用於檢測eb病毒的引物、試劑盒及方法

2023-11-08 12:26:42 2

專利名稱：用於檢測eb病毒的引物、試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。具體地，本發明涉及用於檢測愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus，EBV，在此簡稱EB病毒)的引物、試劑盒及方法。
背景技術：
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)屬於γ皰疹病毒亞科的成員之一，是人類的一種特異性嗜淋巴細胞性皰疹病毒，一直被認為是人類某些嚴重疾病以及腫瘤的致病因子，與許多疾病的發生都有著密切的關係，威脅著人類的健康。EBV主要通過人類唾液傳播， 因此呼吸道是EBV潛伏的最大場所。調查結果顯示，世界人口的90%以上都存在EBV的潛伏感染，或成為EBV攜帶者。更重要的是EBV感染與越來越多的人類惡性腫瘤有關，應用原位雜交證明了攜帶高拷貝EBV除了能轉化淋巴細胞外，也能賦予腫瘤細胞一定的生長優勢，使其成為優勢細胞群，呈現轉化特徵。EBV引發了全球癌症的1%，並佔所有感染性癌症的5. 6%。根據國際癌症研究署對致癌因子的分類標準，EBV被列在第一組致癌因子中。隨著近幾年癌症在全球的急劇蔓延，EBV感染的早期檢測和預防成為當務之急。 目前ELISA檢測EBV各項抗體是臨床診斷EBV感染的重要指標之一，但它實際上檢測的是人體對EBV感染的免疫反應狀態，無法檢測病毒自身，也就無法準確靈敏地反映EBV感染的情況。由於鼻咽癌外周血循環的游離EBV-DNA的拷貝數隨著全身化療周期的進行而呈現動態變化，所以檢測鼻咽癌患者EBV-DNA的表達水平對判斷病灶殘留、復發、轉移、判斷治療的敏感性、綜合治療方案的及時更改、確認以及判斷療效、預後均具有重要的指導意義，EBV 目前已經成為鼻咽癌診治中重要的血清分子標誌物，可以作為診斷和治療中的一項參考依據。目前國外已經上市的檢測EBV-DNA的試劑盒有幾種，檢測的方法主要是螢光免疫雜交(HIGH)，國內檢測EBV主要採用ELISA方法，未見有批准上市檢測EBV-DNA的試劑盒。 基於EBV感染情況如此嚴重，開發一種簡單、易行、成本較低的檢測方法就顯得尤為重要。

發明內容
因此，本發明的一個目的在於提供一種用於檢測EB病毒的引物或其組合物。本發明的另一個目的在於提供上述引物或其組合物在製備用於檢測EB病毒的工具中的用途。本發明的另一個目的在於提供一種用於檢測EB病毒的試劑盒。本發明的又一個目的在於提供一種檢測EB病毒的方法。本發明的目的是採用以下技術方案來實現的。一方面，本發明提供一種用於檢測EB病毒的引物，該引物的上遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO :1，下遊引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發明還提供了一種用於檢測EB病毒的引物組合物，該引物組合物包括上述用於檢測EB病毒的引物以及內參引物，該內參引物的上遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO :3，下遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4。另一方面，本發明提供了上述引物或引物組合物在製備用於檢測EB病毒的工具中的用途。另一方面，本發明提供了一種用於檢測EB病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述用於檢測EB病毒的引物或引物組合物。該試劑盒還可以包括細胞裂解液、核酸結合液、核酸漂洗液和核酸洗滌液和PCR反應液。又一方面，本發明提供了一種檢測EB病毒的方法，該方法包括以下步驟1)提取樣本DNA;2)使用上述引物、引物組合物或試劑盒對步驟1)得到的DNA進行PCR擴增；3) 檢測步驟2)得到的擴增產物。步驟1)中的樣本優選為人的血液或體液。步驟3)中的檢測方法優選為微流體晶片檢測法。在本發明的一個優選實施方案中，通過對患者血液中的DNA進行EBV檢測，從而判斷患者是否感染了 EBV，具體包括以下步驟1)提取人臨床樣本的DNA。2)將EBV特異性引物和人DNA保守序列特有基因的特異性引物混合，對被測樣本的DNA進行多重PCR擴增，被擴增的目標基因片段大小各不相同。3)擴增產物通過微流體晶片進行檢測。4)通過各檢測峰的位置確定檢測到的片段的大小，從而判斷被檢測到的基因，鑑別臨床樣本感染的病毒類別。5)結果判斷a)未出現任何特異性峰，說明臨床樣本的DNA沒有提取出來，檢測無效；b)只出現DNA內參特異性峰，說明沒有EBV感染；c)出現DNA內參和EBV特異性峰，說明有EBV感染。本發明所提供的新型引物、引物組合物、試劑盒及方法，能夠對EBV進行DNA水平上的檢查，靈敏度更高，效率也相應提高。此外，它們操作簡單，成本較低，適宜於推廣應用。 具體地，本發明具有以下有益效果首先，本發明提供了一種用於檢測EB病毒的引物，其可特異性的擴增出EBV的保守序列BamHl-W片段(genbank登錄號為M15973. 1)。該BamHl-W片段在一個EB病毒拷貝中約重複10 11次，在不同的EB病毒株之間高度保守，選擇其作為擴增的目的基因可提高檢測的敏感性。因此，本發明人在該BamHl-W中選取了一段基因序列並設計了一對特異性引物，即SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。其次，本發明提供了一種用於檢測EB病毒的引物組合物，其為EBV的保守序列 BamHl-W片段的特異性引物和人DNA保守序列β球蛋白(β-globin)特有基因Β297 (NCBI 查詢號NC_000007. 13)的特異性引物的組合。由於人體細胞中都含有B297基因，因此引入該基因可以確定模板的提取質量，避免擴增結果的假陰性。實驗表明通過PCR反應，本發明設計的內參引物較之其它根據人β球蛋白(β-globin)基因設計的引物能夠更快速有效地識別人體DNA，並且擴增出的目的基因片段長度為297bp，能夠很好的區別於EBV的片段長度，有利於後續的檢測。相應地，本發明提供了用於檢測EB病毒的工具、試劑盒和方法，其中均採用了 EBV 保守序列BamHl-W片段的特異性引物，或者EBV保守序列BamHl-W片段的特異性引物和人 DNA保守序列特有基因B297的特異性引物的組合，是一種具有較好靈敏度和特異性的檢測EB病毒的工具或方法。本發明可以在基因水平上進行迅速判斷，具有較好的靈敏度。試劑盒能夠檢測出 EB病毒的最低拷貝數為6X103。本發明能夠對患者的臨床樣本例如血液、體液等進行檢測， 不需要對樣本進行培養後再對病毒株進行檢測，節約了時間。同時，微流體晶片檢測法比傳統的DNA電泳檢測法更簡單、快捷、直觀，為臨床用藥提供了準確、及時的指導。本發明所提供的技術成熟，雖然其檢測結果的靈敏度和準確性與傳統的凝膠法相同，但是該檢測過程更快捷，檢測結果更容易判斷，將生物晶片技術應用於EB病毒檢測也是新的發展趨勢。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為本發明實施例2中單獨使用B297引物擴增DNA樣品的電泳結果圖；圖2為本發明實施例2中單獨使用B658弓丨物擴增DNA樣品的電泳結果圖；圖3為本發明實施例2中使用B297引物和EBV引物擴增臨床樣本(含EB)的電泳結果圖。圖4為本發明實施例2中使用B658引物和EBV引物擴增臨床樣本(含EB)的電泳結果圖。 圖5為本發明實施例3中未感染EBV的DNA樣品的電泳結果圖。圖6為本發明實施例3中感染EBV的DNA樣品的電泳結果圖。圖7為本發明實施例4中未感染EBV的DNA樣品的微流體晶片檢測結果圖。圖8為本發明實施例4中感染EBV的DNA樣品的微流體晶片檢測結果圖。圖9A為本發明實施例4中對DNA樣品的B297基因測序後的比對結果。圖9B為本發明實施例4中對DNA樣品的EBV基因測序後的比對結果。圖IOA 圖IOF為本發明提供的檢測試劑盒靈敏度的微流體晶片檢測結果圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。以下實施例中所使用的技術，除非特別說明，均為本領域的技術人員已知的常規技術；所使用的儀器、設備、試劑等，除非是本說明書特別說明，均為本領域的研究和技術人員可以通過公共途徑獲得的。實施例1 =DNA樣品的製備本實施例採用人體血液樣本製備本發明檢測方法所使用的DNA樣品，具體詳述如下。1、提取試劑A液細胞裂解液，15ml/瓶，每次用200 μ 1。_成份終濃度_Tris-HCl (ρΗ8· 0) 0. Olmol/1
NaCl0. lmol/1
EDTA (ρΗ8· 0)0. 01mol/l
SDS2% (g/ml)
B液核酸結合液，25ml/瓶，每次用400 μ 1。
成份終濃度
GuSCN5mol/l
Tris-HCl(ρΗ6. 4)0.05mol/l
EDTA (ρΗ8· 0)0.02mol/l
TrtionX-1002. 5% (g/ml)
C液核酸漂洗液，20ml/瓶，每次用300 μ 1。
成份含量
GuSCN5mol/l
Tris-HCl(ρΗ6. 4)0.05mol/l
D 核酸洗脫液，5ml/'瓶，每次用50 μ 1。
成份終濃度
Tris-HCl(pH8. 0)0. 01mol/l
NaCl0. lmol/1
EDTA (ρΗ8· 0)0. 01mol/l
E :20mg/ml蛋白酶K，l. 2ml/管，每次使用20 μ 1。 2、提取方法
1)取樣將加入EDTA抗凝劑的血液樣本解凍，混合均勻後取100μ 1於1. 5ml的:內。
2)裂解加入A液200μ 1和蛋白酶K 20 μ 1，混勻後於56°C放置10分鐘(每隔2 分鐘混勻一次，確保裂解充分)。
3)吸附先在吸附柱中加入B液400μ1，然後將裂解液緩慢的傾倒入吸附柱中。 混勻後放置2分鐘，然後12000轉/分鐘離心2分鐘。
4)漂洗去廢液，在吸附柱中加入C液300μ 1，12000轉/分鐘離心2分鐘，去廢液；再加入70% (V/V)的乙醇700 μ 1，12000轉/分鐘離心2分鐘去廢液；最後再12000轉 /分鐘離心2分鐘，徹底去廢液。
5)洗脫換一個乾淨的1. 5ml EP管，套住吸附柱，在吸附柱中央加入D液50 μ L， 於56°C放置10分鐘，12000轉/分鐘離心2分鐘。流出液即為提取的DNA樣品，可直接用於PCR反應。實施例2 內參引物序列的確定本實施例採用根據人DNA保守序列β球蛋白特有基因設計的兩對DNA擴增引物擴增實施例1所製備的DNA樣品，並用凝膠電泳檢測這兩對引物的擴增效果，以篩選出內參引物。1、單引物PCR擴增1)在200 μ L Eppendorf管內配製25 μ 1反應體系如下，其中提取的DNA樣品分別為10份不同的血樣DNA _成份體積/μ
ddH2018. 3
5U/μ 1 Taq 酶0. 2
Taq 酶 IOXbuffer2. 5
10 μ M內參上、下遊引物各0.5
2. 5mM dNTP2
提取的DNA樣品1
內參引物的具體序列如表1所示。表1 PCR擴增內參引物序列
權利要求
1.一種用於檢測EB病毒的引物，該引物的上遊引物核苷酸序列為SEQ ID N0:1，下遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
2.一種用於檢測EB病毒的引物組合物，該引物組合物包括根據權利要求1所述的引物和內參引物，該內參引物的上遊引物核苷酸序列為SEQID NO :3，下遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
3.根據權利要求1所述的引物或權利要求2所述的引物組合物在製備用於檢測EB病毒的工具中的用途。
4.一種用於檢測EB病毒的試劑盒，該試劑盒包括根據權利要求1所述的引物或權利要求2所述的引物組合物。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括細胞裂解液、核酸結合液、核酸漂洗液、核酸洗脫液和PCR反應液。
6.一種檢測EB病毒的方法，該方法包括以下步驟1)提取樣本DNA；2)使用根據權利要求1所述的引物、權利要求2所述的引物組合物、或者權利要求3或 4所述的試劑盒對步驟1)得到的DNA進行PCR擴增；3)檢測步驟2)得到的擴增產物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，其中所述步驟1)中的樣本為人的血液或體液。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，其中所述步驟3)中的檢測方法為微流體晶片檢測法。
全文摘要
本發明提供一種用於檢測EB病毒的引物、試劑盒及方法。其中該引物的上遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO1，下遊引物核苷酸序列為SEQ ID NO2。本發明還提供了包括該引物的用於檢測EB病毒的組合物、工具、試劑盒和方法。它們可以在基因水平上進行迅速的檢測，靈敏度高和特異性號，具有節約時間、技術成熟及檢測結果穩定的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102168149SQ20101012219
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月26日 優先權日2010年2月26日
發明者倪劍鋒, 楊文輝, 謝育媛, 趙珊珊, 鄧其濤 申請人:寧波基內生物技術有限公司