Pfp基因在控制水稻苗期耐熱性中的應用的製作方法

2023-12-09 09:37:26 3

Pfp基因在控制水稻苗期耐熱性中的應用的製作方法
【專利摘要】一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應用，通過對水稻苗期耐熱相關基因PFP進行克隆，構建該基因的過表達載體，並通過基因槍法獲得轉基因陽性植株，轉基因植株與對照相比，苗期耐熱性得到提高。本發明的編碼基因對提高水稻耐熱性及相關性狀的改良具有重要的理論及實際意義。對數個代表性地方水稻品種的耐熱表型和耐熱基因PFP基因型的相關性分析表明，該基因的基因型與品種的耐熱表型存在顯著相關性。進一步研究還表明，耐熱基因PFP在鹽和低溫脅迫下基因表達上調，在PEG乾旱脅迫條件下基因表達下調。為深入分析該基因的功能、表達奠定了基礎，為闡明水稻耐熱的遺傳調控網絡提供了支撐。
【專利說明】PFP基因在控制水稻苗期耐熱性中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及水稻基因工程【技術領域】，具體涉及通過克隆及功能驗證得到一種與水稻苗期耐熱性相關的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應用。
【背景技術】
[0002]植物生長過程中經常會遭受高溫、乾旱等各種逆境的脅迫，在很大程度上降低其產量並限制其種植區域。隨著全球環境的變化加劇和人口的增長，對糧食的需求的壓力越來越大，迫切需要培育在各種逆境下生長的作物。隨著分子生物學技術的發展，對植物適應逆境機制的研究從生理水平步入分子水平，研究的目的不僅在於從分子水平上解釋植物適應逆境的機制，而且希望獲得各種抗逆基因，用於作物的遺傳工程抗逆育種。
[0003]水稻是世界上最重要的糧食作物之一。日本和國際水稻所較早地開展了耐熱水稻品種選育的研究。日本學者Satake等曾進行過耐熱品種的篩選以及耐熱性的數量遺傳分析，發現水稻對高溫的耐性具有品種特異性；我國學者徐雲碧等也報導不同品種耐熱性差異較大。這些研究表明，遺傳因素是決定水稻品種間耐熱性差異的主要原因。近年來，隨著分子標記技術的發展和廣泛應用，出現了一些利用分子標記對水稻耐熱性進行數量性狀基因座(Quantitative trai t loci, QTL)定位研究的報導。
[0004]隨著全球氣候的變暖，水稻耐熱相關基因的挖掘和耐熱水稻品種選育已成為水稻遺傳育種方向的重要課題。但是，目前鮮有關於水稻耐熱基因克隆及其在水稻育種中應用的研究報導。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應用。 申請人:利用基因晶片，對熱敏感的野生稻滲入系YIL106和耐熱的輪迴親本特青在高溫處理後的基因表達譜進行分析，結合QTL定位結果和生物信息學方法，利用野生稻滲入系群體對QTL定位區域內的差異表達基因進行分析和驗證，篩選出與水稻苗期耐熱性相關的基因L0C_0s01gl9020,該基因屬於過氧化物酶家族類(Peroxidase familyprotein)基因，命名為PFP，該基因的⑶S核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，序列長度為1044bp，其編碼蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，胺基酸序列為347個。
[0006]本發明對控制水稻苗期耐熱基因PFP進行克隆，將其編碼區構建過表達載體，並通過基因槍法導入水稻苗細胞、組織或器官，獲得轉基因植株。對轉基因植株的表型檢測表明，其苗期耐熱在一定程度上得到提高，本發明克隆的水稻苗期耐熱基因為水稻耐熱品種選育提供了新的基因資源。
[0007]以下將對本發明作進一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是PFP基因在HL106與特青中基因編碼蛋白比較圖，下劃線處表示兩者之間的編碼蛋白差異。
[0009]圖2是本發明的PFP基因的過表達載體酶切驗證電泳圖。
[0010]其中:0為Marker ; 1-2為Kpn和Spe I雙酶切，為陽性克隆。
[0011]圖3是利用潮黴素引物序列進行PCR篩選PFP轉基因植株的電泳圖。
[0012]其中:0為Marker ;1_9為陽性轉化植株；10_12為水，陰性對照。
[0013]圖4是本發明的轉基因植株和對照中花17高溫處理後的表型比較圖。
[0014]其中:A為中花17，B為轉基因植株。
[0015]圖5是PFP基因分別受NaCl、4°C低溫、PEG和ABA處理後的表達情況。
[0016]其中，A表示NaCl，B表示4°C低溫，C表示PEG，D表示ΑΒΑ。
【具體實施方式】
[0017]1.實驗材料
[0018]野生稻熱敏感滲入系HL106 (PFP基因型同野生稻)、耐熱輪迴親本特青、77個地方水稻品種。實驗中所用的各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、Taq Plus酶等購自TAKARA公司，PCR所使用的PCR Buffer、dNTP、TRIzol RNA提取試劑盒、大腸桿菌(E.coli)T0P10購自天根生物工程公司，反轉錄酶購自六合通公司，基因晶片實驗中所用試劑盒購自Qiagen公司，實驗中所使用的各種引物由北京奧科生物技術公司合成，各種序列分析由北京六合華大基因科技公司進行測序。
[0019]2.PFP基因序列及耐熱相關性分析
[0020]PFP基因序列的擴增和測序分析
[0021]為了獲得PFP基因序列全長編碼序列並驗證PFP基因在野生稻熱敏感滲入系YIL106和耐熱輪迴親本特青之間的基因組水平上是否存在差異，首先依據已公布的日本晴和9311的DNA序列設計引物:正向引物為5 ' -GGCGGATCCATGAGGCTGTCGGTGGCCATCC-3'(見 SEQ ID N0.3)，反向引物為 5' -GGCGGTACCTTAGTACAAGTGGTTGATGGCG-3'(見SEQ ID N0.4)，以HL106和特青兩個材料的苗期cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系共 20 μ 1:2 μ I 模板、0.2 μ I Taq plus (2.5U/μ I)、2 μ I Taq plus buffer (2x) > I μ IdNTPs (2.5mM)、2μ I primer、12.8 μ I ddH20 ;擴增程序:94 °C 5min ；94°C 30s, 58 °C 30s,72°C lmin, 35cycles ;72°C延伸 IOmin0
[0022]PCR產物通過I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，並送北京六合華大基因科技公司對基因組測序和Blast分析。結果表明，熱敏感滲入系HL106和耐熱親本特青擴增產物長均為1044bp，但兩者存在一個編碼蛋白差異(見圖1)。
[0023]PFP基因與耐熱性相關分析
[0024]選取77個代表性地方水稻品種進行了苗期耐熱性鑑定，種子用3%的次氯酸鈉消毒20min，清洗後，室溫浸種2d，30°C催芽2d，將出芽整齊的種子播種於管底剪去的96孔PCR塑料板，放到裝有Yoshida培養液的塑料盒子中培養，置於光照培養箱中培養，隔天換取營養液，培養條件為12h光照(28°C )/12h黑暗(26°C )，溼度70%。42°C處理兩葉一心幼苗，記錄各品種的耐熱表型，選取表型非常確定的17個品種為熱敏感品種(S)，16個品種為耐熱品種(R)。對這33個表型非常確定的品種分別提取基因組DNA，對目的基因PFP進行PCR擴增(引物和PCR程序、條件同上)、測序。結果發現，在耐熱品種中這兩個基因的序列大部分同特青相同，而熱敏感品種的基因序列大部分與YIL106 —致。通過對這33個水稻品種的耐熱表型和基因型的相關性分析發現PFP基因與苗期耐熱性存在顯著相關性相關係數R值為0.610。
[0025]3.PFP基因目的片段的擴增
[0026]從YIL106cDNA模板中擴增出帶有酶切位點的目標基因的⑶S序列。用qRT_PCR的方法擴增目標基因，RT-PCR 條件為-MV 5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s, 35cycles,72°C 延伸 IOmin ;反應體系為 10μ 1，包括:4μ I cDNA 模板(2ng/μ I)、5 μ I SYBR GreenI(1000x)及1μ 14mM引物。並在PCR引物中引入合適的限制性內切酶Kpn I和Spe I酶切位點，引物序列:正向引物為 5' -GGCGGATCCATGAGGCTGTCGGTGGCCATCC-3'(見 SEQ IDN0.5)、反向引物為 5 ' -GGCGGTACCTTAGTACAAGTGGTTGATGGCG-3 '(見 SEQ ID N0.6)，從YIL106的cDNA模板中擴增出帶有酶切位點的目標基因的CDS序列。
[0027]4.PFP基因過量表達載體的構建和遺傳轉化
[0028]酶切上步驟中PCR產物，酶切反應體系如下:目的片段10 μ 1、10XBuffer2 μ 1、限制性內切酶Kpn I和Spe I各I μ 1，將該體系補水至20 μ 1，37°C過夜。紫外燈下割取目標長度的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)。回收後連接到PMD18-T克隆載體上，通用引物Ml3測序，挑選序列完全正確的克隆，酶切回收。
[0029]為了提高目的基因在中花17中的表達，本研究特選用強啟動子——super35Spromotor來調控候選基因在轉基因水稻中的表達。目的片段的酶切回收後(見圖2)，進行回收的目標片段與過表達載體PCAMBIA1301連接。目的片段和載體比例為9:1，首先9111目的片段和Iul載體混合，55°C放置5min，然後加入IOul高效連接酶solution〗，16°C反應40min，然後轉化，連接產物的轉化採用熱激轉化法，具體操作如下:從_80°C冰箱中取出所需感受態細胞(T0P10)，置冰上緩緩解凍；超淨工作檯上將感受態細胞均勻分到滅菌的離心管中(每管50 μ I)，並加入連結產物10μ 1，輕輕搖勻，冰上靜置30min ;42°C水浴熱激90s,迅速置冰上2min ;於超淨工作檯上向離心管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻後37°C振蕩培養45min (220rpm);室溫下4000g離心2min，棄掉900 μ I上清液，將剩餘上清液重新懸浮菌體，加入40 μ I x-gal和16μ1 IPTG，混勻，用塗布器將其均勻塗到LB固體培養基平板上(含Amp)，放置30min ;倒置平板於37°C恆溫箱中培養過夜。
[0030]提取過表達載體pCAMBIAl301-Ubi質粒，採用基因槍轉化法轉化到粳稻受體材料品種「中花17」，其中基因槍轉化採用Bio-Rad公司生產的roS-1000/He基因槍，打槍後先將愈傷組織在不含篩選劑的培養基中恢復生長一周，再轉入含50mg/L潮黴素的繼代培養基中篩選30d左右，挑取抗性突起，再在含50mg/L潮黴素的繼代培養基中篩選30d左右，在預分化培養基(50mg/L潮黴素)光照培養20d左右，在分化培養基中(50mg/L潮黴素)中分化，最後在含50mg/L潮黴素的壯苗培養基中(三角瓶)繼續篩選30d左右，再轉到含壯苗培養基的試管中培養30-40d，然後移栽到土壤。
[0031]5.轉PFP基因植株檢測和表型分析
[0032]採用PCR擴增潮黴素抗性基因(HYG)片段，檢測陽性轉基因植株。抗性基因(HYG)檢測引物為:HYG-F5 ' -TACTTCTACACAGCCATC-3 '(見 SEQ ID N0.7)和HYG-R5' -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'(見 SEQ ID N0.8)，得到 9 株陽性轉基因植株(見圖
3)，並獲得T1代植株。[0033]轉PFP基因植株和對照中花17植株長至兩葉一心時進行42°C高溫處理，觀察耐熱表型。由圖4可以看出，高溫處理後中花17第二和第三片葉一半以上葉片枯黃，而轉基因植株第二和第三片葉只有葉尖枯黃，大部分葉片仍持綠色。可以看出，PFP基因超表達植株與對照中花17相比耐熱性增強。但轉基因植株的每個系的耐熱表型均存在一定程度的分離。
[0034]6.PFP基因受NaCl、低溫、PEG和ABA脅迫處理表達情況分析
[0035]為了研究PFP基因是否受鹽脅迫(NaCl)、低溫、乾旱(PEG)、和ABA脅迫的誘導，本研究分別用200mM NaCl、4°C低溫、30% PEG和100 μ M ABA處理HL106和特青兩葉一心期的幼苗，處理0h、lh、8h和24h時取樣，提取RNA反轉錄後進行了 RT-PCR分析(引物序列:HYG-F5' -AGTCCTGCTGGACAAGTCGT-3'(見 SEQ ID N0.9)和 HYG-R5' -TAGATGAGGATGTCGGAGCA-3丨(見SEQ ID N0.10))。葉片總RNA提取方法參考Sambrook等的方法，選用水稻的18S基因作為內標基因(引物序列為18S-F5' -GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3'(見SEQ IDN0.11)和 18S-R5' -GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'(見 SEQ ID N0.12))進行 PCR 擴增。反應體系為 10 μ 1，包括:4μ I cDNA 模板(2ng/μ 1)、5μ I SYBR Green I(1000x)及 I μ 14mM引物。擴增程序如下(利用MJ檢測系統)-M0C 5min ；94°C 15s，58°C 15s，72°C 20s, readplate85°C ls，40cycles ；72°C 5min ；65°C _95°C每隔 0.3°C作熔解曲線。手工設定螢光閾值，確定特定螢光閾值下各樣品的Ct值，採用2_Λ 計算方法分析不同樣品間相對表達量的聞低。 [0036]根據定量PCR結果，由圖5可以看出，經NaCl處理後，PFP基因在特青中的表達量與未處理時相比，在處理Ih時顯著上升，隨後下降，基因在HL106中的表達量相對較低；低溫處理後，該基因在YIL106的表達量變化不大，在特青中的表達量略有上升；4°C處理後的表達量下降；ABA處理24h後上調明顯。可見，PFP基因受鹽和低溫處理上調表達，受PEG處理下調表達。
[0037]本發明克隆了水稻苗期耐熱相關基因PFP，構建了該基因的過表達載體，獲得了轉基因的後代，對轉基因植株的表型檢測表明其苗期耐熱在一定程度上得到提高。進一步研究還表明，耐熱基因PFP在鹽和低溫脅迫下基因表達上調，在PEG乾旱脅迫條件基因表達下調。這為深入分析該基因的功能、表達奠定了基礎，為闡明水稻耐熱的遺傳調控網絡提供了支撐。
【權利要求】
1.一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應用，其中，該基因編碼的胺基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
2.一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應用，其中，該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。
3.如權利 要求1或2所述的應用，其中，將所述水稻苗期耐熱基因PFP導入水稻苗細胞、組織或器官，再將被轉化的水稻苗細胞、組織或器官進行培育，得到耐熱性提高的轉基因水稻苗。
4.如權利要求3所述的應用，其中，所述水稻苗期耐熱基因PFP通過過表達載體導入水稻苗細胞、組織或器官。
【文檔編號】C12N9/08GK103981196SQ201410256699
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月11日 優先權日:2014年6月11日
【發明者】雷東陽 申請人:湖南農業大學