糖的提取為廣大科研人員和藥 研製者所重視，他們不斷研究和探索靈芝多糖提取的方法，為弄清靈芝多糖的 化學成分寺是供有力的理論依據，同時為許多疾病患者帶來福音。
靈芝多糖是由葡萄糖、甘露糖、果糖等單糖連接成的一種生物大分子，其 生理生化功能與其結構、特別是空間關係十分密切。研究表明①多糖的相對 分子質量在3xl5以上；②多聚物均具有1， 3-D-殘基的主鏈和P-1,6-D-葡 萄糖側鏈殘基，不同來源的多糖，1,6-D-葡萄糖的分支程度不等，主鏈殘基 與側鏈殘基的比例為5 : 2,即每個主鏈殘基圍繞2個l3-1,6-D-葡萄糖殘基，無 P-l，6-側鏈的1， 3-葡聚糖未見抗胂瘤活性；③多糖的三維螺旋結構參與抗 腫瘤活性，此結構遭^C壞則影響其活性。
靈芝多糖存在於從靈芝子實體、菌絲體和發酵液中。從子實體和菌絲體中 提取靈芝多糖已有許多報導，如公開號為CN1786033A(發明名稱靈芝多糖的制 備方法)公開了 一種從靈芝子實體中提取靈芝多糖的方法，該法將靈芝子實體經 過前處理、微濾、冷凍分離、膜分離、膜濃縮、減壓濃縮、減壓乾燥，得到靈 芝粗多糖產品為純天然成份，高營養，療效好，所採用工藝環保、高效、節能。
公開號為CN1307314 (發明名稱酶解製備靈芝多糖的方法)巧妙地利用菌
絲體自身酶系統和外加的混合酶系統在適宜的條件下對靈芝真菌發酵液進行酶
解，酶解後得到的靈芝粗多糖中靈芝多糖的含量可達35 - 60 %，靈芝多糖分子 量在6000 - 50000之間的活性靈芝多糖佔70 - 90 % 。
然而由於子實體和菌絲體中靈芝多糖含量少，直接導致了靈芝多糖產量低， 產物中靈芝多糖的含量低。
另外，從子實體和菌絲體中，提取靈芝多糖的方法還有將靈芝子實體或菌 絲體粉碎，用水或鹼浸提，乙醇沉澱，而後烘乾。這種方法產率較高，但條件 激烈，多糖活性結構遭到破壞，喪失或部分尚失生物活性，而且遭受細胞結構 多糖的汙染。產品色澤較深，溶解度低，不具備藥用價值。
目前也發展了多種利用液體深層發酵發來產生靈芝多糖，如公開號為 CN101235393A (發明名稱促進靈芝酸和靈芝多糖生物合成的發酵方法)，公開 號為CT1141392C (發明名稱中間補料發酵生產靈芝多糖和靈芝酸的方法)，都 極大的提高了發酵液中靈芝多糖的產量和含量，但如何從發酵液中提取靈芝多 糖，並無相關論述。
發明內容
本發明的目的是提供了一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，具有產物提 取效率高，多糖純度高，不損傷多糖生物活性，節能，操作簡單等顯著的優點。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的 一種靈芝細胞 固定化方法，所述方法是先對靈芝多糖發酵液進行預處理，除去菌體和蛋白質； 通過超濾除去部分小分子雜質；再通過預處理好的陽離子交換樹脂和陰離子交 換樹脂，除去雜質，靈芝多糖流過離子交換樹脂得到分離；流出液經冷凍乾燥 後，再真空乾燥即可。
所述方法的第一個關鍵點是發酵液的預處理，先通過高速離心除去發酵液 中的菌體和不溶性雜質，再通過酸鹼選擇性的變性，使蛋白質和部分雜質沉澱 析出，高速離心除去蛋白質和雜質。上述處理除去了全部菌體和蛋白質，以及 部分雜質，降低了發酵液的粘度，從根本上避免了超濾和離子交換時膜的堵塞
和樹脂的汙染，提高了整個工藝的收率。
所述方法的的第二個關鍵點是離子交換樹脂的處理，選擇適當的樹脂，並 保證料液的pH在一定的範圍，就可以除去全部雜質，使大多數靈芝多糖經過離
子交換得以分離。其工藝步驟為
(1) 除菌體和不溶雜質常溫下，以10000 - 14000r/min高速離心，收集 上清液I;
(2) 除去蛋白質取上清液I,用酸調pH至2 4,升溫至45 55C。，保 持30 45min,攪拌下用8~15C°水冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高 速離心，收集上清液II,再用鹼調pH至7. 5~8. 5,升溫至45C。 ~ 55C° ,維 持45 55min,攪拌下用8~15C°水冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高 速離心，收集上清液III，用酸調pH至5, 5 - 6. 5，常溫下，以10000 - 14000r/min 高速離心，收集上清液IV;
(3) 超濾除去小分子雜質取洗脫液IV經超濾膜超濾並濃縮，超濾膜的 截留分子量為30000以上，濃縮液I備用；
(4) 離子交換樹脂的處理離子交換樹脂按常規方法預處理後裝柱；
(5) 離子交換除去雜質取透過液I上陽離子交換柱，先用滅菌水洗滌至 洗滌液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，收集洗脫液I;取洗脫液I上陰離子交換 柱，先用滅菌水洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，收集洗脫液n;
(6) 超濾除去小分子雜質取洗脫液II經超濾膜超濾分離並濃縮，超濾 膜的截留分子量為30000以上，濃縮液II備用；
(7) 乾燥取濃縮液II冷凍乾燥後，再經真空乾燥，得白色粉末即為純化 的靈芝多糖。
本發明一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，步驟(2)中所述酸為鹽酸， 鹼為氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水中的任何一種。
本發明一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，步驟(3)中所述超濾膜為中 空纖維超濾膜。
本發明一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，步驟(3)中所述濃縮液I體
積約為步驟(2)中所述上清液IV體積的20%。
本發明一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，步驟(6)中所述濃縮液II體 積約為步驟(5)中所述洗脫液11體積的20%。
本發明的有益效果為(1)本發明提取靈芝多糖的原材料靈芝深層發酵液 可工業化大規模生產；(2)採用本發明的靈芝多糖產物提取效率高，約為原料 的0.08-1°/。，產品純度極高，其中活性靈芝多糖的含量可達90%以上；(3)。 本發明所涉及的提取工藝簡單，操作簡便，價格低廉。
具體實施例方式
以下將結合具體實施例對本發明有關細節做進一步的說明。 實施例1
取靈芝多糖發酵液，用硫酸-苯酚法測定發酵液中多糖含量為10%。另取20 升靈芝多糖發酵液，稱重，常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速離心，除去菌 體細胞和不溶物，收集上清液I約14L。用2mol/LHCl調pH至2,升溫至45C° 保持30min後，攪拌下用8C。水迅速冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速 離心，收集上清液II約13. 5L,再用2mol/LNaOH調pH至7. 5後，升溫至45C。， 維持45min,攪拌下用8C。水迅速冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速離 心，收集上清液III約，用2mol/LHCl，調pH5. 5，常溫下,以10000 ~ l楊0r/min 高速離心，收集上清液IV約13L。取樣用考馬斯亮藍G-250法檢測蛋白質含量， 在595nm波長下無光吸收。上清液工V經中空纖維超濾膜，排阻相對分子質量為 2000 - 25000萬的小分子，截留相對分子質量為30000以上的大分子，濃縮為原 體積的20%左右，約得2. 6L濃縮液I。
陽離子交換劑預處理取適量陽離子交換樹脂，以無菌水洗滌除雜質，洗 至pH中性後，用0.5mol/L HC1浸泡0.5h,水洗至中性，抽乾除去水分，用 0. 5mol/L NaOH浸泡O. 5h,水洗至中性，抽乾除去水分，再用0.5 mol/L HC1浸 泡O. 5h,水洗至中性，抽乾除去水分，加無菌水保存備用。
陰離子交換劑預處理取適量陰離子交換樹脂，以無菌水洗滌除雜質，並 洗至中性，用0. 5raol/LNa0H浸泡0. 5h,水洗至中性，抽乾除去水分，用0. 5mol/L HC1浸泡0. 5h,水洗至中性，抽乾除去水分，再用用0. 5 mol/L NaOH浸泡0. 5h, 水洗至中性，抽乾除去水分，加無菌水保存備用。
取備用陽離子交換劑，裝柱(10xl00cm)。取濃縮液I10L上柱，先用滅菌 誰洗滌至洗滌液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，流速控制在4ml/min，收集洗脫 液I,約6L。取備用陰離子交換劑，裝柱(6xi00cm)，取洗脫液I約6L上柱， 先用滅菌洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，流速控制在4ml/min,收 集洗脫液II,約3. 6L。洗脫液II經中空纖維超濾膜，排阻相對分子質量為2000 ~ 20000萬的小分子，截留相對分子質量為30000以上的大分子，濃縮為原體積的 20%左右，約得O. 72L濃縮液n。將濃縮液II冷凍千燥後，再經真空乾燥，得 白色粉未即為提取的靈芝多糖。
多糖含量測定將(7)中所述白色粉未稱重，產率為原料的0.08%。按硫 酸-苯酚法(衛生部試用方法)測定，其產物中活性多糖含量約為93%。
實施例2
取靈芝多糖發酵液，用硫酸-苯酚法測定發酵液中多糖含量為12%。另取20 升靈芝多糖發酵液，稱重，常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速離心，除去菌 體細胞和不溶物，收集上清液I約l札。用2mol/LHCl調pH至3，升溫至50C° 保持35min後，攪拌下用8C。水迅速冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速 離心，收集上清液II約13. 5L,再用2mol/LNaC03調pH至8. 0後，升溫至50C。， 維持50min，攪拌下用10C。水迅速冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速
離心，收集上清液III約，用2mol/L HC1，調pH6. O，常溫下，以10000 ~ M000r/min高速離心，收集上清液IV約13L。取樣用考馬斯亮藍G-250法檢測 蛋白質含量，在595nm波長下無光吸收。上清液IV經中空纖維超濾膜，排阻相 對分子質量為2000 - 25000萬的小分子，截留相對分子質量為30000以上的大 分子，濃縮為原體積的20%左右，約得2. 6L濃縮液I。 離子交換樹脂的處理方法同實施例1
取備用陽離子交換劑，裝柱(10 x 100cm)。取濃縮液I10L上柱，先用滅菌 洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，流速控制在4. 5ml/min,收集洗脫 液I,約6L。取備用陰離子交換劑，裝柱(6 x lOOcm )，取洗脫液I約6L上柱， 先用滅菌水洗滌至洗滌液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，流速控制在4. 5ml/min， 收集洗脫液II，約3. 6L。洗脫液II經中空纖維超濾膜，排阻相對分子質量為 2000 ~ 25000萬的小分子，截留相對分子質量為30000以上的大分子，濃縮為原 體積的20%左右，約得O. 72L濃縮液I1。將濃縮液n冷凍乾燥後，再經真空幹
燥，得白色粉未即為提取的靈芝多糖。
多糖含量測定將(7)中所述白色粉未稱重，產率為原料的0.09%。按硫 酸-苯酚法(衛生部試用方法)測定，其產物中活性多糖含量約為92%。
實施例3
取靈芝多糖發酵液，用硫酸-苯酚法測定發酵液中多糖含量為13%。另取20 升靈芝多糖發酵液，稱重，常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速離心，除去菌 體細胞和不溶物，收集上清液I約14L。用2mol/LHCl調pH至2,升溫至45C° 保持40min後，攪拌下用8C。水迅速冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速 離心，收集上清液II約13. 5L，再用2mol/L氨水調pH至8. 0後，升溫至50C° ,
維持50min，攪拌下用8C。水迅速冷卻；常溫下，以10000 ~ 14000r/min高速離 心，收集上清液III約，用2mol/L HC1,調pH6，常溫下，以10000 ~ 14000r/min 高速離心，收集上清液IV約13L。取樣用考馬斯亮藍G-250法檢測蛋白質含量， 在595nm波長下無光吸收。上清液IV經中空纖維超濾膜，排阻相對分子質量為 2000 ~ 25000萬的小分子，截留相對分子質量為30000以上的大分子，濃縮為原 體積的20%左右，約得2. 6L濃縮液I。
離子交換樹脂的處理方法同實施例1。
取備用陽離子交換劑，裝柱(10xl00cm)。取濃縮液I10L上柱，先用滅菌 水洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，流速控制在4ml/min,收集洗脫 液I，約6L。取備用陰離子交換劑，裝柱(6 x 100cm )，取洗脫液I約6L上柱， 先用滅菌洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，流速控制在4ml/tnin，收 集洗脫液II,約3. 6L。洗脫液I1經中空纖維超濾膜，排阻相對分子質量為2000 ~ 25000萬的小分子，截留相對分子質量為30000以上的大分子，濃縮為原體積的 20%左右，約得O. 72L濃縮液n。將濃縮液II冷凍乾燥後，再經真空乾燥，得 白色粉未即為提取的靈芝多糖。
多糖含量測定將(7)中所述白色粉未稱重，產率為原料的1.0。/。。按硫酸 -苯酚法(衛生部試用方法)測定，其產物中活性多糖含量約為90%。
權利要求
1.1.一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，其特徵在於所述方法是先對靈芝多糖發酵液進行預處理，除去菌體和蛋白質；通過超濾除去部分小分子雜質；再通過預處理好的陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂，除去雜質，靈芝多糖流過離子交換樹脂得到分離；流出液經冷凍乾燥後，再真空乾燥，所述方法包括以下步驟(1)除菌體和不溶雜質常溫下，以10000～14000r/min高速離心，收集上清液I；(2)除去蛋白質取上清液I，用酸調pH至2～4，升溫至45～55C°，保持30～45min，攪拌下用8～15C°水冷卻；常溫下，以10000～14000r/min高速離心，收集上清液II，再用鹼調pH至7.5～8.5，升溫至45C°～55C°，維持45～55min，攪拌下用8～15C°水冷卻；常溫下，以10000～14000r/min高速離心，收集上清液III，用酸調pH至5.5-6.5，常溫下，以10000～14000r/min高速離心，收集上清液IV；(3)超濾除去小分子雜質取上清液IV經超濾膜超濾分離並濃縮，超濾膜的截留分子量為30000以上，濃縮液I備用；(4)離子交換樹脂的處理離子交換樹脂按常規方法處理後裝柱；(5)離子交換除去雜質取透過液I上陽離子交換柱，先用滅菌水洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，收集洗脫液I；取洗脫液I上陰離子交換柱，先用滅菌水洗滌至洗脫液無色，再用滅菌生理鹽水洗滌，收集洗脫液II；(6)超濾除去小分子雜質取洗脫液II經超濾膜超濾分離並濃縮，超濾膜的截留分子量為30000以上，濃縮液II備用；(7)乾燥取透過液II冷凍乾燥後，再經真空乾燥，得白色粉末即為純化的靈芝多糖。
2. 如權利要求1所述的從發酵液中提取靈芝多糖的方法，其特徵在於步驟(2) 中所述酸為鹽酸，鹼為氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水中的任何一種。
3. 如權利要求1所述的從發酵液中提取靈芝多糖的方法，其特徵在於步驟(3) 中所述超濾膜為中空纖維超濾膜。
4. 如權利要求1所述的從發酵液中提取靈芝多糖的方法，其特徵在於步驟(3) 中所述濃縮液I體積約為步驟(2)中所述上清液IV體積的20%。
5. 如權利要求1所述的從發酵液中提取靈芝多糖的方法，其特徵在於步驟(6 ) 中所述濃縮液II體積約為步驟(5)中所述洗脫液II體積的20%。
全文摘要
一種從發酵液中提取靈芝多糖的方法，先對靈芝多糖發酵液進行預處理，除去菌體和蛋白質；通過超濾除去部分小分子雜質；再通過預處理好的陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂，除去雜質，靈芝多糖經過離子交換樹脂得到分離；洗脫液經冷凍乾燥後，再真空乾燥即可。本發明的有益效果為(1)提取靈芝多糖的原材料靈芝深層發酵液可工業化大規模生產；(2)採用本發明提取的靈芝多糖產物提取效率高，約為原料的0.08～1％，產品純度極高，其中活性靈芝多糖的含量可達90％以上。(3)本發明所涉及的提取工藝簡單，操作簡便，價格低廉。
文檔編號A61P1/16GK101367883SQ20081019910
公開日2009年2月18日 申請日期2008年10月14日 優先權日2008年10月14日
發明者宋秋蘭 申請人:宋秋蘭