一種金黃色葡萄球菌的培養物及其製備方法
2023-11-07 07:09:52
專利名稱：一種金黃色葡萄球菌的培養物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗腫瘤作用的金黃色葡萄球菌的培養物及其製備方法。
本領域技術人員熟知金黃色葡萄球菌的培養物中含有抗腫瘤成分，其主要的有效成分含有金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxin，SE)目前認為這種毒素是一種生物活性極其強大的超級抗原(superantigen，SAg)。現有文獻中報導的超級抗原來源包括細菌，病毒和寄生蟲等等。超級抗原的含義，作用以及作用機制完全不同於現今所有的普通抗原，或者稱一般抗原。超級抗原是一類來源複雜的蛋白質，它在免役應答中只需要微量即可，例如可按照ngM計算。這種抗原利用非常獨特的機制刺激T細胞大量增殖，產生大量的細胞因子，其表現的細胞毒性為(一)直接激活細胞毒性T淋巴細胞，使之對靶細胞產生殺傷作用；(二)通過細胞因子的作用，激活NK細胞；(三)借超級抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(Superantigen dependentcell-mediated cytotoxicity，SDCC)，殺傷腫瘤細胞。
今年來，證實超級抗原具有抗腫瘤作用後，接著用化學方法合成McAb-SEA結合物，最後採用重組技術製成融合蛋白。這種融合蛋白於1997年進行I期臨床試驗，其結果表明一次計量達1.5ng/kg是安全的，但是病人全身反應較大，大多數接受治療的病人白細胞數量明顯減少，血小板數量減少者更甚。
為了克服現有技術的不足之處，本發明的目的在於提供一種新的金黃色葡萄球菌菌株。
本發明的另一目的在於提供一種金黃色葡萄球菌的培養物及其培養方法，以及培養中採用的培養基。
本發明的另一目的在於提供所述的金黃色葡萄球菌的培養物具有抗腫瘤作用的用途。
本發明採用金黃色葡萄球菌菌株，在新的培養基中發酵培養製備一種培養物，該培養物具有抗腫瘤作用。本發明方法中培養基配方簡單，有效地減少了原料使用量。其治療用的培養物濾液可以不再進行滅菌處理。菌種產生酶的穩定性提高。使用本產品後，使用者的白細胞數量大大增加，提高抗腫瘤的效果。
本發明中所涉及的金黃色葡萄球菌菌株(staphylococcus aures)已經於2000年9月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 0485。
菌株CGMCC No.0485的來源是從醫院臨床細菌檢驗室的標本中分離得到的100多株葡萄球菌中篩選得到菌株CGMCC No.0165後，再經亞硝基胍誘變，選育得之。
菌株CGMCC No.0485的形態特徵形態特徵金黃色葡萄球菌標準菌株和待鑑定的細胞經透射電子顯微鏡放大2萬倍(包埋法)和6萬倍(超薄切片法)可看到細胞均成球行，直徑0.5-1.0μm，單個，成對排列，具特徵性的多於一個平面分裂，形成不規則的堆團，無鞭毛，不運動，不形成夾膜，不產生芽孢。在電子顯微鏡(超薄切片法)下，細胞壁、細胞膜、染色質均可見，不同生長期細胞的大小、結構有所不同，但金黃色葡萄球菌標準菌株和待鑑定菌株並無明顯區別。
培養特徵血平皿培養，菌落成圓形，突起，表面光滑，邊緣整齊，不透明去，菌落呈金黃色，有大而透明的溶血環，35℃培養24hr，菌落直徑約1.5-2.0mm。
液體培養基中生長物最初渾濁，後來變清，並具有細的，易懸浮的沉澱，培養2-3天時常有環狀的膜，液體培養物在相同條件下，濁度略小，菌濃度略低。
染色特徵用標準革蘭氏染色法對金黃色葡萄球菌標準菌株和待鑑定菌株進行染色，在顯微鏡下觀察，實驗結果金黃色葡萄球菌標準菌株和待鑑定菌株均為革蘭氏陽性菌。
用夾膜染色法對金黃色葡萄球菌標準菌株和待定菌株進行染色，在顯微鏡下觀察，實驗結果金黃色葡萄球菌標準菌株和待定菌株均為陰性。
用芽孢染色法對金黃色葡萄球菌標準菌株和待定菌株進行染色，在顯微鏡下觀察，實驗結果金黃色葡萄球菌標準菌株和待定菌株均為陰性。
生理生化特徵血漿凝固酶陽性，在培養基中產酶能力很強。
葡萄糖、甘露醇發酵實驗，產酸能力較弱。
培養物除菌後的濾液熱源合格率高，可達95％以上。
水解澱粉試驗金黃色葡萄球菌標準菌株和待鑑定菌株均呈陰性。
過氧化氫酶實驗金黃色葡萄球菌標準菌株和待鑑定菌株均呈陽性。
本發明的製備方法包括以下步驟(1)將原料豬心加入1～2倍水中粉碎、過濾、得第一濾液和濾渣；(2)向所述的濾渣中加入1～2倍水，於90～95℃浸泡，過濾，得第二濾液和濾渣；合併第一濾液和第二濾液得第三濾液；(3)將按照液體總重量計算的，向第三濾液中加入0.025～0.5g％蛋白腖，以及0.3～0.9g％氯化鈉加入第三濾液，並向該濾液中加入0.5％的活性炭，將其pH值調整為7.2左右得一培養基；(4)將金黃色葡萄菌菌株復甦，增菌後製成種子液，使其細菌濃度達到105-107後進行接種，其接種量為0.02～0.2ml％；(5)35℃發酵約15-20小時後，得一培養物，(6)將所述的培養物除菌、過濾、其滲透壓調至等滲，並將其pH值調整6.8～7.4後得終產物。
本發明所得之產物可以直接進行加工，灌封成安培針劑，供肌肉注射。該注射液對腫瘤病人的使用計量為每日一支，2ml/支。
上述的方法中所述的金黃色葡萄菌菌株是已經於2000年9月14日保藏在中國典型微生物保藏中心，保藏號為CGMCC 0485的菌株。
採用本發明所述的菌株明顯地縮短了約1/5的發酵時間，種子液培養時間縮短了2/3，減少了原料的使用量，工藝簡單，容易控制，大大提高了產品的質量，降低了成本。另外，誘變後菌株的產酶能力得到了提高，該菌株對營養條件要求較低，產品熱源合格率大幅度提高，副反應減少。
為了進一步理解本發明的實施方案，以下將結合實施例對本發明進行非限定性的描述。
實施例1取豬心100公斤，用清水洗淨後，採用鉸肉機，(廣東番禹市肉聯食品機械長生產的，型號TJL12-4)進行鉸碎處理，加入150公斤注射用水於90℃浸泡1小時，然後過濾出濾渣，得豬心濾液備用。
向上述的濾渣中加入注射用水100公斤，90℃浸泡1小時，然後過濾，濾渣棄之，得濾液。將得到的所有濾液合併。取合併後的豬心濾液2000毫升，加入蛋白腖100克，氯化鈉1200克，攪拌沸煮後使加入的物質使其完全溶解，在加入清水，並將它們pH值保持在約8.5，4℃下放置過夜。向該濾液中加入活性炭10克，將所述濾液pH值從8.5逐步調整為7.2左右。
將得到的經過上述處理後的濾液調成等滲液後，分裝栽500毫升的密封瓶瓶內，0.1Mpa的壓力下，消毒滅菌20分鐘，製得培養基400公斤，總體積約為400,000毫升。
將金黃色葡萄球菌菌種CGMCC 0485在35℃溫度復甦24小時，然後在血平皿上增菌8小時，增菌溫度為35℃，得種子液。該種子液的細菌濃度為107。
然後，將培養基混於一不鏽鋼容器內，經除菌過濾後裝入發酵罐中；預熱至35℃接種，接種量為0.2％ml。35℃發酵培養16小時後，得到培養物。對所述的培養物進行滅菌、過濾和檢驗合格後，直接灌封成針劑。
每次發酵培養得到的培養物都進行熱源，酶活性以及過敏實驗等檢測。
向上述的濾渣中加入注射用水100公斤，90℃浸泡1小時，然後過濾，濾渣棄之，得濾液。將得到的所有濾液合併。取合併後的豬心濾液4000毫升，加入蛋白腖2000克，氯化鈉3600克，攪拌沸煮後使加入的物質使其完全溶解，在加入清水，並將它們pH值保持在約8.5，4℃下放置過夜。向該濾液中加入活性炭200克，將所述濾液pH值從8.0逐步調整為7.0。
將得到的經過上述處理後的濾液調成等滲液後，分裝栽500毫升的密封瓶瓶內，0.1Mpa的壓力下，消毒滅菌20分鐘，製得培養基總體積約400,000毫升。
將金黃色葡萄球菌菌種CGMCC 0485在35℃溫度復甦24小時，然後在血平皿上增菌8小時，增菌溫度為35℃，得種子液。該種子液的細菌濃度為105。
然後，向將所述的培養基混合於一不鏽鋼容器內，經除菌過濾後裝入發酵罐中；預熱至35℃接種，接種量為0.2ml％。35℃發酵培養20小時後，得到培養物。對所述的培養物進行滅菌、過濾和檢驗合格後，直接灌封成針劑。
每次發酵培養得到的培養物都進行熱源，酶活性以及過敏實驗等檢測。
實驗例一 抗化療引起的白細胞減少試驗取本發明實施例1所得的金黃色葡萄球菌培養物在中日友好醫院進行抗化療引起的白細胞減少的臨床試驗。20個病例的選擇主要為進行化療的癌症，主要為肺癌(佔60％以上)。試驗經過病理學與細胞學證實，肌肉注射本發明之培養物治療前後對病人肝腎均無影響。對減輕化療引起的白細胞下降有顯著的作用(p＜0.05和p＜0.01)對抗化療引起的白細胞減少的療效在治療期有效率可達90％，其中顯效率為55％，而對照有效率僅為15％，顯效率為5％。
因此，本發明方法製得的培養物具有對抗化療引起的白細胞減少，保護白細胞不下降或減少降低白細胞的程度，縮短白細胞減少的期限，並促進下降的細胞恢復正常。
實驗例二 對自然殺傷細胞活性的影響根據軍事醫學科學院的試驗報告取本發明所述之培養物將其製成注射劑，該注射劑每毫升含有500u。此處本品以每ml藥液含有在37℃6小時能使血漿中的液態纖維蛋白原產生1μg纖維蛋白的游離凝固酶作為一個活性單位(u)。試驗腫瘤為S180肉瘤、Lewis肺癌和U14宮頸癌。採用本領域技術人員公知方法給昆明種小鼠和C57BL/6小鼠進行試驗，測定自然殺傷細胞(NK)活性的測定和淋巴細胞轉化試驗。試驗結果為一次性注射本發明所述之培養物兩天後，殺傷細胞活性升高，四天後達高峰，六天後逐漸恢復至給藥前水平。抑瘤率可達90％以上。
對於S180肉瘤小鼠中一次給藥後的變化為200～1000u/鼠可使得小鼠的殺傷細胞活性輕度增高，劑量增至1200～1500u/鼠，殺傷細胞活性明顯增強。在Lewis和U14宮頸癌荷瘤小鼠中32u/天/一次，連續9天後NK細胞的活性也明顯增高(p＜0.05)。
因此，一次或多次向小鼠給予本發明制培養物均能顯著增強正常小鼠以及荷瘤小鼠的NK細胞的活性。
實驗例三對淋巴細胞轉化率的影響根據軍事醫學科學院的試驗報告對於正常小鼠10隻一次性給藥32.5u，可使淋巴細胞轉化率輕度增高給藥後4天較明顯，6天後恢復正常。
荷瘤小鼠每天腹腔注射32.5u的本發明實施例1之培養物，連續9天也可以使其淋巴細胞轉化率輕度升高。當一次性大劑量給藥(例如1000或1500u時，則可見淋巴細胞轉化率明顯增高。
實驗例四對腫瘤細胞的抑制作用根據軍事醫學科學院的試驗報告自荷S180腹水小鼠瘤小鼠抽腹水，計數瘤細胞，稀釋至預期瘤細胞，加入不同量的本發明實施例1所得的培養物，混合後立即給每隻小鼠皮下接種0.2ml，10天後活殺小鼠取出腫瘤稱重。對照組不加本發明的培養物，只加入等量的生理鹽水，其他與實驗組相同。結果表明50u/鼠劑量即對S180腫瘤生長有明顯抑制作用，與對照組比較平均抑瘤率為38.3±20.9％。隨著劑量的增加，抑瘤作用呈現正相關結果。如果給藥劑量為200～1500u時，抑瘤率最高可達91％。
實驗例五對S180實體瘤的治療作用根據軍事醫學科學院的試驗報告將小鼠86隻分成四組，23隻為對照組，其他為每組21隻，在實驗組小鼠皮下接種S180腹水瘤細胞，24小時後在注射本發明實施例2之培養物。每天一次，連續9天，於10天後活殺取瘤稱重。其中對照組為注射生理鹽水。實驗結果表明50，100以及150u/鼠組劑量的培養物，隨S180的抑制率分別為25％，30％和37％。
另外，C57BL/6小鼠皮下接種腫瘤後24小時皮下注射本發明之培養物，50，100和150u/鼠，每天1此連續9天。實驗顯示表現出有輕度抑制作用。
實驗例六對人體觀察的結果經過中日友好醫院、青島人民醫院、瀋陽市第五醫院、蚌埠醫學院附屬醫院大連醫學院附屬醫院以及上海同仁醫院等六家醫院的臨床大量實驗，包括化療、放療綜合實驗，以及該培養物對人體的各個方面的影響等等實驗結果顯示本發明的培養物對放療、化療引起的白細胞數目減少有明顯提升作用。另外，對放、化療期間同時使用所述的培養物可見它可以阻止人體的由於放、化療作用白細胞下降。由於篇幅的緣故，不在此處贅述。
另外，本發明的培養物含有減輕放、化療毒副作用(例如骨髓抑制、胃腸道反應、食欲不振以及體重和活動狀況等等)的效果。
本發明培養物是安全的，在實驗中開始1-3天有部分實驗者出現發熱，一般體溫在38度左右，但是經過處理很快好轉，多數受試者能夠耐受，自行或者輕微處理當天可以恢復。
總之，綜合療效判斷結果顯效佔25.93％，有效佔55.09％，進步佔15.74％，無效佔3.24％，故總有效率(顯效加有效)81.02％。
權利要求
1.一種製備金黃色葡萄球菌(staphylococcus aures)培養物的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將原料豬心加入1～2倍水中粉碎，過濾，得第一濾液和濾渣；(2)向所述的濾渣中加入1～2倍的90～95℃淨水浸泡後粉碎，得第二濾液和濾渣；合併第一濾液和第二濾液得第三濾液；(3)將按照液體總重量計算的合併後的豬心浸出液中加入，0.025～0.5g％蛋白腖，以及0.3～0.9g％氯化鈉，並向該濾液中加入0.5％的活性炭，將所述的第三濾液pH值從8.5逐步調整為7.2左右得培養基；(4)將金黃色葡萄球菌菌株CGMCC 0485復甦、增菌後，製成種子液，使其細菌濃度達到105-107後向培養基接種，其接種量為0.02～0.2ml％；(5)在35℃發酵培養菌株CGMCC 048約15-20小時後，得一培養物，(6)將所述的培養物除菌，過濾，其滲透壓調至等滲，並將其pH值調整6.8～7.4。
2.一種金黃色葡萄球菌菌株(staphylococcus aures)，已經於2000年9月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.0485。
3.一種如權利要求1所述的方法中所述的培養基，其中按照培養基總重量計算，該培養基含有0.5～10ml％的豬心浸出液，0.025～0.5g％蛋白腖，以及0.3～0.9g％氯化鈉。
4.一種如權利要求1所述的方法製備的金黃色葡萄球菌培養物。
5.如權利要求4所述的金黃色葡萄球菌培養物在製備抗化療引起的白細胞減少藥物中的應用。
6.如權利要求4所述的金黃色葡萄球菌培養物在製備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
一種製備金黃色葡萄球菌培養物的方法,包括將豬心加入水中粉碎,得豬心浸出液,並加入蛋白腖和氯化鈉製得培養基;將金黃色葡萄球菌菌株CGMCC 0485復甦、增菌後,製成種子液,發酵後得一培養物。該培養物具有抗腫瘤作用。
文檔編號A61K35/66GK1369550SQ0110410
公開日2002年9月18日 申請日期2001年2月16日 優先權日2001年2月16日
發明者陳巨餘 申請人:瀋陽協合集團有限公司