一種耐輻射奇球菌轉錄抑制因子的製作方法
2023-11-07 15:19:17 1
一種耐輻射奇球菌轉錄抑制因子的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐輻射奇球菌轉錄抑制因子。所述轉錄抑制因子可以在體外結合耐輻射奇球菌內含位點的DNA損傷應急響應與修復基因啟動子。結合反應緩衝液成分為100-200mMNaCl、10-50mMTris-HC18.0、5-10mMMgCl2,反應溫度為30°C。該轉錄抑制因子可以在體內抑制DNA損傷應急響應與修復基因的轉錄表達。本發明發現了一種迄今為止未曾被報導過的轉錄抑制因子，對DNA損傷修復的研究具有重要意義。
【專利說明】一種耐輻射奇球菌轉錄抑制因子
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種耐福射奇球菌轉錄抑制因子DdrO,涉及與DdrO能特異性結合的 DNA序列及其序列特徵，體內行使抑制因子的功能。
【背景技術】
[0002] 在分子生物學中，轉錄因子是指能夠與基因上遊特異性DNA序列相結合的蛋白 質，並能調控該基因的轉錄。它可以調控RNA聚合酶與DNA模板的結合，也可以調節RNA聚 合酶在DNA模板上行使RNA轉錄功能。轉錄因子不僅與基因上遊的啟動子區域結合，也可 以和其它轉錄因子形成轉錄因子複合體來影響基因的轉錄。
[0003] 轉錄因子及其系統已廣泛應用分子生物學，分子醫學等領域。利用轉錄因子系統， 可以建立生物或醫學模型。另外，人工轉錄因子的構建已用於轉錄因子的生物學功能研究 中起到重要作用。它是將不同的DNA結合結構域與效應結構域組合在一起，人為地構建具 有新的序列特異性與作用效果的轉錄因子，在基礎研究、藥物設計以及基因治療等領域得 到了廣泛研究。
[0004] 耐輻射奇球菌是一種極端環境微生物，以對電離輻射、紫外射線、乾燥和氧化脅迫 等極端條件表現極強抗性而著稱。體內基因(基因名NCBI-GeneID: 1798752) 表達的產物DdrO蛋白由131個胺基酸組成，屬於XRE蛋白家族，僅包含簡單的HTH結構域。 但是至今為止，DdrO的具體功能和調控模式及對象從未被研究報導過。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種耐輻射奇球菌轉錄抑制因子及其結合的特徵DNA序列、 以及其體內行使抑制因子的功能。
[0006] 耐輻射奇球菌轉錄抑制因子DdrO,所述的轉錄抑制因子可以在體內外結合耐輻射 奇球菌內含RDRM位點的DNA損傷應急響應與修復基因啟動子，抑制DNA損傷應急響應與修 復基因的表達。
[0007] 所述的DNA損傷應急響應與修復基因啟動子，包括i/r洲9、 dr0219、dr0326、dra0346、dr0423、dr0596、dr0906、dr1039、dr 1143、dr1289、dr1696、 drl771、drl775、drl913、drl921、dr2256、dr2275、dr2336Mdr2574 等基滿。
[0008] 所述的轉錄抑制因子DdrO,其與DNA序列的結合反應緩衝液為100-200 mM NaCl、 10-50 mM Tris-HCl 8. 0、5-10 mM MgCl2，反應溫度為 30°C。
[0009] 所述的轉錄抑制因子DdrO,其結合最小序列為耐輻射奇球菌內的RDRM位點。
[0010] 所述的轉錄抑制因子DdrO,與其蛋白序列同源性高於50%以上的同源蛋白，均具 有相同的生物學功能。
[0011] 本發明的有益效果： 本發明提供了一種未被研究報導過的轉錄抑制因子，可用於體外轉錄系統研究，對DNA 損傷修復的研究以及轉基因工程具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1是DdrO在體外結合含RDRM位點的基因啟動子； 其中，從左至右，CK為不加 DdrO蛋白的對照；其他為含RDRM位點的基因 啟動子，而現PoWJ似未出現DNA條帶遷移，原因是其RDRM位點的比 對信任度比較低下。
[0013] 圖2是基因啟動子的RDRM位點為體外DdrO結合所必需。
[0014] 選取含RDRM位點的七個基因啟動子作為研究。其中是基因的 全啟動子，也包含RDRM位點；而必-則是不包含RDRM位點的辦力必基因啟動 子。其他基因啟動子依次類推。
[0015] 圖3是DdrO在體內能結合DNA損傷響應與修復基因啟動子。
[0016] 其中，辦洲滯基因作為陰性對照，因為它是看家基因，在處理前後表達、 量恆定。用特異性的DdrO蛋白兔抗富集所選基因啟動子的數量比非特異性的抗體多 三到六倍。
[0017] 圖4是在輻照處理前後野生菌株Rl體內DdrO蛋白對DNA損傷應急響應與修 復基因轉錄的影響。BeforeIR,指福照前的樣品；35min after IR,指福照後恢 復培養35分鐘的樣品；90min after IR，指輻照後恢復培養90分鐘的樣品。
[0018] 圖5是在輻照處理前後ftor/缺失菌株YRl體內DdrO蛋白對DNA損傷應急響應 與修復基因轉錄的影響。BeforeIR,指福照前的樣品；35min after IR,指福照 後恢復培養35分鐘的樣品；90min after IR，指輻照後恢復培養90分鐘的樣品。
【具體實施方式】
[0019] 本發明所用的基因及各個基因啟動子均來自耐福射奇球菌 No. 13939)。耐福射奇球菌是一種極端環境微生物，對電離福射、紫外射 線、乾燥和氧化脅迫等極端條件表現極強抗性。轉錄抑制因子DdrO可以在體外結合耐輻射 奇球菌內含RDRM位點的DNA損傷應急響應與修復基因啟動子，抑制DNA損傷應急響應與 修復基因的表達。
[0020] 實施例1 (I) DdrO在體外結合含RDRM位點的基因啟動子 DAyQ 與 dr0070、dr0099、dra0151、dr0219、dr0326、dra0346、dr0423、dr0596、dr0906 和等基因的全啟動子在結合緩衝液（100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl 8. 0、5 mM MgCl2) 中反應40分鐘。用12% TB-PAGE膠檢測DNA條帶的遷移情況。實驗表明，上述基因啟動子 均能結合DdrO,發生條帶的遷移（圖1)。
[0021] (2)基因啟動子的RDRM位點為體外DdrO結合所必需 DdrO與不含RDRM位點的Ρ?/r㈨㈨你和等基因啟動子在 結合緩衝液（100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl 8. 0、5 mM MgCl2)中反應 40 分鐘。用 12% TB-PAGE 膠檢測DNA條帶的遷移情況。實驗表明，上述不含RDRM位點的基因啟動子均不能結合DdrO， 未發生條帶遷移（圖2)。
[0022] (3) DdrO在體內結合含RDRM位點的基因啟動子 運用染色質免疫共沉澱技術，用DdrO抗體純化在體內與DdrO蛋白結合的DNA序列，再 由RT-PCR定量檢測和你等的豐度。結果表明，特異性的DdrO抗體能富集 所選基因啟動子的數量比非特異性的抗體多三到六倍（圖3)。
[0023] (4)輻照處理前，野生菌株Rl相對於ftor/突變株YRl胞內DNA損傷應急響應與修 復基因轉錄水平不變 在輻照處理前，離心收集野生菌株Rl與AorJ缺失菌株YR1，提取RNA，反轉錄後用 嘆覽魏你私 dr0089、dr2340、dr2574、dr0070、dra0346、dr0423、dr0090 M drl289 等 基因的轉錄水平，其中作為陰性基因，基因突變前後表達量恆定。結果表明，在未輻 照處理前，野生菌株Rl與ftorJ缺失菌株YRl體內DNA損傷應急響應與修復基因轉錄水平 均未發生變化（圖4,圖5)。
[0024] 實施例2 (I) DdrO在體外結合含RDRM位點的基因啟動子 VtArQ 與 dr 1143、dr1289、dr1696、dr 177I、dr1775、dr 1913、dr 1921、dr2256、dr2275、 ?/rW光和等基因的全啟動子在結合緩衝液（150 mM NaCl、30 mM Tris-HCl 8. 0、5 mM MgCl2)中反應40分鐘。用12% TB-PAGE膠檢測DNA條帶的遷移情況。實驗表明，上述基因 啟動子均能結合DdrO,發生條帶遷移（圖1)。
[0025] (2)基因啟動子的RDRM位點是體外DdrO結合所必需 DdrO與不含RDRM位點的Ρ?/r似激-、Pi/raft?你-和Ρ?^57￥-等啟動子在結合緩衝液 (150 mM NaCl、30 mM Tris-HCl 8. 0、5 mM MgCl2)中反應 40 分鐘。用 12% TB-PAGE 膠檢測 DNA 條帶的遷移情況。實驗表明，上述基因啟動子均不能結合DdrO,未發生條帶遷移（圖2)。
[0026] (3) DdrO在體內結合DNA損傷應急響應與修復基因啟動子 運用染色質免疫共沉澱技術，用DdrO抗體純化在體內與DdrO蛋白結合的DNA序列，再 由RT-PCR定量檢測Mrtn%，Pi/raft?你等的豐度。結果表明，特異性的DdrO抗體能富集所 選基因啟動子的數量比非特異性的抗體多三到六倍（圖3)。
[0027] (4)輻照處理後，野生菌株Rl相對於βατ/突變株YRl胞內DNA損傷應急響應與修 復基因轉錄水平上調 經2kGy劑量γ射線輻照處理後，野生菌株Rl與ftor/缺失菌株YRl在培養基中恢復 培養35分鐘，離心收集菌體，提取RNA，反轉錄，並用qRT-PCR檢測體內辦洲滯、辦力必、 辦2574、辦0070、辦30346、辦0423、辦0090取辦1289等荖風飽轉錄木尋。哀中辦0089私 為陰性基因，處理前後表達量恆定。結果表明，在輻照處理恢復前期，野生菌株Rl體內DNA 損傷應急響應與修復基因轉錄水平均上調，而缺失菌株YRl體內未發生轉錄水平變化 (圖4,圖5)。
[0028] (I) DdrO在體外結合含RDRM位點的基因啟動子 在不加 DdrO情況下，選取必基因啟動子在結合緩衝液（200 mM NaCl、50 mM Tris-HCl 8. OUOmM MgCl2)中反應40分鐘。用12% TB-PAGE膠檢測DNA條帶的遷移情況。 實驗表明，在不加 DdrO時，DNA條帶未發生遷移（圖1)。
[0029] (2)基因啟動子的RDRM位點是體外DdrO結合所必需 DdrO與Ρ?/r似激、Pi/ra似你和等全啟動子在結合緩衝液（200 mM NaCl、50mM Tris-HCl 8. 0、10 mM MgCl2)中反應40分鐘。用12% TB-PAGE膠檢測DNA條帶的遷移情況。 實驗表明，上述基因啟動子均能結合DdrO,發生條帶遷移（圖2)。
[0030] (3) DdrO在體內結合DNA損傷應急響應與修復基因啟動子 運用染色質免疫共沉澱技術，用DdrO抗體純化在體內與DdrO蛋白結合的DNA序列，再 由RT-PCR定量檢測陰性對照基因辦洲滯的豐度。結果表明，特異性的DdrO抗體能富集所 選基因啟動子的數量與非特異性抗體的基本一致（圖3)。
[0031] (4)在輻照處理恢復後期，野生菌株Rl相對於βατ/突變株YRl胞內DNA損傷應急 響應與修復基因轉錄水平趨於穩定 在2kGy γ射線輻照處理後，野生菌株Rl與J缺失菌株YRl經恢復培養90分鐘離 心收集，提取RNA，反轉錄，用qRT-PCR檢測體內辦夥財久辦以必、㈨7P、i/ra似你、 和^等基因的轉錄水平，其中辦洲滯作為陰性基因，處理前後表達量 恆定。結果表明，在輻照處理恢復中後期，野生菌株Rl與ftorJ缺失菌株YRl體內各個DNA 損傷應急響應與修復基因轉錄水平未發生變化（圖4,圖5)。
[0032] 本發明實施例中所用的菌株為耐福射奇球菌(ifeiflococciAs rat/ioi/tfra/75·，ATCC No. 13939)，但是根據本發明的教導和啟示，任何人工合成或者其他自然含有的蛋白以及衍 生物，如具有與轉錄抑制因子DdrO同源的序列和類似的結構和功能，也在本發明的保護範 圍之內。
【權利要求】
1. 一種耐輻射奇球菌轉錄抑制因子，其特徵在於，所述的轉錄抑制因子 DdrO, NCBI-GeneID: 1798752,可以在體內外結合耐輻射奇球菌的DNA損傷應急響應與修復 基因啟動子，抑制體內DNA損傷應急響應與修復基因的轉錄表達。
2. 根據權利要求1所述的耐輻射奇球菌轉錄抑制因子，其特徵在於，所述的基因啟 動子，包銀 dr0070、dr0099、dra0151、dr0219、dr0326、dra0346、dr0423、dr0596、dr0906、 drl039、drll43、drl289、drl696、drl771、drl775、drl913、drl921、dr2256、dr2275、dr2336、 dr2574 〇
3. 根據權利要求I所述的耐輻射奇球菌轉錄抑制因子，其特徵在於，結合最小序列為 耐輻射奇球菌內的RDRM位點。
4. 根據權利要求1所述的耐輻射奇球菌轉錄抑制因子，其特徵在於，結合反應緩衝液 為 100-200 mM NaCl、10-50 mM Tris-HCl 8.0、5-10 mM MgCl2，反應溫度為 30°C。
5. 根據權利要求1所述的耐輻射奇球菌轉錄抑制因子，其特徵在於，與其蛋白序列同 源性高於50%以上的同源蛋白，具有相同的生物學功能。
【文檔編號】C07K14/195GK104211788SQ201410262939
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】華躍進, 王雲光, 王梁燕 申請人:浙江大學