胸苷激酶突變體的製作方法

2023-11-08 11:32:37

專利名稱：胸苷激酶突變體的製作方法
技術領域：
本發明總的來說涉及Herpesviridae突變體酶，更具體地說涉及利用胸苷激酶突變體的組合物和方法。
背景技術：
儘管總的來看細菌性疾病可容易地用抗生素治療，但對許多病毒性、寄生蟲性、癌性和遺傳性疾病卻很少存在有效的治療方法。例如，可以經外科切除實體腫瘤(solid tumor)來治療癌症。然而，大多數有實體腫瘤的病人在主要腫瘤位點之外也具有微小轉移灶。若僅外科治療，則約70％的這類病人會出現癌症復發。因而，在美國，癌症引起的死亡佔總死亡的五分之一，居疾病引起的死亡的第二位。
此外，現在也用涉及細胞毒化療藥物(如，長春新鹼、長春花鹼、順式鉑氨、氨甲蝶呤、5-FU等)的療法和/或放射療法結合治療腫瘤。而使用這些方法的困難之一是放療和化療劑對正常組織有毒，常常產生危及健康的副作用。另外，這些方法常常具有極高的無效/緩解率(依癌症的類型而變，可高達90％)。
已嘗試了許多其它方法以支持和加強個體自身的免疫系統，從而消滅腫瘤細胞。例如，某些科學家採用細菌或病毒成分為佐劑，以便刺激免疫系統消滅腫瘤細胞。這些藥劑已作為佐劑和非特異性刺激劑在動物腫瘤模型中使用，但還未證實對人體有效。
淋巴因子也被用於治療腫瘤(以及病毒性和寄生蟲性疾病)，以便在免疫反應的產生中刺激或影響特異性免疫細胞。例如，一個小組採用淋巴因子白細胞介素-2刺激外周血細胞，以擴增和產生大量對腫瘤細胞為細胞毒性的細胞(Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.3131485-1492，1985)。
有人已建議採用特異性單克隆抗體或＂魔彈＂特異性靶向和殺傷腫瘤細胞的抗體介導性治療(Dillman，＂Antibody Therapy＂，Principles of CancerBiotherapy，Oldham(ed)，Raven Press，Ltd.，New York，1987)。然而，有一個困難是大多數單克隆抗體來源於鼠，因而對鼠抗體的超敏反應可能限制其效率，特別是在重複治療後。通常的副作用包括發燒、盜汗、畏冷、皮膚疹、關節炎和神經癱瘓。
最近已引起極大興趣的一種方法是使用基因治療，它不僅已用於治療遺傳性疾病，也已用於治療病毒性和癌性疾病(參見PCT出版物WO91/02805、EPO415731和WO90/07936)。簡單地說，是把得自病毒的特別設計的載體用於將特定的遺傳信息傳遞到細胞中。這種遺傳信息本身可以用於阻斷損壞的蛋白質或抗原的表達(例如，反義治療)，可以編碼對選擇的細胞有毒並殺死選擇的細胞的蛋白質，可以編碼阻斷細胞免疫反應的治療蛋白質或編碼取代失活或非成活的蛋白質的蛋白質。
最近推薦用於這種治療的一種蛋白質是1型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK-1)。簡單地說，胸苷激酶是一種磷酸化天然核苷酸底物以及核苷類似物的補救途徑酶(參見Balasubramaniam et al.，J.of Gen.Vir.712979-2987，1990)。可以通過將表達這一蛋白質的逆轉錄病毒引入到細胞中，接著施用核苷類似物(例如，無環鳥苷、ganciclovir)治療性地使用所述蛋白質。然後，HSVTK-1磷酸化所說的核苷類似物，產生能夠殺死宿主細胞的毒性產物。因此，使用表達HSVTK的逆轉錄病毒載體不僅被建議用於治療癌症，而且被建議用於其它疾病。
本發明提供了具有增強的生物學活性的新胸苷激酶突變體，該突變體適於多種用途(例如基因治療)，並具有其它相關的優點。
發明概述簡單地說，本發明提供了利用Herpesviridae胸苷激酶的組合物和方法。本發明一方面提供了包含一個或多個突變的編碼Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，其中至少一個突變編碼一個DRH核苷結合位點上遊的胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。在本發明的另一方面，所說的突變編碼一個DRH核苷結合位點內的胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。本發明另一方面提供了編碼包含一個或多個突變的Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，其中至少一個突變是一個DRH核苷結合位點下遊(例如，下遊4、5或6位核苷酸)的胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。本發明也提供了適於表達這種DNA分子的載體以及使用該載體的方法。合適的Herpesviridae胸苷激酶的代表性例子包括單純皰疹病毒1型胸苷激酶和單純皰疹病毒2型胸苷激酶、水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶以及絨猴皰疹病毒、豬皰疹病毒1型、Pseudorabies病毒、馬皰疹病毒1型、牛皰疹病毒1型、火雞皰疹病毒、Marek′s病病毒、皰疹病毒saimiri和EB病毒胸苷激酶。在其它實施方案中，所說的胸苷激酶可以是靈長類皰疹病毒胸苷激酶或非靈長類皰疹病毒胸苷激酶，例如禽皰疹病毒胸苷激酶。
本發明的內容包含許多種突變。例如在一個實施方案中描述了編碼所述DRH核苷結合位點上遊1-7位胺基酸的一個或多個胺基酸取代。在一個優選的實施方案中，所述DRH核苷結合位點上遊1位的胺基酸被選自纈氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和異亮氨酸的胺基酸取代。在另一個優選的實施方案中，胺基酸丙氨酸取代存在於所說DRH核苷結合位點上遊7位的胺基酸。在另一個實施方案中，穀氨酸可以取代所說DRH核苷結合位點中的天冬氨酸。在另一個實施方案中，組氨酸可以取代所說DRH核苷結合位點中的精氨酸。在另一個實施方案中，所說胸苷激酶是截短的，但仍保留生物學活性。
本發明的另外的實施方案提供了分離的核酸分子，所說的核酸分子編碼一種胸苷激酶，該胸苷激酶能夠磷酸化核苷類似物，其磷酸化核苷類似物的能力至少超過野生型胸苷激酶的一倍。在另一個實施方案中，所說的胸苷激酶磷酸化核苷類似物的能力至少超過野生型胸苷激酶的X倍，其中X選自1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。在另一個實施方案中，所說胸苷激酶能夠磷酸化核苷類似物，其中Z>[(TKmNAp)/(TKmTp)(TKwtNAp)/(TKwtTp)]]]>式中TKmNAp是胸苷激酶突變體引起的核苷類似物磷酸化率，TKmTp是胸苷激酶突變體引起的胸苷激酶磷酸化率，TKwtNAp是未突變的胸苷激酶引起的核苷類似物磷酸化率，TKwtTp是未突變的胸苷激酶引起的胸苷激酶磷酸化率，Z選自1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。合適的核苷類似物的代表性例子包括ganciclovir、無環鳥苷、buciclovir、famciclovir、penciclovir、valciclovir、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
增加核苷類似物磷酸化的特別優選的突變體胸苷激酶包括其中所說的酶是1型單純皰疹病毒胸苷激酶，並且其中丙氨酸取代155位脯氨酸，纈氨酸取代161位苯丙氨酸的那些。在另一個實施方案中，異亮氨酸可以取代161位苯丙氨酸，半胱氨酸可以取代161位的苯丙氨酸。
本發明另一方面提供了由上述核酸分子編碼的突變體胸苷激酶以及能夠表達這些分子的載體。一方面本發明提供了包含可操作連接到本發明的核酸分子上的啟動子的表達載體。優選的一方面所說載體是能夠指導上述核酸分子表達的病毒載體。這些病毒載體的代表性的例子包括單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、痘病毒載體、細小病毒載體、杆狀病毒載體和逆轉錄病毒載體。另一方面本發明提供了能夠指導一種核酸分子表達的病毒載體，所說核酸分子編碼一個胸苷激酶，包含一個或多個突變，其中至少一個所說突變編碼一個胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。
多種啟動子可以用於本發明，這些啟動子包括，例如MoMLV LTR、RSV LTR、Friend MuLv LTR、腺病毒啟動子、新黴素磷酸轉移酶啟動子/增強子、晚期細小病毒啟動子、皰疹TK啟動子、SV40啟動子、金屬硫蛋白IIa基因增強子/啟動子、巨細胞病毒立即早期啟動子、巨細胞病毒立即晚期啟動子之類的啟動子，以及組織特異性啟動子，例如酪氨酸酶相關啟動子(TRP-1和TRP-2)、DF3增強子、SLPI啟動子(分泌白細胞蛋白酶抑制劑-在許多類型的癌中表達)、TRS(組織特異性調節序列)、酪氨酸羥化酶啟動子、脂肪細胞P2啟動子、PEPCK啟動子、CEA啟動子、甲胎蛋白啟動子、乳清酸性啟動子和酪蛋白啟動子。在相關的一方面，上述載體可以與藥學上可接受的載體和稀釋劑一起以藥物組合物被提供。
本發明另一方面提供了攜帶有一種上述載體的宿主細胞，這種細胞的代表性例子包括人細胞、狗細胞、猴子細胞、大鼠細胞和小鼠細胞。
本發明另一方面提供了一種抑制溫血動物病原體的方法，該方法包括給溫血動物施用一種上述載體以使所說的病原體受到抑制。在多種實施方案中，所說載體可以體內施用，或者施用到得自體內的細胞上，然後將該細胞移植進或再移植進動物中。所說病原體可以是病毒、細菌、寄生蟲、腫瘤細胞或自體反應性免疫細胞。
參照下列詳細描述和附圖，本發明的這些方面和其它方面會很清楚。此外，以下提出了更詳細描述某些方法或組合體(例如，質粒等)的多種參考資料，這些參考資料作為整體一併被參考。
附圖簡要說明

圖1是描述構建含隨機核苷酸的文庫和選擇TK突變體策略的圖解性概要。
圖2是顯示選擇TK和AZT突變體的照片。
圖3描述了野生型、TKF105、TKI208和TKF2 TK的密碼子165-175。
圖4是描述野生型TK和TK突變體熱穩定性的系列圖。
圖5是描述體外翻譯的野生型和TKF2胸苷激酶熱失活輪廓的圖。
圖6是SDS/PAGE-分級分離的體外翻譯產物(野生型和TKF2)的放射自顯影。
圖7是經SDS-PAGE和TCA-可沉澱計數處理的35S-標記的無細胞翻譯產物的放射自顯影。
圖8A和8B是說明在兔網質紅細胞裂解物無細胞翻譯系統中引起的高活性(A)和低活性(B)突變體的時間過程分析的兩個圖。
圖9A和9B是說明高活性(A)和低活性(B)突變體的熱穩定性的兩個圖。
圖10是描述由突變體和野生型胸苷激酶引起的核苷和核苷類似物磷酸化的條線圖。
圖11是說明野生型、TKF36和沉默質粒(pMDC)TK活性的條線圖。
圖12是說明包含TKF36、TKF52、野生型質粒、TKF99或沉默質粒(pMDC)的細胞隨時間變化的胸苷攝入活性的圖。
圖13是用一種HSVTK突變體基因治療的一個代表性例子的圖解性說明。
圖14是描述在LIF-ALL文庫中隨機化並作為選擇結果的核苷酸的圖解性說明。
圖15是表示選擇的和未選擇的克隆的胺基酸取代的表。
圖16是說明選自LIF-ALL文庫的對GCV或ACV敏感的突變體的數量的表。
圖17是說明在選擇的TK突變體中核苷酸變化的表。
圖18是說明159-161和168-170位上胺基酸序列和幾個突變體TK的磷酸化水平的表。
圖19是說明生長在GCV上並用多種TK突變體轉染的細胞的成活率的圖。
圖20是說明生長在ACV上並用多種TK突變體轉染的細胞的成活率的圖。
圖21說明代表性人鳥苷酸激酶的核苷酸序列和推定的胺基酸序列。
圖22說明代性表鼠鳥苷酸激酶核苷酸序列和推定的胺基酸序列。
發明詳述定義在詳細說明本發明之前，給出此後要用到的某些術語的定義對於理解本發明會有幫助。
＂載體＂指一種能夠指導突變的tk基因以及任何附加序列或興趣基因表達的裝配體。該載體必須包括轉錄啟動子/增強子元件，以及轉錄時可操作連接到tk基因和/或其它興趣基因上的其它序列。該載體可由脫氧核糖核酸(＂DNA＂)、核糖核酸(＂RNA＂)或兩者結合(例如，DNA-RNA嵌合)組成。該載體可包含可不包含一個聚腺苷酸化序列、一個或多個限制位點以及一個或多個選擇性標記(例如，新黴素磷酸轉移酶或潮黴素磷酸轉移酶)。此外，根據所選擇的宿主細胞和所使用的載體，其它遺傳元件(例如，複製源、附加核酸限制位點、增強子、賦予轉錄誘導性的序列和選擇性標記)也可以摻合進這裡所述的載體中。
＂組織特異性啟動子＂指控制基因在有限數量的組織或在單個組織中表達的轉錄啟動子/增強子元件。該組織特異性啟動子的代表性例子包括酪氨酸羥化酶啟動子、脂肪細胞P2啟動子、PEPCK啟動子、甲胎蛋白啟動子、乳清酸性啟動子和酪蛋白啟動子。
胸苷激酶的＂生物學活性＂指胸苷激酶磷酸化核苷(例如，dT)和核苷類似物的能力，所說的核苷類似物例如，ganciclovir(9-{[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基]甲基}鳥苷)、famciclovir、buciclovir、penciclovir、valciclovir、無環鳥苷(9-[2-羥基乙氧基]甲基)鳥苷)、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A腺苷、阿拉伯糖苷、vivarabine)、1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷(5-碘-2′-脫氧尿苷)、AZT(3′-疊氮基-3′-胸苷)、ddC(二脫氧胞苷)、AIU(5-碘-5′-氨基-2′，5′-二脫氧尿苷)、和AraC(胞苷阿拉伯糖苷)。如本文所使用的，如果某種胸苷激酶突變體的活性水平或比率超過未突變的胸苷激酶的至少＂y＂ 倍，則該突變體被認為具有＂增加的生物學活性＂，其中y選自1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。在優選的實施方案中，當Z>[(TKmNAp)/(TKmTp)(TKwtNAp)/(TKwtTp)]]]>時，胸苷激酶突變體被認為具有增加的生物學活性，其中TKmNAp是胸苷激酶突變體引起的核苷類似物磷酸化率，TKmTp是胸苷激酶突變體引起的胸苷磷酸化率，TKwtNAp是未突變的胸苷激酶引起的核苷類似物磷酸化率，TKwtTp是未突變的胸苷激酶引起的胸苷激酶磷酸化率，Z選自1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。
除了胸苷激酶磷酸化核苷和核苷類似物的能力外，術語＂生物學活性＂也應理解為指胸苷激酶的其它生物學活性，例如蛋白質穩定性(如，經抵抗胰蛋白酶之類的蛋白酶降解測得的)和熱穩定性(如，溫度增加時保持對核苷類似物磷酸化作用)。
＂病原體＂指引起病態的外源生物體或引起病態的＂改變的＂細胞。病原體的代表性例子包括象病毒、細菌和寄生蟲之類的外源生物體以及象腫瘤細胞和自體反應性免疫細胞之類的改變的細胞。如本文所使用的，如果病原體的生長或擴散減慢或者病原體本身被消滅，則病原體被認為是＂被抑制的＂。
如上所述，本發明提供了利用Herpesvirdae胸苷激酶突變體的組合物和方法。簡單地說，可以從許多種Herpesviridae(包括，例如靈長類皰疹病毒和象禽皰疹病毒之類的非靈長類皰疹病毒)製備本發明的胸苷激酶突變體。合適的皰疹病毒的代表性例子包括單純皰疹病毒1型(McKnight等人，核酸研究85949-5964，1980)、單純皰疹病毒2型(Swain和Galloway，病毒學雜誌461045-1050，1983)、水痘-帶狀皰疹病毒(Davison和Scott，遺傳病毒學雜誌671759-1816，1986)、絨猴皰疹病毒(Otsuka和Kit，病毒學135316-330，1984)、豬皰疹病毒1型(Nunberg等人，病毒學雜誌。633240-3249，1989)、Pseudorabies病毒(Kit和Kit，美國。專利4,514,497，1985)、馬皰疹病毒1型(Robertson和Whalley，N核酸研究11307，1988)、牛皰疹病毒1型(Mittal等人，病毒學雜誌702901-2918，1989)、火雞皰疹病毒(Martin等人，病毒學雜誌.632847-2852，1989)、Marek′s病病毒(Scott等人，遺傳病毒學雜誌703055-3065，1989)、皰疹病毒saimiri(honess等人，遺傳病毒學雜誌703003-3013，1989)和EB病毒(Baer等人，自然(倫敦)310207-311，1984)。
這些皰疹病毒可以容易地從商業途徑(例如從美國典型培養物保藏中心(＂ATCC＂，Rockville，Maryland))獲得。以上指出的皰疹病毒的某些保藏物可以容易地從ATCC獲得，例如，ATCC No.VR-539(單純皰疹病毒1型)、ATCC No.VR-734和VR-540(單純皰疹病毒2型)、ATCC No.VR-586(水痘-帶狀皰疹病毒)、ATCC No.VR-783(感染性喉氣管炎)、ATCCNos.VR-624、VR-987、VR＝2103、VR-2001、VR-2002、VR-2175、VR-585(Marek′s病病毒)、ATCC Nos.VR-584B和VR-584B(火雞皰疹病毒)、ATCC Nos.VR-631和VR-842(牛皰疹病毒1型)、ATCC Nos.VR-2003、VR-2229和VR-700(馬皰疹病毒1型)。皰疹病毒也可以容易地從天然來源(例如，從感染的動物)分離和鑑別。
任何以上提到的皰疹病毒(以及Herpesviridae的其它成員)都可容易地用於製備本發明的胸苷激酶突變體。簡單地說，人們發現被認為決定核苷結合的主要區在位點3和4周圍的區域(參見Baladubramaniam et al.，JGen.Vir.712979-2987，1990)這些位點有高保守區的特徵，由基序-DRH-(位點3)和-C(Y/F)P-(位點4)組成。如本文所採用的，儘管核酸的編號在不同的皰疹病毒之間有很大的變化，但可以參照與DRH核苷結合位點相關的位置。例如，對單純皰疹病毒1型(McKnight et al.，Nuc.Acids Res 85949-5964，1980)來說，這一位點被發現在胺基酸162、163和164位。其它代表性的皰疹病毒的DRH核苷結合位點包括163、164和165(單純皰疹病毒2型)；129、130和131(水痘-帶狀皰疹病毒)；130、131和132(絨猴皰疹病毒)；以及148、149和150(EB病毒)。
對從前沒有測序的皰疹病毒來說，可以通過測序編碼所述酶的核酸序列，或者通過酶本身的胺基酸測序，接著將所得序列與其它已知皰疹病毒序列對比(參見Baladubramaniam，同上)容易地識別所說的DRH核苷結合位點。識別出一個以上的-DRH-基序後，就可以容易地經例如晶體結構分析(Sanderson et al.，J.Mol.Biol.202917-919，1988；Montfort et al.，Biochem 29(30)6964-6977，1990；Hardy et al.，Science 235448-455，1987)或交聯研究(Knoll et al.，Bioch.Biophys.Acta 1121252-260，1992)識別正確的基序。
然後來源於選擇的皰疹病毒的胸苷激酶基因可以按如下的描述容易地分離和誘變，以構建編碼包含一個或多個突變的胸苷激酶的核酸分子，所說突變增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。如本文所採用的，應當理解＂未突變的胸苷激酶＂指天然的或野生型胸苷激酶，例如McKnight et al.，(Nucl.Acids Res.85949-5964，1980)所描述的那些。用本文所述的任何試驗方法可以容易地測定這些激酶的生物學活性，所述方法包括，例如，核苷類似物攝入率測定、核苷或核苷類似物磷酸化率測定(參見實施例2-40。此外，可以容易地選擇具有其它生物學性質(如，熱穩定性(參見實施例2-4)和蛋白質穩定性)的胸苷激酶.
本發明的內容中包括許多種胸苷激酶突變體。本發明的一個實施方案提供了包含一個或多個突變的編碼Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，其中至少一個突變編碼一個DRH核苷結合位點上遊(5』)的胺基酸取代。簡單地說，任何所述DRH核苷結合位點上遊(5′)位置上的胺基酸都可以按本文的說明用另一個胺基酸取代。可被取代的代表性胺基酸包括(括號內為其單字母代碼)丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
本發明的一個實施方案提供了編碼在-DRH-核苷結合位點上遊1-7位具有一個或多個胺基酸取代的胸苷激酶的核酸分子。在一個實施方案中，DRH核苷結合位點上遊1位的胺基酸被另一個胺基酸取代，包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。特別優選的取代包括纈氨酸(V)、亮氨酸(L)和半胱氨酸(C)。
在另一個實施方案中，DRH核苷結合位點上遊2-6位的胺基酸被其它胺基酸取代，包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
在其它實施方案中，DRH核苷結合位點上遊7位的胺基酸被其它胺基酸取代，包括，例如，精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。特別優選的取代包括丙氨酸(A)。
本發明另一方面提供了編碼包含一個或多個突變(這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性)的胸苷激酶的核酸分子，所說的突變編碼DRH核苷結合位點上遊w為的胺基酸取代，其中w是大於8(一般小於162)的整數。可以被取代的代表性胺基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
本發明的另一個實施方案提供了編碼在-DRH-核苷結合位點中具有一個或多個胺基酸取代的胸苷激酶的核酸分子。在一個實施方案中，-DRH-核苷結合位點中的天冬氨酸被另一個胺基酸取代，所述胺基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
在另一個實施方案中，-DRH-核苷結合位點中的精氨酸被另一個胺基酸取代，所述胺基酸包括，例如，丙氨酸(A)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
本發明某些優選的方面提供了編碼包含一個或多個突變(這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性)的胸苷激酶的核酸分子，所說的突變編碼DRH核苷結合位點上遊(5』)的一個或多個胺基酸取代，和/或DRH核苷結合位點下遊4、5或6位或者CYP核苷結合位點(參見圖4)上遊1、2或3位的一個或多個胺基酸取代。以下實施例8和圖8更詳細地給出了這種突變體的特定的說明。
在另一個實施方案中，-DRH-核苷結合位點中的組氨酸被任何其它的胺基酸取代，所述胺基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
本發明另一方面提供了編碼包含一個或多個突變(這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性)的胸苷激酶的核酸分子，所說的突變編碼DRH核苷結合位點下遊(3』)1-11位的一個或多個胺基酸取代，這些胺基酸可被其它胺基酸取代，包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
本發明另一方面提供了編碼包含一個或多個突變(這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性)的胸苷激酶的核酸分子，所說的突變編碼DRH核苷結合位點下遊12-v位的胺基酸取代，其中v是大於13(一般小於202)的整數。這些胺基酸可以容易地被其它胺基酸取代，包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。
在各方面，本發明的核酸分子編碼幾個胺基酸突變。例如，一個優選的實施方案提供了編碼具有1、2、3、4個或多個胺基酸取代的突變以及符合讀框的缺失的胸苷激酶突變體。就此而言，特別優選的突變包括P155A/F161V、P155A/F161C、P155A/D162E、I160L/F161L/A168V/L169M和F161L/A168V/L169Y/L170C。
按照本文描述的試驗方法和以下實施例，可以容易地篩選具有增加的生物學活性的任何以上所述的胸苷激酶突變體。
胸苷激酶突變體的構建可以用多種方法構建本發明的胸苷激酶突變體。例如，可以通過合成寡核苷酸在特定位置引入突變，所說寡核苷酸包含側翼於使其能連接到天然序列上的限制位點的突變序列。連接後，所形成的再構序列編碼具有所需胺基酸插入、取代或缺失的衍生物。
另外，寡核苷酸指導的位點特異性(或節段特異性)誘變可用於提供具有特定的按所需取代、缺失或插入改變的密碼子的改變的基因。經採用鄰近於所需缺失的便利的限制內切核酸酶位點也可以構建胸苷激酶突變體的缺失或截短衍生物。限制酶切後，可引入突出端，並再連接DNA。Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，1989)公開了獲得以上提出的改變的示範性方法。
也可以用PCR誘變、化學誘變技術Drinkwater和Klinedinst，PNAS833402-3406，1986)，經迫使核苷酸錯摻(例如，Lian和Wise基因88107-111，1990)或經使用隨機誘變寡核苷酸(Horwetz等人，基因組3112-117，1989)構建胸苷激酶突變體。以下實施例1-4中提出了構建胸苷激酶突變體的特別優選的方法。
HSVTK載體本發明中，術語＂胸苷激酶突變體＂應理解為不僅包括本文描述的特定蛋白質(以及編碼這些蛋白質的核酸序列)，而且包括其衍生物(可以包括保持生物學活性的一級蛋白質(primary protein)的多種結構形式)。例如，胸苷激酶可以是酸性或鹼性形式，或者是中性形式。此外，單個胺基酸殘基可以被氧化或還原修飾。而且，可以對胺基酸或核苷酸序列進行取代、缺失或添加，其淨效果是使突變體增強的生物學活性保留或進一步增強。由於密碼簡併，編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列會有相當大的變化。
本發明公開的胸苷激酶突變體的其它衍生物包括胸苷激酶與其它蛋白質或多肽的綴合物。這可以通過合成N-端或C-端融合蛋白(其可添加來促進胸苷激酶突變體的純化或鑑別)來獲得(參見，美國專利4,851,341，也參見，Hopp等人，生物技術61204，1988)。
本發明的一個實施方案提供了胸苷激酶突變體的截短的衍生物。例如，可以容易地進行定點誘變以缺失胸苷激酶突變體N-端45位胺基酸，從而構建保持其生物學活性的突變體的截短的形式。
為表達胸苷激酶衍生物構建的核苷酸序列應保留編碼序列的讀框相(phase)。此外，突變最好不產生可雜交產生二級mRNA結構(例如，環狀結構或髮夾結構)的互補區。採用多種技術(包括以上討論的那些)可以容易地構建這些衍生物。
如以上所指出的，本發明提供了重組載體，這些載體包括編碼胸苷激酶突變體或其衍生物的合成的或cDNA-衍生的核酸分子，它們可操作連接到合適的轉錄或翻譯調節元件上。合適的調節元件可以得自多種來源，包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物、昆蟲或植物基因。合適的調節元件的選擇取決於所選擇的宿主細胞，可以由本領域普通技術人員容易地完成。調節元件的例子包括轉錄啟動子和增強子或者RNA聚合酶結合序列、核糖體結合序列，包括轉錄起始信號。
編碼以上所述的任一胸苷激酶突變體的核酸分子可以被許多種原核和真核宿主細胞(包括細菌、哺乳動物、酵母或其它真菌、病毒、昆蟲或植物細胞)容易地表達。轉化或轉染這些細胞以表達外源DNA的方法是本領域公知的(參見，例如，Itakura等人，美國專利4,704,362，Hinnen等人.，PNAS USA 751929-1933，1978，Murray等人，美國專利4,801,542；Upshall等人，美國專利4,935,349；Hagen等人，美國專利4,784,950；Axel等人，美國專利4,399,216；Goeddel等人，美國專利4,766,075；和Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，1989；對植物細胞參見Czako和Marton，植物生理1041067-1071，1994；和Paszkowski等人，生物技術.24387-392，1992)。
適於進行本發明的細菌宿主細胞包括大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和假單胞菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬的各個種，以及許多本領域技術人員熟知的其它的細菌種。細菌宿主細胞的代表性例子包括DH5((Stratagene，Lajolla，加利福尼亞)。
細菌載體最好包含在宿主細胞中起作用的啟動子、一個或多個可選擇的表型標記和細菌複製源。代表性的啟動子包括(-內醯胺酶(青黴素酶)和乳糖啟動子系統(參見，Chang等人，自然275615，1978)、T7 RNA聚合酶啟動子(Studier等人，酶學方法18560-89，1990)、(啟動子(Elvin等人，基因87123-126，1990)、trp啟動子(Nichols和Yanofsky，酶學方法101155，1983)和tac啟動子(Russell等人，基因20231，1982)。代表性的選擇性標記包括多種抗生素抗性標記，例如卡拉黴素或氨苄青黴素抗性基因。適於轉化宿主細胞的許多質粒是本領域已知的，其中包括pBR3229(參見Bolivar等人，基因295，1977)、pUC質粒(pUC18、pUC19、pUC118、pUC119)(參見Messing，酶學方法10120-77，1983；Vieira和Messing，基因19259-268，1982)和pNH8A、pNH16a、pNH18a以及Bluescript M13(Stratagene，La Jolla，加利福尼亞)。
適於進行本發明的酵母和真菌宿主細胞包括Saccharomyces pombe、啤酒糖酵母、畢赤氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、和麴黴屬的各個種。酵母和真菌合適的表達載體包括YCp50(ATCC No37419)(用於酵母)，和amdS克隆載體pV3(Turnbull，生物技術7169，1989)。轉化酵母的方案也是本領域普通技術人員熟知的。例如，可以經用DNA製備酵母原生質球(參見Hinnen等人，PNAS USA 751929，1978)或經用LiCl之類的鹼金屬鹽處理(參見Itoh等人，生物/技術153163，1983)容易地完成轉化。也可以按Cullen等(生物/技術5369，1987)的描述用乙二醇進行真菌的轉化。
適於進行本發明的哺乳動物細胞包括COS(如，ATCC No.CRL1650或1651)、BHK(如，ATCC No.CRL 6281)、CHO(ATCC No.CCL61)、HeLa(如，ATCC No.CCL2)、293(ATCC No.1573)和NS-1細胞。指導在哺乳動物中表達的合適的表達載體通常包含啟動子以及其它轉錄和翻譯控制序列。普通啟動子包括SV40、MMTV、金屬硫蛋白-1、腺病毒E1a、巨細胞病毒立即早期啟動子和巨細胞病毒立即晚期啟動子。
轉化哺乳動物的方案是本領域普通技術人員熟知的。代表性的方法包括磷酸鈣介導的轉染；電穿孔；脂轉染；逆轉錄病毒、腺病毒和原生質體融合-介導的轉染(參見Sambrook等人.，見上)。
可通過培養上述宿主/載體系統以表達重組胸苷激酶突變體製備胸苷激酶突變體。可以進一步按以下更詳細的描述純化重組產生的胸苷激酶突變體。
如以上所指出的，本發明也提供了多種適於指導上述核酸分子表達的病毒和非病毒載體。本發明一方面提供了病毒載體，該載體包含指導編碼上述胸苷激酶突變體的核酸分子表達的病毒啟動子。可用於本發明的多種啟動子包括，例如，MoMLV LTR、RSV LTR、Friend MuLv LTR、腺病毒啟動子(Ohno等人，科學265781-784，1994)、新黴素磷酸轉移酶啟動子/增強子、晚期細小病毒啟動子Koering等人，人體基因治療5457-463，1994)、皰疹TK啟動子、SV40啟動子、金屬硫蛋白IIa基因增強子/啟動子、巨細胞病毒立即早期啟動子、巨細胞病毒立即晚期啟動子之類的啟動子。在本發明特別優選的實施方案中，所述啟動子是組織特異性啟動子(參見，例如，WO91/02805；EP0415731和WO90/07936)。合適的組織特異性啟動子的代表性例子包括酪氨酸酶相關啟動子(TRP-1和TRP-2，Vile和Hart，癌症研究53962-967，1993)、DF3增強子(用於胸腺細胞，參見Manome等人，癌症研究545708-5413，1994)、SLPI啟動子(分泌白細胞蛋白酶抑制劑-在許多類型的癌中表達，參見，Garver等人，基因治療146-50，1994)、TRS(組織特異性調節序列，參見Dynan和Tjian，自然316774-778，1985)、白蛋白和(胎蛋白啟動子(分別對正常肝細胞和轉化肝細胞特異)、癌胚抗原啟動子(用於轉化的胃腸道、肺、乳房和其它組織的細胞)、酪氨酸羥化酶啟動子(用於黑素細胞)、膽鹼乙醯轉移酶或神經元特異性烯醇化酶(用於成神經細胞瘤)、膠質成纖微細胞調節序列、酪氨酸羥化酶啟動子、c-erb B-2啟動子、PGK啟動子、PEPCK啟動子、乳清酸性啟動子(乳房組織)、酪蛋白啟動子(乳房組織)以及脂肪細胞P2啟動子(Ross等人，基因及開發.1318-1324，1993；和Lowell等人，自然366740-742，1993)。除了以上提到的啟動子外，可以使用其它病毒特異性啟動子(如，逆轉錄病毒啟動子(包括以上提到的那些以及象HIV之類的其它啟動子)；肝炎、皰疹(如，EBV)和細菌、真菌或寄生蟲(例如，瘧疾)特異性啟動子，以靶向病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染的特定細胞或組織。
本發明的胸苷激酶突變體可以從多種病毒載體表達，所述載體包括，例如，皰疹病毒載體(如美國專利5,288,641)、逆轉錄病毒載體(例如，EP0,415,731；WO 90/07936；WO 91/0285，WO 94/03622；WO 93/25698；WO93/25234；美國專利5,219,740；WO 93/11230；WO 93/10218；Vile和Hart，癌症研究.533860-3864，1993；Vile和Hart，癌症研究53962-967，1993Ram等人，癌症研究5383-88，1993；Takamiya等人，神經科學研究33493-503，1992；Baba等人，神經外科雜誌79729-735，1993)，假型病毒，腺病毒載體(例如，WO 94/26914，WO 93/9191；Kolls等人，PNAS 91(1)215-219，1994；Kass-Eisler等人，PNAS 90(24)11498-502，1993；Guzman等人，循環系統88(6)2838-48，1993；Guzman et al.，循環系統研究73(6)1202-1207，1993；Zabner細胞75(2)207-216，1993；Li等人，人體基因治療4(4)403-409，1993；Caillaud等人，歐洲神經科學雜誌5(101287-1291，1993；Vincent等人，自然遺傳學5(2)130-134，1993；Jaffe等人，自然遺傳學1(5)372-378，1992；和Levrero等人，基因101(2)195-202，1991)，腺病毒-相關病毒載體(Flotte等人，PNAS 90(22)10613-10617，1993)、細小病毒載體(Koering等人，人體基因治療5457-463，1994)、杆狀病毒載體和痘病毒載體(Panicaoi和Paoletti，PNAS 794927-4931，1982；Ozaki等人，生物生理研究通訊193(2)653-660，1993)。在各實施方案中，病毒載體本身或含有病毒載體的病毒粒子可用於以下所述的方法和組合物中。
除了以上所述的胸苷激酶核酸分子外，本發明的載體還可以包含或表達許多種附加核酸分子。例如，病毒載體可以表達淋巴因子、反義序列、毒素或＂置換型＂蛋白質(如腺苷脫氨酶)。淋巴因子的代表性例子包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、(-幹擾素、(-幹擾素、(-幹擾素和腫瘤壞死因子。反義序列的代表性例子包括反義myc、反義p53、反義ras以及阻斷病毒(如HIV、HBV和HCV)表達和產生的反義序列。毒素的代表性例子包括蓖麻毒蛋白、紅豆因、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、商陸抗病毒蛋白、tritin、志賀氏菌屬毒素和假單胞菌屬外毒素。
在本發明優選的實施方案中，編碼增強或增加胸苷激酶生物學活性的蛋白質的一個或多個基因可以包含在本文所述的載體中，並可以由所述載體表達。例如，在本發明的一個實施方案中，除了編碼胸苷激酶(野生型或以上所述的胸苷激酶突變體)外，編碼DNA聚合酶(如，皰疹DNA聚合酶)和/或鳥苷酸激酶(Konrad，生化雜誌267(36)25652-25655，1992；Miller和Miller，生化雜誌255(15)7204-7207，1980)的核酸分子從一個或幾個分開的啟動子(如，從多個內核糖體結合位點)表達。這類實施方案的代表性例子在實施例7和9中更詳細地給出。應當理解，儘管公開了某些編碼DNA聚合酶或鳥苷酸激酶的核酸分子，但本發明不受到這樣的限制。事實上，如以上所討論的，就胸苷激酶突變體而言，許多種編碼DNA聚合酶或鳥苷酸激酶活性的核酸分子(如，截短的核酸分子或就所編碼的胺基酸而言是簡併的核酸分子)都被認為包括在本發明的範圍內。
胸苷激酶突變體也可以在非人轉基因動物(如，小鼠、大鼠、兔、羊、狗和豬)中表達(參見，Hammer等人，美國自然科學研究彙刊824438-4442，1985)，Palmiter和Brinster(細胞41343-345，1985)和美國專利4,736,866)。簡單地說，將表達單位(包括待表達的核酸分子以及鄰近位置的表達控制序列)引入到(例如，經微注射)受精卵的前核中。注射的DNA的整合經組織樣品的DNA印跡分析檢測。引入的DNA整合進動物的種系以便其遺傳給動物的子代是優選的。可經使用組織特異性啟動子或經使用可誘導啟動子(例如，允許轉基因調節表達的金屬硫蛋白基因啟動子(Palmiter等人，1983，同上))獲得組織特異性表達。
宿主細胞以上所述的編碼本發明的胸苷激酶突變體的核酸分子(包含和/或表達這些突變體的載體)可以容易地引入到許多種宿主細胞中。這種宿主細胞的代表性例子包括植物細胞、真核細胞和原核細胞。在優選的實施方案中，所述核酸分子引入到脊椎動物或溫血動物細胞(如，人、獼猴、奶牛、馬、豬、羊、鼠或魚細胞，或者它們的任何雜種)中。
可以用許多種機制將所說核酸分子(或載體)引入到宿主細胞中，所說機制包括磷酸鈣介導的轉染(Wigler等人，細胞14725，1978)；脂轉染；基因槍(Corxaro和Pearson，體細胞遺傳7603，1981；Graham和Van der Eb.病毒學52456，1973)；電穿孔(Neumann等人，EMBO J.1841-845，1982)；逆轉錄病毒、腺病毒和原生質體融合-介導的轉染或DEAE-葡聚糖介導的轉染(Ausubel等人，(eds.)，分子生物學現行方案，John Wiley和Sons公司，紐約，1987)。
抗體的製備按照本文公開的內容可以容易地製備本文所述的胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶蛋白質的抗體。在本發明的內容中，抗體被理解為包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(如，Fab和F(ab)2以及其可用多種重組方法產生的部分)。如果其以大於或等於107M的Ka結合，則該抗體被認為是抗胸苷激酶反應性的。可以開發出不僅結合到配體(如胸苷激酶突變體)上，而且阻斷或抑制所說突變體生物學活性的抗體，這一點是本領域普通技術人員所能理解的。
簡單地說，本領域普通技術人員可以容易地從多種溫血動物(如，馬、奶牛、多種家禽、兔、小鼠或大鼠)產生多克隆抗體。簡單地說，經腹膜內、肌內、眼睛內或皮下注射胸苷激酶突變體(在抗-鳥苷酸激酶抗體是所需的時為鳥苷酸激酶)和佐劑(如Freund′s完全或不完全佐劑)免疫動物。在幾次加強免疫後，收集血清樣品，並試驗對胸苷激酶突變體的反應性。特別優選的多克隆抗血清在這些試驗的一個中會給出一個至少大於基底三倍的信號。一旦有關胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶的動物的滴度達到高原值時，就可以容易地經每周取血或經給動物放血獲得大量的抗血清。
也可以用常規的技術容易地產生單克隆抗體(參見美國專利RE32011、4902614、4545439和4411993，它們一併在本文中作為參考；也參見單克隆抗體雜交瘤生物分析的新範圍，PlenumPress，Kennett，McKearn，和Bechtol(編輯)，1980，和抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編輯)和冷泉港實驗室出版社，1988，它們也一併在本文中作為參考)。
簡單地說，在本發明的有關實施方案中，用如上所述的胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶注射受試動物。所述胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶可與佐劑(如Freund′s完全或不完全佐劑)預混合，以增強所產生的免疫反應。在初免後的1和3周之間，動物可以用另一次加強免疫再免疫動物，並用以上所述的試驗方法試驗對胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶的反應性。一旦動物具有對所說突變體反應性的高原值，就將其宰殺，收穫含大量B-細胞的組織(如，脾臟和淋巴結)。
從免疫動物獲得的細胞可以由用病毒(如EB病毒(EBV)轉染無限增殖化(參見Glasky和Reading，雜交瘤8(4)377-389，1989)。另外，在一個優選的實施方案中，將所收穫的脾臟和/或淋巴結細胞懸液與已知合適的骨髓瘤細胞融合，以產生分泌單克隆抗體的＂雜交瘤＂。合適的骨髓瘤細胞系包括，例如NS-1(ATCC No.TIB 18)和P3X63-Ag 8.653(ATCC NO.CRL1580)。
融合後，可將細胞置入包含合適培養基(例如，RPMI 1640或DMEM(Dulbecco′s Modified Eagles Medium)(JRH生物科學，Lenexa，Kaneas))以及其它組份(例如胎牛血清(FBS，即，來源於Hyclone，Logan，Utah，或JRH生物科學的))的培養平板上。此外，培養基應包含選擇性地容許融合的脾臟和骨髓瘤細胞生長的試劑，例如HTA(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)(Sigma化學有限公司Louis，Missouri)。約7天的培養後，可以篩選所形成的融合細胞或雜交瘤細胞，以檢測抗胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶反應性的抗體的存在。許多種試驗(包括，例如，對流免疫-電泳放射免疫測定、放射免疫沉澱法、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、斑點印跡測定、蛋白質印跡法、免疫沉澱法、抑制或競爭測定、和夾心測定)可以用於檢測抗本發明的蛋白質反應性的抗體的存在(參見，美國專利4376110和4486530；也參見抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實驗室出版社，1988)。在幾次克隆稀釋和再測定後，可以分離到抗胸苷激酶突變體反應性的雜交瘤產生的抗體。
其它技術也可以用於構建單克隆抗體(參見William D.Huse等人，「免疫球蛋白全組分的大型重組文庫在λ噬菌體中的增殖」，科學2461275-1281，12月1989；也參見L.Sastry等人，「免疫總組分在用於單克隆催化抗體生成的大腸桿菌中的克隆重鏈可變區域特異性cDNA文庫的構建」，美國自然科學研究彙刊865728-5732，1989年8月；也參見MichelleAlting-Mees等人，「單克隆抗體表達文庫對雜交瘤的迅速更替」，分子生物學策略31-9，1990年1月。這些參考資料描述了一個可從Stratacyte，LaJolla，California獲得的市售系統，該系統使得可經重組技術產生抗體)。簡言之，從B細胞群分離mRNA，並用於在kImmunoZap(H)和kImmunoZap(L)載體中產生重鏈和輕鏈免疫球蛋白cDNA表達文庫。這些載體可被單獨篩選或共表達以形成Fab片段或抗體(參見Huse等人，同上；也參見Sastry等人，同上)。陽性噬斑可接著轉化成容許從大腸桿菌高水平表達單克隆抗體的非裂解性質粒。
類似地，也可以用重組DNA技術摻合編碼特異性結合抗體的基因的可變區來構建抗體部分。在一個實施方案中，用可變區核苷酸引物擴增編碼雜交瘤產生的興趣單克隆抗體的可變區的基因。這些引物可由本領域普通技術人員合成，或者可以由商業途徑購得。Stratacyte(La Jolla，Calif.)出售小鼠和人可變區引物，其中包括VHa、VHb、VHc、VHd、CHl、VL和CL區引物。這些引物可以用於擴增重鏈或輕鏈可變區，這些可變區然後可分別插入到載體(例如，ImmunoZAPTMH或Immuno ZAPTML(Stratacyte)。然後將這些載體引入到大腸桿菌中表達。採用這些技術，可以產生大量的包含VH和VL融合的單鏈蛋白質(參見，Bird等人，科學242423-426，1988)。此外，這些技術可用於將鼠抗體變化成人抗體，而不改變抗體的結合特異性。
一旦獲得合適的抗體，就可以用本領域普通技術人員熟知的許多技術分離或純化它們(參見，抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實驗室出版社1988)。合適的技術包括肽或蛋白質柱層析、HPLC或RP-HPLC、在蛋白質A或蛋白質G上的純化、或者這些技術的任何組合。
抗體的標記可以用多種分子(包括，例如，螢光分子、毒素和放射性核素)標記以上所述的抗-胸苷激酶或抗-鳥苷酸激酶抗體。螢光分子的代表性例子包括螢光素、藻紅蛋白、桿菌胺(rodamine)、德克薩斯紅和螢光素酶。毒素的代表性例子包括蓖麻毒蛋白、紅豆因、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、商陸抗病毒蛋白、tritin、志賀氏菌屬毒素和假單胞菌屬外毒素A。放射性核素的代表性例子包括Cu-64，Ca-67，Ga-68，Zr-89，Ru-97，Tc-99m，Rh-105，Pd-109，In-111，I-123，I-125，I-131，Re-186，Re-188，Au-198，Au-199，Pb-203，At-211，Pb-212和Bi-212。此外，以上所述的抗體也可被標記或結合到配體結合對的一半上。代表性的例子包括親和素-生物素和核黃素-核黃素結合蛋白質。
用以上提出的代表性標記來結合或標記以上討論的抗-胸苷激酶或抗-鳥苷酸激酶抗體的方法可以由本領域普通技術人員容易地完成(參見，Trichothecene抗體共軛物；美國專利4,744,981；抗體共軛物，美國專利5,106,951；產螢光材料及標記技術，美國專利4,018,884；用於診斷及治療的金屬/放射性核素標記蛋白質，美國專利4,897,255；和改善螯合動力學的金屬放射性核素螯合化合物，美國專利4,988,496；也參見Inman，酶學方法34卷，親和技術，酶提純B部分，Jakoby和Wilchek(編輯)，學術研究出版社，紐約，p.30，1974；也參見Wilchek和Bayer，」「生物分析應用中的抗生物素蛋白-生物素複合體」，分析生物化學1711-32，1988)。
藥物組合物如以上所指出的，本發明也提供了多種藥物組合物，該組合物包含一種以上所述的胸苷激酶突變體(如，核酸分子、載體或蛋白質)以及藥學上或生理學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。一般來說，這些載體在所使用的劑量和濃度時對受治療者是無毒的。通常，這些組合物需要將治療劑與緩衝劑、抗氧化劑(如抗壞血酸)、低分子量(少於10個殘基)多肽、蛋白質、胺基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合劑(如EDTA、穀胱甘肽)和其它穩定劑和賦形劑組合。中性緩衝鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是非常合適的稀釋劑。
此外，本發明的藥物組合物可以製備成由不同途徑給藥的製劑，所說的途徑包括，例如，關節內、顱內、真皮內、肌內、眼內、腹膜內、鞘內、靜脈內、皮下或者甚至直接進入腫瘤(例如，經定向注射)。另外，本發明的藥物組合物可置入容器內，附帶給出有關使用這些藥物組合物的說明的包裝材料。一般來說，這種說明包括描述藥劑濃度的明確的說明以及(在某些實施方案中)構成所說藥物組合物必需的賦形劑組份或稀釋劑(如，水、鹽水或PBS)的相對量。
方法本發明也提供了抑制溫血動物病原體的方法，該方法包括給溫血動物施用如上所述的載體(如，表達載體、病毒載體或包含載體的病毒粒子)，以使所說病原體受到抑制。本領域技術人員會很清楚，施用量和次數當然取決於待治療疾病的性質和嚴重程度、所需的反應、病人的狀況等因素。典型地，所說組合物可以由多種方法給藥，所說的方法包括，例如，關節內、顱內、真皮內、肌內、眼內、腹膜內、鞘內、靜脈內、皮下或者甚至直接進入腫瘤(例如，經定向注射)。在本發明的其它實施方案中，包含或表達編碼以上所述胸苷激酶突變體的核酸分子的載體，或者甚至核酸分子本身可以用多種可替換的方法施用，所說方法包括，例如，施用與聚(L-賴氨酸)DNA複合物結合的脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Cristano等人.，PNAS92122-92126，1993)、與殺滅的腺病毒連接的DNA(Michael等人，生物化學雜誌268(10)6866-6869，1993；Curiel等人，人體基因治療3(2)147-154，1992)、細胞轉染劑介導的引入(DMRIE-DOPE，Vical，Calif.)、直接DNA注射(Acsadi等人，自然352815-818，1991)、DNA配體(Wu等人，生物化學雜誌26416985-16987，1989)、脂轉染(Felgner等人，美國自然科學研究彙刊847413-7417，1989)、脂質體(Pickering等人，循環系統89(1)13-21，1994；Wang et al.，PNAS 847851-7855，1987)、微粒轟擊(Williams等人，PNAS 882726-2730，1991)、逆轉錄轉座子、運鐵蛋白-DNA複合物(Zenke)和直接單獨(vile和Hart，癌症研究533860-3864，1993)或採用PEG-核酸複合物運送編碼酶本身的核酸。
本發明的一個方面提供了抑制溫血動物腫瘤或癌症的方法，該方法包括給溫血動物施用如上所述的一種載體(或編碼本發明的胸苷激酶突變體或鳥苷酸激酶的核酸分子)，以使所說的腫瘤或癌症受到抑制。在另一實施方案中，這些方法還包括施用核苷類似物的步驟。這些核苷類似物的代表性例子包括ganciclovir、無環鳥苷、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU(5-碘-5′-氨基-2′，5′-二脫氧尿苷)、二脫氧胞苷和AraC。簡言之，採用這些方法可以治療多種腫瘤(早期的和惡性的)。這些腫瘤的代表性例子包括實體腫瘤，例如，肺癌、腎細胞癌、乳腺癌、結腸癌和黑素瘤，以及彌散性癌(如，白血病和淋巴瘤)。
本發明另一方面提供了用以上所述的核酸分子或載體治療多種其中一組細胞以病態或改變為特徵的疾病的方法。這些疾病的代表性例子包括表皮角化病(牛皮癬)、前列腺肥大、甲狀腺機能亢進、多種內分泌病、自體免疫疾病(由象T細胞某些亞類之類的自體免疫反應性細胞引起)、變態反應病(如，通過調節對變態反應起決定作用的IgE表達細胞的活性)、再狹窄(如，經殺滅在血管向內生長和/或堵塞中起決定作用的細胞)、多種病毒病(如，AIDS(HIV)、肝炎(HCV或HBV)和胞內寄生性疾病。本發明的其它實施方案提供了抑制按慣例不與疾病相關的細胞生長或殺滅該細胞的方法。例如，在某些實施方案中，施用抑制或消除脂肪細胞的載體(或單獨的核酸分子)以使動物重量減輕，或者消除毛髮囊泡(作脫毛髮劑)。
本發明的其它方面提供了在原核細胞、真核細胞、植物(Czako andMorton，Plant physiol.1041067-1071，1994)、寄生蟲(例如，錐蟲)或病毒中將以上所述的胸苷激酶突變體用作陰性-選擇標記基因(參見，例如，Czakoand Narton，Plant Physiol.1041067-1071，1994)的方法。此外，這些突變體可以用作同源重組的條件致死標誌(Mansour et al.，Nature 336348-352，1988)。代表性的例子在以下實施例6中更詳細地給出。
下列實施例以說明的方式而不是限制的方式給出。
實施例實施例1用20％隨機文庫構建包含165-175位密碼子突變的TK突變體實施例1描述了用20％隨機文庫構建包含165-175位密碼子突變的TK突變體。圖1中給出了描述這一實施例中採用的策略的圖解性概要。
A.TK突變體的產生1.寡核苷酸的產生用操縱子技術(Operon Technologies)(San Pablo，CA)合成具有野生型tk序列的52鏈節寡核苷酸(SEQ..ID NO.No.2)和包含tk基因(SEQ.ID NO.No.1-注，SEQ.ID NO.No.1僅列出HSVTK-1開放讀框中的核苷酸)165-175位密碼子簡併核苷酸的56鏈節寡核苷酸(SEQ.ID NO.No.3)(其中N＝在各位置上80％野生型核苷酸和20％其它三種的混合物。兩種寡聚物沿3』-末端12個鹼基相互互補。5′-TG GGA GCT CAC ATG CCC CGC CCC CGG CCC TCA CCC TCA TCT TCGATC GCC AT-3′(SEQ ID No.2)5′-ATG AGG TAC CGN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNA TGG CGA TCG AA-3′(SEQ ID No.3)為構建以下描述的pKTPD，用磷醯胺化學由操縱子技術合成兩個附加的寡核苷酸。這些寡核苷酸是5′-CCC CTC GAG CGC GGT AC-3′(SEQ ID No.4)5′-CGC GCT CGA GGG GAG CT-3′(SEQ ID No.5)2.包含隨機序列的文庫的產生1).載體pMDC和pMCC的構建基本上按以下的描述從質粒pHETK1和pHETK2產生嵌合載體pMDC(產生失活的TK基因產物)和pMCC(產生野生型TK)。簡言之，質粒pHETK1和pHETK2(Waldman et al.，J.Biol. Chem.25811571-11575，1983)是包含HSV-1tk結構基因的表達載體，並且是pBR322的衍生物。在Waldman et al.，J.Biol.Chem.25811571-11575，1983(描述了這些質粒的構建)中可以發現pHETK1和pHETK2的限制圖。質粒pHETK2含有(PL和(PR啟動子、ampR和c1 857溫度敏感性阻抑物，而質粒pHETK1含有除了(PL啟動子外的所有上述那些。質粒pHETK1和pHETK2從Dr.William Summers(School of Medicine，Yale University，New Haven)獲得。
為構建pMDC和pMCC，首先按Dube等在Biochem.3011760-11767，1991中描述的方法構建一個沉默(dummy)載體(指定為pKTPD)。簡言之，首先將寡核苷酸SEQ.ID No.4和5(各25pmol)磷酸化，然後退火形成具有KpnI和SstI-匹配末端並具有內XhoI位點的雙鏈寡核苷酸。此外，用SstI和KpnI限制性內切核酸酶消化pHETK2，經瓊脂糖凝膠電泳和後續電洗脫分離大片段，將2pmol大片段與6pmol雙鏈寡核苷酸連接。將所形成的雙鏈環狀DNA產物(指定為pKTPD)用於轉化感受態大腸桿菌KY895，大腸桿菌KY895是從Summers，Yale University，new Haven，CT獲得的TK-缺陷菌株(K12 tdk-，F-，ilv276)。將包含重組質粒pKTPD的克隆在含50(g/ml羧苄青黴素的LB平板上生長。經在XhoI位點切割證實重組質粒DNA的存在。在胸苷激酶選擇培養基中pKTPD不能支持大腸桿菌KY895的生長表明它沒有產生功能性胸苷激酶。
將pHETK1和pKTPD用於構建一個新的嵌合沉默載體(指定為pMDC)。簡言之，經用SphI和pvuII消化，pHETK1被切成兩個片段。較大片段含有ampR、cI857、(PR序列和跨越從BamHI到SphI位點的tk基因部分。較小片段含有tk基因從SphI到PvuII的剩餘部分。類似地，經用兩種相同的酶消化，pKTPD被切成一個較大的片段和一個較小的片段。pKTPD的SphI/PvuII片段在tk基因的KpnI和SacI位點內含有沉默或失活序列。將pHETK1的較大片段與pKTPD的較小片段連接產生嵌合載體(pMDC)，該載體產生失活的tk基因產物。
經將pHETK1的較大片段與將pHETK2的較小片段連接類似地構建另一含有野生型tk基因的嵌合載體(pMCC)。如以上所指出的，pMCC產生活性野生型TK。
2)文庫的產生按以下所述構建包含20％隨機核苷酸序列的文庫。簡言之，將包含野生型序列的52-鏈節寡核苷酸(SEQ.ID No.2)雜交到包含跨越165-175位密碼子的簡併序列的56-鏈節寡核苷酸(SEQ.ID No.3)上。
用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段延伸雜交體以產生完整的雙鏈DNA產物。策略是互補以避免合成包含SEQ.ID No.3的長的隨機核苷酸序列，因為載體中KpnI和SacI位點(插入位點)位置需要長的彈夾。用兩種合成引物對克列諾片段產生的雙鏈DNA進行聚合酶鏈反應擴增第一引物，a相應於寡核苷酸SEQ.ID No.2的5』末端的21-鹼基序列的5』-TGGGAG CTC ACA TGC CCC GCC-3』(SEQ.ID No.6)。b相應於寡核苷酸SEQ.ID No.3的5』末端的11-鹼基序列的5』-ATG AGG TAC CG-3』(SEQ.ID No.7)。所述聚合酶鏈反應擴增反應在100(l終反應體積中含有20mMtris-HCl(pH 8.3)、25mM KCl、1.5mM MgCl2、0.05％ Tween20、0.1mg/ml BSA、四種脫氧寡核苷酸三磷酸鹽各50(M、20pmol引物＂a＂、40pmol引物＂b＂、約1pmol作為模板的延伸的雙鏈寡核苷酸和2單位Taq聚合酶(Cetus)。各混合物用礦物油覆蓋並進行30圈溫度循環94℃ 1分鐘、34℃ 2分鐘和72℃ 7分鐘。
用Centricon 30超濾單位經離心從聚合酶鏈反應產物中除去低分子量組份和過量引物，並用KpnI和SacI消化擴增的DNA。再用Centricon 30單位純化包含隨機序列的雙鏈寡核苷酸，在10(l體積中有1mM ATP和1單位T4 DNA連接酶(BRL)存在時以10∶1摩爾比率連接到pMDC的KpnI/SacI消化的大片段上。於14℃培養18小時，用苯酚-氯仿提取接著用乙醇沉澱終止反應。
3)TK突變體的選擇將上述沉澱乾燥並溶解到10(l水中，用於經電穿孔轉化感受態大腸桿菌KY895。將1(l連接產物與50(l感受態細胞混合，用Gene-pulser電穿孔器(Bio-Rad)在2KV、25(FH 400 Ohms下電穿孔。脈衝後，加入1mlSOC介質(2％ Bacto-胰化蛋白腖、0.5％ Bacto酵母膏、10mM NaCl 2.5mMKCl 10mM MgCl2、10Mm MgSO4和20mM葡萄糖)。接著於37℃伴隨連續攪拌培養1.5小時。將各轉化溶液的一小份噴射到含50(g/ml羧苄青黴素的LB-瓊脂培養基上，以測定轉化體的總數量。在含有50(g/ml羧苄青黴素、10(g/ml 5′氟脫氧尿苷、2(g/ml胸苷、20(g/ml尿苷、2％BBL蛋白腖、0.5％NaCl、0.2％葡萄糖和0.8％Gel-Rite(Scott Laboratories，Inc.，Carson，CA)的TK選擇培養基上進行活性TK克隆的選擇(圖1)。於37℃在羧苄青黴素培養基上培養菌落14-16小時，而於37℃在培養的TK選擇培養基上培養24小時。
生長在羧苄青黴素培養基上的總共53000個轉化體中，190個能補充大腸桿菌KY895TK功能。
實施例2用100％隨機文庫構建包含165-175位密碼子突變的TK突變體實施例2描述了用100％隨機文庫構建包含165-175位密碼子突變的TK突變體。這一實施例所採用的策略類似以上實施例1描述的。
A.TK突變體的產生1.寡核苷酸的產生用操縱子技術(Operon Technologies)(San Pablo，CA)合成具有野生型tk序列和5』末端KpnI位點的52-聚體5』-d(TG GGA GCT CAC ATG CCCCGC CCC CGG CCC TCA CCC TCA TCT TCG ATC GCC AT)-3』(SEQ.ID No.8)。此外，也合成包含相應於HSV-1 tk 165-175位密碼子隨機核苷酸和包含3』末端SacI位點的56聚體5′-d(ATG AGG TAC CGN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNA TGG CGA TCG AA)-3′(SEQ.ID No.3)，其中N＝G、A、T或C的等摩爾濃度。通過經20％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離寡核苷酸，接著在反相小柱9Glen Research，Sterling，VA)上純化。
2.包含100％隨機序列的文庫的產生將相應於野生型HSV-1tk序列的52-聚體與包含隨機核苷酸的56-鏈節雜交。然後，基本上按以上實施例1的描述用DNA聚合酶I的克列諾片段延伸雜交體、PCR擴增和連接到pMDC上。
3.TK+突變體的選擇基本上按以下所述基於其磷酸化dT的能力經TK選擇培養基上菌落形成識別功能性TK突變體。簡言之，將連接產物引入到tk-大腸桿菌菌株KY895中。通過在每毫升含50微克羧苄青黴素的LB瓊脂上平板接種測定轉化體的總數量，通過在TK選擇培養基[2％BBL蛋白腖、0.5％NaCl、0.2％葡萄糖和0.8％ Gel-Rite(Scott Laboratories，Carson，CA)、50(g/ml羧苄青黴素、10(g/ml氟脫氧尿苷、2(g/mldT、20(g/ml尿苷]上平板接種測定產生酶促活性胸苷激酶的轉化體的數量。
從100％隨機文庫篩選出2百萬個轉化體，其中1540個在TK選擇培養基上形成菌落。
B.AZT-敏感突變體的選擇將100％隨機文庫(TKI)的690個突變體和20％簡併文庫(TKF)的190個突變體的亞類在含AZT的培養基上進行第二次陰性選擇，以識別表現出增強的AZT磷酸化作用的突變體。這一篩選是基於假定具有與dT相關的增強的磷酸化AZT能力的突變體能在AZT-選擇培養基上形成菌落。特別是，產物AZT單磷酸鹽會進一步被宿主細胞非特異性核苷酸激酶或可能被突變體TK磷酸化，經宿主DNA聚合酶摻入到細菌DNA中，終止DNA合成，從而阻止宿主染色體複製。
簡言之，首先使TK突變體以單個菌落在TK-選擇培養基(1.0(g/ml dT)上生長，然後複製鋪板到AZT-選擇培養基(0.05(g/mlAZT，1.0(g/ml dT)上。AZT-選擇培養基中的所有其它組份與TK-選擇培養基中的相同。選擇那些在AZT-選擇培養基上不生長的TK突變體再試驗分別在TK-和AZT-選擇培養基上的生長。
在篩選的880個初步選擇體中，僅兩個突變體(TKF105(從20％文庫)和TKI208(從100％文庫))以類似於包含有野生型質粒的大腸桿菌的效率在TK-選擇培養基上形成菌落而不在AZT-選擇培養基上形成菌落(圖2)。
圖3給出了TKF105和TKI208的核苷酸和推定的胺基酸序列。兩種胺基酸在相同的位置含有單個胺基酸取代Leu-170變成Ile(TKF105)和Val(TKI208)。在周圍220個核苷酸中未觀察到其它取代。
為了確保TKF105和TKI208之間的不同不是由於包含突變體和野生型質粒的大腸桿菌中TK的差異表達，比較了包含TKI208或野生型質粒細胞抽提物的蛋白質印跡。在免疫反應性染色蛋白質的數量或電泳遷移率上未觀察到明顯不同。也測定了每毫克蛋白質磷酸化率，發現類似於包含TKI208、TKF105和野生型質粒的大腸桿菌抽提物。
為了說明兩種突變體在AZT-選擇培養基上不生長是由於AZT增強的磷酸化，進行了下列試驗。
1).[3H]AZT攝入率首先測定了包含野生型和突變體質粒的大腸桿菌的相對於[3H]dT的[3H]AZT攝入率。研究表明，與具有野生型質粒的大腸桿菌相比，包含AZT敏感突變體、TKF105和TKI208的大腸桿菌表現出AZT對dT攝入比率增加4倍。
2).TK的親和純化通過連接到p-氨苯基胸苷3』-磷酸鹽上的CH-瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)上的親和層析進行野生型和突變體TK的純化。然後柱子依次用緩衝液A
、緩衝液B(0.1M TrisHCl，pH7.5/0.5M KCl/5mM DTT/10％甘油)和緩衝液A各30毫升洗脫。用60毫升緩衝液C(0.3M TrisHCl，pH7.4/50mMKCl/10％甘油)中的0-600(M dT線性梯度液洗脫TK。收集活性組份並對2升50mM TrisHCl，pH7.4/5mM DTT/10％甘油透析3次，除最終透析外，所有上述緩衝液均包含50(g/ml抑蛋白酶肽以及抑胃酶肽和亮抑蛋白酶肽各2(g/ml。
3).AZT磷酸化動力學其次測定了由兩種突變體引起的AZT磷酸化的動力學。簡言之，在含有50mM TrisHCl、5mM ATP、4mMMgCl2、2.5mM DTT、12mMKCl、0.18mg/ml牛血清白蛋白、5％甘油、0.08(Ci[3H]AZT(Sigma)、各種濃度的未標記的AZT(0-4.0(M)和純化酶(對野生型和TKI208分別為4和1.2單位，酶的1單位定義為在以上描述的條件下1分鐘能磷酸化1.0pmoldT成TMP的量)的100微升終體積中進行反應。在34℃(1℃下10分鐘，加入1.0mM未標記的dT和在冰上冷卻終止反應。將一半反應混合物移取到DEAE-纖維素盤(25毫米)上，浸入蒸餾水中，接著用無水乙醇洗滌4次。經閃爍光譜法測定吸附到盤上的放射活性的量。用Cleland SUBIN方案(Cleland，Methods Enz.63103-138，1979)測定Km和Vmax值。用等式Vmax＝Kcat[E]o計算Kcat值，其中[E]o＝總酶濃度。用0.3(Ci([3H-甲基]dT87Ci/mmolAmersham)、各種濃度的未標記dT(0-4.0(M)以及1.1(對野生型)和0.5(對TKI208)單位的TK在50微升終體積中進行測定dT磷酸化的TK試驗。反應混合物中的所有其它組份和培養條件如以上AZT磷酸化中所描述的。
如以下表1所示，與野生型(8.5(M)相比，AZT-敏感變體TKI208表現出較低的Km(4.4(M)。通過比較兩種底物(AZT對dT)增加的Kcat/Km可以看出，TKI208選擇性磷酸化AZT的效率較dT高出2.3倍。用純化的TKF 105 TK進行的類似的初步試驗也表明AZT較低的Km(3.7(M)，但與野生型比較有類似的Kcat/Km值。
表1野生型和TKI208磷酸化AZT和dT的能力

C.突變體TK的熱穩定性分析基本上按以下所述分析突變體的熱穩定性。簡言之，將25微克各提取物在包含0.28(g/ml牛血清白蛋白、50(g/ml抑蛋白酶肽、2(g/ml抑胃酶肽和2(g/ml亮抑蛋白酶肽的0.3毫升28mM Tris-HCl(pH7.5)中於42℃預培養0.5、10、20、30或40分鐘。在各時間點在包含50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM ATP、4Mm MgCl2、2.5mM DTT、12mM KCl、0.18mg/ml牛血清白蛋白、5％甘油和1(M[3H-甲基]dT(60×103dpm/pmol)的總反應體積中試驗30微升(2.5微克)樣品的殘餘TK活性。於34℃培養10分鐘。在冰上冷卻終止反應。將25微升移取到DEAE-纖維素盤上。盤的洗滌和試驗條件如以上AZT試驗所述的。
TKF2、TKF56、TKF75、TKF446和野生型TK的未分級處理的試驗結果示於圖4A-4D中。一種突變體(TKF2)在42℃比其它任何突變體或比野生型對熱更穩定。除了TKF2外，所有試驗的突變體(包括野生型)在與34℃比較於42℃預培養時具有0.05-0.30的殘餘活性比率TKF2具有0.7的比率。TKF2包含三個胺基酸取代Pro-165*His，Ala-167*Ser和Ala-174*Val(圖3)。TKF75包含一個Ala-167*Ser取代，TKF56包含一個Ala-174*Val取代，TKI440包含一個Pro-165*Ala取代。具有Ala-174*Val和Ala-167*Ser取代的突變體TKF56和TKF75的熱穩定性分別類似於野生型。在於42℃培養5分鐘後，兩者均喪失80％以上的活性。具有Pro-165*Ala的TKF440更穩定，但不如TKF2(三重突變體)穩定。進行了兩種類型的試驗證實TKF2的熱穩定性。首先，將來源於包含TKF2和野生型質粒的大腸桿菌的TK蛋白質用親和層析純化至接近均質，並按以上的方法試驗。與前述相同，在於42℃預培養後，TKF2的活性損失少於野生型(圖4E)。
其次，將TKF2和野生型TK的tk基因轉移進具有T3 RNA聚合酶啟動子的載體中。更具體地說，分離野生型和TKF2質粒的tk基因的全長BglII-Pvu I片段，並採用合成接頭在Spe I和Eco RI位點之間亞克隆進pBluescript SK((Stratagene)載體。用Promega轉錄系統進行採用T3啟動子的轉錄。用網質紅細胞裂解物系統(Promega)按供應者的方案進行體外翻譯。野生型和TKF2tk基因的體外合成蛋白質的TK活性損失為42℃預培養的函數示於圖5中。在預培養45分鐘後，由TKF2編碼的蛋白質其活性損失小於10％。相反，由野生型基因編碼的蛋白質其初始活性損失大於80％。體外合成的TKF2表現出的熱穩定性的程度類似於或高於基因原始TKF2質粒的粗提物。為進行SDS/PAGE分析，用[35S]蛋氨酸標記翻譯產物。
SDS/PAGE分析後的標記產物的放射自顯影示於圖6中。箭頭表示按分子量標準(Bio-rad)判斷的翻譯的TK的大小。從這一放射自顯影可以清楚看出，翻譯產物以雙帶遷移，其中一個相當於43kDa(與大腸桿菌表達的HSV-1TK的報導的大小一致)，第二條帶可能是由於氨基末端的32-殘基片段的蛋白酶降解，它以不可檢測的水平改變HSV-1 TK的TK活性。
實施例3用20％隨機文庫構建和分析具有155和161-165位密碼子突變的TK突變體這一實施例描述了在155和161-165位密碼子突變的TK突變體的構建和分析。以下給出這一實施例中使用的細菌菌株和材料。
細菌菌株 將最初由Igarashi等(Genetics 57643-654，1967)描述的大腸桿菌菌株KY895用於胸苷激酶活性的遺傳互補試驗中。在所有亞克隆試驗中大腸桿菌菌株NM522(F′lacIq((lacZ)M15 proAB/supE thi((lacproAB)((hsdMS-mcrB)5(rk-McrB-))(NEB，Beverly，MA)用作受體。輔助噬菌體VCM13(Stratagene，La Jolla，CA)用於產生用來測序的單鏈噬菌體。
材料 用於蛋白質合成測定的L-[35S]蛋氨酸/半胱氨酸(特異活性，1140 Ci/mmol)和[甲基-3H]胸苷(特異活性，87Ci/mmol)從Amersham購得。其它放射性同位素[[側鏈-2-3H]無環鳥苷(特異活性，28.6 Ci/mmol)和[5-3H]-脫氧胞苷(特異活性，29 Ci/mmol)從Du Pont-New EnglandNuclear(Boston，MA)購得，ganciclovir(特異活性，22 Ci/mmol)和[甲基-3H]-3′-疊氮-3′-脫氧胸苷(特異活性，14Ci/mmol)從Moravek(Brea，CA)購得。限制性內切核酸酶和T4連接酶從New England Biolabs(NEB)購得，Promega(Madison，WI)是轉錄和翻譯試劑的來源(除了帽類似物7m(5′)GPPP(5′)G從NEB購得外)。用於測序和聚合酶鏈反應擴增的寡核苷酸從Operon(Alameda，CA)購得。除了指明的外，其它化學品從Sigma(St.Louis，MO)購得。
A.TK突變體的產生1.寡核苷酸的產生由American Synthesis，Inc.(Pleasanton，CA)合成兩種寡核苷酸(Pleasanton，CA)MB110(70 聚體)5』-TGGGAGCTCACATGCCCCGCCC〔CCG〕GCCCT CACCCTCATC〔TTCGACCGCC ATCCC〕ATCGCCGCCCTCCTG-3』(SEQ ID No.9)，和MB111(38聚體)5』-ATGAGGTACCGCGCAGCTGG GTAGCACAGGAGGGCGGC-3』(SEQ ID No.10)。在這些寡核苷酸中，括號中合成的核苷酸80％為野生型核苷酸，20％為其它三種核苷酸。
MB110的5』末端是SacI限制位點，MB111的5′末端是KpnI限制位點。這些限制位點在發生第二鏈合成後的後面的步驟中使用。而且，作為內控，在MB111中引入PvuII位點，以便在測序前證實隨機序列的插入。各寡核苷酸的3′末端的12個核苷酸互補，使得兩條鏈可相互雜交。將各寡核苷酸在20％丙烯醯胺-脲凝膠上電泳，在PEI-纖維素TCL板(Baker，Phillipsburg，NJ)上經UV顯影觀察，切下包含合適大小寡核苷酸的凝膠部分，在0.5M乙酸銨/10mM乙酸鎂中於37℃過夜從凝膠洗脫寡核苷酸。然後洗脫的寡核苷酸用乙醇沉澱，並再懸浮到水中，進行OD260測定，各寡核苷酸的消光係數用於確定濃度。
將等摩爾量的MB110和MB111(25pmol)在小體積(20微升)1×退火緩衝液(10×退火緩衝液＝70mM Tris(pH7.5)/60mM MgCl2/200mM NaCl)中於95℃退火5分鐘，然後於65℃退火20分鐘，接著緩慢冷卻至室溫。向退火的寡核苷酸(20微升)中加入2微升10×退火緩衝液、2.8微升10mM dNTPs、0.8微升0.1M的二硫蘇糖醇(DTT)、2.4微升DNA聚合酶I克列諾片段(5單位/微升)和水，使體積達到40微升。混合物置於37℃下30分鐘，65℃10分鐘，最後置於室溫下10分鐘。通過將樣品進行變性丙烯醯胺凝膠電泳和放射自顯影完成全延伸放射活性寡核苷酸的證實。用Taq聚合酶(Stratagene)經聚合酶鏈反應進行延伸產物的擴增。100uL反應物包含20mM Tris(pH8.3)/20mM KCl/1.5mM MgCl2/0.05％Tween20/0.1mg/mlBSA/四種脫氧核苷酸三磷酸鹽(dNTPs)各50(M/22pmol PCR引物1/20pmol PCR引物2/2單位Taq聚合酶和6pmol延伸的隨機寡核苷酸；引物1＝5』-TGGGAGCTCACATGCC CCGCC-3′(SEQ.ID No.6)，引物2＝5』-ATGAGGTACCG-3′(SEQ.ID No.7)。向試管中加入1滴礦物油，然後置入Perkins Elmer-Cetus熱循環器中，設定90℃1分鐘，34℃2分鐘的30個循環。30個循環結束後，將反應物置於72℃7分鐘，然後將循環器保持在4℃。在用2％瓊脂糖凝膠電泳證實擴增後，收集含產物的反應物，沉澱，並用KpnI和SacI消化。從非變性丙烯醯胺凝膠上的單切或未切片段辨別雙限制片段，按以上所述切下合適的片段並分離。
2.包含隨機序列文庫的產生用KpnI和SacI限制性內切核酸酶消化氯化銫梯度純化的pMDC(＂沉默＂載體)(按以上實施例1所述構建)，並用GenClean II(Bio101，La Jolla，CA)從1％瓊脂糖/1×TBE凝膠進行凝膠分離。用1單位的T4 DNA連接酶於16℃過夜連接這一載體與凝膠分離的PCR-擴增隨機片段。
3.TK突變體的選擇然後，將連接混合物用於經電穿孔(Biorad gene Pulser，2kV，25(F，400轉化KY895。簡言之，按照BioRad(Richmond，CA)提供的方案製備用於電穿孔的細胞，在各次脈衝後，將1毫升SOC(2％ Bacto-胰化蛋白腖、0.5％ Bacto酵母膏、10mM NaCl 2.5mM KCl 10mM MgCl2、10MmMgSO4和20mM葡萄糖)加入到小池中，將電穿孔混合物轉移到25毫升折反帽(snap-cap)Falcon管中。在將管於37℃振蕩1小時後，將細胞平板接種到含有羧苄青黴素(50微克/毫升)的LB平板[每升10克胰化蛋白腖/5克酵母膏/10克氯化鈉(pH7)](＂LB+carb50板＂)上，於37℃培養過夜。計數菌落的數量，用牙籤挑取接種到TK選擇培養基[2％BBLTrypticase蛋白腖(Becton Dickenson，Cockeysville，MD)/0.5％NaCl/ 0.8％Gel-Rite(ScottLaboratories，Carson，CA)/0.2％葡萄糖/50(g/ml羧苄青黴素/10(g/ml5′-氟脫氧尿苷/2(g/ml胸苷/12.5(g/ml尿苷]上。這一選擇的基礎是5′-氟脫氧尿苷(FUdR)被胸苷激酶磷酸化形成FdUMP(一種從頭途徑酶胸苷合成酶的抑制劑)。然後對dTMP的需要可以僅通過活性胸苷激酶完成。補充尿苷來抑制胸苷磷酸化酶。16-24小時後，對TK選擇平板進行生長評分，挑出所有陽性的，再接種到TK選擇平板和LB+carb50板上證實表型。
對約260個隨機轉化體就在TK選擇培養基上補充KY895(一種TK-缺陷大腸桿菌)的能力進行篩選。其中，82個評分為陽性並被測序。因此，所有轉化體的約32％編碼功能性酶。
B.突變體分析按下述分離和測序TK突變體。簡言之，由於質粒的低拷貝數，除了每次分析使用3毫升培養液外，按製造者的說明用Promega Magic小量製備試劑盒從在2×YT(每升16克胰化蛋白腖/10克酵母膏/5克氯化鈉)+carb50中過夜生長的培養物中分離突變體DNA。將10微升各dsDNA用鹼變性，沉澱，並再懸浮到測序酶反應緩衝液、水和測序引物(5』-CATGCCTTATGCCGTGA-3』)(SEQ.ID No.11)中。然後將引物退火，按製造者的說明(USB，Cleveland，OH)用測序酶對DNA進行雙脫氧測序(Sanger et al.，1977).
11個克隆編碼野生型胺基酸序列(13.4％)，7個包含野生型核苷酸序列。具有野生型胺基酸殘基的3個克隆包含單個核苷酸變化，1個包含3個核苷酸變化。如以下表IA所示，識別了包含單個胺基酸變化的總共49個TK陽性克隆(59.8％)。識別了雙胺基酸突變的19個(23.2％)，三個胺基酸突變的2個(2.4％)和四個胺基酸變化的1個克隆(1.2％)。在表IA中，突變的野生型HSV-1 TK胺基酸用粗體給出，帶有殘基數和主要序列中發現的殘基類型[O＝疏水的；I＝親水的；(+)＝帶陽電荷的；(-)＝帶陰電荷的殘基]。野生型殘基的下面是發現的特定胺基酸取代的次數的數量。底部列出了發現的各類型殘基的百分比。
具有多個改變的克隆的胺基酸序列示於表IB中。表的上部表示了HSV-1 TK多肽中的野生型胺基酸和其位置。各自的欄目中顯示了雙、三和四胺基酸取代。如果一組突變被識別一次以上，則發生的數量在左邊的括號中註明。
表IA


表IB

C.第二次篩選和亞克隆在以下所述的第二次篩選中，測定了pMCC(KY895)和35個對數期突變體pMDC(KY895)培養物在無環鳥苷(＂ACV＂)或AZT平板上產生菌落的能力。簡言之，將對數期TK陽性克隆培養物用0.9％氯化鈉系列稀釋，散布到無環鳥苷或AZT平板(TK選擇平板，除了1微克/毫升胸苷+1微克/毫升無環鳥苷或0.05微克/毫升AZT外)上。突變體培養物也散布到重複的TK選擇和LB+carb50平板上，一組TK選擇平板和LB+carb50平板在42℃培養，所有其它平板在37℃培養。16-24小時後評分各平板。
結果示於以下表II中。簡言之，僅給出了給出不同於用野生型pMCC(KY895)觀察到的結果的突變體。突變體用野生型殘基和位置編號接著從核苷酸序列推導的胺基酸取代基指定，例如，F161I指在這一特定的突變體中在161位殘基上異亮氨酸取代苯丙氨酸。(++)指與對照平板相比觀察到相同的菌落數；(+)指與對照平板相比觀察到很少(小於用pMCC觀察到的20％)和總的來說較小的(約50％較小直徑)菌落；(-)指未觀察到菌落。
表II

如表II所示，所有培養物在對照TK選擇和LB+carb50平板上形成菌落。與野生型比較，幾種突變體顯得優先利用一種和兩種核苷類似物而不是胸苷(P155A/F161V，F161I，F161C和R163P/H164Q)。此外，幾種突變體在42℃在TK選擇平板上不能形成菌落(F161L和R163P/H164Q)，一種在42℃表現出形成菌落的能力嚴重降低(F161I/R163H)。
D.在無細胞翻譯系統中突變體酶的表達1.選擇的突變體的亞克隆為了研究突變體TK的性質，將8種突變體的1.07kbp MluI-BssHII片段體外亞克隆進載體pT7HSVTKII中。更具體地說，用MluI和BssHII限制消化選擇的克隆的DNA以釋放出1.07kbp片段[McKnight序列上核苷酸編號(335-1400(Nucl.Aacids Res.85949-5964，1980；McKnight菌株衍生自HSV-1的mp菌株，wagner，PNAS 781441-1445，1981)]。用GenCleanII從1％瓊脂糖凝膠凝膠分離該片段，並連接到pT7HSVTKII載體DNA(已用MluI和BssHII限制消化，小牛小腸鹼性磷酸酶處理和凝膠分離)上。pT7HSVTKII衍生自Black and Hruby在J.Biol.Chem.2679743-9748，1992中描述的pT7HSVTK轉錄載體。簡言之，pT7HSVTKII不同於pT7HSVTK僅在於喪失了HSV-1 tk基因3』末端的NcoI-BamHI片段(原來用於幫助tk基因的起始克隆)。
2.序列分析在亞克隆進pT7HSVTKII載體的8種突變體片段的最終序列分析中，在這些tk基因之間識別出了兩個附加胺基酸的不同。pT7HSVTKII的序列與McKnight發表的(Nucl.Aacids Res.8(24)5949-5964，1980)完全相同。pMCC(pMDC的母體質粒)和因此連接進隨機序列的載體含有兩個異常於McKnight序列的胺基酸。它們在434(C*T)和575(G*A)位，導致脯氨酸-49向亮氨酸，精氨酸-89向穀氨醯胺變化。因此，除了以上所述的外，，所有突變體都含有這兩種突變。此外，也識別出了480位的單個核苷酸不同(C*T)，但沒有引起胺基酸的變化。
因為所有體外分析均與作為野生型的pT7HSVTKII比較，所以將pMCC的MluI-BssHII片段亞克隆進pT7HSVTKII的相應的位點(現在指定為pT7MCC)，並且將後續的無細胞產物與得自pT7HSVTKII的比較。當胸苷(1.3倍)、脫氧胞苷(1.3倍)、GCV(0.8倍)、ACV(0.95倍)或AZT(1.1倍)用作底物時，在pT7MCC和pT7HSVTKII之間未觀察到磷酸化效率的明顯不同。而且，Sanderson等(J.Mol.Biol.202917-919，1988)報導胸苷和ATP的Km以及從具有pHETK2(pMCC的母體質粒)的大腸桿菌純化的TK和HSV-1-感染細胞的Vmax是難以區分的。因此，各種TK突變體性質上觀察到的變化可以歸因於靶向區內的核苷酸取代和在酶促性質上僅發生小的變化的載體(pT7MCC和pT7HSVTKII)之間的任何不同。
3.體外轉錄和翻譯將以上描述的轉錄物用於兔網質紅細胞裂解物無細胞翻譯系統以合成活性酶。用核酸酶處理的兔網質紅細胞裂解物按Promega進行無細胞翻譯。
通過將35S-標記的無細胞翻譯產物進行SDS-PAGE和放射自顯影分析全長蛋白質的表達。簡言之，將1微升各放射性標記的無細胞翻譯體外衍生突變體mRNA進行含SDS的聚丙烯醯胺(12％)凝膠電泳。這一凝膠的放射自顯影圖示於圖7中。第一道包含14C-標記的各種分子量標記(Amersham)(帶有左邊給出的表觀分子量(×10-3)。第二道相應於無任何添加的mRNA存在時完成的無細胞翻譯。第三道相應於野生型pT7HSVTKIImRNA翻譯產物。所有其它各道包含按以上描述產生的突變體mRNA的翻譯產物。圖7明顯說明，各突變體轉錄物的主要放射性標記翻譯產物在電泳期間作為(43kDa蛋白質遷移，具有與用野生型pT7HSVTKII轉錄物的翻譯產物觀察到的相同的電泳遷移率。
為了定量各翻譯的蛋白質合成水平，以三次重複進行各相同樣品的三氯乙酸可沉澱計數測定。酸可沉澱計數的數量基本上平行於圖7中各突變體帶密度。
E.突變體酶的時間過程分析基於TK活性，各突變體TK可分成兩個亞類；(1)高活性突變體(P155A/F161V，F161I，F161C和D162E)；(2)低活性突變體(F161I/R163H，F161L，D162G和R163P/H164Q)。對高活性的突變體酶，將未標記的翻譯產物稀釋1/9，於30℃培養0、5、10、20和30分鐘。這一試驗的結果示於圖8A中。用相應的TCA-可沉澱計數(35Scpm)將TK活性結果(每分鐘計數)調節到等量蛋白質合成水平。兩種突變體(F161I和P155A/F161V)表現出對胸苷比對野生型TK統計學上較高的親和力。F161C和D162E活性(數據未給出)的標準偏差表明與野生型TK酶活性相比活性上沒有不同。
將低活性的突變體稀釋1/5，也測定作為時間函數的磷酸化率。這一試驗的結果示於圖8B中。時間過程分析表明大多數突變體低於10％野生型活性。然而，一個(F161L)表現出磷酸化胸苷的中等能力，儘管來源於HSVTKII的有降低很多的比率。
F.熱穩定性試驗在TK選擇平板上菌落形成試驗中，幾個突變體在42℃不能補充KY895，表明這些突變體TK是溫度敏感的。為了證實這一觀察結果，將無細胞翻譯產物在42℃溫育，增加試驗酶活性試驗前的時間。簡言之，將各高活性突變體的無細胞翻譯(＂CTF＂)產物、-RNA和HSVTKII樣品稀釋1/9，並於42℃培養0、5、10和20分鐘。然後試驗預培養樣品5分鐘(P155A/F161V和F161I)或20分鐘(-RNA，HSVTKII，F161C和D162E)。以未處理樣品組為100％確定活性保留百分率。如圖9A所示，除F161C外，所有高活性的突變體在42℃長達60分鐘(數據未給出)的預培養後顯示出類似於HSVTKII的熱穩定性。由於F161C在42℃開始的20分鐘內酶活性喪失大於90％，因此進行了較短時間(0、5、10和20分鐘)的培養。F161C例外的不耐熱性表明42℃僅5分鐘活性喪失(85％。
將各高活性突變體的CTF產物稀釋1/5，並於42℃培養0、20、40和60分鐘。然後以三次重複試驗預培養樣品胸苷磷酸化作用60分鐘。以未處理(時間0)樣品為100％確定活性保留百分率。如圖9B所示，低活性突變體亞類中，一種翻譯產物(F161L)比HSVTKII更不耐熱。這類中的其它(R163P，F161I/R163H，H164Q和D162G)等同於HSVTKII。
G.底物特異性試驗用胸苷、脫氧胞苷、ACV、GCV和AZT作為底物以三次重複試驗三種突變體(P155A/F161V，F161I和F161C)磷酸化相對水平。簡言之，48微摩爾的各含氚底物用於各試驗反應中。按以下稀釋翻譯產物用於各核苷酸試驗(翻譯產物/水)1/100，胸苷；2/3，脫氧胞苷、GCV和AZT；1/4，ACV。於30℃培養各試驗組2小時，測定磷酸化產物的量。
調整各試驗組的每分鐘計數，繪製於圖10中。簡言之，P155A/F161V和F161I顯示出相對於HSVTKII的增強的磷酸化胸苷的能力(各2.6和2.2倍)。突變體酶磷酸化脫氧胞苷超過野生型酶1.9-2.8倍(F161I，1.9倍；F161C，2.8倍；P155A/F161V，2.8倍)。兩種突變體表現出具有增加的磷酸化ACV的能力(F155A/F161V和F161C分別超過HSVTKII2.4和2倍)。所有突變體表現出接近AZT磷酸化的野生型水平。與野生型磷酸化水平比較，所有試驗的突變體表現出具有GCV磷酸化上的大的增加(3.9-5.2倍)。
實施例4
具有改變的酶促效率的TK突變體的分析為了識別具有改變的酶促活性的突變體，在以下給出的試驗中分析了實施例1分離的190個TK突變體(TKF)。
A. 功能性胸苷攝入的菌落的形成用改進的Bio-Rad蛋白質試驗估測純化酶的蛋白質含量。用BSA和125ul終體積中25微升Bio-Rad試劑建立標準曲線。通過測定595nm的OD值並與BSA比較確定蛋白質的量。
為了識別具有改變的TK活性的突變體，基於突變體在含有不同濃度胸苷(表I)的培養基上的生長能力設計第二篩選方案。簡言之，首先確定1.0和10.0微克/毫升是支持具有野生型tk質粒的大腸桿菌生長的培養基中胸苷的最低和最高濃度。因為具有野生型tk質粒的大腸桿菌在含有低濃度的胸苷(0.05微克/毫升)的TK選擇培養基上不能形成可見的菌落，因此在這一胸苷濃度下生長可以指示出具有增強的磷酸化胸苷能力的突變體。因而，0.05微克/毫升胸苷用於選擇高TK活性的變體，20微克/毫升胸苷用於選擇低活性的變體。以下表I示出了作為增加的胸苷濃度的函數的選擇的突變體功能性補充tk-大腸桿菌KY895的能力。當190個TK變體和野生型在表1所給出的胸苷濃度下進行篩選時，僅1個(TKF36)在最低胸苷試驗濃度(0.05微克/毫升)下形成菌落。另一方面，僅TKF41在培養基中最高胸苷濃度下生長。所有其它188個突變體和野生型在含有1微克/毫升胸苷的培養基中形成可見菌落。
表I作為胸苷濃度的函數的用野生型和突變體質粒轉化的tk-大腸桿菌KY895的菌落形成能力


在於37℃培養24小時後確定菌落形成。
a.+和-表示具有不同質粒的大腸桿菌在所指出的TK-選擇培養基上能夠或不能夠形成菌落。
b.(表示起始細胞生長在培養20小時後細胞死亡明顯，可能是由於突變體和野生型克隆中胸苷過度磷酸化產生的核苷酸層不平衡。
c.因TKF41顯得是非常低活性的克隆，所以，這一突變體TK的過度表達對大腸桿菌在TK-選擇培養基上成活是必需的。pMCC和表達載體pMDC具有溫度敏感性阻抑基因c1857，它於42℃失活，因此，存在TK的過度表達和隨後的細胞死亡。為了獲得控制表達，於37℃完成篩選。然而，將含TKF41的大腸桿菌在含20微克/毫升胸苷的TK-選擇培養基上於42℃培養。
d.從以上實施例2描述的文庫獲得TKI208。
B.高和低活性克隆的序列分析按以上實施例2的描述測序野生型tk和選擇的突變體。表II示出了野生型tk和選擇的突變體的165-175位密碼子的核苷酸和推導的胺基酸序列。簡言之，TKF36(在含低胸苷的培養基中形成菌落的突變體)包含單個胺基酸取代(Ala168*Ser)，而TKF41包含四個胺基酸取代(Pro165*Ser，Ala167*Gly，Leu170*Gln，Ala174*Val)。有趣的是，TKF52在相同的位置具有與TKF36不同的胺基酸取代(Ala168*Thr)，但在含胸苷濃度低的培養基上不能形成菌落。TKF99包含兩個胺基酸取代(Cys171*Leu，Ala174*Thi)，TKI208具有引起Leu170*Val取代的單個核苷酸取代。
表II野生型和突變體TK酶在靶區的胺基酸和推導的胺基酸序列165a 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 SEQID野生型 ccc atc gcc gcc ctc ctg tgc tac ccg gcc gcg 12pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala 13TKF36 ccc atc gcc Tcc ctc ctg tgc tac ccg gcc gcg 14Pro Ile SER SER Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala 15TKF41 Tcc atc gGc gcc ctAb cAG tgc tac ccg gTc gcg 16SER Ile GLY Ala Leu GLN Cys Tyr Pro VAL Ala 17TKF52 ccc atc gcc Acc ctg ctg tgc tac ccg gcc gcg 18Pro Ile Ala THR Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala 19TKF99 ccc atc gcc gcc TtA ctg tTA tac ccg Acc gcg 20Pro Ile Ala Ala Leu Leu LEU Tyr Pro THR Ala 21TKI208 ccc atc gcc gcc ctc Gtg tgc tac ccg gcc gcg 22Pro Ile Ala Ala Leu VAL Cys Ty r Pro Ala Ala 23a.表示靶區簡併密碼子的編號，野生型核苷酸和胺基酸序列示於密碼子編號的下面。
b.沉默突變。在測序區(跨越密碼子140-182)未觀察到其它核苷酸改變。各模板測序兩次。
取代的核苷酸和胺基酸殘基用粗的大寫字母表示。
c.在具有野生型和突變體TK質粒的大腸桿菌中的胸苷攝入為了證實具有野生型和突變體質粒的大腸桿菌中的胸苷攝入實際水平，進行了以下試驗。
1.[甲基-3H]胸苷攝入試驗基本上按以下所述測定具有野生型和突變體TK質粒的大腸桿菌中的[甲基-3H]胸苷攝入。簡言之，用包含100微克/毫升羧苄青黴素的LB-介質以1∶100稀釋包含pMDC(失活TK)(一種含野生型TK或TK36的質粒)的大腸桿菌的過夜培養物，變成A550時的0.1 OD，移到37℃並在劇烈攪拌下培養。一旦達到1.0 OD，則將培養物放入室溫((25℃)下，以0.21(M(0.16(Ci[甲基-3H]胸苷)的終濃度加入1毫升等分的胸苷。在於22℃培養0、5、10、20、30和60秒鐘後，將50(l轉移到硝基纖維素濾膜(0.45(m)上，在真空下用10毫升預冷的50mMTris-HCl，pH7.0，0.9％NaCl洗滌，乾燥並用scintiverse BD(Fisher)閃爍計數。結果示於圖11中。簡言之，在具有pMDC的大腸桿菌中基本上無胸苷攝入。在具有TKF36的大腸桿菌中胸苷攝入量比具有野生型質粒的大腸桿菌中的高42％(培養10秒鐘後18pmol/108細胞比12.7pmol/108細胞)。
2.[甲基-3H]胸苷摻合進酸不溶物質通過測定胸苷摻合進酸不溶物質間接測定包含野生型和突變體質粒的大腸桿菌粗提物中TK活性物的量.
簡言之，按以上第一部分的描述培養培養物。向0.5毫升培養物中加入胸苷至終體積1.32(M(0.2(Ci[甲基-3H]胸苷)。在預定的培養時間後，取出30(l加入到2.0毫升冷的5％高氯酸中。洗滌沉澱，基本上按Dube et al.，1991的描述測定摻合進酸不溶物質中的放射活性。
圖12表明，[甲基-3H]胸苷摻合進酸不溶產物用TKF36大腸桿菌比用含有野生型質粒或其它試驗的tk突變體的大腸桿菌更迅速。具有兩個胺基酸取代(Cys168*Leu，Ala174*Thr)的一種突變體(TKF99)表現出與野生型相同比率的胸苷摻合。TKF52含有Ala168*Thr取代(與TKF36中Ala168*Ser比較)，在含最少胸苷的TK選擇培養基中不能形成菌落(表I)，而胸苷摻合進酸不溶物質的比率大於野生型但小於TKF36。
D.野生型和各突變體TK的純化從11種培養物獲得不同突變體的粗提物，使其在30℃生長至A550時的0.1 OD，移到37℃生長自1.0 OD。在4℃下離心收集細胞，用25毫升含25％(w/v)蔗糖、50mM Tris-HCl，pH7.5和5mM EDTA的溶液洗滌。離心後，細胞沉澱(約5-6克)於-70℃貯存。將細胞沉澱冷幹並懸浮到20毫升緩衝液I中(緩衝液由10體積50mM Tris-HCl，pH7.5，10％蔗糖與1體積0.3M亞精胺-HCl，2.0M NaCl，10％蔗糖和0.5和0.5mM PMSF，pH7.5混合而成)。一旦再懸浮液均一，就加入4.0毫升含6.25毫克溶菌酶的緩衝液I。將懸液倒入預冷的離心管中，並置於冰上30分鐘。如果在30分鐘內細胞不裂解，則將試管置於37℃的水浴中4-6分鐘，增加裂解。一旦細胞開始裂解(由增加的粘度判斷)，則加入2-3毫升預冷的含50(g/ml抑蛋白酶肽以及抑胃酶肽和亮抑蛋白酶肽各2(g/ml的緩衝液I至終體積25毫升，於4℃在28000r.p.m.下離心混合物1小時，於70℃貯存上清液。
按Kowal和Marcus(生化製劑6369-385，1976)的描述和Lee和Cheng(生物化學雜誌2512600-2604，1976)的改進通過在連接到p-氨苯基胸苷3』-磷酸鹽上的CH瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)基質上的親和層析進行野生型和突變體TK的純化。除非有其它說明，所有用於純化TK的緩衝液均含有5mM DTT、50(g/ml抑蛋白酶肽、2(g/ml亮抑蛋白酶肽、2(g/ml抑胃酶肽、1mM PMSF。用緩衝液A平衡7毫升柱床體積的柱子(0.1M TrisHCl，pH7.5、10％甘油)，以8-10毫升/小時的速率裝人約25毫升未分級處理的上清液。柱子由兩次流過再循環，然後接著每次用柱床體積的緩衝液B(0.1M TrisHCl，pH7.5、0.5M KCl、10％甘油)和緩衝液A順序洗滌。用緩衝液A和緩衝液C(0.3M Tris-HCl，pH7.4、50mM KCl、10％甘油)各30毫升由胸苷(0-600(M)線性梯度洗脫TK。收集所有組份和峰值TK組份並對2升透析緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.4、5mM DTT、10％甘油)透析3次完成TK試驗。在最終透析中，從緩衝液省去蛋白酶抑制劑，等分透析組份並在-70℃貯存。在使用各提取物製劑前，按以上描述的相同的洗滌和洗脫方案充分洗滌柱子兩次。
用修改的Bio-Rad蛋白質試驗估測純化酶的蛋白質含量。用BSA和125ul終體積中25微升Bio-Rad試劑建立標準曲線。通過測定595nm的OD值並與BSA比較確定蛋白質的量。
胸苷攝入結果示於圖11中。簡言之，在具有pMDC的大腸桿菌中基本上無胸苷攝入。在具有TKF36的大腸桿菌中胸苷攝入量比具有野生型質粒的大腸桿菌中的高42％(培養10秒鐘後18 pmol/108細胞比12.7pmol/108細胞)。
通過測定胸苷摻合進酸不溶物質間接測定包含野生型和突變體質粒的大腸桿菌粗提物中TK活性物的量。
E.純化突變體胸苷激酶的動力學參數迄今研究的三種細胞參數表明，TKF36是比任何其它試驗的突變體酶或野生型都更有活性的酶。為了測定催化作用的動力學參數，用如以上描述的親和層析將野生型、TKF36和三種其它突變體胸苷激酶純化至接近均質。在SDS-PAGE系統中經電泳測定純化的野生型、TKF36和TKI208，發現單個突出的帶在43kDa遷移，銀染判斷其為95％均質。
基本上按以下的描述測定動力學參數。簡言之，TK試驗混合物(50微升)含有50mM tris-HCl(pH 7.5)、5mM ATP、4mM MgCl2、2.5mMDTT、12mM KCl、0.18mg/mlBSA、5％甘油、1(M胸苷(0.3(Ci[甲基-3H]胸苷)和指定量的純化酶。用各種未標記的胸苷濃度(0-4.0(M)和純化酶的已知數量(野生型、TKF36、TKI208、TKF99和TKF41分別為1.1、3.0、0.5、0.34和0.01單位)的變化測定胸苷磷酸化的動力學。酶的1單位定義為在以上描述的條件下1分鐘能磷酸化1.0pmol胸苷成胸苷酸的量。在34℃(1℃下培養10分鐘，加入1.0mM冷胸苷終止反應。將一半反應混合物移取到DEAE-纖維素盤(25毫米)上，浸入蒸餾水中(1分鐘)，接著用無水乙醇洗滌4次。用閃爍計數器計數吸附到盤上的產物。用ClelandSUBIN方案(Cleland，酶學方法63103-138，1979)測定動力學參數Km和Vmax值。用等式Vmax＝Kcat[E]o計算Kcat值，其中[E]o＝總酶濃度。
這些試驗的結果總結在表III中。TKF36中Ala*Ser取代引起Kcat增加4.8倍。與野生型TK比較，沒有被分析的其它純化突變體酶(TKF41、TKF99和TKI208)表現出Kcat的增加。Kcat降低2.2倍源於TKI208中的Leu170*Val取代，而兩種其它tk突變體(TKF99和TKF41)在體內試驗中具有降低的效率，表現出Kcat降低28-和34 700-倍降低。表III也列出了以胸苷為底物的突變體和野生型的Michaelis常數(Km)。野生型酶的表觀Km為0.47(M，與以前報導的值很吻合(Jamieson和Subak-Sharpe，遺傳病毒學雜誌24481-492，1974Elion，美國醫學雜誌737-13，1982；Waldman等人，生物化學雜誌25811571-11575，1983)。儘管TKF36表現出較高的Kcat值，但Km反映出的其對胸苷的親和力低於野生型TK6.2倍。TKI208、TKF41和TKF99具有與野生型類似的Km。有趣的是，TKF36的Kcat/Km值[2.0×106s-1 M-1]與野生型[2.5×106s-1M-1]並無很大不同，但TKI208、TKF99和TKF41分別表現出較低的值1.57×106s-1M-1、0.15×106s-1M-1和0.00012×106s-1M-1。
表III胸苷激酶的動力學參數比較酶 Km(μM)kcat(1/s)野生型 0.47±0.1a1.2TKF 36 2.90±0.01 5.7bTKF 41 0.28±0.16 3.5×10-5bTKF 99 0.29±0.0020.04bTKI 208 0.35±0.0080.5b
a.數據表示為±SE。
b.與野生型比較P值小於0.02。
實施例5選擇性殺滅用包含突變體SHV-1TK的逆轉錄病毒載體轉染的細胞這一實施例描述了逆轉錄病毒載體的構建，所述載體表達1型單純皰疹病毒胸苷激酶，155位的脯氨酸向丙氨酸突變，161位的苯丙氨酸向纈氨酸突變。
A.載體構建用P155A/F161V的胸苷激酶基因替換以Moloney鼠白血病病毒(＂MoMLV＂)為基礎的載體GlTkSvNa.90中的野生型HSV tk序列，所述載體得自基因治療有限公司(Gaithersburg，MD；參見，Ram等人，癌症研究 5383，1993)。
具體地說，突變體tk基因插入到5』長端重複序列的下遊，該tk基因用作啟動子。這一載體也包含從SV40早期啟動子表達的新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。
B.產生細胞系在磷酸鈣轉染後，以上描述的逆轉錄病毒載體可以用兼嗜性逆轉錄病毒包裝細胞系GP+envAm12(美國專利5287056)包裝。包含(-半乳糖苷酶基因的載體用作對照載體。克隆載體產生細胞保持在包含Dulbecco′s改進的Eagle′s培養基(具有10％胎牛血清、2mM穀氨醯胺、50單位/毫升青黴素、50微克/毫升鏈黴素和2.5微克/毫升Fungizone)的培養物中。使用前，除去培養基並用鹽水衝洗細胞。於37℃用胰蛋白酶消化細胞單層5-10分鐘，收集、洗滌兩次，並以10×108細胞/毫升再懸浮。
C.對ganciclovir的體外敏感性為了估測用包含突變體與野生型tk基因的載體轉導的細胞的敏感性，通過將細胞露置於包含複製非活性載體顆粒的上清液中體外轉導大鼠9L神經膠質瘤細胞和人U251成膠質瘤細胞。通過將G148(1毫克/毫升)包含在培養基中選擇轉導的細胞。然後估測未轉導的、HSVtk野生型轉導的和HSVtk突變體轉導的細胞對ganciclovir增加的敏感性。通過各種ganciclovir露置時間和ganciclovir水平後的含氚胸苷的摻合測定DNA合成水平。通過在不存在或存在各種濃度的ganciclovir的10毫米組織培養板上平板接種測定細胞生存力，每隔24小時計數細胞數量。
D.體內轉導用包含(-半乳糖苷酶的載體測定腫瘤細胞中原位轉導效率和載體基因表達的相對水平。簡言之，麻醉Fischer 344大鼠，用10微升與定向性注射裝置連接的Hamilton注射器注射4×104同系的9L成膠質瘤細胞。10天後，相同的定向位置用於將1.5×106、3×106、或6×106HSVtk(野生型或突變體)(-半乳糖苷酶轉導的或未轉導的產生細胞系和產生細胞系上清液直接注射進9L腫瘤。作為對照，用相同體積的無菌鹽水代替細胞注射大鼠。然後施用ganciclovir，宰殺大鼠，測定抗腫瘤作用。也進行組織學檢查。
E.ganciclovir的劑量優選用4×104HSVtk(野生型或突變體)或(-半乳糖苷酶轉導的大鼠9L產生細胞大腦內注射大鼠。接種7天後，以5、2.或15毫克/公斤每天兩次腹膜內施用ganciclovir7天。對照大鼠接受腹膜內鹽水注射。用ganciclovir處理後宰殺所有的大鼠，移去大腦和腫瘤，進行重量測定和組織學檢查。
F.野生型或突變體HSVtk轉導和GCV引起的腫瘤消退基於ganciclovir劑量優選的結果，對用轉導的或未轉導的產生細胞系和產生細胞系上清液接種的大鼠腫瘤施用ganciclovir劑量一段特定的時間期限。通過測定腫瘤重量和組織學檢查測定抗腫瘤作用。
實施例6VZV TK作為選擇性同源重組的靶的用途這一實施例描述了突變體水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶(＂VZV tk＂)在構建穩定轉染的細胞系、菌株或重組病毒中用作同源重組靶的用途。具體地說，描述了用於在TK(細胞中選擇重組病毒的作為含突變體VAV TK的克隆載體的痘苗病毒的構建。
A.包含VZV TK突變體的重組痘苗病毒載體質粒的構建將VZV tk基因(野生型和突變體)克隆進重組質粒的用於組成型基因表達的痘苗病毒7.5K啟動子後。此外，將新黴素磷酸轉移酶基因克隆到VZVtk基因3′末端後用作選擇性標記。痘苗病毒編碼胸苷激酶基因的5′或3′區側翼於VZV tk基因的5′末端和新黴素磷酸轉移酶基因的3′末端。這使得可將VZV tk基因插入到病毒基因組和伴隨滅活痘苗胸苷激酶基因。剩餘質粒基於pUC，包含青黴素抗性基因和ColE1複製源(用於保持大腸桿菌中的質粒)。
B.重組痘病毒的構建用野生型痘苗病毒將VZV tk(野生型和突變體)+neo重組質粒或僅含有neo基因的重組質粒轉染進BSC40細胞。由對G418的抗性選擇重組病毒。幾次噬斑純化後，將重組病毒進行噬斑雜交和DNA分析，以證實外源基因的插入和位置。
C.ganciclovir的劑量優選用各種劑量的ganciclovir處理感染和未感染BSC40細胞的痘苗病毒，以確定耐受水平。用表達VZV TK和neo的重組病毒和僅表達neo的重組病毒感染的細胞將在各種水平的ganciclovir存在時生長。包含VZV tk基因的病毒對ganciclovir處理比單獨的細胞或用野生型痘苗病毒感染的細胞更敏感。從這些試驗結果選擇對與其它待插入到VZV tk基因座的基因的同源重組來說對ganciclovir喪失敏感性的ganciclovir水平。
D.用ganciclovir選擇重組VZV tk痘病毒在攜帶引入到VV基因組(鄰近VV7.5K啟動子，克隆到VZV tk序列側翼)的基因的重組質粒存在下用VZV tk重組病毒感染BSC40，用ganciclovir選擇重組病毒。
任何用VZV tk基因穩定轉染的細胞系可以是經同源重組引入外源基因和通過ganciclovir抗性選擇這種組件的靶。
實施例7HSV-1胸苷激酶和HSV-1 DNA聚合酶載體的構建A.載體的構建構建含HSV-1 DNA聚合酶基因、HSV-1胸苷激酶或這兩者的構建體。
1)pHSG576HSVpol用兩個步驟將5.5kb pGEM2-702(David Dorsky，康奈爾大學)的HinDIII/EcoRI片段克隆到pHSG576(Sweasy和Loeb，生物化學雜誌2671407-1410)(1)將2.4kb PstI/EcoRI片段克隆到用PstI和EcoRI消化的pHSG576中，這一克隆指定為pHSG5761/2pol。
(2)將3.1kbHinDIII/PstI片段克隆進用HinDIII和PstI消化的pHSG5761/2pol中，這一克隆指定為pHSG576HSV DNApol。
2)pHSG576HSV-1TK將pET23dHSVTK(含有pET23d中HSV-1 TK NcoI-NcoI片段，Novagen)的XbaI/BamIII片段平端化，並克隆到pHSG576的SmaI位點，這一克隆指定為pHSG576HSV-1 TK。
3)pHSG576HSVpol/TK這一克隆包含HSV-1 DNA聚合酶和TK基因(用於從相同載體共表達)。從兩步克隆方案產生。
(1)將XbaI/BamHI平端TK片段克隆到pHSG5761/2pol(包含2.4kb PstI/EcoRI片段的平端EcoRI位點上。
(2)將3.1kb HinDIII/PstI片段(聚合酶基因的5′末端)克隆進用HinDIII和PstI消化的pHSG5761/2pol/TK中，這一克隆指定為pHSG576HSVpol/TK。
B.具有DNA聚合酶缺損的大腸桿菌的轉化用pHSG576HSV DNApol或pHSG576 DNA轉化大腸桿菌JS200(polA12recA718)，平板接種到含有四環素(12.5微克/毫升)和氯黴素(34微克/毫升)的營養瓊脂(NA)上。於30℃(許可的溫度)培養平板。單菌落在NB+tet+Cm上生長過夜。從這些培養物分離DNA，用於再轉化JS200。從第二次轉化中各挑出幾個菌落，用於接種存在或不存在IPTG的NB+tet+Cm。於30℃過夜生長後，將單個滿環各培養物在分散螺管(從平板中心增加稀度)中分散。於30℃(許可的溫度)或37℃(非許可的溫度)下培養NB板+tet+Cm+/-IPTG。
包含pHSG576HSV DNApol的細胞的生長模式在37℃顯示出單菌落(低細胞密度)生長，而僅包含載體的細胞在非許可溫度下不能以低密度生長。
這些結果說明皰疹DNA聚合酶能體內補充大腸桿菌PoII缺損。
實施例8用100％隨機文庫構建和分析包含159-161和168-170位密碼子突變的TK突變體這一實施例描述了在159-161和168-170位密碼子突變的TK突變體的構建和分析。
細菌菌株SY211(BL21(DE3)tdk-，pLysS)經在非選擇平板(無氯黴素)上重複通過由pLysS處理(SY211是從Wiooiam Summers，Yale University，New Haven，CT獲得的禮品，在Summers，W.C.and Raskin，P.，J.Bact.1756049-6051，1993中有描述)。形成的菌株BL21(DE3)tdk-用於胸苷激酶活性的遺傳互補試驗中。其它使用菌株實施例3已描述。
細胞BHK tk-(ts13)細胞(ATCC No.CRL-1632)從美國典型培養物保藏中心購得，於37℃在6％CO2下在DMEM+10％小牛血清中培養。
材料 如實施例3所述。
A.TK突變體的產生1.隨機插入體的構建用操縱子技術(Alameda，CA)合成兩種寡核苷酸MB126(58聚體)5』-TGGGAGCTCA CATGCCCCGCCCCCGGCCCT CACCNNNNNN NNNGACCGCC ATCCCATC-3』(SEQID No.24)和MB127(51聚體)5』-ATAAGGTACC GCGCGGCCGGGTAGCANNNN NNNNNGGCGA TGGGATGGCG G-3』(SEQ IDNo.25)。
N表示合成中所有四種核苷酸等摩爾混合。
基本上按實施例3的描述進行寡核苷酸的純化、退火、延伸和PCR擴增。
2.包含隨機序列的文庫的構建載體構建從Novagen購得的pET23d是構建pET23dHSVTK-沉默的骨架，pET23dHSVTK-沉默用來代替pMDC(實施例1和3中描述)插入隨機序列。簡言之，從pT7HSVTKII(實施例3)的限制消化產物純化出1.7kbNcoI/HinDIII片段，並克隆進用相同的酶消化的pET23d，以產生pET23dHSVTK。通過用pMDC的KpnI/SacI片段代替KpnI和SacI位點之間的tk序列構建沉默載體(實施例3)。
文庫構建用KpnI和SacI限制消化Qiagen柱純化的pET23dHSVTK-沉默DNA，用GenCleanII(Bio101，La Jolla，CA)分離載體凝膠以除去小插入片段。用T4 DNA連接酶於16℃過夜連接這一載體和凝膠分離的PCR-擴增隨機片段。
3.TK突變體的選擇如實施例3所述，經電穿孔將連接混合物用於轉化BL21(DE3)tdk-細胞。將轉化體直接平板接種到TK選擇平板(實施例3)上，同時將小部分平板接種到2×YT(每升16克胰化蛋白腖/10克酵母膏/5克氯化鈉/15克BactoAgar)+羧苄青黴素(在50微克/毫升(carb50))以測定轉化體的總數。在37℃下培養平板過夜，對在TK選擇平板上的生長評分，並測定轉化頻率。挑出在TK選擇平板上生長的菌落，再接種到新鮮的TK選擇平板和2×YT+carb50平板上。從1.1×10個轉化體中識別出約426個陽性克隆，或者所有轉化體的0.039％具有對BL21(DE3)tdk-的TK活性(圖14)。
B.突變體分析1.選擇的和未選擇的克隆的序列成功地測序了17個說明TK活性(選擇的)或取自2×YT+carb50平板(未選擇的)的克隆。用Qiagen小量製備試劑盒分離DNA，並按實施例3的描述進行雙鏈測序。圖15示出了各組序列，說明起始隨機寡核苷酸是隨機化的。在選擇的和未選擇的tk基因兩者中，觀察到隨機化區的遠側位點的第二突變的引入。然而，突變基本上限制在兩個密碼子，155和156。這些突變很可能由原始隨機寡核苷酸合成期間的沾汙引入。所有在密碼子155上的變化都是沉默的。在密碼子156上的變化引起丙氨酸向纈氨酸、色氨酸向脯氨酸改變。序列對比研究表明，156位對丙氨酸和該位置上的胺基酸類型都不是保守的。因此，這些第二突變對突變體酶活性產生任何真正的作用是不太可能的。所有選擇的突變體包含至少兩個胺基酸變化。
2.GCV和ACV敏感性的第二次篩選挑出426個突變體的每一個，用於接種200(l96孔微滴板中的TK選擇培養基(實施例3)上。所有426個克隆用48-prong replicator(Sigma，St.Louis，MO)以0.9％氯化鈉系列稀釋104。將30微升最後稀釋物散布到包含1微克/毫升胸苷以及各種濃度的ganciclovir或無環鳥苷的TK選擇平板上。起始使用2微克/毫升GCV，將不能生長的克隆記為陽性，具有增加的原藥向活性毒素轉化作用的突變體產生致死性。在2微克/毫升GCV上識別出197個克隆。在1微克/毫升和0.5微克/毫升GCV上的系列平板接種導致識別出47個突變體。在ACV平板(1微克/毫升)上的平板接種給出116個ACV敏感克隆。由於在使用的較低濃度的胸苷上不能生長，為保證所述克隆是真正的對核苷類似物敏感並不被簡單地評價，將47個GCV和116個ACV克隆平板接種到含有1微克/毫升胸苷(無核苷類似物)的TK選擇培養基上。幾乎一半克隆(總共26個GCV敏感突變體和54個ACV敏感突變體)不能在低胸苷上生長。結果示於圖16中。
C.體外分析1.體外轉錄和翻譯經Qiagen柱層析純化質粒DNA。除了轉錄前分離的質粒不線性化外，按實施例3進行80個選擇的突變體的轉錄和翻譯。重複試驗體外翻譯產物的胸苷、ganciclovir和無環鳥苷的磷酸化作用，並與pET23dHSVTK-mRNA翻譯產物試驗比較。
2.酶活性測定存在於試驗中的放射性標記的核苷胸苷、ganciclovir和無環鳥苷分別為1(M、7.5(M和7.5(M。從重複翻譯的TCA-可沉澱計數(用35S蛋氨酸)將活性水平調節到反映蛋白質合成水平。對80個突變體酶的大多數而言，胸苷、ganciclovir和無環鳥苷的水平低於野生型TK的1％。10個突變體酶顯示出大於10％的磷酸化(至少一種試驗的核苷酸)作用。幾個克隆在隨機區外側包含突變。兩個克隆(30和84)具有引起胺基酸變化(分別為A152V和A156S)的突變。四個克隆包含符合讀框的缺失3個(226、340和411)具有-3缺失，1個(197)具有-6缺失。所有突變均以編碼肽APPPA的富-GC區為中心。這一富含脯氨酸的肽很可能包含環部分頂點上的轉變處。如圖18所示，所有這些突變體均包含3-6個胺基酸改變，具有各自的體外測定的活性水平。
D.GCV和ACV在表達突變體胸苷激酶的哺乳動物細胞上的作用1.亞克隆進哺乳動物表達載體3個突變體選擇來估價在ganciclovir和無環鳥苷存在下的體內細胞毒性。將突變體克隆編號30、75和132和野生型胸苷激酶基因用NcoI限制性消化並克列諾平端化。將凝膠分離的片段(NcoI平端)連接到用NcoI限制性消化的pCMV上，並轉化進大腸桿菌菌株NM522中。相對於CMV啟動子為錯誤取向的野生型TK基因也用作對照。測序Qiagen純化的克隆證實取向、序列和5′連接區。各克隆指定為pCMV、pCMVTK-錯誤、pCMVTK、pCMV30、pCMV75和pCMV132。
2.轉染作為估價這些突變體的起始步驟，用Chen and Okayama的改進的方法(Molec.Cell.Biol.72745-2752，1987)經磷酸鈣沉澱法，在新黴素抗性標記質粒(pSV2neo)存在下將pCMV基因引入到TS13 BHK tk-細胞(幼倉鼠腎細胞)中。
簡言之，按如下所述進行細胞轉染。將約5×105ts 13BHK tk-細胞(ATCC CRL-1632)平板接種到有DMEM+10％小牛血清的100毫米盤中。對各轉染，將0.25M氯化鈣中的1微克pSV2neo和10微克pCMV構建體(pCMV、pCMVTK-錯誤(相對於啟動子HSVTK為錯誤取向)、pCMVHSVTK、pCMV30、pCMV75和pCMV132DNA)與0.5毫升2×BBS(參見Chen and Okayama)混合，於37℃在2.5％二氧化碳下預培養24小時。將氯化鈣/DNA混合物逐滴加入到板上，充分混合。於37℃在2.5％二氧化碳溼培養器中培養24小時後，用Dulbecco PBS-Ca/Mg衝洗兩次，加入新鮮的DMEM+10％小牛血清。於37℃在6％二氧化碳下培養平板。在轉染後72小時後，分開細胞1∶3，平板接種到包含600微克/毫升G418的DMEM+10％小牛血清中。
3.選擇和ED50測定於37℃在G418(600微克/毫升)上選擇細胞17天。在此期間，庫集平板(用於各DNA轉染)，並以1∶3比率分開3次。以這種方式對各包含正確取向的tk基因的轉染DNA選擇約30-40個克隆。pCMV、pCMVTK-錯誤轉染各產生130-140個克隆。收穫G418抗性克隆，庫集並以2000細胞/孔的密度平板接種到96孔微滴板中的100微升DMEM+10％小牛血清和200微克/毫升G418+6％二氧化碳中。將各種濃度的ganciclovir(0.125、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10和20(M)或無環鳥苷(0.5、1、2.5、5、10、25、50、75和100(M)加入到各平板上，對各轉染體群各種濃度8次重複(無核苷類似物的對照各16次重複)。在核苷類似物存在3天後，加入Alamar Blue，6小時後，按製造者的方案(Alamar Biosciences，Inc.，Sacramento，CA)用螢光計掃描平板。將平板進一步於37℃溫育24小時，再次掃描。
在Alamar Blue存在下培養細胞的螢光水平的測定與細胞生存力直接相關。扣除基底螢光可以繪製細胞成活對核苷類似物濃度的曲線，以確定殺滅50％細胞的有效濃度(ED50)。用第二次掃描的數據繪製成成活曲線，示於圖19(GCV)和20(ACV)中。
在核苷類似物上4天後，對GCV和ACV，殺滅50％細胞的有效濃度從圖19和20確定(參見表IV).
表IVED50ED50GCV 超過WT倍數ACV 超過WT倍數WT 20μM 1 25μM 130 5μM4 18μM 1.475 0.4μM 50 1.25μM 20132 20μM 1 25μM 14.酶試驗和免疫帶試驗2.4×106個庫集轉染體細胞抽提物的胸苷、ganciclovir和無環鳥苷活性。磷酸化水平與體外(兔網質紅細胞裂解物翻譯產物)測定的活性和蛋白質印跡分析測定的蛋白質表達量非常一致。相應於pCMV、pCMVTK-錯誤(TK基因為錯誤取向)的道未見免疫反應性帶。野生型TK(pCMVHSVTK)和pCMV132兩者轉染的細胞裂解物表現出基本上相等的帶強度。pCMV30細胞裂解物的免疫反應性帶實際上更強(5-10倍)，pCMV75的帶約為等量細胞數的pCMVHSVTK帶強度的一半。
5.在成膠質細胞瘤中試驗突變體將從pCMVHSVTK、pCMV30和pCMV75分離的平端NcoI片段克隆進pLXSN(Miller and Rosman BioTechmiques 7980，1989)的HpaI位點。用Qiagen層析進行質粒純化，測序分離的DNA，證實取向和5′連接區。除了pSV2-neo不共轉染外(因為新黴素磷酸轉移酶基因由pLXSN編碼)，按以上的描述製備鼠C6成膠質細胞瘤(ATCC CCL-107)和人成膠質細胞瘤細胞系(SF767)。基本上按以上的描述選擇和分析。
E.突變體胸苷激酶的動力學分析1.突變體和野生型酶的過度表達將在BL21(DE3)tk-細胞中的pET23dHSVTK、pET23d30、pET23d75和pET23d132的單菌落用於接種5毫升含有20微克/毫升羧苄青黴素的M9ZB培養基(1％胰化蛋白腖、0.5％氯化鈉、1×M9鹽、1mM硫酸鎂、100(M氯化鈣和0.2％葡萄糖)。在37℃培養過夜。第二天，將5毫升培養物用於接種1升M9ZB+20微克/毫升羧苄青黴素，將培養物在37℃生長至OD600 0.1。加入IPTG 0.4mM時，再培養培養物3小時。在冰上預冷細胞，離心沉澱，在於-70℃冷幹沉澱前，在細胞洗滌緩衝液(50mM Tris，pH7.5、5mM EDTA、10％蔗糖)中洗滌沉澱1次。次日，將細胞懸浮在12毫升緩衝液1(50mM Tris，pH7.5、10％蔗糖、2mMDTT、5mMEDTA、1mM PMSF)中，將該體積分到兩個13毫升的Oakridge超離心管中。將1毫升含有3毫克溶菌酶的緩衝液1加到各管中，把管置於冰上1小時。再加入另外的緩衝液1+蛋白酶抑制劑，於4℃在Sorvall T-1250離心機中以35 krpm離心試管。然後等分澄清的上清液，於-70℃冷凍。
2.親和純化胸苷-瓊脂糖凝膠柱用於一步純化方法中(實施例2)。由在柱子中通過10毫升緩衝液1，接著通過10毫升吸收緩衝液(50mM Tris，pH7.5、10％蔗糖、2mM DTT、25mM醋酸鎂、10mM ATP)製備1毫升柱床體積的柱子。將2毫升澄清的裂解物與2毫升吸收緩衝液混合併通過0.2微米濾器。使這一混合物通過所述柱3次。用5毫升吸收緩衝液洗滌柱子3次，收集5毫升組份。為洗脫酶，使3毫升胸苷緩衝液(300mM Tris，pH7.5、10％蔗糖、2mM DTT、50mM氯化鉀、600(M胸苷))通過柱子，收集各1毫升組份。經裝人10毫升高鹽緩衝液(50mM Tris，pH7.5、10％蔗糖、2mM DTT、0.5M氯化鉀)和10毫升50mM Tris，pH7.5再活化柱子。柱子貯存在50mM Tris，pH7.5+0.004％疊氮化鈉中。經考馬斯染色的SDSPAGE分析監測純化的程度，用BioRad試劑(Bradford試劑)測定純化蛋白質的濃度。於4℃使包含TK蛋白質的組份對幾升50mM Tris，pH7.5、10％蔗糖、2mM DTT透析以除去胸苷。
3.酶動力學以上描述的酶試驗用於測定純化的TK酶對底物胸苷、ganciclovir和無環鳥苷的Km、Vmax和Kcat。
實施例9人和小鼠鳥苷酸激酶的分離以及HSV-1胸苷激酶和鳥苷酸激酶雙表達載體的構建這一實施例描述了人和小鼠鳥苷酸激酶的分離以及雙表達皰疹胸苷激酶和鳥苷酸激酶的載體構建。
A.人鳥苷酸激酶基因的分離1.人鳥苷酸激酶基因的分離兩種寡核苷酸設計來擴增完整的人鳥苷酸激酶開放讀框。下列兩種寡核苷酸由GenSet(La Jolla，CA)合成5』-ACTACTGGAT〔CCATGG〕CGGGCCCCAGGCCTGTG-3』，33聚體(SEQ ID NO.26)和5』-TACTACGGATCCTCAGGCGGCGGTCCTTTGAGC-3』，33聚體(SEQID NO.27)在各末端的BamHI位點是下劃線的，在起始蛋氨酸密碼子上的NcoI位點在括號中表示。粗體核苷酸表示原始序列(GenBank登記號A11042)的改變。從用(-CD3刺激的人增殖的B淋巴細胞cDNA文庫擴增人鳥苷酸激酶基因。用BamHI限制性消化所形成的單個帶(約600bp)，並克隆進pUC118(BamHI)以產生pUC118Hugmk。用下組寡核苷酸完整測序(雙鏈)插入物5』-CTGCTGAAGAGGCTGCTC-3』(18聚體)(DMO 512)(SEQ ID.NO.28)，5』-ACACAGATGCGGTTTCATG-3』(19聚體)(DMO 513)(SEQ ID.NO.29)，5』-CTGGACGTGGACCTGCAG-3』(18聚體)(DMO 514)(SEQ ID.NO.30)，5』-GTTAATGATGACCACATC-3』(18聚體)(DMO 515)(SEQ ID.NO.31)，5』-TGTAAAACGACGGCCAGT-3』(18聚體)(從ABI購得的M13正向引物)(SEQ ID.NO.32)和5』-CAGGAAACAGCTATGACC-3』(18聚體)(從ABI購得的反向引物)(SEQ ID.NO.33)。序列分析揭示出除了在NcoI位點的超前改變(anticipated alteration)(引起絲氨酸向丙氨酸變化)(S2A)外，與GenBank序列相同(圖21)。
2.RNA印跡在1×MOPS緩衝液/75％甲醯胺中製備SP2/0鼠B淋巴瘤細胞的8微克總RNA，在55℃下變性10分鐘，加到1×MOPS緩衝液中的1.2％瓊脂糖凝膠上。轉移到硝基纖維素濾膜上後，用人gmk基因探測。
從pUC118Hugmk凝膠分離600bpBamHI片段，並按照製造者的說明用隨機引物標記試劑盒(得自Amersham)標記。經大小排阻色譜除去游離的放射性標記。雜交和洗滌後將印跡於-70℃露置於X-光膠片下兩天。RNA印跡的放射自顯影揭示出單個約750ntRNA物種。在使用poly A+得自增殖的B淋巴細胞的人RNA的類似試驗中，也觀察到單個約750nt的帶。
B.小鼠鳥苷酸激酶基因的分離1.篩選小鼠cDNA文庫用人基因探測(與用於RNA印跡分析相同的探針)小鼠702/3細胞(B淋巴瘤)的(gt10 cDNA文庫。篩選的噬斑的總數量為2×10pfu。9個獨立的(克隆雜交到人探針上，被噬斑純化。
2.陽性克隆的亞克隆和序列分析凝膠分離8種噬菌體DNA製劑的EcoRI片段，亞克隆進用EcoRI限制性消化和脫磷酸化的pUC118中。DNA插入物的大小範圍從約300bp-1.2kb。採用引物(M13正向引物)的基本序列分析揭示出所有克隆從約60bp5′開始到推定的ATG起始密碼子(由人和牛鳥苷酸激酶序列序列對比測定)，在其各自的3′末端變化。用下列寡核苷酸完全地測序了一個有代表性的克隆(雙鏈)5』-TGTGTCCCATACTACTACAAG-3』(21聚體)(DMO 592)(SEQID.NO.34)，5』-TGAGAACTCAGCAGCATGCTC-3』(21聚體)(DMO594)(SEQ ID.NO.35)，5』GTGCTAGATGTCGACCTA-3』(18聚體)(DMO595)(SEQ ID.NO.36)，5』-ACCTGGATAAAGCCTATG-3』(18聚體)(DMO674)(SEQ ID.NO.37)，5』-AAGCAGGCGCTCTCTCTGA-3』(19聚體)(DMO 675)(SEQ ID.NO.38)，5』-CTATTTCTCATATGATGT-3』(18聚體)(DMO 731)(SEQ ID.NO.39)和5』-GTTACAGTGTGTCTCTAGAG-3』(18聚體)(DMO 732)(SEQ ID.NO.40)，5』-TCCCCCACCTCCAGGC-3』(16聚體)(DMO 748)(SEQ ID.NO.52)，5』-CTCAGTGTTGCCCAGTCG-3』(18聚體)(DMO 749)(SEQ ID.NO.53)和5』-GCCGAAGATGCTGCTGTG-3』(18聚體)(DMO 750)(SEQ ID.NO.54)。
最終的鼠鳥苷酸激酶序列以及推導的胺基酸序列示於圖22中。
2.新限制位點的引入按Black，M.E.and Hruby，D.E.(J.Biol.Chem.26517584-17592，1990)中的描述將新NcoI位點在小鼠鳥苷酸激酶開放讀框的起始密碼子處引入。使用的誘變寡核苷酸是5′-CTAGGTCCTG[CCATGG]CGTCCGCG-3′(24聚體)(DMO)(SEQ.ID.NO.41)，NcoI位點表示在括號中，粗體核苷酸表示C到G變化。測序所形成的克隆(pUC118Mugmk-NcoI)證實取向和5′連接區。
C.供體外轉錄和翻譯分析的載體的構建將人和鼠胸苷激酶基因亞克隆進pET23d(參見實施例8)。凝膠分離pUC118Mugmk的600bp NcoI/BamHI片段，直接亞克隆進用NcoI和BamHI消化的pET23d(參見實施例8)中。凝膠分離為約800bpNcoI/BamHI片段的鼠鳥苷酸激酶基因(用ATG上引入的NcoI位點和pUC118 3′多接頭區的BamHI位點)，克隆進用NcoI和BamHI消化的pET23d(參見實施例8)中。所形成的質粒pUC118Hgmk和pUC118Mgmk用作體外轉錄的模板，產生的mRNA用於實施例3和8中描述的兔網質紅細胞裂解物無細胞翻譯系統。用從Sigma購得的牛鳥苷酸激酶作為陽性對照，按Agarwal etal.(Methods in Enzymol.51483-490，1978)所述進行證實全長蛋白質產生和活性的酶試驗。
D.人和小鼠鳥苷酸激酶的純化和特徵確定
1.表達載體構建pET23d載體(Novagen，Madison，WI)用作構建pETHT的載體骨架。這一載體包含6個組氨酸殘基肽，接著凝血酶切割位點，允許表達可除去的組氨酸標記融合進靶基因產物的N末端。通過pET23d啟動子區的PCR擴增進行6個組氨酸-凝血酶融合編碼區的合成，用下列引物在3個順序PCR擴增步驟中延伸。5』-ACTACTACTA GATCTCGATC CCGCGAA-3』(27聚體)(DMO604)(SEQ ID.NO.42)，5』-ATGATGATGATGATGGCTGC TAGCCATAGTATATCTCCTT C-3』(41聚體)(DMO605)(SEQ ID.NO.43)，5』-CGGCACCAGG CCGCTGCTGT GATGATGATG ATGATGGCT-3』(39聚體)(DMO 606)(SEQ ID.NO.44)，5-AGTAGTAT〔CC ATGG〕AGCTGCCGCGCGGCAC CAGGCCGCTGCT-3』(42聚體)(DMO 607)(SEQ ID.NO.45)。在所有PCR擴增步驟中，將序列DMO 604退火到pET23d的BglII區。序列DMO 605以3′到5′取向退火到相應於NcoI位點的區，引起NcoI位點的喪失(由於以上序列中粗體所示的核苷酸突變)。用序列DMO 606或DMO 607以3′到5′取向的後續擴增與序列DMO 604配對，以延伸序列(附加6個組氨酸密碼子和凝血酶切割位點)。也用序列DMO607引入新的NcoI位點(如以上括號中所示)。將最終的BgIII/NcoI片段在相應的位點克隆進pET23d，以產生pETHT。測序pETHT證實正確的合成和插入。新載體融合肽的胺基酸序列是MAS S H H H H H H S S G L V P R G S S M(NcoI位點)(SEQ.ID.NO.46)，凝血酶切割識別位點有下劃線。凝血酶的切割在精氨酸和甘氨酸殘基之間。
2.在大腸桿菌中的過度表達和親和純化過度表達和分析的方法如實施例8。
按製造者的說明進行採用His-Bind Resin(Novagen，Madison WI)的親和純化。凝血酶用於切割掉末端17個胺基酸，留下胸苷激酶起始蛋氨酸的3個胺基酸N-末端。通過將切割混合物過His-Bind柱第二次除去引導肽。
3.酶動力學用純化的人和小鼠鳥苷酸激酶測定鳥苷酸、GCV-單磷酸鹽和無環鳥苷單磷酸鹽的Km、Vmax和Kcat值。除了採用Agarwal et al.(Methods inEnzymol.51483-490，1978)中描述的試驗方案外，通過薄層層析和閃爍計數分析從用放射性核苷酸底物完成的試驗產生的核苷酸產物。
E.體內雙表達載體的構建和分析將HSV-1 tk基因作為NcoI(平端)片段克隆進pLXSN(Miller andRosman，Biotechniques，7980-990，1989)的HpaI位點，用限制酶切作圖確定取向。這將HSV-1 tk基因置於到MoMLV LTR啟動子之後。新黴素磷酸轉移酶基因被鳥苷酸激酶基因(人和小鼠)(作為BamHI(平端)片段)取代，以使鳥苷酸激酶基因的表達不由SV40啟動子驅動。此外，構建其中tk和gmk基因順序顛倒的載體，以使tk基因從SV啟動子表達，gmk基因從LTR啟動子表達。也構建具有單個具有基因(tk或gmk)的載體構建體。也構建包含HSV-1tk突變體(替代野生型HSV-1tk基因)的表達載體。
如實施例8，將以上描述的構建體的質粒DNA用於在標記質粒(pSV2-neo)存在下，轉染ts13 BHK tk-細胞、SF767人成膠質細胞瘤細胞、鼠C6成膠質細胞瘤細胞，以便能夠在G418上選擇轉染體。
穩定轉染體的選擇和對ACV和GCV增加的敏感性試驗如實施例8所述。
從以上的描述可見，儘管本文為說明目的描述了本發明的特定實施方案，但在不背離本發明的精神和範圍的前提下可作各種修改。因此，除了所附的權利要求外，本發明不受其它限制。
序列表(1)一般信息(i)申請人Loeb，Lawrence A.
Black，Margaret(ii)發明名稱胸苷激酶突變體(iii)序列數54(iv)通訊地址(A)聯繫人Seed and Berry(B)街6300 Columbia Center，701 Fifth Avenue(C)城市Seattle(D)州Washington(E)國家US(F)郵區碼98104-7092(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前的申請資料(A)申請號(B)申請日1995年5月2日(C)分類號(viii)律師/代理人信息(A)姓名McMasters，David D.(B)登記號33，963(C)證書號240052.409C1(ix)電訊信息(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(C)電傳3723836(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度1131個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGCTTCGT ACCCCGGCCA TCAACACGCG TCTGCGTTCG ACCAGGCTGC GCGTTCTCGC60GGCCATAGCA ACCGACGTAC GGCGTTGCGC CCTCGCCGGC AGCAAGAAGC CACGGAAGTC120CGCCTGGAGC AGAAAATGCC CACGCTACTG CGGGTTTATA TAGACGGTCC TCACGGGATG180GGGAAAACCA CCACCACGCA ACTGCTGGTG GCCCTGGGTT CGCGCGACGA TATCGTCTAC240GTACCCGAGC CGATGACTTA CTGGCAGGTG CTGGGGGCTT CCGAGACAAT CGCGAACATC300TACACCACAC AACACCGCCT CGACCAGGGT GAGATATCGG CCGGGGACGC GGCGGTGGTA360ATGACAAGCG CCCAGATAAC AATGGGCATG CCTTATGCCG TGACCGACGC CGTTCTGGCT420CCTCATATCG GGGGGGAGGC TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC480TTCGACCGCC ATCCCATCGC CGCCCTCCTG TGCTACCCGG CCGCGCGGTA CCTTATGGGC540AGCATGACCC CCCAGGCCGT GCTGGCGTTC GTGGCCCTCA TCCCGCCGAC CTTGCCCGGC600ACCAACATCG TGCTTGGGGC CCTTCCGGAG GACAGACACA TCGACCGCCT GGCCAAACGC660CAGCGCCCCG GCGAGCGGCT GGACCTGGCT ATGCTGGCTG CGATTCGCCG CGTTTACGGG720CTACTTGCCA ATACGGTGCG GTATCTGCAG TGCGGCGGGT CGTGGCGGGA GGACTGGGGA780CAGCTTTCGG GGACGGCCGT GCCGCCCCAG GGTGCCGAGC CCCAGAGCAA CGCGGGCCCA840CGACCCCATA TCGGGGACAC GTTATTTACC CTGTTTCGGG CCCCCGAGTT GCTGGCCCCC900AACGGCGACC TGTATAACGT GTTTGCCTGG GCCTTGGACG TCTTGGCCAA ACGCCTCCGT960TCCATGCACG TCTTTATCCT GGATTACGAC CAATCGCCCG CCGGCTGCCG GGACGCCCTG1020CTGCAACTTA CCTCCGGGAT GGTCCAGACC CACGTCACCA CCCCCGGCTC CATACCGACG1080ATATGCGACC TGGCGCGCAC GTTTGCCCGG GAGATGGGGG AGGCTAACTG A 1131(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度52個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO2TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC TTCGATCGCC AT 52(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特徵(A)長度56個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO3ATGAGGTACC GNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNATGGCG ATCGAA 56(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO4CCCCTCCAGC GCGGTAC 17(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO5CGCGCTCGAG GGGAGCT 17(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO6TGGGAGCTCA CATGCCCCGC C 21(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特徵(A)長度11個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO7ATGAGGTACC G 11(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特徵(A)長度52個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO8TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC TTCGATCGCC AT 52(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特徵(A)長度70個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞misc特徵(B)位置23..25(D)其它信息/注＝「80％野生型核苷酸，20％其它三種核苷酸」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞misc特徵(B)位置41..55(D)其它信息/注＝「80％野生型核苷酸，20％其它三種核苷酸」(Xi)序列描述SEQ ID NO9TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC TTCGACCGCC ATCCCATCGC 60CGCCCTCCTG 70(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特徵(A)長度38個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO10ATGAGGTACC GCGCAGCTGG GTAGCACAGG AGGGCGGC 38(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO11CATGCCTTAT GCCGTGA 17(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..33(Xi)序列描述SEQ ID NO12CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG33Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO13Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵CDS(B)位置join(1..3)(Xi)序列描述SEQ ID NO14CCC ATC GCC TCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG33Pro Ile Ala Ser Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO15Pro Ile Ala Ser Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..3(Xi)序列描述SEQ ID NO16TCC ATC GGC GCC CTA CAG TGC TAC CCG GTC GCG33Ser Ile Gly Ala Leu Gln Cys Tyr Pro Val Ala1 5 10(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO17Ser Ile Gly Ala Leu Gln Cys Tyr Pro Val Ala1 5 10(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..33(Xi)序列描述SEQ ID NO18CCC ATC GCC ACC CTG CTG TGC TAC CCG GCC GCG33Pro Ile Ala Thr Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO19Pro Ile Ala Thr Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..33(Xi)序列描述SEQ ID NO20CCC ATC GCC GCC TTA CTG TTA TAC CCG ACC GCG33Pro Ile Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO21Pro Ile Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..33(Xi)序列描述SEQ ID NO22CCC ATC GCC GCC CTC GTG TGC TAC CCG GCC GCG33Pro Ile Ala Ala Leu Val Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO23Pro Ile Ala Ala Leu Val Cys Tyr Pro Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特徵(A)長度58個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO24TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCNNNNNN NNNGACCGCC ATCCCATC58(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特徵(A)長度51個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO25ATAAGGTACC GCGCGGCCGG GTAGCANNNN NNNNNGGCGA TGGGATGGCG G 51(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO26ACTACTGGAT CCATGGCGGG CCCCAGGCCT GTG 33(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO27TACTACGGAT CCTCAGGCGG CGGTCCTTTG AGC 33(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO28CTGCTGAAGA GGCTGCTC 18(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO29ACACAGATGC GGTTTCATG 19(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO30CTGGACGTGG ACCTGCAG 18(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID 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NO41CTAGGTCCTG CCATGGCGTC CGCG 24(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO42ACTACTACTA GATCTCGATC CCGCGAA 27(2)SEQ ID NO43信息(i)序列特徵(A)長度41個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO43ATGATGATGA TGATGGCTGC TAGCCATAGT ATATCTCCTT C 41(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO44CGGCACCAGG CCGCTGCTGT GATGATGATG ATGATGGCT 39(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO45AGTAGTATCC ATGGAGCTGC CGCGCGGCAC CAGGCCGCTG CT 42(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特徵(A)長度21胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO46Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser Ser Met20(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特徵(A)長度19個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO47Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Als Ala Leu Leu Cys1 5 10 15Tyr Pro Ile(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特徵(A)長度606個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置7..600(Xi)序列描述SEQ ID NO48GGATCC ATG GCG GGC CCC AGG CCT GTG GTG CTG AGC GGG CCT 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Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser115 120 125CTG CAC GTG CTG GAG CAG CGG CTG CGG CAG CGC AAC ACT GAA ACC GAG 432Leu His Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu130 135 140GAG AGC CTG GTG AAG CGG CTG GCT GCT GCC CAG GCC GAC ATG GAG AGC 480Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser145 150 155AGC AAG GAG CCC GGC CTG TTT GAT GTG GTC ATC ATT AAC GAC AGC CTG 528Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu160 165 170GAC CAG GCC TAC GCA GAG CTG AAG GAG GCG CTC TCT GAG GAA ATC AAG 576Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys175 180 185 190AAA GCT CAA AGG ACC GGC GCC TGA GGATCC606Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala *195(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特徵(A)長度198個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO49Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly1 5 10 15Lys Ser Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Ala His Ser Gly Ile Phe20 25 30Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu35 40 45Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp50 55 60Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu65 70 75 80Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg85 90 95Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala100 105 110Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His115 120 125Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser130 135 140Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys145 150 155 160Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln165 170 175Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala180 185 190Gln Arg Thr Gly Ala *195(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特徵(A)長度660個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置25..621(Xi)序列描述SEQ ID NO50CTGGGTCGGG TCCCCGCGGA CGGC ATG GCA GGA CCT AGG CCA GTA GTG CTG 51Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu1 5AGC GGG CCG TCA GGG GCA GGG AAG AGC ACT CTG CTC AAG AAG CTG TTC 99Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Lys Leu Phe10 15 20 25CAG GAG CAC AGC AGC ATC TTC GGC TTC AGT GTG TCC CAT ACT ACA AGG147Gln Glu His Ser Ser Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg30 35 40AAC CCA CGA CCT GGT GAA GAA GAT GGC AAA GAT TAC TAC TTT GTG ACC195Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asp Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr45 50 55AGG GAG ATG ATG CAG CGT GAT ATT GCA GCA GGG GAC TTC ATT GAG CAT243Arg Glu Met Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His60 65 70GCT GAG TTC TCA GGG AAC CTG TAC GGG ACA AGC AAG GAA GCT GTT CGG291Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Ala Val Arg75 80 85GCT GTG CAG GCC ATG AAC CGC ATC TGC GTG CTA GAT GTC GAC CTA CAA339Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln90 95 100 105GGT GTG CGC AGC ATC AAG AAG ACT GAT CTG TGT CCC ATC TAC ATC TTT387Gly Val Arg Ser Ile Lys Lys Thr Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Ile Phe110 115 120GTG CAG CCT CCC TCG CTG GAC GTG CTG GAG CAA CGA CTG CGA CTG CGC435Val Gln Pro Pro Ser Leu Asp Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Leu Arg125 130 135AAC ACT GAG ACT GAG GAG AGT CTG GCA AAG CGG CTG GCA GCT GCA CGG483Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Ala Lys Arg Leu Ala Ala Ala Arg140 145 150ACA GAC ATG GAG AGC AGC AAG GAG CCT GGC TTG TTT GAC CTG GTG ATC531Thr Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Leu Val Ile155 160 165ATC AAT GAC GAC CTG GAT AAA GCC TAT GCA ACC CTG AAG CAG GCG CTC579Ile Asn Asp Asp Leu Asp Lys Ala Tyr Ala Thr Leu Lys Gln Ala Leu170 175 180 185TCT GAG GAA ATC AAG AAA GCA CAG GGA ACT GGC CAC GCC TGA621Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Gly Thr Gly His Ala *190 195AGGCCTGCTT CATTCCACAG AGTGATGTCT GTGGTCTAA 660(2)SEQ ID NO51信息(i)序列特徵(A)長度199個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO51Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly1 5 10 15Lys Ser Thr Leu Leu Lys Lys Leu Phe Gln Glu His Ser Ser Ile Phe20 25 30Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu35 40 45Asp Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Met Met Gln Arg Asp50 55 60Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu65 70 75 80Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Ala Val Arg Ala Val Gln Ala Met Asn Arg85 90 95Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Ala Val Arg Ser Ile Lys Lys100 105 110Thr Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Ile Phe Val Gln Pro Pro Ser Leu Asp115 120 125Val Leu Glu Gln Pro Leu Arg Leu Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser130 135 140Leu Ala Lys Arg Leu Pro Ala Ala Arg Thr Asp Met Glu Ser Ser Lys145 150 155 160Glu Pro Gly Leu Phe Asp Leu Val Ile Ile Asn Asp Asp Leu Asp Lys165 170 175Ala Tyr Ala Thr Leu Lys Gln Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala180 185 190Gln Gly Thr Gly His Ala *195(2)SEQ ID NO52信息(i)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO52TCCCCCACCT CCAGGC16(2)SEQ ID NO53信息(i)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO53CTCAGTGTTG CGCAGTCG 18(2)SEQ ID NO54信息(i)序列特徵(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(Xi)序列描述SEQ ID NO54GCCGAAGATG CTGCTGTC 18
權利要求
1.一種編碼包含一個或多個突變的Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，至少一個所說的突變是一個DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。
2.按照權利要求1的編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，其中蛋氨酸或酪氨酸取代所說DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸。
3.按照權利要求1的編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，進一步包含纈氨酸取代所說DRH核苷結合位點下遊的4位胺基酸。
4.按照權利要求1的編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，進一步包含半胱氨酸取代所說DRH核苷結合位點下遊的6位胺基酸。
5.一種編碼包含一個或多個突變的Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，至少一個所說的突變是半胱氨酸取代一個DRH核苷結合位點下遊的6位胺基酸，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。
6.一種編碼包含至少四個突變的Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)，所說突變包括一個DRH核苷結合位點上遊的2位胺基酸突變成亮氨酸、所說DRH核苷結合位點上遊的1位胺基酸突變成亮氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的4位胺基酸突變成纈氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸突變成蛋氨酸。
7.一種編碼包含至少四個突變的Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)，所說突變包括一個DRH核苷結合位點上遊的1位胺基酸突變成亮氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的4位胺基酸突變成纈氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸突變成酪氨酸。所說DRH核苷結合位點下遊的6位胺基酸突變成半胱氨酸。
8.按照權利要求1-7之任一編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，其中所說的胸苷激酶選自單純皰疹病毒1型胸苷激酶和單純皰疹病毒2型胸苷激酶。
9.按照權利要求1-7之任一編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，其中所說的酶是截短的或者包含符合讀框的缺失。
10.按照權利要求1-7之任一編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，其中所說的胸苷激酶能夠磷酸化核苷類似物，其磷酸化核苷類似物的能力至少超過野生型胸苷激酶的一倍。
11.按照權利要求10的分離的核酸分子，其中所說的核苷類似物選自下列物質ganciclovir、無環鳥苷、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
12.按照權利要求1-7之任一編碼一種胸苷激酶的分離的核酸分子，其中所說的胸苷激酶能夠磷酸化核苷類似物，並且其中Z>[(TKmNAp)/(TKmTp)(TKwtNAp)/(TKwtTp)]]]>式中TKmNAp是胸苷激酶突變體引起的核苷類似物磷酸化率，TKmTp是胸苷激酶突變體引起的胸苷激酶磷酸化率，TKwtNAp是未突變的胸苷激酶引起的核苷類似物磷酸化率，TKwtTp是未突變的胸苷激酶引起的胸苷激酶磷酸化率，Z選自1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。
13.按照權利要求12的分離的核酸分子，其中所說的核苷類似物選自下列物質ganciclovir、無環鳥苷、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
14.一種表達載體，該載體包含可操作連接到權利要求1-13之任一核酸分子上的啟動子。
15.按照權利要求14的表達載體，其中所說的啟動子選自MoMLVLTR，巨細胞病毒立即早期啟動子和巨細胞病毒立即晚期啟動子。
16.按照權利要求15的表達載體，其中所說的啟動子是組織特異性啟動子。
17.按照權利要求16的表達載體，其中所說的組織特異性啟動子選自酪氨酸羥化酶啟動子、脂肪細胞P2啟動子、PEPCK啟動子、甲胎蛋白啟動子、乳清酸性啟動子和酪蛋白啟動子。
18.按照權利要求14的表達載體，該載體還包括可操作連接到編碼鳥苷酸激酶或DNA聚合酶的核酸分子上的啟動子。
19.一種能夠指導編碼一種胸苷激酶的核酸分子表達的病毒載體，所說核酸分子包含一個或多個突變，其中至少一個所說的突變編碼胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。
20.按照權利要求19的病毒載體，其中所說的載體選自單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體和逆轉錄病毒載體。
21.按照權利要求19的病毒載體，其中所說的載體包含一種啟動子，該啟動子選自MoMLV LTR，巨細胞病毒立即早期啟動子和巨細胞病毒立即晚期啟動子。
22.按照權利要求21的病毒載體，其中所說的啟動子是組織特異性啟動子，該啟動子選自酪氨酸羥化酶啟動子、脂肪細胞P2啟動子、PEPCK啟動子、甲胎蛋白啟動子、乳清酸性啟動子和酪蛋白啟動子。
23.攜帶權利要求14-22之任一載體的宿主細胞。
24.按照權利要求23的宿主細胞，其中所說的細胞選自人細胞、狗細胞、猴子細胞、大鼠細胞和小鼠細胞。
25.一種分離的胸苷激酶，該胸苷激酶包含一個或多個突變，至少一個所說突變是一個DRH核苷結合位點下遊的胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。
26.按照權利要求25的分離的胸苷激酶，其中蛋氨酸或酪氨酸取代所說DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸。
27.按照權利要求25的分離的胸苷激酶，該胸苷激酶還包含纈氨酸取代所說DRH核苷結合位點下遊的4位胺基酸。
28.按照權利要求25的分離的胸苷激酶，該胸苷激酶還包含半胱氨酸取代所說DRH核苷結合位點下遊的6位胺基酸。
29.一種分離的Herpesviridae胸苷激酶，該胸苷激酶包含一個或多個突變，至少一個所說的突變是半胱氨酸取代一個DRH核苷結合位點下遊的6位胺基酸，這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。
30.一種分離的Herpesviridae胸苷激酶，該胸苷激酶包含至少四個突變，這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)，所說突變包括一個DRH核苷結合位點上遊的2位胺基酸突變成亮氨酸、所說DRH核苷結合位點上遊的1位胺基酸突變成亮氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的4位胺基酸突變成纈氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸突變成蛋氨酸。
31.一種分離的Herpesviridae胸苷激酶，該胸苷激酶包含至少四個突變，這種突變增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)，所說突變包括一個DRH核苷結合位點上遊的1位胺基酸突變成亮氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的4位胺基酸突變成纈氨酸、所說DRH核苷結合位點下遊的5位胺基酸突變成酪氨酸。所說DRH核苷結合位點下遊的6位胺基酸突變成半胱氨酸。
32.按照權利要求25-31之任一分離的胸苷激酶，其中所說的胸苷激酶選自單純皰疹病毒1型胸苷激酶和單純皰疹病毒2型胸苷激酶。
33.按照權利要求25-31之任一分離的胸苷激酶，其中所說的酶是截短的或者包含符合讀框的缺失。
34.按照權利要求25-31之任一分離的胸苷激酶，其中所說的胸苷激酶能夠以超過野生型胸苷激酶對核苷類似物的磷酸化至少一倍的方式磷酸化核苷類似物。
35.按照權利要求34的分離的胸苷激酶，其中所說的核苷類似物選自下列物質ganciclovir、無環鳥苷、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
36.按照權利要求25-31之任一分離的胸苷激酶，其中所說的胸苷激酶能夠磷酸化核苷類似物，並且其中Z>[(TKmNAp)/(TKmTp)(TKwtNAp)/(TKwtTp)]]]>式中TKmNAp是胸苷激酶突變體引起的核苷類似物磷酸化率，TKmTp是胸苷激酶突變體引起的胸苷磷酸化率，TKwtNAp是未突變的胸苷激酶引起的核苷類似物磷酸化率，TKwtTp是未突變的胸苷激酶引起的胸苷激酶磷酸化率，Z選自1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。
37.按照權利要求36的分離的胸苷激酶，其中所說的核苷類似物選自下列物質ganciclovir、無環鳥苷、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
38.一種抑制溫血動物病原體的方法，該方法包括給溫血動物施用按照權利要求14-22之任一載體以便所說的病原體受到抑制。
39.按照權利要求38的方法，其中所說的載體被體內施用。
40.按照權利要求38的方法，其中所說的病原體選自病毒、細菌和寄生蟲。
41.按照權利要求38的方法，其中所說的病原體是腫瘤細胞。
42.按照權利要求38的方法，其中所說的病原體是自體反應性免疫細胞。
43.按照權利要求38-42的任一方法，該方法還包括施用核苷類似物的步驟。
44.按照權利要求43的方法，其中所說的核苷類似物選自下列物質ganciclovir、無環鳥苷、三氟胸苷、1-[2-脫氧，2-氟，(-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脫氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脫氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脫氧胞苷和AraC。
45.一種藥物組合物，該組合物包含按照權利要求14-22之任一載體和藥學上可接受的載體和稀釋劑。
46.一種藥物組合物，該組合物包括按照權利要求23之宿主細胞和藥學上可接受的載體和稀釋劑。
全文摘要
本發明提供了編碼Herpesviridae胸苷激酶的分離的核酸分子，該分子包含一個或多個突變，其中至少一個所說突變編碼一個DRH核苷結合位點上遊的胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。在另一方面，一個所說的突變編碼一個DRH核苷結合位點內的胺基酸取代，這種取代增加所說胸苷激酶的生物學活性(與未突變的胸苷激酶比較)。本發明也提供了適於表達這種DNA分子的載體以及使用該載體的方法。
文檔編號A61P37/00GK1151186SQ9519371
公開日1997年6月4日 申請日期1995年5月2日 優先權日1994年5月2日
發明者L·A·羅布, M·E·布萊克 申請人:華盛頓大學