多肽和編碼該多肽的核酸的製作方法

2023-12-08 20:19:36 2

專利名稱：：多肽和編碼該多肽的核酸的製作方法專利說明多肽和編碼該多肽的核酸發明領域本發明涉及分離的多肽以及編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發明也涉及包含該核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生所述多肽和在動物飼料中使用所述多肽的方法，例如用於改善飼料轉化比(FeedConversionRatio)(FCR)和/或用於調節消化道微生物區系(gutmicroflora)。本發明多肽的實例是來自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)ATCC14580的所謂L12蛋白，該蛋白具有本文SEQIDNO2的胺基酸+1至+85的胺基酸序列(在下文中SEQIDNO2的胺基酸1-85)。本發明也涉及產生與L12有關的蛋白的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株在動物飼料中的益生菌用途(probioticuse)。
背景技術：
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：WO03/093453在實施例1中公開了設計改進的地衣芽孢桿菌宿主細胞，該宿主細胞不產生由WO03/093453的SEQIDNO133的核苷酸601至978編碼的小胞外蛋白，該蛋白具有WO03/093453的SEQIDNO134的胺基酸1-126的胺基酸序列。WO03/093453的SEQIDNO133和134分別作為SEQIDNO3和4包含在本序列表中。本文SEQIDNO4的胺基酸1-126的序列與本文的SEQIDNO2的胺基酸-41至+85相同。WO03/093453未公開具有SEQIDNO2的胺基酸1-85的分離的多肽。WO03/093453也未公開具有SEQIDNO1的核苷酸124-378的分離的核酸序列。GenPept登錄號YP_081375為來自地衣芽孢桿菌ATCC14580的假定的蛋白BL00275。GenPept登錄號YP_081375與本文SEQIDNO2的胺基酸-41至+85相同。也將來自地衣芽孢桿菌ATCC14580的假定的蛋白BL00275的序列以原始登錄號(primaryaccessionnumber)Q65CU4登錄入UniProtKB/TrEMBL。此序列也與本文SEQIDNO2的胺基酸-41至+85相同。編碼YP_081375的核苷酸序列具有GenBank登錄號NC_006270。GenBank登錄號NC_006270與本文SEQIDNO1的核苷酸1-381相同。本發明人令人驚訝地發現與這個地衣芽孢桿菌假定的序列的部分有關的多肽，即SEQIDNO2的胺基酸1-85，具有用於動物飼料的巨大潛力。SWISSPROT登錄號Q8DQM5是來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)(菌株ATCCBAA-255/R6)的115個胺基酸的假定蛋白spr0600。這個序列也由Hoskins等公開於J.Bacteriol.1835709(2001)的「GenomeoftheBacteriumStreptococcuspneumoniaeStrainR6」中。Q8DQM5不包含與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％同一性的胺基酸序列。Martinez等，Microbiology(1999)，Vol.145，pp.3155-3161在圖3中公開了具有預測的66個胺基酸的C-末端成熟部分的前細菌素(pre-bacteriocin)乳球菌素972的推斷的91個胺基酸的序列。每一個前多肽以及成熟多肽與SEQIDNO2的胺基酸1-85的同一性百分比低於33％。用SEQIDNO1的核苷酸124-378(其編碼SEQIDNO2的胺基酸1-85)搜索核苷酸資料庫顯示了與SEQIDNO1的核苷酸124-378具有47％同一性的DNA片段。這個片段為由仍在進行中的測序計劃產生的序列的一部分。得到該片段的生物體稱為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus(Geobacillus)stearothermophilus)菌株10。測序工作是在俄克拉荷馬州大學(UniversityofOklahoma)完成的(http:/www.genome.ou.edu/bstearo.html)。沒有可能對應於這個DNA片段的任何胺基酸序列的出版物，因此也沒有任何編碼的胺基酸序列的任何潛在效用的顯示。稱為BioPlusTM2B的飼料中的益生菌產品由Chr.HansenA/S，10-12BoegeAllé，DK-2970Hoersholm，Denmark提供出售。該產品包含地衣芽孢桿菌的菌株，但是該菌株並不產生與L12有關的蛋白(參見本文實施例6)。本發明的目的是提供多肽、編碼多肽的核酸、芽孢桿菌屬的特殊菌株，以及在動物飼料中使用多肽和芽孢桿菌屬菌株的方法。發明概述本發明涉及選自下組的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％同一性程度的胺基酸序列；(b)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)多肽變體，其具有包含一個或多個胺基酸的取代、缺失、延伸和/或插入的SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段；條件是多肽不是SEQIDNO4的胺基酸1-126。本發明也涉及編碼多肽的分離的核酸序列，並涉及包含核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生多肽和在動物飼料中使用多肽的方法。此外，本發明涉及芽孢桿菌屬的菌株在動物飼料中的用途，該菌株在本文實施例6的試驗中是陽性的，即，當收穫所述菌株的DNA並將其在以SEQIDNO6和7作為引物的PCR反應中用作DNA模板時，導致產生大小約0.4kb的PCR片段。發明詳述多肽、其特徵和用途在第一方面，本發明涉及選自下組的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％同一性程度的胺基酸序列；(b)由核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)多肽變體，其具有包含一個或多個胺基酸的取代、缺失、延伸和/或插入的SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段，條件是多肽不是SEQIDNO4的胺基酸1-126。本發明也涉及上述多肽和/或具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽在動物飼料中的用途，以及任何這些多肽在製備用於動物飼料的組合物中的用途。這些多肽通過改進飼料轉化比(FCR)和/或調節(modulate)消化道微生物區系來改進動物飼料利用(animalfeedutilization)。上述條件(即多肽不是SEQIDNO4的胺基酸1-126)用於放棄WO03/093453的SEQIDNO134的胺基酸1-126，參見
背景技術：
部分。該條件是任選的；在其可選擇的實施方案中，(i)多肽不包括信號肽部分，(ii)多肽不包括前肽(propeptide)部分，和/或(iii)多肽為成熟的多肽。在其它可選的實施方案中，多肽包含、可選地具有50-120個胺基酸，優選55-115、60-110、65-105、70-100、75-95或最優選80-90個胺基酸，或(基本上)由50-120個胺基酸，優選55-115、60-110、65-105、70-100、75-95或最優選80-90個胺基酸組成。在第一個具體的實施方案中，多肽具有胺基酸序列、基本上由胺基酸序列組成或者由胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％的同一性程度，例如，SEQIDNO2的胺基酸1-85的多肽。其它具體的實例為SEQIDNO8、9和10(基於本文實施例6的PCR檢驗，鑑定為L12相似物(L12-likes))中任一個的胺基酸1-85的多肽。本發明的多肽可以是細菌多肽或真菌多肽。在第二個具體的實施方案中，多肽為革蘭氏陽性細菌多肽，如芽孢桿菌屬多肽或其變體，例如由地衣芽孢桿菌ATCC14850得到的地衣芽孢桿菌多肽，所述地衣芽孢桿菌ATCC14850是地衣芽孢桿菌的典型菌株並且根據要求可從美國典型培養物保藏中心ATCC獲得。地衣芽孢桿菌的優選菌株在本文實施例6的試驗中是陽性的，如地衣芽孢桿菌的下述菌株ATCC14580(＝NCIB9375)、NCIMB6346(＝DSM8785)、NCTC1024、NCTC1025、NCTC2120、NCTC7589、NCTC9932、ATCC21424、NCIMB10689和ATCC53757。在第三個具體的實施方案中，通過改善飼料轉化比(feedconversionratio)(FCR)和/或調節消化道微生物區系，多肽改進了動物飼料的利用。在可選的實施方案中，多肽改善了動物飼料的可消化性(digestibility)和/或通過幫助正確的消化和/或維持免疫系統功能來保持動物的健康。也可以基於雛雞(broilerchicken)生長試驗測定FCR，該生長試驗包括第一處理，其中將多肽以5mg每kg飼料的濃度加入動物飼料，和不將多肽加入動物飼料的第二處理(對照)，每個處理由6隻雄性小雞的8個組組成，任意(adlibitum)餵食小雞玉米/SBM48食物的小粒(pellet)，將FCR計算為試驗的8-29天以g/只雞表示的飼料攝取量(feedintake)相對於以g/只雞表示的重量增加(weightgain)，相對於第二處理的FCR，第一處理的FCR得到改進。在具體實施方案中，生長試驗是籠養試驗(cagetrial)。進一步的細節參見實施例5。也可以基於雛雞生長試驗測定FCR，該試驗包括第一處理，其中將多肽以(i)2.5mg、(ii)5.0mg或(iii)7.5mg每kg飼料的濃度加入動物飼料，和不將多肽加入動物飼料的第二處理(對照)，每個處理由6隻雄性小雞的10個組組成，任意餵食小雞玉米/SBM48食物的小粒，將FCR計算為試驗的8-29天以g/只雞表示的飼料攝取量相對於以g/只雞表示的重量增加，相對於第二處理的FCR，第一處理的FCR得到改進。在具體實施方案中，生長試驗是籠養試驗(cagetrial)。進一步的細節參見實施例9。也可以基於雛雞生長試驗測定FCR，該試驗包括第一處理，其中將多肽以7.5mg每kg飼料的濃度加入動物飼料，和不將多肽加入動物飼料的第二處理(對照)，每個處理由20隻小雞的12個組組成(6個組為20隻雌性小雞；6個組為20隻雄性小雞)，任意餵食小雞基於小麥、黑麥以及大豆粉的食物的小粒，FCR計算為試驗的1-36天以g/只雞表示的飼料攝取量相對於以g/只雞表示的重量增加，相對於第二處理的FCR，第一處理的FCR得到改進。在第一個具體的實施方案中，小雞圈養於堆滿木材刨花的地板圍欄(floorpens)內。在第二個具體的實施方案中，在1-22天的時間，餵食小雞起始食物(starterdiet)，在22-36天的時期，餵養生長食物(growerdiet)，兩者都基於小麥、黑麥和大豆粉，且具有如表9所示的組成，進一步的細節參見實施例12。如通常所公知的，改進的FCR低於對照FCR。在具體的實施方案中，與對照相比，FCR改進(即減少)了至少1.0％，優選至少1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或至少2.5％。在其它具體實施方案中，與對照相比FCR改進(即減少)了至少2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或至少3.0％。在更進一步的實施方案中，與對照相比FCR改進(即減少)了至少3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％或至少3.8％。如本文所用的，術語「消化道(gut)」指胃腸道(gastrointestinal)或消化道(digestivetract)(也稱為消化道(alimentarycanal))，它涉及多細胞動物內吸收食物、將其消化以提取能量和營養物並排出殘餘廢物的器官系統。消化道可分成上胃腸道和下胃腸道，前者包括口和胃，後者包含腸(intestines)。腸(intestines)可分為小腸和大腸。雖然動物種類之間具有不同，小腸的基本組成是十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)以及迴腸(ileum)。大腸的基本組成是盲腸(caecum)、結腸(colon)和直腸(rectum)(洩殖腔(cloaca))。如本文所用的，術語消化道「微生物區系」指天然微生物培養物，其居住於消化道內並且通過幫助正確的消化和/或維持免疫系統功能而保持健康。如本文所用的，與消化道微生物區系有關的術語「調節」通常指在健康以及機能正常的動物中改變、操縱、更改或調整其功能或狀態，即非治療性用途。調節是對本發明的多肽和/或芽孢桿菌屬菌株的響應。以下為通過本發明的多肽獲得的消化道微生物區系調節作用的非限制性具體實例(與不含本發明的多肽的對照相比時的變化)，進一步的細節，參見實施例8(i)體內總的兼性厭氧菌數目的增加，例如在小豬和/或雛雞中，優選將迴腸-直腸內容物和/或盲腸內容物分別在補充了5％vol/vol綿羊血的布魯氏瓊脂(Brucellaagar)上培養，在無氧箱37℃下溫育5天後測定；(ii)體內大腸桿菌(Escherichiacoli)數目的增加，例如在小豬和/或雛雞中，優選將迴腸-直腸內容物和/或盲腸內容物分別用Coli-ID產色素培養基在有氧條件下在37℃培養24小時後測定。(iii)體內總的乳酸菌基本不變或增加，例如，在小豬和/或雛雞中，優選將迴腸-直腸內容物和/或盲腸內容物分別在MRS瓊脂上在無氧箱中在37℃培養48小時後測定。(iv)體內總的乳桿菌屬菌種(Lactobacillusspp.)基本不變，例如，在小豬中，優選將迴腸-直腸內容物在Rogosa瓊脂上、在無氧箱中在37℃培養48小時後測定。(v)體內其它腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(除大腸桿菌外)數目的減少，例如，在小豬中，優選將迴腸-直腸內容物在Coli-ID產色素培養基上在有氧條件下在37℃培養24小時後測定；(vi)體內腸球菌屬菌種(Enterococcusspp.)數目的減少，例如，在小豬中，優選將迴腸-直腸內容物在腸球菌瓊脂(Enterococciagar)上在有氧條件下在37℃培養48小時後測定；和/或(vii)體內產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)出現頻率的降低，例如，在小豬中，優選將迴腸-直腸內容物在80℃加熱10分鐘後，在TSN瓊脂上在無氧箱中在46℃培養24小時後測定。此外，仍然涉及消化道微生物區系調節作用，以及相對於不含本發明多肽的對照，本發明的多肽優選(iix)對於革蘭氏陽性球菌(cocci)，比革蘭氏陰性菌在體外更具有活性，即顯示了前者更強的減少，例如，對於從小豬和/或雛雞腸內容物分離的革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性菌而言。(ix)對於梭菌屬的菌種(Clostridiumspp.)，例如，產氣莢膜梭菌比革蘭氏陰性菌在體外更具有活性，即前者顯示了更強的減少，例如，對於從小豬和/或雛雞腸內容物分離的產氣莢膜梭菌和革蘭氏陰性菌而言。(x)基本上不影響有益微生物的體外生長，所述有益微生物如細菌，例如，如分離自小豬和/或雛雞腸內容物的細菌；和/或(xi)基本上影響，例如降低有害微生物的體外生長，所述有害微生物如細菌，例如，如從分離自小豬和/或雛雞腸內容物的細菌。關於實例(iix)至(xi)的詳細內容，請參見實施例8的最後部分。在實施方案(x)中，有益的微生物優選選自乳桿菌屬菌種，例如唾液乳桿菌DSM18070(LactobacillussalivariusDSM18070)，它的MIC90為至少1000微克/ml，優選至少2000、3000、4000、4500、5000、5500、6000或至少7000微克/ml，特別是至少4170微克/ml。因而，針對唾液乳桿菌DSM18070，本發明的多肽具有至少1000微克/ml的MIC90，優選至少2000、3000、4000、4500、5000、5500、6000，或至少7000微克/ml，特別是至少4170微克/ml。在實施方案(xi)中，有害的微生物優選選自腸球菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、梭菌屬(優選產氣莢膜梭菌)；如糞腸球菌DSM18047(EnterococcusfealisDSM18047)，它的MIC90低於4000微克/ml，優選低於3000、2000、1000、800、600、500、400、300、200、100、90、80或低於70微克/ml，優選50-80的MIC90，更優選60-70微克/ml的MIC90。因而，針對糞腸球菌DSM18047，本發明的多肽具有低於4000微克/ml的MIC90，優選低於3000、2000、1000、800、600、500、400、300、200、100、90、80或低於70微克/ml，優選50-80的MIC90，更優選60-70微克/ml的MIC90。MIC90指抑制90％的生物體生長所需要的最小抑制濃度(MinimumInhibitoryConcentration)。就本發明而言，將MIC90定義為相對於無本發明多肽的對照，將培養物濃度(將其測定為OD595)降低90％所需的本發明多肽的濃度。在適當的溫育條件下(其依賴於所述的生物體，如實施例8的表5中所示)溫育後測定OD595。用胰蛋白酶大豆培養液(trypticsoybroth)中約105CFU/ml的純細菌，加入連續2倍稀釋的本發明的多肽，用水作為對照，可通過微量滴定培養液稀釋法(microtitrerbrothdilutionmethod)進行MIC90的測定。更多細節，參見實施例8。本文中，MIC90通常以每ml的純多肽微克的單位來表示(微克/ml)。在其它具體的實施方案中，本發明的多肽(xii)具有革蘭氏陰性菌的MIC90，所述革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)或奇異變形菌(Proteusmirabils)的菌株，其比革蘭氏陽性球菌的MIC90高至少50％，如腸球菌屬或葡萄球菌屬菌株，例如糞腸球菌，優選糞腸球菌DSM18047，在其優選的亞實施方案(sub-embodiment)中，前者的MIC90優選比後者的MIC90高至少100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或至少500％。在第四個具體的實施方案中(細節參見實施例11)，本發明的多肽以其天然(即非變性的)形式，不被(i)胃蛋白酶(pH3.5、40℃、2小時)；(ii)胰酶製劑(pH7.0、40℃、4小時)；和/或(iii)胃蛋白酶繼之以胰酶製劑(胃蛋白酶在pH3.5、40℃、2小時，繼之以胰酶製劑在pH7.0、40℃、4小時)降解，對於所有的實施方案(i)-(iii)，如通過SDS-PAGE判斷(參見實施例10)。在第五個具體的實施方案(細節參見實施例7)中，如通過差示掃描量熱法(DifferentialScanningCalorimetry)(DSC)測定的，本發明的多肽具有下列變性溫度(i)在pH2.5至少54℃，(ii)在pH4.0至少68℃，和/或(iii)在pH7.0至少59℃，優選(iv)在pH2.555℃；(v)在pH4.069℃；和/或(vi)在pH7.060℃。同一性和雜交，片段和變體兩個胺基酸序列之間的相關性通過參數「同一性」描述。就本發明而言，通過使用來自EMBOSS包(http://emboss.org)的Needle程序(Needleprogram)確定兩個胺基酸序列的比對(alignment)。Needle程序執行Needleman，S.B.andWunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的全局比對算法(globalalignmentalgorithm)。所用的取代矩陣(substitutionmatrix)為BLOSUM62，缺口開放罰分(gapopeningpenalty)為10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)為0.5。將本發明的胺基酸序列(「發明序列」，如SEQIDNO2的胺基酸1-85，和不同的胺基酸序列「外來序列」)之間的同一性程度計算為兩個序列比對中精確匹配的數目，除以「發明序列」的長度或「外來序列」的長度中最短的那個。結果以百分比同一性表示。當「發明序列」與「外來序列」在重疊的相同位置具有相同的胺基酸殘基(在以下比對的實例中，其以「|」表示)時，出現精確匹配。序列的長度為序列中胺基酸殘基的數目(例如SEQIDNO2的胺基酸1-85的長度是85)。在以下完全假定的比對實例中，重疊為序列1的胺基酸序列「HTWGER-NL」；或者序列2的胺基酸序列「HGWGEDANL」。在實例中，缺口以「-」表示。假定的比對實例序列1ACMSHTWGER-NL||||||序列2HGWGEDANLAMNPS在具體的實施方案中，通過i)用具有BLOSUM62取代矩陣、缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5的Needle程序，比對兩個胺基酸序列；ii)計算比對中準確匹配的數目；iii)以準確匹配的數目除以兩個胺基酸序列中最短的長度，和iv)將iii)的除法結果轉變為百分數，來測定多肽胺基酸序列與SEQIDNO2的胺基酸1-85，或對於SEQIDNO2的胺基酸1-85的同一性百分數。在上述假定的實例中，準確匹配的數目是6，兩個胺基酸序列的最短長度為12，因此同一性的百分數為50％。可選擇地，通過Needleman-Wunsch比對(即全局比對(globalalignment))的程序「align」來測定兩個胺基酸序列之間的同一性程度，以及兩個核苷酸序列之間的同一性程度。該程序用於多肽以及核苷酸序列的比對。預設得分矩陣BLOSUM50用於多肽的比對，預設同一性矩陣用於核苷酸比對。對於多肽，缺口的第一個殘基罰分為-10，對於核苷酸為-16。對於多肽，缺口的其它殘基罰分為-2，對於核苷酸為-4。「align」為FASTA軟體包版本v20u6的一部分(參見W.R.PearsonandD.J.Lipman(1988)，″ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis″，PNAS852444-2448，和W.R.Pearson(1990)″RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA，″MethodsinEnzymology18363-98)。FASTA蛋白比對使用對缺口大小無限制的Smith-Waterman算法(參見″Smith-Watermanalgorithm″，T.F.SmithandM.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。也可參見MyersandMiller，CABIOS(1989)411-17。在優選的實施方案中，與SEQIDNO2的胺基酸1-85的同一性程度為至少35％或至少37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或至少99％。與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有任何這些同一性程度的多肽稱為同源多肽。在可選的實施方案中，與SEQIDNO2的胺基酸1-85的同一性程度為32％。在具體的實施方案中，本發明的多肽包含胺基酸序列(或具有胺基酸序列，或由胺基酸序列組成)，該胺基酸序列(i)與SEQIDNO2的胺基酸1-85相差57、55、50、45、40、35、30或25個胺基酸；(ii)與SEQIDNO2的胺基酸1-85相差20、19、18、17、16、15、14、13、12或11個胺基酸；或(iii)與SEQIDNO2的胺基酸1-85相差10、9、8、7、6或5個胺基酸。在另外的具體實施方案中，多肽包含胺基酸序列(或具有胺基酸序列，或由胺基酸序列組成)，該胺基酸序列與SEQIDNO2的胺基酸1-85相差4、3或2個胺基酸，或者相差1個胺基酸。胺基酸序列的片段，例如SEQIDNO2的胺基酸1-85的片段是從這些胺基酸序列的氨基端或羧基端缺失一個或多個胺基酸的多肽。在一個實施方案中，片段包含至少30、35、40、45、50或至少55個胺基酸。在另一個實施方案中，片段包含至少65個胺基酸殘基，或至少70個胺基酸殘基，或至少75個胺基酸殘基，或至少80個胺基酸殘基，或至少81個胺基酸殘基，或至少82個胺基酸殘基，或至少83個胺基酸殘基，或至少84個胺基酸殘基。等位基因變體表示佔據相同的染色體基因座的基因的兩種或多種可選擇形式中的任何形式。等位基因變異通過突變自然發生，並且可導致種群內的多態性(polymorphism)。基因突變可為沉默的(silent)(在編碼的多肽中無變化)，或可編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。本發明也涉及由核酸序列編碼的分離的多肽，該核酸序列在非常低或低或中或中高或高或非常高的嚴緊條件下與核酸探針雜交，該核酸探針在相同的條件下與(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378、(ii)(i)的亞序列或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarbor，NewYork)。在一個具體的實施方案中，核酸探針從上述(i)、(ii)或(iii)的核酸序列中選擇。SEQIDNO1的核苷酸124-378的亞序列可為至少100個核苷酸，或在另一個實施方案中，至少50、150或200個核苷酸。根據本領域熟知的方法，可用SEQIDNO1的核苷酸124-378的核酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列或其片段，來設計核酸探針以鑑定和克隆編碼來自不同屬或種的菌株的多肽的DNA，該多肽具有用於動物飼料的潛力。具體而言，採用標準的Southern印跡法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定和分離其中的相應基因。與全序列相比，這些探針可以相當的短，但應該在長度上為至少15個，優選至少25個，並且更優選35個核苷酸。也可使用更長的探針。既可使用DNA探針又可使用RNA探針。為了檢測相應的基因，通常標記探針(如採用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標記)。這些探針包含於本發明中。因此，為了得到與上述探針雜交且編碼具有所期望活性的多肽的DNA，可以篩選由這些其它生物體製備的基因組DNA或cDNA文庫。通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳或其它的分離技術，可分離來自這些其它生物體的基因組DNA或其它DNA。可將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移並固定至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料(carriermaterial)上。為了鑑定與SEQIDNO1或其亞序列同源的克隆或DNA，將載體材料用於Southern印跡。就本發明而言，雜交表示核酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與對應於SEQIDNO1中所示的核酸序列、其互補鏈或其亞序列的標記的核酸探針雜交。用X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在具體的實施方案中，核酸探針是編碼SEQIDNO2的胺基酸1-85的核酸序列，或其亞序列。在另一個實施方案中，核酸探針是SEQIDNO1的核苷酸124-378(SEQIDNO1的成熟肽編碼區)。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴緊條件定義為，採用標準的Southern印跡法，在42℃下在5×SSPE、0.3％的SDS、200μg/ml剪切並且變性的鮭精DNA，以及25％甲醯胺(對於非常低以及低嚴緊性下)、35％的甲醯胺(對於中以及中高嚴緊性下)或50％的甲醯胺(對於高和非常高的嚴緊性下)中預雜交和雜交。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，最後將載體物質用2×SSC、0.2％SDS洗滌三次，每次15分鐘，優選至少在45℃(非常低的嚴緊性)，更優選至少在50℃(低嚴緊性)，更優選至少在55℃(中嚴緊性)，更優選至少在60℃(中高嚴緊性)，甚至更優選至少在65℃(高嚴緊性)，以及最優選至少在70℃(非常高的嚴緊性)。對於長度為約15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針，嚴緊條件定義為採用標準的Southern印跡法，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)、1mM磷酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate)、0.1mMATP和0.2mg/ml的酵母RNA中，在比計算出的Tm低5℃-10℃的溫度進行預雜交、雜交和雜交後洗滌，該Tm根據Bolton和McCarthy的計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)計算。對於長度約為15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6×SSC加0.1％SDS中洗滌一次15分鐘，並用6×SSC在比計算出的Tm低5℃-10℃的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。本發明也涉及多肽的變體，其具有包含一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入的SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列。通過插入或缺失一個或多個胺基酸殘基和/或用不同的胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基，變體多肽的胺基酸序列可以不同於SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列。優選胺基酸改變對性質是不重要的(ofaminornature)，即不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性的保守胺基酸取代；通常為1至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至約20-25殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氨酸序列(poly-histidinetract)。保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。因此，例如，本發明涉及具有或包含如SEQIDNO2中所列序列的多肽，優選其成熟部分，或其活性片段，其中保守胺基酸取代包含在鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)中、酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)中、極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)中、疏水性胺基酸(丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)中、芳族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中以及小胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)中，用一個置換另一個；或其任何組合。如本文所定義的，「分離的」或「純的」多肽為基本上不含其它多肽的多肽，例如當通過SDS-PAGE測定時(例如，通過考馬斯染色和通過本領域已知方法的隨後的掃描-參見實施例2和4)至少80％純的，優選至少85％、86％、87％、88％、89％或至少90％純的，更優選至少91％、92％、93％、94％、95％或至少96％純的。也可通過HPLC，優選通過RP-HPLC測定純度(例如，使用Watersμ-BondapakC18柱，流動相A0.1％TFA，流動相B乙腈+0.1％TFA，在280nm下檢測，參見實施例10)。SDS-PAGE純度以及HPLC純度指本發明多肽的量相對於總蛋白的量。在可選擇的實施方案中，多肽可以為至少20％、40％、60％或至少70％純的。可通過本領域中已知的任何方法測定總蛋白的量，例如凱氏定氮法(Kieldahlmethod；A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)，並且也可通過本領域已知的方法，由SDS-PAGE和隨後的掃描測定本發明多肽的量。由本發明的核酸序列編碼的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通過將編碼其它多肽的核酸序列(或其部分)融合至本發明的核酸序列(或其部分)來產生融合多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，並且包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在開讀框中，並且融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。在具體的實施方案中，多肽為低變應原的變體(low-allergenicvariant)，設計為當暴露於動物包括人時，引起減少的免疫應答。術語免疫應答可以理解為暴露於多肽的動物免疫系統的任何反應。一種免疫應答類型是變應性應答，其導致暴露的動物中增加的IgE水平。可以利用本領域已知的技術製備低變應原變體。例如多肽可與屏蔽(shield)涉及免疫應答的多肽的表位或部分(portions)的多聚體部分(polymermoieties)接合(conjugation)。與多聚體的接合可涉及多聚體與多肽的體外化學耦聯，例如WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489中所述。接合可另外或可選地涉及多聚體與多肽的體內耦聯。此類接合可通過編碼所述多肽的核苷酸序列的遺傳工程改造實現。提供低變應原變體的另一種方式為編碼多肽的核苷酸序列的遺傳工程改造以引起多肽自身寡聚化(self-oligomerize)，導致多肽單體可屏蔽其它多肽單體的表位，並且由此降低寡聚體的抗原性。這些產物和它們的製備描述於例如WO96/16177中。可通過各種方法鑑定與免疫應答有關的表位，例如描述於WO00/26230和WO01/83559的噬菌體展示方法(phagedisplaymethod)或描述於EP561907的隨機方法(randomapproach)。一旦表位被確定，可通過已知的基因操縱技術如定位誘變(參見例如WO00/26230，WO00/26354和/或WO00/22103)改變它的胺基酸序列以產生多肽的改變的免疫特性，和/或可在充分接近表位處進行多聚體的接合，以使多聚體屏蔽表位。細菌菌株；益生芽孢桿菌屬菌株在第二方面，本發明涉及芽孢桿菌屬菌株在動物飼料中的用途，當收穫所述菌株的DNA，並在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作模板時，導致產生大小約0.4kb的PCR片段。這個試驗用於鑑定具有L12樣基因的菌株，參見本文的實施例6。這些芽孢桿菌屬菌株也可用於製備用於動物飼料的組合物。這些用途例如著眼於改進飼料轉化比(feedconversionratio；FCR)和/或調節消化道微生物區系。在第一個具體的實施方案中，芽孢桿菌屬菌株是益生微生物(probioticmicroorganism)。術語「益生」通常指餵養動物包括鳥類的非病原細菌，作為防止病原細菌群集(colonization)的方式。基本的想法是將助長黏膜表面群集作為阻斷嚴重病原體群集的方式。益生菌還可定義為活的或可存活的(livable)微生物，該微生物有益地影響健康的並且機能正常的人和動物的腸平衡，因此優選增加活重增加(liveweightgain)和/或改進飼料轉化。在第二個具體的實施方案中，以孢子的形式使用芽孢桿菌屬菌株。孢子可以是外生孢子或優選地是內生孢子。內生孢子是在生物體(通常是細菌)內產生的任何孢子。內生孢子可經歷環境應激(environmentstress)過程而存活，並因此能夠通過上消化道(uppergastrointestinaltract)的嚴苛的(harsh)(酸性)環境而存活，而僅當內生孢子到達腸內後才發揮它的作用，內生孢子將在腸內形成正常的營養細胞(vegetablecell)。在第三個具體的實施方案中，PCR片段，當純化和測序後，編碼與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％同一性的胺基酸序列。本發明的第一方面(多肽及其在動物飼料中的用途)的具體實施方案也適用於本發明的這一方面。在另外具體的實施方案中，芽孢桿菌屬菌株為地衣芽孢桿菌菌株，優選選自下列地衣芽孢桿菌菌株ATCC14580(＝NCIB9375)、NCIMB6346(＝DSM8785)、NCTC1024、NCTC1025、NCTC2120、NCTC7589、NCTC9932、ATCC21424、NCIMB10689和ATCC53757。優選的亞群(subgroup)包括地衣芽孢桿菌ATCC14580(＝NCIB9375)和地衣芽孢桿菌NCIMB6346(＝DSM8785)。在另外具體的實施方案中，依據本發明所用的芽孢桿菌屬菌株(i)不是地衣芽孢桿菌DSMZ5749，(ii)不是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DSMZ5750和/或(iii)不是地衣芽孢桿菌FERMBP-266。(i)和(ii)的菌株包括於BioPlusTM2B產品中，參見例如EP1472933。(iii)的菌株描述於GB2138023中。關於細菌的分類學分類和鑑定的參考文獻是Bergey′sManualofSystematicBacteriology(1986)，vol2，ISBN0-683-0783；(參見例如第1104頁的第13節，EndosporeformingGrampositiverodsandcocci；第1105頁，GenusBacillus；第1105-1129頁，descriptionofthegenus；第1130-1138頁，descriptionoftheindividualBacillusspecies，例如在第1132頁Bacilluslicheniformis)。可選的是，可使用熟知的16SrRNA序列分析(參見，例如Johansenetal，Int.J.Syst.Bacteriol，1999，49，1231-1240，具體而言是在第1233頁第二欄的方法部分)；或可請教來自例如DSMZ或其它公認的保藏機構的分類學專家。芽孢桿菌屬菌株，例如地衣芽孢桿菌菌株在本領域內是已知的，並且可從例如類似上文提到的ATTC的培養物保藏中心獲得，或它們可從自然界分離。如在本領域所知的，可製備活的或可存活的芽孢桿菌屬細胞的製備物。這些細胞的實例為營養細胞(vegetativecells)，和孢子如內生孢子。在一個實施方案中，使用芽孢桿菌屬菌株的發酵提取物，例如以噴霧乾燥的發酵液(fermentationliquor)的形式。實施例6的試驗為PCR反應，在這個實施例中以分離自地衣芽孢桿菌的各種菌株的DNA進行。在這個試驗的具體實施方案中，用作PCR反應模板的DNA為能夠通過本領域已知的技術分離的染色體DNA。當獲得正確大小的PCR片段時，實施例6試驗的結果是陽性的。在實施例6中，正確的大小表示為0.4kb。在具體的實施方案中，正確的大小為0.35kb至0.44kb(＝350bp-440bp)。在可選擇的實施方案中，正確的大小為330-430bp、340-420bp、350-410bp、360-400bp、370-390bp或385-395bp。SEQIDNO1編碼序列(CDS)的大小約為380bp(即378bp)。核酸序列本發明也涉及包含編碼多肽的核酸序列的分離的核酸序列，所述核酸序列(a)編碼本發明的多肽；(b)在非常低的嚴緊條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和/或(c)與SEQIDNO1的核苷酸124-378具有至少48％的同一性程度；條件(proviso)為所述核酸序列不是(iv)SEQIDNO3，且不是(v)SEQIDNO3的核苷酸601-978，且不是(vi)SEQIDNO1的核苷酸1-381。本發明另外涉及編碼本發明的多肽的分離的核酸序列。關於上述條件，參考文獻為本文的
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部分。因此，放棄(disclaimer)(iv)涉及WO03/093453的SEQIDNO133，放棄(v)其核苷酸601-978，以及放棄(vi)GenBank登錄號NC_006270。這些放棄是任選的；在其可選擇的實施方案中，核酸序列編碼多肽，該多肽(i)不包括信號肽部分，(ii)不包括前肽部分，和/或(iii)為成熟的多肽。在另外可選的實施方案中，核酸序列包含、或者具有150-360個核苷酸或(基本上)由150-360個核苷酸組成，優選165-345、180-330、195-315、210-300、225-285，或最優選240-270個胺基酸。在前面的部分定義了同一性和雜交。在第一個具體的實施方案中，核酸序列編碼多肽，該多肽通過改進飼料轉化比(FCR)和/或調節消化道微生物區系改進動物飼料的利用。本發明具體的核酸序列是SEQIDNO1的核苷酸124-378，後者對應於成熟多肽編碼區。本發明其它具體的核酸序列為編碼SEQIDNOs2、8、9和10中任一的胺基酸1-85的多肽的那些核酸序列。本發明也包括核酸序列，該核酸序列包含編碼具有SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列的多肽，由於遺傳密碼的簡併性，該核酸序列不同於SEQIDNO1的對應部分。本發明也涉及SEQIDNO1的亞序列，其編碼SEQIDNO2的片段。SEQIDNO1的亞序列為包含於SEQIDNO1內的核酸序列，除了一個或多個核苷酸已從5』和/或3』末端缺失。優選地，亞序列包含至少150個核苷酸，更優選至少165、180、195、210、225、240、270、285、300、315、330，或最優選至少345個核苷酸。本發明也涉及核苷酸序列，其包含編碼多肽的核酸序列，並且所述核苷酸序列與SEQIDNO1的核苷酸124-378具有至少48％的同一性程度。為了測定核苷酸同一性程度，使用在上文提到的「align」程序。在優選的實施方案中，與SEQIDNO1的核苷酸124-378的同一性程度為至少50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％，或至少99％。在可選擇的實施方案中，與SEQIDNO1的核苷酸124-378的同一性程度為至少32％或至少35％、37％、40％、42％、45％或至少為47％。本發明也涉及在SEQIDNO1的核苷酸124-378中包含至少一個突變的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列編碼多肽，該多肽(i)由SEQIDNO2的胺基酸1-85組成，或(ii)是(i)的序列的變體，其中所述變體包含一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入，或(iii)為(i)的序列的等位基因變體，或(iv)為(i)的序列的片段。用於分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術在本領域內是已知的，並且包括從基因組DNA中分離、從cDNA中製備或其組合。通過例如使用眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共有的結構特徵的克隆的DNA片段，可實現從此類基因組DNA中克隆本發明的核酸序列。參見例如Innisetal.，1990，PCRAGuidetoMethodsandApplication，AcademicPress，NewYork。可以使用其它的核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription，LAT)和基於核酸序列的擴增(NASBA)。核酸序列可從芽孢桿菌屬菌株，優選地衣芽孢桿菌或另外的或相關的生物體中克隆，並且因此可以是例如核酸序列多肽編碼區的等位基因變體或者種變體(speciesvariant)。如本文所使用的，術語「分離的核酸序列」指基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如當通過瓊脂糖電泳測定時，至少約20％純的，優選至少約40％純的，更優選至少約60％純的，還更優選至少約80％純的，最優選至少約90％純的。例如，可通過遺傳工程所用的標準克隆方法獲得分離的核酸序列，以將所述核酸序列從它的天然位置重新定位至它將得以複製的不同位點。所述克隆方法可包括切除和分離包含編碼多肽的核酸序列的期望的核酸片段，將所述片段插入至載體分子，和將重組載體併入宿主細胞，在該宿主細胞內，所述核酸序列的多拷貝或克隆將得以複製。核酸序列可為基因組、cDNA、RNA，半合成、合成來源或它們的任意組合。修飾編碼本發明多肽的核酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術語與所述多肽「基本上相似」指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同於從其天然來源分離的多肽，例如，熱穩定性、pH穩定性、對消化酶的穩定性、變應原性(allergenicity)等等方面不同的變體。基於呈現為SEQIDNO1的多肽編碼部分的核酸序列如其亞序列，可構建變體序列，和/或通過引入核苷酸取代來構建變體序列，該核苷酸取代不產生由核酸序列編碼的多肽的另外的胺基酸序列，但其對應於意欲產生多肽的宿主生物體的密碼子選擇，或該核苷酸取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苷酸取代的一般描述參見例如Fordetal.，1991，ProteinExpressionandPurification295-107。例如低變應原性的多肽可如上所述製備。本發明也涉及包含編碼多肽的核酸序列的分離的核酸序列，並且所述核酸序列在非常低的嚴緊條件下、優選低嚴緊條件下、更優選中嚴緊條件下、更優選中-高嚴緊條件下、還更優選高嚴緊條件下並且最優選非常高嚴緊條件下與核酸探針雜交，該核酸探針在相同的條件下與下列雜交SEQIDNO1的核酸序列或其互補鏈；或它們的等位基因變體和亞序列(Sambrooketal.，1989，如上)，如本文所定義的。本發明也涉及通過下列途徑產生的分離的核酸序列(a)通過在非常低、低、中、中-高、高或非常高的嚴緊條件下將DNA與以下序列雜交(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378，(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；(b)分離核酸序列。所述亞序列優選至少為100個核苷酸的序列，例如編碼多肽片段的序列。本發明另外涉及產生突變核酸序列的方法，包括將至少一個突變引入SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其亞序列，其中突變核酸序列編碼由SEQIDNO2的胺基酸1-85組成的多肽；或其片段。用任意本領域任何已知的方法，通過定位誘變可實現將突變導入核酸序列以將一個核苷酸置換成另一個。具體而言，利用帶有感興趣的插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和包含期望突變的兩個合成引物的方法是有用的。寡聚核苷酸引物，每一個都與載體的相反鏈互補，依靠PfuDNA聚合酶在溫度循環中延伸。通過引物的併入，產生包含交錯切口(staggerednicks)的突變的質粒。溫度循環後，用對於甲基化和半甲基化的DNA具有特異性的DpnI處理產物以消化親本DNA模板並且選擇包含合成的DNA的突變。也可使用本領域已知的其它方法。核酸構建體本發明也涉及包含本發明的核酸序列的核酸構建體，該核酸序列可操作地連接於一種或多種控制序列(controlsequence)，該控制序列指導編碼序列在合適的表達宿主中表達。合適的表達宿主是芽孢桿菌屬宿主細胞，當收穫其DNA並且在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作DNA模板時，如在實施例6中所述的，導致產生大小約0.4kb的PCR片段。適宜宿主細胞的實例在下文標題為「宿主細胞」的部分提及。將表達理解為涉及產生多肽的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。「核酸構建體」在本文定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子修飾以含有以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式結合和並置的核酸的區段。當核酸構建體包含本發明編碼序列的表達所需要的所有的控制序列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。術語「編碼序列」在本文定義為直接詳明其蛋白質產物的胺基酸序列的核酸序列。編碼序列的範圍通常通過核糖體結合位點(原核生物)或通過恰好位於mRNA5』端的開讀框上遊的ATG起始密碼子(真核生物)以及恰好位於mRNA3』端的開讀框下遊的轉錄終止子序列而得以確定。編碼序列可包括但不限於DNA、cDNA和重組核酸序列。編碼本發明多肽的分離的核酸序列可以多種方式操縱以提供多肽的表達。依賴於表達載體，在將其插入至載體之前，操縱核酸序列是理想的或必需的。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術在本領域是熟知的。術語「控制序列」在本文定義為包括對本發明多肽的表達是必需的或有利的所有成分。各種控制序列對於編碼所述多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。這些控制序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，控制序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。控制序列可以和用於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進控制序列與編碼多肽的核酸序列編碼區的連接。術語「可操作地連接」在本文中定義為這樣一種構型(configuration)，在該構型中，將控制序列適當地置於相對於DNA序列的編碼序列的位置，以使控制序列指導多肽的表達。啟動子序列，即由表達核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列，包含介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，並且可從編碼與宿主細胞同源的或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。指導本發明的核酸構建體在地衣芽孢桿菌宿主細胞中(該宿主細胞在實施例6的試驗中為陽性)轉錄的適宜啟動子的實例，為獲得自地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-澱粉酶基因(amyQ)的啟動子，CryIIIA啟動子(參見WO99/43835)，以及下文提到的任何具體的地衣芽孢桿菌宿主細胞的內源性L12啟動子。將轉錄終止子序列，即由宿主細胞識別以終止轉錄的序列，可操作地連接於編碼多肽的核酸序列的3』末端。在選擇的宿主細胞中起作用的任何終止子都可用於本發明。對於上述地衣芽孢桿菌宿主細胞優選的終止子為來自地衣芽孢桿菌的α-澱粉酶基因(amyL)的終止子，以及來自任何這些宿主細胞的內源L12終止子。控制序列也可以是合適的前導序列，其為對宿主細胞的翻譯很重要的mRNA的非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核酸序列的5』末端。在選擇的宿主細胞中起作用的任何前導序列都可用於本發明。信號肽編碼區編碼連接於多肽的氨基末端的胺基酸序列，其指導所編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。在優選的實施方案中，信號肽編碼區為編碼SEQIDNO2的胺基酸-41至-1的SEQIDNO1的核苷酸1-123。根據SignalP版本3.0軟體，SEQIDNO2的預測信號肽為胺基酸-41至-2。這意味著預測的成熟蛋白始於SEQIDNO2的胺基酸-1，即Ala。然而，依據本文的實施例2，成熟蛋白的N-末端從SEQIDNO2的胺基酸+1起始，即從Trp起始，其意味著信號肽部分跨越(span)SEQIDNO2的胺基酸-41至-1，其比預測的長1個胺基酸。因此，SEQIDNO2的胺基酸-1至+85為L12蛋白的可選擇的成熟形式，其也是本發明的一部分。因此，本文中有關SEQIDNO2的胺基酸1-85的任何權利要求或任何陳述，可以因而同樣涉及或可選地涉及(alsooralternativelyreferto)SEQIDNO2的胺基酸-1至+85。對於涉及SEQIDNO1對應部分的任何權利要求和任何陳述情況(case)是相同的除了SEQIDNO1的核苷酸124-378之外或可替換SEQIDNO1的核苷酸124-378，還可涉及SEQIDNO1的121-378核苷酸。同樣，本文中對SEQIDNO2信號部分的任何提及，還可為，或可選地為SEQIDNO2的胺基酸-41至-2。SEQIDNO1的對應部分為SEQIDNO1的核苷酸1-120。本文有關信號肽部分的任何權利要求和任何陳述也因此還可涉及或可選地涉及SEQIDNO1的核苷酸1-120。SignalP方法V3.0描述於BendtsenetalinJournalofMolecularBiology2004，340(4)，pp.783-95。也可參見NielsenetalinProceedingsoftheSixthInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology(ISMB6)，AAAIPress，MenloPark，California，pp122-130，1998(V.2.0)；以及NielsenetalinProteinEngineering10，1-6(1997)(V.1.1)。表達載體本發明也涉及包含本發明核酸構建體的重組表達載體，例如包含本發明的核酸序列、啟動子、轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體。可將上述的各種核酸和控制序列連接在一起以產生重組表達載體，所述重組表達載體可包括一個或多個便利的限制位點以允許編碼多肽的核酸序列在這些位點的插入或取代。可選擇地，可通過將核酸序列或包含所述序列的核酸構建體插入適當的表達載體，來表達本發明的核酸序列。在產生表達載體的過程中，將編碼序列定位於載體中，從而將編碼序列可操作地連接於適當的表達控制序列。重組表達載體可以為任何載體(例如，質粒或病毒)，其可便利地經受重組DNA方法並且能實現核酸序列的表達。載體的選擇將通常倚賴於載體與將導入所述載體的宿主細胞的相容性(compatibility)。載體可以為線性質粒或閉環質粒。載體可以為自主複製載體，即作為染色體外的實體存在的載體，其複製獨立於染色體的複製，例如質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可包含確保自複製(self-replication)的任何方式(means)。可選擇地，載體可以為當導入宿主細胞後整合至基因組並中並且與其所整合的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或者兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA，或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例為來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的標記。本發明的載體優選包含使載體穩定整合至宿主細胞基因組或在細胞中獨立於基因組自主複製的一種或多種元件。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組將載體穩定整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組。所述額外的核酸序列使得載體能夠在染色體中的精確位置整合入宿主細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優選含有足夠數量的核酸，如100至1,500鹼基對，優選400至1,500鹼基對，並且最優選800至1,500鹼基對，其與相應的目標序列高度同源以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合入宿主細胞的基因組中。對於自主複製，載體可另外包含使載體能夠在所述宿主細胞中自主複製的複製起點。細菌複製起點的實例為允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的複製起點。複製起點可以是具有突變的複製起點，所述突變使其機能在宿主細胞中成為溫度敏感的(參見例如Ehrlich，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751433)。可以將多於一個拷貝的本發明的核酸序列插入宿主細胞以增加基因產物的產生。核酸序列拷貝數的增加可通過如下方法獲得將序列的至少一個額外拷貝整合入宿主細胞基因組，或使所述核酸序列包括可擴增選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，並且由此得到核酸序列的額外拷貝。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法對本領域技術人員來說是熟知的(參見例如Sambrooketal.，1989，如上)。本發明的多肽也可與用於動物飼料的至少一種感興趣的其它成分一起共表達，例如具有用於動物飼料中的期望的酶活性的多肽。本發明的多肽和至少一種其它多肽可由不同的載體共表達、由同一個載體共表達或者使用兩種技術的組合。宿主細胞本發明另外涉及包含本發明核酸構建體和/或本發明表達載體的重組芽孢桿菌屬宿主細胞。當收穫宿主細胞的DNA並在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作模板時，導致大小約為0.4kb的PCR片段的產生。在具體的實施方案中，PCR片段在純化和測序後，編碼與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％同一性的胺基酸序列。本發明的第一方面的具體實施方案(具體而言公開於標題為「多肽，其特徵和用途」以及「同一性和雜交、片段和變體」部分中的那些)也可適用於本發明的宿主細胞。例如，在本發明的芽孢桿菌屬宿主細胞的另外的具體實施方案中，PCR片段，當純化和測序後，編碼與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少35％的同一性程度的胺基酸序列，或具有至少37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或至少99％同一性程度的胺基酸序列。在另外的具體的實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細胞為地衣芽孢桿菌宿主細胞，優選選自地衣芽孢桿菌的下列菌株ATCC14580(＝NCIB9375)，NCIMB6346(＝DSM8785)，NCTC1024，NCTC1025，NCTC2120，NCTC7589，NCTC9932，ATCC21424，NCIMB10689和ATCC53757。優選的亞群(subgroup)包括地衣芽孢桿菌ATCC14580(＝NCIB9375)，和地衣芽孢桿菌NCIMB6346(＝DSM8785)。這些宿主細胞有利地用於多肽的重組產生中。將包含本發明核酸序列的載體引入宿主細胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自複製的染色體外載體。術語「宿主細胞」包含親本細胞的任何子代，其由於複製過程中發生的突變而與親本細胞不同。可通過例如原生質體轉化(參見例如ChangandCohen，1979，MolecularGeneralGenetics168111-115)、使用感受態細胞(參見例如YoungandSpizizin，1961，JournalofBacteriology81823-829，或DubnauandDavidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56209-221)、電穿孔(參見例如ShigekawaandDower，1988，Biotechniques6742-751)或接合(參見例如KoehlerandThorne，1987，JournalofBacteriology1695771-5278)來實現將載體導入至細菌宿主細胞。生產方法本發明也涉及產生本發明的多肽的方法，該方法包括(a)培養本發明的重組宿主細胞以產生包含多肽的上清液；以及(b)回收多肽。本發明另外涉及產生本發明多肽的方法，該方法包括(a)培養芽孢桿菌屬菌株，當收穫所述菌株的DNA並在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作模板時，導致產生大小約為0.4kb的PCR片段；以及(b)回收多肽。宿主細胞的實例在上文標題為「宿主細胞」的部分提到。本發明也涉及產生本發明多肽的方法，該方法包括(a)在有益於多肽產生的條件下，培養重組的地衣芽孢桿菌ATCC14580(＝NCIB9375)或地衣芽孢桿菌NCIMB6346(＝DSM8785)宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核酸序列，該突變核酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸124-378中的至少一個突變，其中突變的核酸序列編碼多肽，該多肽(i)由SEQIDNO2的胺基酸1-85組成，或(ii)是(i)的序列的變體，其中該變體包含一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入，或(iii)為(i)的序列的等位基因變體，或(iv)為(i)的序列的片段。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適的培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下在實驗室或工業發酵罐中進行的搖瓶培養，小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公布的成分製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。可用本領域已知的對於多肽特異性的方法檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用；揭示約12kDa的相對分子量Mr的條帶的SDS-PAGE凝膠分析；和/或當從SDS-PGAE凝膠切割下來時，測定純化的樣品和/或12kDa的Mr條帶的N末端序列。在後者的情況中，N-末端應優選與SEQIDNO5具有至少33％，或至少35％、37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％或至少99％的同一性，百分數同一性如上所概括描述的來測定。可通過本領域已知的方法回收所得的多肽。例如，可通過常規方法從營養培養基中回收多肽，所述方法包括但不限於離心、過濾(例如超濾(ultrafiltration)和/或滲濾)、提取、噴霧乾燥(spray-drying)、蒸發或沉澱。可通過本領域已知的多種方法純化多肽，所述方法包括但不限於層析(離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見例如ProteinPurification，J.-C.JansonandLarsRyden，editors，VCHPublishers，NewYork，1989)。組合物和用途在另一方面，本發明涉及包含本發明的多肽和/或芽孢桿菌屬菌株的組合物。所述多肽組合物可以根據本領域已知方法製備，可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可將待包括於組合物中的多肽用本領域已知的方法來穩定。本發明組合物的具體的實例如下動物飼料添加劑，包含(a)i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)本發明的多肽；和(b)至少一種脂溶性維生素，(c)至少一種水溶性維生素，(d)至少一種痕量礦物，和/或(e)至少一種大量(macro)礦物；動物飼料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量(crudeproteincontent)並且包含i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)本發明的多肽；動物飼料添加劑，其包含(a)如在標題為「細菌菌株；益生芽孢桿菌屬菌株」部分中所定義的芽孢桿菌屬菌株；和(b)至少一種脂溶性維生素，(c)至少一種水溶性維生素，(d)至少一種痕量礦物，和/或(e)至少一種大量礦物；和動物飼料組合物，具有50至800g/kg的粗蛋白含量並且包含如在標題為「細菌菌株；益生芽孢桿菌屬菌株」部分中所定義的芽孢桿菌屬菌株。所謂的預混合料(premix)為本發明動物飼料添加劑的實例。預混合料指一種或多種微量成分(micro-ingredients)與稀釋劑和/或載體的優選的均勻混合物。預混合料用於促進較大的混合物中微成分的均勻分散。以上給出依據本發明的優選用途的實例(在標題為「多肽，其特徵和用途」和「細菌菌株；益生芽孢桿菌屬菌株」的部分中)，並在下進一步詳述。動物飼料術語動物包括所有動物。動物的實例為非反芻和反芻動物。反芻動物包括，例如，動物如綿羊(sheep)、山羊(goat)和牛(cattle)，例如牛(cow)，如肉牛(beefcattle)和奶牛(dairycows)。在具體的實施方案中，動物為非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物，例如豬(pig)或豬(swine)(包括但不限於小豬(piglets)、成長的豬(growingpigs)和母豬(sow))；家禽例如火雞(turkeys)、鴨(ducks)和小雞(chickens)(包括但不限於雛雞、蛋雞(layers))；魚(包括但不限於鮭魚(salmon)、鱒魚(trout)、羅非魚(tilapia)、鯰魚(catfish)和鯉魚(carp))；和甲殼動物(包括但不限於蝦(shrimp)和對蝦(prawn))。術語飼料或飼料組合物意指適合於動物攝取或旨在供給動物攝取的任何化合物、製備物(preparation)、混合物或組合物。在依據本發明的用途中，可將多肽和/或芽孢桿菌屬菌株在日常飲食(diet)之前、之後或與之同時地餵給動物。後者是優選的。在具體的實施方案中，以某種形式添加至飼料中的多肽，或包括在飼料添加物中的多肽是定義明確的。術語定義明確意味著所述多肽製備物如前述測定或由大小排阻層析(參見WO01/58275的實施例12)測定是至少50％純的。在另外的具體實施方案中，定義明確的多肽製備物是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％純的。定義明確的多肽製備物是有利的。例如，將本質上不含其它幹擾或汙染多肽的多肽劑量正確地配入(dosecorrectly)飼料要容易得多。術語「劑量正確地配入」具體而言指獲得一致的並且恆定的結果的目的，和基於期望的效果最優化劑量的能力。然而，對於在動物飼料中的用途，多肽不需要那麼純；例如，所述多肽可包括其它的多肽如動物飼料酶，在這種情況下，可稱其為多肽製備物。多肽製備物能夠(a)直接添加至飼料(或直接使用在蛋白的處理過程中)，或(b)其能夠用於產生一種或多種中間體組合物，例如後續加入到飼料中的(或在處理過程中使用的)飼料添加劑或預混合料。上述的純度指原始多肽製備物的純度，無論用於如上的(a)或(b)。具有這種數量級純度的多肽製備物具體而言能夠使用重組產生方法來獲得，而它們不是很容易獲得的，並且當通過傳統發酵方法產生所述多肽時，還要經受更嚴重的批次間變化(batch-to-batchvariation)。在本發明的上下文中，術語飼料轉化比或FRC與術語飼料轉化率同義地使用。將FCR計算為相對於(以g/動物表示的)重量增加的(以g/動物表示的)飼料攝取，參見例如實施例5中的表2。多肽能夠以任何形式添加至飼料，其作為相對純的多肽，或與有意添加至動物飼料的其它成分混合，即以動物飼料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料的預混合料。除了本發明的多肽和/或芽孢桿菌屬菌株外，本發明的動物飼料添加劑還包含至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素和/或至少一種痕量礦物和/或至少一種大量礦物。另外，任選的，飼料添加劑成分是著色劑(colouringagents)，例如類胡蘿蔔素，如β-胡蘿蔔素、變胞藻黃素(astaxanthin)和葉黃素(lutein)；芳香化合物(aromacompounds)；穩定劑；抗微生物肽(antimicrobialpeptides)；多不飽和脂肪酸；活性氧產生類別(reactiveoxygengeneratingspecies)；和/或至少一種選自下組的酶肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(EC3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、澱粉酶例如α-澱粉酶(EC3.2.1.1)和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。在具體的實施方案中，這些其它的酶是明確定義的(如上對多肽製備物的定義)。抗微生物肽(antimicrobialpeptides，AMP’s)的實例是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、防衛素(Defensin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、Lactoferricin，和Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)、Plectasins和Statins，包括公開於WO03/044049和WO03/048148中的化合物和多肽，以及上述保留了抗微生物活性的多肽的變體或片段。抗真菌多肽(antifungalpolypeptides，AFP’s)的實例是如公開於WO94/01459和WO02/090384中的巨大麴黴(Aspergillusgiganteus)和黑麴黴(Aspergillusniger)肽，以及保留了抗真菌活性的上述多肽的變體和其片段。多不飽和脂肪酸的實例是C18、C20和C22多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亞油酸。活性氧產生類別的實例為化學試劑，如過硼酸鹽、過硫酸鹽、過碳酸鹽；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。通常脂溶性和水溶性維生素、以及痕量礦物形成有意添加至飼料的所謂的預混合料的部分，而通常將大量礦物質分開添加至飼料。這些組合物類型中的任一在與本發明的多肽或芽孢桿菌屬菌株一起富集(enrich)時，都是本發明的動物飼料添加劑。在具體的實施方案中，旨在將本發明的動物飼料添加劑以0.01至10.0％；更具體而言0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％意味著g添加劑/100g飼料)的水平包括於(或規定為必需包括於)動物飲食或飼料中。尤其對於預混合料而言。以下是這些成分實例的非排他性(non-exclusive)列表脂溶性維生素的實例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，如維生素K3。水溶性維生素的實例是維生素B12、生物素和膽鹼、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸以及泛酸鹽(panthothenate)例如D-泛酸鈣(Ca-D-panthothenate)。痕量礦物的實例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。大量礦物的實例是鈣、磷和鈉。這些組分的營養需求(以家禽和小豬/豬示例)在WO01/58275的表A中列出。營養需求意指這些組分應該以指示的濃度提供於飲食中。可供選擇的是，本發明的動物飼料添加劑包含至少一種在WO01/58275的表A中指定的單獨組分。至少一種的意思是任一種、一種或多種、一種、或兩種、或三種、或四種等多至所有十三種、或多至所有十五中單獨組分。更具體而言，將這樣至少一種單獨組分包括在本發明的添加劑中，所述組分的量提供其飼料中濃度(in-feed-concentration)在表A第4欄、第5欄或第6欄中說明的範圍之內。動物飼料組合物或飲食具有相對高的蛋白質含量。家禽和豬飲食的特徵可如WO01/58275表B的第2-3欄中所說明。魚飲食的特徵可如此表B的第4欄中所說明。此外，這些魚飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275對應於US09/779334，其在此併入作為參考。依據本發明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，並且另外包含本文所描述的或提出權利要求的至少一種多肽和/或至少一種芽孢桿菌屬菌株。此外，或者可選擇的(對於上文指出的粗蛋白含量)，本發明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量(metabolisableenergy)含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg可用磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體的實施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量在WO01/58275(R.2-5)的表B中的範圍2、3、4或5中的任一範圍中。粗蛋白按氮(N)乘以因子6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮的含量通過凱氏定氮法(Kjeldahlmethod)(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)來測定。可代謝能量可基於NRC出版物Nutrientrequirementsinswine，ninthrevisededition1988，subcommitteeonswinenutrition，committeeonanimalnutrition，boardofagriculture，nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress，Washington，D.C.，pp.2-6和theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs，Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension，7361DABeekbergen，TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5計算。在完整的動物飲食(completeanimaldiet)中，鈣、可用磷和胺基酸的飲食含量(dietarycontent)基於飼料表如Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7來計算。在具體的實施方案中，本發明的動物飼料組合物包含至少一種植物蛋白或植物蛋白源。其也可包含動物蛋白，如肉骨粉(MeatandBoneMeal)和/或魚粉(FishMeal)，通常以0-25％的量。本文所用的術語植物蛋白指任何化合物、組合物、製備物或混合物，其包含至少一種衍生自或起源於植物的蛋白，包括修飾的蛋白和蛋白衍生物。在具體的實施方案中，植物蛋白的蛋白含量是至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。植物蛋白可以源自植物蛋白源，如豆類和穀類，例如來自豆科(Fabaceae，豆科(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的材料，如大豆粉(soybeanmeal)、羽扇豆粉(lupinmeal)和油菜籽粉(rapeseedmeal)。在具體的實施方案中，植物蛋白源是來自豆科的一種或多種植物的材料，如大豆(soybean)、羽扇豆(lupine)、豌豆(pea)或豆(bean)。在另一具體的實施方案中，植物蛋白源是來自藜科的一種或多種植物的材料，如甜菜(beet)、糖甜菜(sugarbeet)、菠菜(spinach)或奎奴亞藜(quinoa)。植物蛋白源的其它實例是油菜籽(rapeseed)、向日葵籽(sunflowerseed)、棉籽(cottonseed)和甘藍(cabbage)。植物蛋白源的其它實例是穀類，例如，大麥(barley)、小麥(wheat)、黑麥(rye)、燕麥(oat)、玉蜀黍(maize)(玉米(corn))、稻(rice)、黑小麥(triticale)和高粱(sorghum)。在其它具體的實施方案中，本發明的動物飼料組合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-30％黑麥；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％魚粉；和/或0-25％肉骨粉；和/或0-20％的乳清(whey)。可將動物飲食製造成例如醪液飼料(mashfeed)(非粒狀(nonpelleted))或粒狀飼料。通常而言，將粉碎的飼料原料(feed-stuff)混合，並且根據所述類別的具體要求添加足夠量的必要維生素和礦物。可將多肽和/或芽孢桿菌屬菌株作為固體或液體劑型添加。例如，固體多肽製備物通常在混合步驟之前或期間添加；液體多肽製備物通常在制粒步驟之後添加。也可將多肽併入飼料添加劑或預混合料。飲食中多肽的終濃度是在每kg飲食0.01-200mg蛋白的範圍內，例如在每kg動物飲食0.1-20mg蛋白的範圍內。當然應該以有效的量使用多肽和/或芽孢桿菌屬菌株，即以足夠改進飼料轉化率(feedconversion)的量。目前預計以下列一種或多種量(劑量範圍)施用多肽0.01-200、0.01-100、0.5-100、1-50、5-100、10-100、0.05-50、1-10或0.10-10，所有這些範圍以mg多肽蛋白/kg飼料(ppm)來表示。在具體的實施方案中，劑量範圍是1-9、1-8、2-7、2-6或2-5ppm。尤其優選的劑量範圍的實例為0.5-15.0、1.0-12.5、1.5-10.0和2.5-7.5ppm。如同實施例10中描述的對於L12蛋白的方式，測定多肽的量。目前預計以下列一種或多種量(劑量範圍)施用芽孢桿菌屬菌株10E2-14、10E4-12、10E6-10、10E7-9，優選10E8CFU/g飼料(符號E表示指數，即例如10E2-14意指102-1014)。為了測定mg多肽蛋白/kg飼料，將多肽從飼料組合物中純化，並且以mg多肽蛋白/kg飼料來計算劑量，例如，如實施例10中所述。相同的原則應用於測定飼料添加劑中的mg多肽蛋白。生物材料的保藏以下分離自雛雞的腸內容物的生物材料，如實施例8所述，已經根據布達佩斯條約保藏在DSMZ(德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeg1b，D-38124Braunschweig，Germany))，並給出以下登錄號保藏物登錄號保藏日糞腸球菌DSM180472006年3月10日唾液乳桿菌DSM180702006年3月16日保藏物由NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880，Denmark製造。這些菌株在確保在本專利申請未結案期間，由專利與商標委員依據37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122所授權的人能夠得到該菌株系的條件下保藏。這種保藏表示所保藏的菌株系基本上是純的培養物。這種保藏可以在提交了這些申請的副本或其後續文本的國家，依據該外國專利法的要求獲得。然而，應當理解，保藏物的獲得並不構成對實施本發明的許可，實施本發明將侵犯由政府行為所授予的專利權。本文所描述及所要求保護的本發明不受本文所公開的具體實施方案的範圍所限制，因為這些實施方案旨在作為本發明幾個方面的舉例說明。任何等同的實施方案都將被認為在本發明的範圍之內。事實上，按照前面的描述，在本文所示和所述的基礎上對本發明作出各種修改，對於本領域技術人員來說是顯而易見的。這些修改也意欲落在所附的權利要求的範圍內。在有衝突的情況下，以包括定義的本公開為準。本文引用了各種文獻，其公開的內容本文全部引入作為參考。實施例實施例1地衣芽孢桿菌的搖瓶發酵將地衣芽孢桿菌ATCC14580在TY瓊脂培養基(用2％瓊脂固化的TY培養液)上在37℃過夜增殖，並接種至包含100mlTY培養液的搖瓶中，該TY培養液具有以下成分胰蛋白腖20g/l，酵母提取物5g/l，FeCl2·4H2O7mg/l，MnCl2·4H2O1mg/l，MgSO4·7H2O15mg/l，pH7.3。將搖瓶在37℃以225rpm搖動速度溫育20個小時。通過離心除去細胞。上清液的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳顯示了與所期望的多肽一致的相對分子量12kDa的條帶。將本發明的多肽稱為「L12蛋白」，因為通過SDS-PAGE測量所述多肽的相對分子量為12kDa(但是，理論上的分子量可計算至9591.56Da)。實施例2地衣芽孢桿菌搖瓶發酵的純化將實施例1中的發酵液(fermentationbroth)離心(20000×g，20分鐘)並且小心地將上清液從沉澱中傾析。通過SeitzEKS平板過濾混合的上清液以除去芽孢桿菌屬細胞。將EKS濾液在Filtron3k截留(cut-off盒中超濾並且滲濾以濃縮蛋白和減少SeitzEKS濾液的傳導性(conductivity)。通過另一個SeitzEKS平板過濾Filtron濃縮物。將濃縮物的pH用20％CH3COOH調整至pH4.5。pH調整將溶液中的一些物質(非L12蛋白)沉澱，將這種沉澱物由通過SeitzK-250平板的過濾去除。將K-250濾液上樣於100ml的SP-SepharoseFF柱，該柱在用NaOH調整至pH4.5的20mMCH3COOH、50mMH3BO3、1mMCaCl2中平衡。在用平衡緩衝液將柱充分洗滌後，用線性NaCl梯度(0-->0.5M)在相同的緩衝液中洗脫L12蛋白。通過SDS-PAGE分析鑑定包含L12蛋白的級分(fractions)，並將這些級分匯集並用去離子水稀釋10倍以減少集合物(pool)的傳導性。將集合物上樣於以相同的平衡緩衝液(20mMCH3COOH、50mMH3BO3、1mMCaCl2，用NaOH調整至pH4.5)平衡的8mlSOURCES柱，並且在以平衡緩衝液充分洗滌柱後，用相同緩衝液中的線性NaCl梯度(0-->1.0M)洗脫L12蛋白。通過SDS-PAGE分析，分析來自柱的級分，並匯集包含L12蛋白的級分，用3％NaOH將pH調整至pH8，並且將集合物置於冷室(coldroom)至第二天。pH8的調整引起L12蛋白沉澱，並且在第二天通過離心(5000×g，10分鐘)收集L12沉澱。將L12蛋白沉澱以20mMTris/HCl，pH8的洗滌以增加沉澱的L12蛋白的純度。第二次離心(5000×g，10分鐘)後，將L12蛋白沉澱在最小體積的(20mMCH3COOH、50mMH3BO3、1mMCaCl2，100mMNaCl，用NaOH調整至pH4.5)中溶解並上樣於以相同的緩衝液平衡的300mlSuperdex75大小排阻柱。以相同的緩衝液洗脫Superdex75柱，並用SDS-PAGE分析來自柱的級分。在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上僅看到一個條帶處的級分匯集作為純化的L12蛋白製備物。將甘油加入匯集的L12級分至50％(w/w)的終濃度。將以甘油配製的L12蛋白(glycerolformulatedL12protein)冷藏於冰箱中。當在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上測定時，製備物是基本上純的(一條帶)。特性由SDS-PAGE測量的相對分子量為Mr＝12kDaN-末端的序列為WVNPGYHYQYPSEGG(SEQIDNO5)實施例3地衣芽孢桿菌的補料分批發酵按下文所述進行地衣芽孢桿菌ATCC14580的補料分批發酵過程。所有的培養基通過本領域已知的方法滅菌。除非另有說明，使用自來水。下文配方(recipe)中涉及的組分濃度是在任何接種之前的濃度。培養基LB瓊脂10g/l來自酪蛋白的蛋白腖(例如，Fluka目錄號95039，來自酪蛋白的胰蛋白酶消化物)；5g/l酵母提取物(通過釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的自溶製造，例如來自OrganotechnieS.A.，27，avenueJeanMermoz，F-93120LaCoumeuve，France的目錄號9512)；10g/lNaCl；12g/lBacto-瓊脂(LB-瓊脂(Miller)，Merck目錄號110283)，調整至pH7.0+/-0.2。M-9緩衝液Na2HPO4·2H2O(Di-Sodiumhydrogenphosphate，2H2O)8.8g/l；KH2PO4(potassiumdihydrogenphosphate)3g/l；NaCl4g/l；MgSO4·7H2O0.2g/l(在此緩衝液中使用去離子水)。PRK-50110g/l大豆粗粉(soygrits)；Na2HPO4·2H2O5g/l；消泡劑(例如StruktolSB2121，Schill&Seilacher，Hamburg，Germany)1ml/l；在滅菌前用NaOH/H3PO4將pH調整為8.0。組成培養基(make-upmedium)胰蛋白腖(酪蛋白水解物，例如BactoTMTryptone，酪蛋白的胰腺消化物，目錄號211699)30g/l；MgSO4·7H2O4g/l；K2HPO47g/l；Na2HPO4·2H2O7g/l；(NH4)2SO4(di-ammoniumsulphate)4g/l；檸檬酸0.78g/l；維生素(二氯硫胺素(thiamin-dichlorid)34.2mg/l；核黃素2.9mg/l；煙酸23mg/l；D-泛酸鈣(calciumD-pantothenate)28.5mg/l；鹽酸吡哆醛(pyridoxal-HCl)5.7mg/l；D-生物素1.1mg/l；葉酸2.9mg/l)；痕量金屬(MnSO4·H2O39.2mg/l；FeSO4·7H2O157mg/l；CuSO4·5H2O15.6mg/l；ZnCl215.6mg/l)；消泡劑(StruktolSB2121，見上文)1.25ml/l；在滅菌前用NaOH/H3PO4將pH調為6.0。接種28和47小時後(即大約分別為1天和2天後)加入丙二醇(Monopropyleneglycol)(MPG)24ml/l，加入總共48ml/l的MPG。補料培養基(Feed-medium)葡萄糖·1H2O820g/l。發酵方法將地衣芽孢桿菌ATCC14580(ATCC14580)在LB瓊脂斜面上在37℃培養一天。隨後用M-9緩衝液洗滌瓊脂，並測量所得細胞懸液在650nm的光密度(OD)。用OD(650nm)×ml細胞懸液＝0.1的接種物(其意指每ml所需的接種物的量通過將0.1除以接種物細胞懸液的OD(650nm)來確定)將接種搖瓶(具有100ml培養基PRK-50)接種。將搖瓶在37℃以300rpm培養20小時。所用的發酵罐為標準實驗室發酵罐，其配備了溫度控制系統、使用氨水和磷酸的pH控制、測量完全發酵過程中的＞20％氧飽和度的溶氧電極。通過用來自接種物搖瓶的生長培養物接種主發酵罐，開始在主發酵罐(發酵罐(fermentationtank))中的發酵。接種的體積為組成培養基的10％(80ml用於720ml組成培養基，接種後產生800ml的初始培養液(initialbroth))。發酵參數為溫度41℃；pH6.8-7.2(用氨水和磷酸，控制6.8(氨水)，7.2磷酸)。通氣1.5L/min/kg的發酵液重量，攪拌1500rpm。如下加入補料培養基在發酵起始時，初始補料速率0.05g/min/kg，8小時後線性增加至0.16g/min/kg，並且保持在0.16g/min/kg直至發酵末(通過參考恰好在接種後發酵液的起始重量)。3天(70小時)後收穫發酵液並且如下面實施例4中所述進行純化。實施例4地衣芽孢桿菌補料分批發酵的純化將來自實施例3的發酵液離心(20000×g，20分鐘)，並且小心地將上清液從沉澱中移出。將組合的上清液通過SeitzK-250平板過濾，接著通過SeitzEKS平板過濾以除去剩餘的芽孢桿菌屬宿主細胞。EKS濾液的傳導性為10mS/cm。將100mlEKS濾液在用NaOH調節至pH4.5的20mMCH3COOH、50mMH3BO3、1mMCaCl2中稀釋10x，並且將稀釋的EKS濾液的pH用20％CH3COOH調整為pH4.5。將稀釋的EKS濾液上樣於19mlSP-sepharoseFF柱，該柱在用NaOH調節至pH4.5的20mMCH3COOH、50mMH3BO3、1mMCaCl2中平衡。用平衡緩衝液充分洗滌柱後，用線性NaCl梯度(0-->0.5M)在相同的緩衝液中洗脫L12蛋白。通過SDS-PAGE分析鑑定包含L12蛋白的級分，將這些級分匯集並且用去離子水稀釋10倍以減少集合物的傳導性。將集合物上樣於在相同的平衡緩衝液(20mMCH3COOH、50mMH3BO3、1mMCaCl2，用NaOH調整至pH4.5)中平衡的8mlSOURCES柱，並且在用平衡緩衝液充分洗滌柱後，用線性NaCl梯度(0-->1.0M)在相同的緩衝液中洗脫L12蛋白。通過SDS-PAGE分析，分析來自柱的級分，將包含L12蛋白的級分匯集並且上樣於120mlSuperdex75的大小排阻柱，該柱在用NaOH調整至pH4.5的20mMCH3COOH、50mMH3BO3、100mMNaCl、1mMCaCl2中平衡。用相同的緩衝液洗脫Superdex75柱，並且通過SDS-PAGE分析，分析來自柱子的級分。將在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上在12kDa處產生強條帶的級分匯集作為純化的L12蛋白製備物。通過考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠判斷，所述製備物是至少90％純的，並且如通過SDS-PAGE所測定的，相對分子量為Mr＝12kDa。N-末端序列為WNVPGYHYQY(SEQIDNO5的胺基酸1-10)。實施例5在動物飼料中的體內性能(籠實驗)動物飼料中的L12蛋白的性能在雛雞生長試驗中用於下參數評價生長試驗第8天到第29天(第0天＝孵化日)處理A對照；B5mg純化的L12蛋白/kg飼料飲食玉蜀黍/SBM48飲食(參見飼料組合物，表1)混合後將飼料在約70℃顆粒化(3×25mm)。將L12蛋白在500ml水中稀釋並噴灑至顆粒上。對於對照處理，將相同量的水噴灑至顆粒上。重複(Replicates)8組，每組6隻雄性小雞，ROSSPM3，每個處理餵養(feeding)隨意地餵食顆粒。表1實驗飲食的飼料組合物1TiO2作為不消化的標記包含於飼料混合物中2可從DSMNutritionalProductsNV，Dorpsstraat4，B-9800Deinze，Belgium以商業途徑獲得，並且包括拉沙洛西鈉(LasalocidSodium)3以EC-方程式(EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlaméthodedecalculdelavaleurénérgétiquedesalimentscomposésdestinésàlavolaille；JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54)計算4飼養材料的原材料；可從法國Hirsingue的MoulinModerneHirsingue獲得5大豆粉，油製造業的殘餘物，飼養材料的原材料；可從法國Hirsinque的MoulinModerneHirsinque獲得表2雄性雛雞的性能；平均值±標準偏差(stdev)Newman-Keuls試驗一行內不共享共同上標的平均值顯著不同(p＜0.05)。實施例6由PCR鑑定的具有L12樣基因的芽孢桿菌菌株通過PCR在許多其它地衣芽孢桿菌菌株中鑑定了與編碼L12蛋白的基因(SEQIDNO1)相似的基因。從在TY瓊脂平板上(對於配方，參見實施例1)在37℃培養過夜的11個不同的地衣芽孢桿菌菌株中分離用作PCR反應模板的DNA。在0.1mlH2O中懸浮具有來自每個菌株的細胞的一個接種管，並且煮沸10分鐘，離心，將來自每管的5微升上清液在如下所述的PCR反應中用作模板。PCR反應在AmershamBiosciences的「PureTaqTMReady-ToGoTMPCRBeads」中運行5微升DNA模板+2×1微升的引物Pep481(SEQIDNO6)和Pep482(SEQIDNO7)引物+18微升H2O。PCR程序1)95℃3分鐘；2)95℃10秒；3)65℃30秒，每循環-1℃(-1℃pr.cycle)；4)72℃1分鐘；5)回到2)9次；6)95℃10秒；7)55℃30秒；8)72℃1分鐘；9)回到6)19次；10)72℃5分鐘；11)4℃永遠(forever)，其意味著步驟10)後，將溫度降低至4℃。引物Pep481AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3』(SEQIDNO6)Pep482TTAAGAATTCGAATGAAAGAGGAGGAATG-3』(SEQIDNO7)將從5個陽性菌株(陽性意指產生正確大小的DNA條帶)中得到的0.4kbPCR片段純化，並且用於DNA測序實驗，再次使用Pep481(SEQIDNO6)和Pep482(SEQIDNO7)作為測序引物。5個陽性菌株中的3個產生了相同的DNA序列地衣芽孢桿菌ATCC14580、地衣芽孢桿菌NCIMB6346(＝DSM8785)和地衣芽孢桿菌菌株712，導致SEQIDNO2的胺基酸序列。在地衣芽孢桿菌菌株470中，DNA變化導致兩個胺基酸變化(SEQIDNO9)，但在成熟肽中無變化。在地衣芽孢桿菌菌株009中，DNA變化導致15個胺基酸變化(SEQIDNO8)，其中8個在成熟肽中。而且，共有序列(SEQIDNO10)源自SEQIDNOs2、8和9。注意在這個實驗中，編碼SEQIDNO2的7個C-末端胺基酸的核苷酸包含於Pep481引物(SEQIDNO6)中，並且SEQIDNOs8-9的7個C-末端胺基酸殘基可能因此不正確。然而SEQIDNOs8-9的正確性在後面得以確認。分離自稱為BioPlusTM2B(由Chr.HansenA/S，10-12BoegeAllé，DK-2970Hoersholm，Denmark提供)的飼料中益生產品(in-feedprobioticproduct)的地衣芽孢桿菌菌株包含於測試的11個菌株中，但其是陰性的。另外，如上所述試驗了44個其它地衣芽孢桿菌菌株。在其中的27個菌株中發現了陽性的PCR反應。發現為L12陽性的其它公眾可以獲得的地衣芽孢桿菌菌株的實例具有下列保藏號NCTC1024、NCTC1025、NCTC2120、NCTC7589、NCTC9932、ATCC21424、NCIMB10689、ATCC53757。NCTC為國立典型培養物保藏中心(NationalCollectionofTypeCultures)。ATCC是美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)。NCIMB是國立工業、食品和海洋細菌保藏中心(NationalCollectionofIndustrial，MarineandFoodBacteria)。實施例7熱穩定性使用差示掃描量熱法(DSC)以測定L12蛋白在pH2.5、4.0和7.0的溫度穩定性。將濃度約2mg/ml的純化的L12相對於適當的緩衝液在4℃透析過夜，並且以1.5℃/min的恆定掃描速率(constantscanrate)從20至90℃在VP-DSC儀器(MicroCal)上運行。使用MicroCalOrigin軟體(版本4.10)進行數據處理(data-handling)，並且將變性溫度定義為在焓峰值(enthalpypeak)頂點的溫度。在10mM檸檬酸、50mMNaCl、pH2.5中，發現L12具有55℃的變性溫度。在10mM醋酸鈉、50mMNaCl、pH4.0中，L12在69℃變性，並且在10mM磷酸鈉、50mMNaCl、pH7.0中，變性溫度為60℃。實施例8體內和體外消化道微生物區系調節將L12蛋白對消化道微生物區系影響進行a)體內評估，在小豬和雛雞中；和b)體外評估，對從消化道微生物區系分離的微生物。小豬研究根據法國對於使用活體動物實驗的法律規章來進行的此項研究，對5ppmL12(5mg純化的L12/kg飼料)對於小豬消化道微生物區系的影響進行了評估。使初始體重25.3±1.3kg的10隻小豬(Large-White、蘭德瑞斯豬(Landrace)和Piétrain的雜交種，從法國Ostheim的GAECLeclerc獲得)經受迴腸直腸吻合術(ileo-rectalanastomosis)(將末端迴腸連接至直腸的末端，繞開盲腸和結腸)。在這些小豬中，可在肛門水平收集末端迴腸的微生物區系，並且該微生物區系是腸的所有連續消化部分的細菌種群的代表。手術後，在手術恢復期間和實驗期期間，將動物放入代謝籠(metaboliccages)中，以便於迴腸-直腸內容物的取樣。在6周的實驗過程中，將小豬各個並且交替地(eachandalternatively)餵食(按雙拉丁平方設計(double-latin-squaredesign)，以減少個體差異的影響以及處理順序的任何潛在影響)補充以試驗化合物或不含試驗化合物的基本飲食。所述飲食組成如下飲食AKLIBA，可從瑞士Kaiseraugst的Provimi-Kliba獲得，具有18％大豆粉、53％玉蜀黍、13％大麥、6％燕麥粉、5.4％小麥麩(wheatbran)、1％大豆油、3.6％礦物、維生素和合成胺基酸(w/w)。飲食E飲食A加入了5mg/kg的蛋白L12。飲食B、C和D包含與本發明不相關的其它試驗化合物。將試驗化合物(包括L12)在Buhler混合器(Buhler，Aschwill，瑞士)中混合至飲食中。製備實驗飲食並且以糊狀形式(mashform)施用於小豬。將實驗飲食以每天2kg的水平分配在8:00和15:30相等的2餐中提供給動物。在每一個處理期的最後兩天從每一隻動物取樣迴腸直腸內容物，並且測定乾物質(drymatter)的濃度和微生物區系的不同組分的濃度。在實驗過程中，動物未顯示任何中毒症狀或疾病症狀。在觀察過程中，它們每天的增重(dailyweightgain)為1.14+/-0.1kg，該數值為很好的畜牧學表現。在實驗的末期，在鎮定(tranquilisation)後，通過致死注射對動物實施安樂死。依據標準的AssociationofOfficialAnalyticalChemists(AOAC)方法(1009)(AssociationofOffcialAnalyticalChemists.(1990).(Officialmethodsofanalysis.15thedition.AssociationofOffcialAnalyticalChemists.Arlington.)，在105℃過夜乾燥1g樣品後，測定樣品的乾物質含量。如下進行微生物區系的分析排洩(emission)後，立即將10g迴腸直腸內容物轉移至包含100ml氯化鈉蛋白腖培養液(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號10582)的燒瓶中並且均質化。在排洩和除去迴腸內容物之間經過少於5分鐘，將該迴腸內容物快速地轉移至無氧室(AESCheminex，Combourg，法國)。隨後，將樣品用氯化鈉蛋白腖培養液以10倍梯度(step)從10-1連續稀釋至10-8(wt/vol)。用兩個複製平板獲得所有細菌計數(counts)。總的兼性厭氧計數代表生長於補充有羊血(5％vol/vol，由AESCheminex，Combourg，法國提供)的Brucella瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號10490)上的菌落的平均數目。在37℃在無氧箱中將平板溫育5天。在MRS瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號110660)上計數乳酸細菌，並且在Rogosa瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號105413)上計數乳桿菌屬(Lactobacillus)菌種。在37℃在無氧箱中將兩個平板溫育48小時。在V.R.B.D瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號110275)上對腸桿菌科(Enterobacteriacae)計數。在Coli-ID顯色培養基(BioMérieux，Marcyl』Etoile，France，目錄號42017)上分析大腸桿菌和其它腸桿菌科。這種培養基包含兩種顯色底物一種產生粉紅菌落(pinkcolonies)用於檢測β-D-葡糖苷酸酶(glucuronidase)(大腸桿菌)，另一種產生藍色菌落用來檢測半乳糖苷酶(其它腸桿菌科細菌)。在37℃將兩個平板有氧溫育24小時。在37℃，有氧溫育48小時後，在腸球菌瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號65009)上評估腸球菌屬菌種，並且在BairdParker瓊脂上(AESCheminex，Combourg，France，目錄號AEB150302)評估葡萄球菌屬菌種。將樣品在80℃的水浴中加熱10分鐘後，使用在46℃在無氧室中溫育24小時的TSN瓊脂(BioMérieux，Marcyl』Etoile，France，目錄號51048)分離產氣莢膜梭菌。在革蘭氏染色並且使用適當API體系(BioMérieux，Marcyl』Etoile，France)進行生物化學試驗後，通過顯微檢查進一步確認了代表性菌落的特徵。對於每個試驗組，數據的統計分析涉及平均值、平均值標準偏差的計算以及方差分析，接著是斯氏t檢驗以評價組間差異的顯著性。各個細菌計數(每克迴腸內容物乾物質(DM)的菌落形成單位(CFU)的數目)+/-標準偏差(SD)呈現於下面的表3中，其也顯示相對於對照，由於加入5ppmL12引起的各個細菌計數中的改善。表3小豬迴腸直腸消化道微生物區系中的細菌含量在這個試驗中，發現細菌計數中無顯著差異，僅觀察到數字影響(numericeffect)，但有時它們很強。在總的兼性厭氧細菌的平均值中發現了L12的正面影響(positiveeffct)，其中相對於對照計數增加了49％。在總的乳酸細菌和總的乳桿菌屬菌種中發現了L12的中性影響(neutraleffect)，所述細菌是腸小型生物群的有益細菌的代表。對總的腸桿菌科來說情形是一樣的。在小豬微生物區系中腸桿菌科群體的主要成員大腸桿菌增加了19％，而潛在致病的其它腸桿菌科(除了大腸桿菌)的組則強烈減少。對於腸球菌屬菌種的群體發現了L12的負面影響(negativeeffect)。在20個對照樣品(飲食A)中的13個樣品中發現了產氣莢膜梭菌，而其僅在補充了L12的飲食(飲食E)的20個樣品中的6個樣品中發現。因而用L12將這種致病細菌的群體顯著減少(減少99％)。雛雞研究在實施例5描述的雛雞生長試驗中，也評估了L12(每kg飼料中5mg純化的L12)對雛雞消化道微生物區系的影響。在處死雛雞後，使用盲腸內容物作為起始材料，如上所述(小豬研究)對來自每組的20個雛雞的微生物區系進行分析。雛雞盲腸內容物中細菌種群計數的結果顯示於表4中。表4雛雞盲腸微生物區系中的細菌含量在總的兼性厭氧細菌區系中發現了正面影響，所述區系統計學顯著地增加了178％。這種變化可由在補充了L12的組中觀察到的總的乳酸細菌觀察到的(數字的)增加來解釋。總的乳酸細菌代表總的厭氧的兼性厭氧生物區系的主要種群，並且主要由乳桿菌屬菌種組成，對於宿主的健康，所述乳桿菌屬菌種在由正常小型生物群(normalmicrobiota)所賦予的益處中起重要作用。在補充了L12的組中，大腸桿菌的計數在數字上，而非統計學上顯著增加。這與其它兩組微生物的計數的增加一致。參與這個實驗的所有動物都具有健康的並且平衡的盲腸微生物區系，並且在試驗過程中，沒有在動物中發現腹瀉疾病，表明可增加的是共生的(commensal)大腸桿菌菌株。消化道微生物區系的體外調節進一步在體外評價了L12對微生物區系的影響。將腸小型生物群中有益和有害微生物的細菌代表從小豬和雛雞腸內容物中分離。在革蘭氏染色和使用適當的API(BioMérieux，Marcyl』Etoile，France)體系進行生物化學試驗後，通過顯微鏡檢查確認了它們的特性。通過微滴定培養液稀釋法(microtitrebrothdilutionmethod)測量在595nm的吸光度，來測定L12對這些細菌的細菌生長的影響。所有這些體外檢驗在滅菌的96孔板(Falcon353072微滴定平板，BectonDickinsonLabware，Meylan，France)中的110微升終體積中如下進行將100微升懸液添加至包含連續2倍稀釋的L12的10微升水中或作為對照的10微升水中，所述懸液包含胰蛋白酶大豆培養液(Merck，Darmstadt，Germany，目錄號105459)中約105CFU/ml的純細菌。在純細菌最佳生長的適當溫度溫育適當的時間後，通過用MultiskanAscent(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)測量595nm的吸光度來測定生長抑制，參見表5。表5溫育條件通過從對照培養物的OD595減去24小時或48小時後(依據表5)試驗培養物的OD595，測定培養物密度的減少。通過將培養物密度的減少表示為對照培養物的OD595的百分比數來將其歸一化，並且MIC90對應於將培養物密度減少90％所需要的L12濃度，意思是抑制90％試驗的生物體的生長所需要的濃度(將MIC90定義為抑制90％的生物體生長所需要的最小抑制濃度(MinimumInhibitoryConcentration))。這些評價結果顯示於表6中。表6針對分離自小豬和雛雞腸內容物的細菌的MIC90L12對分離自豬和雛雞內容物的革蘭氏陽性球菌和梭菌(clostridia)比對分離自相同對象的革蘭氏陰性菌更具活性。這些結果至少部分地解釋了L12對胃腸小型生物群的影響所觀察的L12在體外對糞腸球菌和屎腸球菌的影響確認了小豬體內所觀察的腸球菌屬菌種中觀察到的減少。所觀察到的L12在體外對乳桿菌屬菌種的影響確認了小豬和雛雞體內研究的發現，即L12對來自豬和家禽的乳桿菌屬菌種在體內沒有負面影響。所觀察到的L12在體外對分離自雛雞腸內容物的產氣莢膜梭菌的影響確認了小豬體內觀察到的這個種群的強烈減少。實施例9體內在動物飼料中的性能(籠試驗)-各種劑量用於下參數在雛雞生長試驗中對L12蛋白在動物飼料中的性能做了評價生長試驗第8天至第29天(第0天＝孵化日)處理A對照；B2.5、5.0和7.5mg純化的L12蛋白/kg飼料食物玉蜀黍/SBM48食物(參見飼料組合物，表7)混合後將飼料在約70℃顆粒化(3×25mm)。將L12蛋白溶解在500ml水中並噴灑至顆粒上。對於對照處理，將相同量的水噴灑至顆粒上。重複10組，每組6隻雄性小雞，ROSSPM3，每個處理餵養隨意地餵食顆粒表7實驗飲食的飼料組合物成分(％)玉蜀黍4SBM4851TiO2作為不消化的標記包含於飼料混合物中2可從DSMNutritionalProductsNV，Dorpsstraat4，B-9800Deinze，Belgium以商業途徑獲得，並且包括拉沙洛西鈉(LasalocidSodium)3以EC-方程式(EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlaméthodedecalculdelavaleurénérgétiquedesalimentscomposésdestinésàlavolaille；JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54)計算4飼養材料的原材料；可從法國Hirsingue的MoulinModerneHirsingue獲得5大豆粉，油製造業的殘餘物，飼養材料的原材料；可從法國Hirsinque的MoulinModerneHirsinque獲得表8雄性雛雞的表現；平均值±標準偏差Newman-Keuls試驗一行內不共享共同上標的平均值是顯著不同的(p＜0.05)實施例10濃度測定將純化的L12蛋白製備物用作L12蛋白標準品(standard)。將其如實施例4所述製備，並且如實施例2所述用甘油配製。如HPLC所測量的(使用Waters2690分離組件(separationmodule)和Waters2487UV探測器，在280nm下檢測，使用柱ACEC185μm100150×3.0mm和Watersμ-BondapakC1820×3.9mm(保護柱)，0.5ml/分鐘的流速，10微升的注射體積，流動相AH2O18MΩ+0.1％TFA(Tri-FluorAceticacid；三氟乙酸)，流動相B乙腈+0.1％TFA)，純度在96％以上。如通過胺基酸分析所測定的(如下文所述)，標準品的L12濃度為3.6mg純蛋白/ml。通過也如下丈所述的SDS-PAGE凝膠方法，參考此標準品，來測定各種其它L12樣品的純度和濃度。胺基酸分析(AAA)-L12蛋白標準品的濃度將L12蛋白標準樣品的肽鍵經受酸水解，隨後依據製造商的說明書在Biochrom20PlusAminoAcidAnalyser上分離和定量釋放的胺基酸，Biochrom20PlusAminoAcidAnalyser可從Bie&BerntsenA/S，Sandbaekvei5-7，DK-2610Roedovre，Denmark以商業途徑獲得。對於所述酸水解，將蛋白樣品在真空離心機中乾燥，溶解(resolve)於18.5％(vol/vol)HCl+0.1％(vol/vol)酚中，並在110℃下溫育16小時。溫育後，將樣品在真空離心機中再次乾燥，溶解於上樣緩衝液(0.2M檸檬酸鈉，pH2.2)中並且上樣於Biochrom20PlusAminoAcidAnalyser。對於所述定量，將水解的樣品上樣於陽離子交換樹脂UltroPacno.8，Sodium-form的柱子，其可從Bie&BerntsenA/S以商業途徑獲得，目錄號80-2104-15。根據上面提到的製造商的說明書，將可變pH(pH1至pH8)和離子強度的緩衝液泵送通過柱，以分離各種胺基酸。也根據製造商的說明書，精確地控制柱溫度(從53℃到92℃再回到53℃)，以確保所要求的分離。將柱洗脫液與茚三酮試劑(Bie&Berntsen，目錄號80-2038-07)混合，並且將混合物穿過AminoAcidAnalyser的高溫反應螺旋管(hightemperaturereactioncoil)。在反應螺旋管中，茚三酮與胺基酸反應形成有色的化合物，該化合物的量與存在的胺基酸的量成正比例。L12蛋白樣品的濃度用於下方法測定各種L12樣品的濃度(所有提到的Novex產品商業上可從Invitrogen得到，參見www.invitrogen.com)在Eppendorf管中，將50微升L12溶液(0.1-1.0mgL12/ml)與5微升1％(w/v)EDTA+10微升6％PMSF+10微升0.5MDTT+25微升NuPageLDS樣品緩衝液(來自NOVEX的NP0007)混合，並將所述Eppendorf管加熱至95℃，持續5分鐘。將10微升的樣品上樣於10％Tris-Bis預製凝膠(precastgel)(NP0301BOX，來自NOVEX)。根據製造商的說明書，在200V恆壓下，用MES電泳緩衝液(MES＝2-(N-嗎啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethansulfonicacid)；來自NOVEX的NP0002)+抗氧化劑(來自NOVEX的NP0005)進行電泳。電泳後，在10％醋酸+50％EtOH中輕輕搖動凝膠10分鐘。接著用ColloidalBlue染色溶液(來自NOVEX的46-7016)輕輕搖動凝膠最少3個小時，並通過用蒸餾水輕輕搖動2至4小時來洗滌，其間將蒸餾水更換幾次。用配備了QuantityOne軟體(版本4.6.0，BioRad)的BioRadCalibratedDensitometerGS-800掃描溼凝膠，並根據製造商的說明書定量L12蛋白。將上述L12標準品用作標準品，即在0.1-1.0mg/ml範圍內的3-4次稀釋(inthree-fourdilutions)。實施例11對胃蛋白酶和胰酶的穩定性天然的L12純化的L12蛋白，在10mMTris/CH3COOH緩衝液pH4.5中稀釋至1mg/ml。變性的L12將純化的L12樣品(1mg/ml，在10mMTris/CH3COOH緩衝液pH4.5中)煮沸5分鐘以使蛋白變性。胃蛋白酶豬胃蛋白酶(SigmaP-7000，453單位/mg固體)。將30000單位/ml溶解於10mM琥珀酸pH3.0中。胰酶豬胰酶(SigmaP-7545，8xUSP)。將80mg/ml懸浮於0.5M磷酸鈉緩衝液pH7.0中。pH3的緩衝液10mM琥珀酸pH3.0。pH7的緩衝液0.5M磷酸鈉緩衝液pH7.0。製備下列樣品1)與胃蛋白酶和胰酶一起溫育的L12將278微升天然的或變性的L12+100微升胃蛋白酶溶液+122微升pH3緩衝液在40℃搖動溫育2個小時，將pH測量至3.5。隨後加入400微升pH7緩衝液+100微升胰酶懸液，接著在40℃搖動溫育4小時，將pH測量至7.0。2)與胃蛋白酶一起溫育的L12將278微升天然的或變性的L12+100微升胃蛋白酶溶液+122微升pH3緩衝液在40℃搖動溫育2小時(測量為pH3.5)。接著加入500微升pH7緩衝液(測量為pH7.0)。3)與胰酶一起溫育的L12將278微升天然的或變性的L12+222微升pH3緩衝液在40℃搖動溫育2個小時。隨後加入400微升pH7緩衝液+100微升胰酶懸液，接著在40℃搖動溫育4小時。4)L12對照樣品將278微升天然的或變性的L12+100微升胃蛋白酶溶液+122微升pH3緩衝液+400微升pH7緩衝液+100微升胰酶懸液在冰上混合併保持冰冷。5)胃蛋白酶對照樣品將100微升胃蛋白酶溶液+400微升pH3緩衝液在40℃搖動溫育2小時(測量為pH3.5)。接著加入500微升pH7緩衝液。6)胰酶對照樣品將500微升pH3緩衝液+400微升pH7緩衝液+100微升胰酶懸液在40℃搖動溫育4小時(測量為pH7.0)。7)胃蛋白酶+胰酶對照樣品將100微升胃蛋白酶溶液+400微升pH3緩衝液在40℃搖動溫育2小時(測量為pH3.5)。隨後加入400微升pH7緩衝液+100微升胰酶懸液，接著在40℃搖動溫育4小時(測量為pH7.0)。如實施例10中所述通過SDS-PAGE分析所有樣品。通過SDS-PAGE判斷，天然的L12未被胃蛋白酶、胰酶或胃蛋白酶之後接著胰酶處理降解。變性的L12大量地被胃蛋白酶、胰酶或胃蛋白酶之後接著胰酶處理降解，因為在相應樣品中的SDS-凝膠上沒有檢測到L12條帶。實施例12體內動物飼料性能(地板圍欄試驗(floorpentrial))本實施例評估L12蛋白在36天的完全生長周期中對雛雞生長性能的影響。從第1天至第36天，用雛雞進行生長性能試驗。將動物圈養於堆滿木材鋸末的地板圍欄中。在起始期(第1-22天)和生長期(第22-36天)期間，小雞接受基於小麥、黑麥和大豆粉的飲食(組成參見表9)。除了未補充的對照處理外，以每kg飼料7.5mg蛋白的劑量包含L12蛋白。生長試驗第1天至第36天(第0天＝孵化日)飲食小麥/黑麥/SBM48飲食(參見表9中的飼料組成)餵養隨意地餵食顆粒混合後將飼料在約70℃顆粒化(3×25mm)。將L12蛋白溶解於800ml和1200ml水中分別用於起始飼料(starterfeed)和生長飼料(growerfeed)，並噴灑至顆粒上。對於對照處理，將無L12蛋白的相同量的水分別噴灑在顆粒上。處理對照，每kg飼料7.5mgL12蛋白重複每個性別和處理20隻小雞的6個組(20隻雌性的6個組，20隻雄性的6個組)表9實驗飲食的飼料組成1TiO2作為不消化的標記包含於飼料混合物中2可從DSMNutritionalProductsNV，Dorpsstraat4，B-9800Deinze，Belgium以商業途徑獲得，並且包括拉沙洛西鈉(LasalocidSodium)3以EC-方程式(EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlaméthodedecalculdelavaleurénérgétiquedesalimentscomposésdestinésàlavolaille；JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54)計算4飼養材料的原材料；可從法國Hirsingue的MoulinModerneHirsingue獲得5大豆粉，油製造業的殘餘物，飼養材料的原材料；可從法國Hirsinque的MoulinModerneHirsinque獲得表10雛雞的表現；平均值±標準偏差Newman-Keuls試驗一行內不共享共同上標的平均值顯著不同(p＜0.05)*因為技術問題排除一個籠子L12蛋白稍微改進了小雞的重量增加(表10)，然而這種影響並不顯著。接受L12蛋白的小雞的飼料攝取與對照小雞的不同。與對照相比，飼料轉化比(FCR)通過L12蛋白得以顯著地改進，即提高2.7％。實施例13動物飼料和添加劑動物飼料添加劑通過將25g塗覆的T-顆粒加入以下預混合料(每千克(kilo)預混合料)來製備動物飼料添加劑，該T-顆粒包含20g/kg量的純化的L12蛋白(按EP569468B1的實施例3中所述製備，但是具有大約7％氫化棕櫚油和大約13％CaCO3的塗層)1100000IE維生素A300000IE維生素D34000IE維生素E250mg維生素B1800mg維生素B21200mgD-泛酸鈣500mg維生素B62.5mg維生素B125000mg煙酸10000mg維生素C300mg維生素K315mg生物素150mg葉酸50004mg氯化膽鹼6000mgFe3000mgCu5400mgZn8000mgMn124mgI60mgCo29.7mgSe9000mg拉沙洛西鈉(Avatec)17.3％Ca0.8％Mg11.7％Na動物飼料通過混合組分，製備具有以下組成(％，w/w)的雛雞生長飲食。可從法國Hirsingue的MoulinModerneHirsinque獲得小麥、黑麥和SBM48。混合後，在所期望的溫度例如約70℃將飼料顆粒化(3×25mm)。小麥46.00黑麥15.00大豆粉(SBM48)30.73大豆油4.90DL-甲硫氨酸0.04DCP(磷酸二鈣)1.65石灰石0.43鹽0.15TiO20.10動物飼料添加劑(見上)1.00所得的每kg動物飼料包含5.0mg純化的L12蛋白(5ppm)。以相同的方式製備其它的動物飼料和飼料添加劑組合物，但是用1013集落形成單位(ColonyFormingUnit；CFU)，優選以地衣芽孢桿菌ATCC14580的內生孢子的形式，替代每kg預混合料25g塗覆的L12CT顆粒，其產生每g飼料組合物具有約108CFU的動物飼料。序列表諾維信公司(NovozymesA/S)多肽和編碼該多肽的核酸10799.204-WO10PatentInversion3.31381DNA地衣芽孢桿菌ATCC14580(BacilluslicheniformisATCC14580)CDS(1)..(378)成熟肽(124)..(378)1atgaaaaatcatttgtatgagaaaaaaaagaggaaacctttgactcgg48MetLysAsnHisLeuTyrGluLysLysLysArgLysProLeuThrArg-40-35-30acaattaaagcgacgctcgccgtgttgacaatgtccatcgctttggtg96ThrIleLysAlaThrLeuAlaValLeuThrMetSerIleAlaLeuVal-25-20-15-10ggaggcgctacggtgccttcatttgcatgggtgaatccgggttatcac144GlyGlyAlaThrValProSerPheAlaTrpValAsnProGlyTyrHis-5-115taccagtacccatcggaaggtggtacatggaggtatggattcgtaaac192TyrGlnTyrProSerGluGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsn101520gccgggctccgttcagagtacaaccacccgacaaaggtccacggctcg240AlaGlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProThrLysValHisGlySer253035acagtgcaaaagctcatcgatggaaaagtggataaaacgaatagaagt288ThrValGlnLysLeuIleAspGlyLysValAspLysThrAsnArgSer40455055attgatacggctgcgggccgctactctaatgcctatgtcggagccata336IleAspThrAlaAlaGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyAlaIle606570aactcacctggtcttaagggtcgttactactatcgcaccaactaa381AsnSerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn7580852126PRT地衣芽孢桿菌ATCC14580(BacilluslicheniformisATCC14580)2MetLysAsnHisLeuTyrGluLysLysLysArgLysProLeuThrArg-40-35-30ThrIleLysAlaThrLeuAlaValLeuThrMetSerIleAlaLeuVal-25-20-15-10GlyGlyAlaThrValProSerPheAlaTrpValAsnProGlyTyrHis-5-115TyrGlnTyrProSerGlyGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsn101520AlaGlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProThrLysValHisGlySer253035ThrValGlnLysLeuIleAspGlyLysValAspLysThrAsnArgSer40455055IleAspThrAlaAlaGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyAlaIle606570AsnSerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn75808531581DNA地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CDS(601)..(978)3gaattttccggaagctgaaacacccgtgatatatataaccataaattaaacagcataggc60ggattgtgcgagttcctccacattcggagtatttctgaatgatagagccacacggtccac120gttctcactggctaaccggatcaaatgatcttcaggagtcagcataatacatccagttca180ggtagataagatttgaatttggtgacttgcttttgttcttcttctttcattttctgacta240atccaaactggaaaaagcaggtcttttaacagattaggaggtttctgacatgcaccattc300ggtcactaaccgaatgcagtaaaggacactgtggtgcttgccagccattagggtattgag360gaggtgatcaaaatgctaggtgacagtatttcgtcgaagtggacaagtcgtgaccaaatg420acctcggatcgagggttggtcatggaggaaaaaattgatgtctggtgacaaagaggagtc480atgatcatggcaccgccaacgagggaaaaaactcttcccgcatcgacacggtatgtgggc540ggtgacaaactaacttatagagtaaatttattagtcgaatgaaagaggaggaatgaaata600atgaaaaatcatttgtatgagaaaaaaaagaggaaacctttgactcgg648MetLysAsnHisLeuTyrGluLysLysLysArgLysProLeuThrArg151015acaattaaagcgacgctcgccgtgttgacaatgtccatcgctttggtg696ThrIleLysAlaThrLeuAlaValLeuThrMetSerIleAlaLeuVal202530ggaggcgctacggtgccttcatttgcatgggtgaatccgggttatcac744GlyGlyAlaThrValProSerPheAlaTrpValAsnProGlyTyrHis354045taccagtacccatcggaaggtggtacatggaggtatggattcgtaaac792TyrGlnTyrProSerGluGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsn505560gccgggctccgttcagagtacaaccacccgacaaaggtccacggctcg840AlaGlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProThrLysValHisGlySer65707580acagtgcaaaagctcatcgatggaaaagtggataaaacgaatagaagt888ThrValGlnLysLeuIleAspGlyLysValAspLysThrAsnArgSer859095attgatacggctgcgggccgctactctaatgcctatgtcggagccata936IleAspThrAlaAlaGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyAlaIle100105110aactcacctggtcttaagggtcgttactactatcgcaccaac978AsnSerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn115120125taatcaaagggaaaacggttgctgtcaacggggctagcatggcaagacccagaaaagttc1038tgggagatcccgctttgcataagcgtattatagtggatgacgcgggctttgttgtttaca1098cttcttgcacctgctgacggcaatcatccctatctatgaaatcgagatttcagcaggccg1158ttattttcgagagagttaaatctatattcattgtttttattttggtaaggacataccgga1218ttttaggtttggattaccggtcgagttagcttgtcttttcgcccactaccgtgtcgatgc1278gggagcaatttaccagaagcacttaccgattgatagttttttattccggtgattgcaaag1338tttcataaactctgagaattcaataggggtaataccccgctttgaggggcgcggcatttt1398atgcgccccgagtatttattcttaaaatttttaaattaatgtatctatataaaaaggaga1458tgctttcggtgtactgccaaagcatctccacaaaagatagtgcatatctgcaggaaaaaa1518cataaaatgcaactaacatttttttggaaagcaataggtttatttaattttgtagtttta1578tct15814126PRT地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)4MetLysAsnHisLeuTyrGluLysLysLysArgLysProLeuThrArg151015ThrIleLysAlaThrLeuAlaValLeuThrMetSerIleAlaLeuVal202530GlyGlyAlaThrValProSerPheAlaTrpValAsnProGlyTyrHis354045TyrGlnTyrProSerGluGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsn505560AlaGlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProThrLysValHisGlySer65707580ThrValGlnLysLeuIleAspGlyLysValAspLysThrAsnArgSer859095IleAspThrAlaAlaGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyAlaIle100105110AsnSerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn115120125515PRT地衣芽孢桿菌ATCC14580(BacilluslicheniformisATCC14580)MISC_FEATUREN-末端5TrpValAsnProGlyTyrHisTyrGlnTyrProSerGluGlyGly151015631DNA人工的引物Pep481misc_feature引物6aattacgcgtgttggtgcgatagtagtaacg31729DNA人工的引物Pep482misc_feature引物7ttaagaattcgaatgaaagaggaggaatg298125PRT地衣芽孢桿菌菌株009(Bacilluslicheniformisstrain009)成熟肽(41)..(125)8MetLysAsnLeuLeuAsnLysLysLysArgLysProLeuThrArgThr-40-35-30-25IleLysAlaThrPheAlaValLeuThrValSerIleGlyLeuValGly-20-15-10GlyAlaThrValProAlaPheAlaTrpValAsnProAspTyrHisTyr5-115GlnTyrProSerGluGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsnLeu101520GlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProLysLysValHisGlySerThr25303540ValGlnLysLeuIleAspGlyLysValGluLysThrAsnArgSerLeu455055AspThrAlaProGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyValValAsn606570SerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn7580859126PRT地衣芽孢桿菌菌株470(Bacilluslicheniformisstrain470)成熟肽(42)..(126)9MetLysAsnTyrLeuTyrGluLysLysLysArgLysProLeuThrArg40-35-30ThrIleLysAlaThrLeuAlaValLeuThrMetSerIleAlaLeuVal-25-20-15-10GlyGlyAlaThrValProAlaPheAlaTrpValAsnProGlyTyrHis-5-115TyrGlnTyrProSerGluGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsn101520AlaGlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProThrLysValHisGlySer253035ThrValGlnLysLeuIleAspGlyLysValAspLysThrAsnArgSer40455055IleAspThrAlaAlaGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyAlaIle606570AsnSerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn75808510126PRT人工的共有序列成熟肽(42)..(126)10MetLysAsnHisLeuTyrGluLysLysLysArgLysProLeuThrArg-40-35-30ThrIleLysAlaThrLeuAlaValLeuThrMetSerIleAlaLeuVal-25-20-15-10GlyGlyAlaThrValProAlaPheAlaTrpValAsnProGlyTyrHis-5-115TyrGlnTyrProSerGluGlyGlyThrTrpArgTyrGlyPheValAsn101520AlaGlyLeuArgSerGluTyrAsnHisProThrLysValHisGlySer253035ThrValGlnLysLeuIleAspGlyLysValAspLysThrAsnArgSer40455055IleAspThrAlaAlaGlyArgTyrSerAsnAlaTyrValGlyAlaIle606570AsnSerProGlyLeuLysGlyArgTyrTyrTyrArgThrAsn758085布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格諾維信公司(NovozymesA/S)原始保藏情況下的證明Krogshojvej36其按照細則7.1，由在本頁底部確認的2880Bagsvaerd國際保藏單位丹麥頒布當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。表DSMZ-BP/4(只此一頁)12/2001布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格諾維信公司(NovozymesA/S)存活證明Krogshojvej36其按照細則10.2，由在下一頁確認的2880Bagsvaerd國際保藏單位丹麥頒布1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。3用打叉表示選定。4如果要求該信息並且如果檢驗為陰性，則填寫此項。表DSMZ-BP/9(只此一頁)12/2001布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格諾維信公司(NovozymesA/S)原始保藏情況下的證明Krogshojvej36其按照細則7.1，由在本頁底部確認的2880Bagsvaerd國際保藏單位丹麥頒布當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。表DSMZ-BP/4(只此一頁)12/2001布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格諾維信公司(NovozymesA/S)存活證明Krogshojvej36其按照細則10.2，由在下一頁確認的2880Bagsvaerd國際保藏單位丹麥頒布1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。3用打叉表示選定。4如果要求該信息並且如果檢驗為陰性，則填寫此項。表DSMZ-BP/9(只此一頁)12/200權利要求1.選自下組的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的胺基酸1-85具有至少33％同一性程度的胺基酸序列；(b)由核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在低嚴緊條件與下列序列雜交(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；(c)多肽的變體，其具有包含一個或多個胺基酸的取代、缺失、延伸和/或插入的SEQIDNO2的胺基酸1-85的胺基酸序列；(d)(a)或(b)的等位基因變體；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段；條件為該多肽不是SEQIDNO4的胺基酸1-126。2.根據權利要求1的多肽，其通過改進飼料轉化比(FCR)和/或調節消化道微生物區系，改進了動物飼料的利用。3.分離的核酸序列，其包含編碼多肽的核酸序列，其(a)編碼權利要求1的多肽；(b)在非常低的嚴緊條件下與下列序列雜交(i)SEQIDNO1的核苷酸124-378，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和/或(c)與SEQIDNO1的核苷酸124-378具有至少48％的同一性程度；條件是該核酸序列不是(iv)SEQIDNO3，且不是(v)SEQIDNO3的核苷酸601-978，且不是(vi)SEQIDNO1的核苷酸1-381。4.根據權利要求3的核酸序列，其編碼權利要求2的多肽。5.核酸構建體，其包含權利要求3-4任一項的編碼多肽的核酸序列，該核酸序列可操作地連接於一個或多個控制序列，該控制序列指導所述多肽在芽孢桿菌屬宿主細胞中產生，當收穫該宿主細胞的DNA並將其在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作DNA模板時，導致產生大小約0.4kb的PCR片段。6.重組表達載體，其包含權利要求5的核酸構建體。7.重組芽孢桿菌屬宿主細胞，其包含權利要求5的核酸構建體或權利要求6的載體，當收穫該宿主細胞的DNA並將其在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作DNA模板時，導致產生大小約0.4kb的PCR片段。8.產生權利要求1-2任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養權利要求7的重組宿主細胞以產生包含多肽的上清液；以及(b)回收所述多肽。9.產生權利要求1-2任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養芽孢桿菌屬菌株，當收穫其DNA並將其在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作DNA模板時，導致產生大小約0.4kb的PCR片段；以及(b)回收所述多肽。10.i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)權利要求1-2任一項的多肽在動物飼料中的用途。11.i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)權利要求1-2任一項的多肽在製備用於動物飼料的組合物中的用途。12.改進動物飼料轉化比(FCR)的方法，其中將i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)權利要求1-2任一項的多肽加入飼料中。13.調節動物消化道微生物區系的方法，其中將i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)權利要求1-2任一項的多肽加入飼料中。14.動物飼料添加劑，其包含(a)i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)權利要求1-2任一項的多肽；以及(b)至少一種脂溶性維生素，(c)至少一種水溶性維生素，(d)至少一種痕量礦物，和/或(e)至少一種大量礦物。15.動物飼料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量並包含i)具有SEQIDNO4的胺基酸1-126的多肽和/或ii)權利要求1-2任一項的多肽。16.芽孢桿菌屬菌株在動物飼料中的用途，當收穫所述芽孢桿菌屬菌株的DNA並將其在以SEQIDNOs6和7作為引物的PCR反應中用作DNA模板時，導致產生大小約0.4kb的PCR片段。18.如權利要求16所定義的芽孢桿菌屬菌株在製備用於動物飼料的組合物中的用途。19.改進飼料轉化比(FCR)的方法，其中將如權利要求16所定義的芽孢桿菌屬菌株加入動物飼料中。20.調節消化道微生物區系的方法，其中將如權利要求16所定義的芽孢桿菌屬菌株加入動物飼料中。21.動物飼料添加劑，其包含(a)如權利要求16所定義的芽孢桿菌屬菌株；和(b)至少一種脂溶性維生素，(c)至少一種水溶性維生素，(d)至少一種痕量礦物，和/或(e)至少一種大量礦物。22.動物飼料組合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量並且包含如權利要求16所定義的芽孢桿菌屬菌株。23.糞腸球菌DSM18047。24.唾液乳桿菌DSM18070。全文摘要本發明涉及分離的多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列，以及產生該多肽和在動物飼料中使用該多肽的方法。本發明多肽的實例是來自地衣芽孢桿菌ATCC14580的所謂的L12蛋白，該蛋白改進了飼料轉化比(FCR)和/或作為消化道微生物區系調節劑發揮功能。本發明進一步涉及產生與L12有關的蛋白的芽孢桿菌屬菌株的益生菌用途。文檔編號C07K14/32GK101189255SQ200680017809公開日2008年5月28日申請日期2006年3月22日優先權日2005年3月22日發明者彼得·R·奧斯特加德,萊恩·N·安德森,奧裡莉亞·賽翁,卡洛斯·西莫斯-努涅斯,安娜-瑪利亞·克倫特,倫納多·德瑪利亞,比約恩·E·克裡斯坦森申請人:諾維信公司