提高真菌細胞中基因表達的方法

2023-12-09 09:33:51

專利名稱：：提高真菌細胞中基因表達的方法提高真菌細胞中基因表達的方法
背景技術：
：發明領域本發明涉及提高真菌細胞中編碼多肽的基因的表達的方法。相關技術描述在真菌宿主細胞(例如酵母或絲狀真菌細胞)中重組產生天然或外源多肽可以為以商業相關量製備多肽提供更理想的運載體(vehicle)。天然或外源多肽的重組產生通常通過構建表達盒(expressioncassette)來完成，在所述表達盒中將編碼所述多肽的DNA置於啟動子的表達調控之下，該啟動子來自一種受調節的基因。通常通過質粒介導的轉化將表達盒引入宿主細胞。然後通過在使表達盒中所含啟動子正確發揮功能所必需的誘導條件下培養受轉化的宿主細胞來實現多肽的產生。用於在真菌宿主細胞中重組產生多肽的新表達構建體和載體的開發通常要求高效啟動子的可用性，所述高效啟動子適合用於在所述宿主細胞中調控所述多肽的表達。然而，即使是最廣為人知的啟動子對於表達感興趣的基因也可能是低效的(ine伍cient)。許多啟動子對於受到的能夠提高它們的效率的調節是敏感的。指名為Ct/屍7的釀酒酵母(Sacc/wram少cescwevWae)金屬闢u蛋白基因由銅通過特異性啟動子區UASCW7(上遊激活序列)轉錄激活，據報導UASo;w位於相對於Ct/屍/轉錄激活位點的-105和-230之間(Thiele和Hamer,1986,Mo/.CW/.說o/.6:1158-1163;Zhou和Thiele，1993,所o/actow4:105-115)。釀酒酵母的Ace1蛋白(Acelp)負責在銅離子(Thiele,1988，Mo/,Ce〃.所o/.8:2745-2752)或銀離子(Furst等，1988，Ce//55:705-717)的存在下誘導酵母金屬硫蛋白基因C77P7。Acelp氨基末端的一半富含鹼性胺基酸殘基和半胱氨酸，並且在Cu(I)或Ag(I)存在下與C77屍7上遊激活序列特異性地結合，而在不存在Cu(I)或Ag(I)時則不與Ct/屍7上遊激活序列特異性地結合(Furst等，1988，見上文)。Thiele和Hamer,1986，A/o/ecw/wfl"dCW/w/ar歷o/o^y6:1158-1163乂>開了串聯重複上5;摔調4空序歹'J(tandemlyduplicatedupstreamcontrolsequences)介導酉良酒酵母^同-金屬硫蛋白基因的銅誘導型轉錄，並且這些元件之一的合成形式(syntheticversion)當以兩個串聯拷貝存在時為異源啟動子賦予銅誘導性。Gralla等，1991,PA^S腦88:8558-8562公開了Acelp激活酵母銅、鋅的超氧化物歧化酶基因的表達。Lapinskas等，I993,O^remGe"eri"24:388-393公開了Acelp激活釀酒酵母胞質過氧化氪酶基因的表達。Mehra等，1989，歷o/o&ca/CT/em/^y264:19747-19753描述了對來自光滑念珠菌(Ca"^^ag/a6rato)金屬硫蛋白基因的克隆和該基因的序列。Zhou和Thiele,1991,/WAS88:6112-6116描述了來自光滑念珠菌的由金屬激活的轉錄因子基因的分離。Thorvaldsen等，1993,/所o/og!'ca/CTzew^^y268:12512-12518公開了通過對指名為M7Y、M7Y/a和M777Z的光滑念珠菌金屬硫蛋白基因的調節。Mascorro-Gallardo等，1996，172:169-170公開了調節釀酒酵母中基因表達的基於CT/戶/啟動子的載體的構建。Macreadie等，1989,P/wmzW21:147-150公開了一系列利用釀酒酵母Cf/P/基因的酵母表達載體。Hottiger等，1994,10:283-296公開了CT/屍7啟動子的生理學特徵和過表達它的轉錄激活子Acelp的後果。本發明的一個目的是提供改進的在真菌宿主細胞中產生多肽的方法。發明概述本發明涉及用於產生多肽的方法，其包括(a)在有益於產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含含有編碼所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與包含銅響應性上遊激活序列的銅誘導型啟動子序列可操作地連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核芬酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；和第三多核苷酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因；和(b)從培養基分離所述多肽。多肽對於真菌宿主細胞可以是天然的或外源的。本發明還涉及真菌宿主細胞，其包含含有編碼多肽的核酸序列的第一6連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核香酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；和第三多核苷酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因。本發明還涉及核酸構建體和載體，所述核酸構建體和載體包含含有編碼多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與包含銅響應性上遊激活序列的銅誘導型啟動子序列可操作地連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核普酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄。附圖簡述圖1顯示pBM128a的限制圖譜。圖2顯示pMB1537的限制圖語。圖3顯示pBM126a的限制圖語。圖4顯示pMB1539的限制圖譜。圖5顯示p幾inl68的限制圖譜。圖6顯示pBM142c的限制圖譜。圖7顯示pBM143b的限制圖譜。圖8顯示pMB1682的限制圖譜。圖9顯示pJLinl95的限制圖譜。圖10顯示pBM163a的限制圖i昝。圖11顯示pBM65a的限制圖譜。圖12顯示pBM168a的限制圖i普。圖13顯示pBM69a的限制圖譜。圖14顯示pBM171a的限制圖譜。圖15顯示pBM70a的限制圖i昝。發明詳述本發明涉及產生多肽的方法，其包括(a)在有益於產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含含有編碼所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與包含銅響應性上遊激活序列的銅誘導型啟動子序列可操作地連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核苦酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；和第三多核苷酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因；和(b)從培養基分離所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養真菌宿主細胞。例如，可以通過搖瓶培養，或實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源、氮源、無機鹽和銅離子(和/或銀離子)。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。當培養基中存在銅離子時，所述培養基含有至少10iiM銅離子，優選至少50pM銅離子，更優選至少100pM銅離子，甚至更優選至少250pM，並且最優選至少500iiM銅離子。可以將銅離子以CuS04、CuCl2的形式，或以任何其它合適的形式添加至培養基。培養基可以還含有銀離子，或者可以替代銅離子而(alternatively)含有銀離子。當培養基中存在銀時，所述培養基含有至少10^M《艮離子，優選至少50juM銀離子，更優選至少100pM銀離子，甚至更優選至少250^M銀離子，並且最優選至少500pM銀離子。可以將銀離子以Ag2S04、AgCl的形式，或以任何其它合適的形式添加至培養基。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、高效液相層析、毛細管層析(capillarychromatography)、酶產物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，在多肽是酶的情況下，酶測定法(enzymeassay)可用於測定所迷酶的活性。對於許多酶用於測定酶活性的方法是本領域已知的(參見，例如，D.Schomburg和8M.Salzmann(編),￡，附Z/aw必ooA:,Springer-Verlag，NewYork,1990)。如果多肽分泌到營養培養基中，那麼該物質能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，那麼其能夠從細胞裂解物(celllysate)回收。可以使用本領域已知的方法分離所得多肽。例如，可以通過常規方法從培養基分離多肽，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發和/或沉澱。隨後可以通過多種本領域已知的方法將分離的多肽進一步純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦(IEF))、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、或^是取(參見，例如，屍w7yc""o",丄-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發明的真菌宿主細胞，其包含含有編碼所述多肽的核酸序列的第一連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；和第三多核普酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因，所述真菌宿主細胞與不含第二多核苷酸(其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列)和/或第三多核苷酸(其包含至少一個拷貝的編碼同依賴性反式作用轉錄因子的基因)的真菌宿主細胞相比，多產生至少10%，優選至少25°/。，更優選至少50°/。，甚至更優選至少75%,最優選至少100%,並且甚至最優選至少200%的所述多肽。啟動子術語"啟動子"在本申請中定義為這樣的DNA序列，其結合RNA聚合酶並且將所述聚合酶引導至正確的下遊多核苦酸轉錄起始位點以起始轉錄，所述多核香酸包含編碼多肽的核酸序列。RNA聚合酶有效地催化信Y吏RNA的裝配，所述信使RNA與編碼區適當的DNA鏈互補。術語"啟動子"還應理解為包括在轉錄成mRNA後用於翻i奪的5'非編碼區(在啟動子和翻i,起點之間)、順式作用轉錄調控元件如轉錄激活子，和其它能夠與轉錄因子相互作用的核苷酸序列。9術語"銅誘導型啟動子序列"在本申請中定義為這樣的啟動子，該啟動子通過作為其組成部分的順式作用元件受到銅離子的誘導，所述啟動子含有轉錄調節因子的結合位點，所述轉錄調節因子負責該啟動子的銅誘導型轉錄。術語"串聯啟動子"在本申請中定義為兩個或更多個啟動子序列，它們中的每個均與編碼序列可操作地連接並且介導該編碼序列轉錄為mRNA。串從編碼胞外或胞內多肽的基因獲得，所述多肽對於宿主細胞可以是天然的或外源的。串聯啟動子中所含啟動子中的至少一個是銅誘導型啟動子。在優選的方面，串聯啟動子由銅誘導型啟動子構成。術語"雜合啟動子"在本申請中定義為由兩個或更多個啟動子的部分組成的啟動子序列，其與編碼序列可操作地連接並且介導該編碼序列轉錄為mRNA。所述啟動子可以從編碼胞外或胞內多肽的基因獲得，所述多肽對於宿主細胞可以是天然的或外源的。雜合啟動子的至少一個部分是銅誘導型啟動子的部分。在優選的方面，雜合啟動子由兩個或更多個銅誘導型啟動子的部分構成。術語"可操作地連接"在本申請中定義為這樣的構型，其中將調控序列(例如啟動子序列)置於相對於編碼序列的適當位置，使得該調控序列指導由該編碼序列編碼的多肽的產生。術語"編碼序列"在本申請中定義為這樣的核酸序列，當置於適當調控序列的控制之下時，其轉錄成mRNA,該mRNA被翻譯為多肽，例如酶。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可替換的起始密碼子例如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以包括，但不限於，基因組DNA、cDNA、半合成的、合成的和重組的核酸序列。在本發明方法的實踐中，銅誘導型啟動子可以獲得自釀酒酵母金屬硫蛋白基因、釀酒酵母超氧化物歧化酶基因、釀酒酵母胞質過氧化氫酶基因、釀酒酵母銅耐受抑制基因(copperresistantsuppressorgene)、光滑念J朱菌金屬石克蛋白基因、粗糙脈孢菌(A^wra^oracra^a)金屬硫蛋白基因、解脂西洋蓍黴(Ksrrawz'a/z;po(y"ca)金屬石克蛋白基因、只又孑包蘑菇(^gan'cwZ^/on^)金屬石克蛋白基因、灰梨孢菌(Magna/o"/7e金屬硫蛋白基因和鵝柄孢殼菌(/Wo5/orafl""r/we)金屬石克蛋白基因。在優選的方面，銅誘導型啟動子序列是從釀酒酵母金屬硫蛋白基因獲得的。在更優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母CC/i37基因(登錄號P07215)(Butt等，1984,/WAS"C/"76:3332-3336)(DNA為SEQIDNO:1,推定的胺基酸序列為SEQIDNO:2)。在另一個優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母超氧化物歧化酶基因。在更優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母5V9D/基因(登錄號P00445)(Gralla等，1991,屍A^固88:8558-8562)(DNA為SEQIDNO:3，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:4)。在另一個優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母胞質過氧化氬酶基因。在更優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母CT77基因(登錄號P06115)(Lapinskas等，1993，Cw/re"fGe"e"cs24:388-393)(DNA為SEQIDNO:5,推定的胺基酸序列為SEQIDNO:6)。在另一個優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母銅耐受抑制基因。在更優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自釀酒酵母C7^5基因(登錄號P41902)(Culotta等,1994，/嵐(3em.269:25295-252302)(DNA為SEQIDNO:7,推定的胺基酸序列為SEQIDNO:8)。在另一個優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自光滑念珠菌金屬硫蛋白基因。在更優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自光滑念珠菌MT基因。在最優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自光滑念珠菌M77基因(登錄號P15113)(Mehra等，1989,/5z.o/ogz'ca/C/^抓.W7264:19747-19753;Mehra等,1992，114:75-80;Mehra等,1990,G潔265:6369-6375)(DNA為SEQIDNO:9，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:10)。在另一個最優選的方面，銅誘導型啟動子序列獲得自M77/基因(登錄號J05398)(Mehra等，1989,見上文；Mehra等，1992，見上文；Mehra等，1990，見上文)(DNA為SEQIDNO:11，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:12)。在本發明的方法中，銅誘導型啟動子也可以是包含兩個或更多個啟動子的串聯啟動子，或包含兩個或更多個啟動子的部分的雜合啟動子，其中的至少之一是銅誘導型啟動子或銅誘導型啟動子的部分。子或雜合啟動子的啟動子實例包括，但不限於，從下列各項的基因獲得的啟動子米麴黴(v^/e^/〃z^wjzae)TAKA澱粉酶、曼赫才艮毛黴(i/n'zowwcwlim/e/^')天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(Ap^gz7/^w'gw)中性a-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性a-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴(A^wg/〃wawamon')葡糖澱粉酶(g/^4)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴(y^;erg77/us1m^w/(37M)乙醯胺酶、《裡片鐮孑包(屍wran'wmvewewafwm)澱4分葡4唐香酶、鑲片鐮孢Daria啟動子、鑲片鐮孢Quinn啟動子、尖鐮孢CPwsan'wmox;^pwww)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、裡氏木黴(7h'c/zofife^^)3一葡糖苦酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶IV、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴p-木糖苷酶、釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶；以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性a-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。其它對於酵母宿主細胞有用的啟動子由Romanos等，1992，FeaW8:423-488描述。在本發明的方法中，雜合啟動子或串聯啟動子應理解為對於編碼多肽的核酸序列是外源的，即使作為所述串聯啟動子或雜合啟動子組成部分的野生型啟動子或其部分對於該核酸序列是天然的。例如，在由至少兩個啟動子組成的串聯啟動子中，一個或多個(幾個)啟動子可以是編碼多肽的所述核酸序列的野生型啟動子。上遊激活序列(UAS)術語"銅響應性上遊激活序列"在本申請中定義為包含名為順式作用元件的DNA序列的啟動子區，其充當轉錄調節因子的結合位點，所述轉錄調節因子負責啟動子的銅誘導型轉錄。對於酵母和絲狀真菌基因，將含有這種順式作用元件的啟動子區稱為上遊激活序列，縮寫為UAS。(Thiele，1992,iVwc/e/c爿c/Aie化arc/220:1183-1191)。這種UAS的鑑定和分離能夠根據由Thiele和Hamer，1986，見上文；Zhou和Thiele,1993,見上文；和Thiele,1992，見上文描述的方法來完成。在本發明的方法中，可以使用負責銅誘導型基因轉錄的任何順式作用啟12動子釀酒酵母金屬硫蛋白基因、釀酒酵母超氧化物歧化酶基因、釀酒酵母胞質過氧化氫酶基因、釀酒酵母銅耐受抑制基因、光滑念珠菌金屬硫蛋白基因、粗糙脈孢菌金屬硫蛋白基因、解脂西洋蓍黴金屬硫蛋白基因、雙孢蘑菇金屬硫蛋白基因、灰梨孢菌金屬硫蛋白基因和鵝柄孢殼菌(屍o^w;oraamen'"e)金屬石克蛋白基因。在優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母金屬硫蛋白基因的啟動子。在更優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母C77屍/基因(登錄號P07215)(Butt等，1984，見上文)的啟動子。在另一個優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母胞質過氧化氬酶基因的啟動子。在更優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母CT77基因(登錄號P06115)(Lapinskas等，1993，見上文)的啟動子。在另一個優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母超氧化物歧化酶基因。在更優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母SOD/基因(登錄號P00445)(Gmlla等，1991,見上文)的啟動子。在另一個優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母銅耐受抑制基因。在更優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自釀酒酵母C7^5基因(登錄號P41902)(Culotta等，1994,見上文)的啟動子。在另一個優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自光滑念珠菌金屬硫蛋白基因。在更優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自光滑念珠菌MT基因。在最優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自光滑念珠菌M7Y基因(登錄號P15113)(Mehra等，1989，見上文；Mehra等，1992，見上文；Mehra等，1990，見上文)。在另一個最優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自光滑念珠菌M77/a基因(登錄號P15113)(Mehra等，1989，見上文；Mehra等，1992,見上文；Mehra等，19卯，見上文)。在另一個最優選的方面，銅響應性上遊激活序列獲得自光滑念珠菌基因(登錄號P15114)(Mehra等，1989,見上文；Mehra等，1992,見上文；Mehra等，1990,見上文)。在本發明的方法中，一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列(UAS)可操作地連接於銅誘導型啟動子的上遊。應理解的是銅誘導型啟動子應含有它自身的銅響應性上遊激活序列，並且，因此，可操作地連接於該啟啟動子中所含相同的UAS區，可以是與該啟動子中所含不同的UAS區，或者可以是它們的組合。依賴於與上遊激活序列相聯的銅響應性元件的數目，即，銅響應性元件的數目和銅依賴性轉錄效力的關係，可以將多於一個上遊激活序列置於啟動子的上遊。因此，依賴於上遊激活序列中包含的銅響應性順式作用元件的數目，可以使用多拷貝的特異性上遊激活序列，可以使用不同上遊激活序列的組合，或者可以使用前述各項的組合。銅響應性順式作用元件的總數是至少2，優選至少3，更優選至少4，甚至更優選至少5，並且最優選至少6。在優選的方面，額外的銅響應性上遊激活序列之一是SEQIDNO:46。在另一個優選的方面，額外的銅響應性上遊激活序列之一是SEQIDNO:47。轉錄激活子基因術語"銅依賴性反式作用轉錄因子基因"在本申請中定義為編碼轉錄因子的基因，所述轉錄因子藉由與銅誘導型啟動子序列偶聯的銅響應性上遊激活序列(UAS)以銅依賴性的方式激活基因轉錄。這些基因也稱為銅金屬調節轉錄因子(MRTF)基因。應理解的是如用於本申請，術語"銅依賴性反式作用轉錄因子基因"中涵蓋這種基因的截短的和/或突變的形式。在本發明的方法中，可以使用編碼轉錄因子的任何轉錄激活子基因，所因可以選自下組釀酒酵母」C五/基因、光滑念珠菌^M77基因、解脂西洋蓍黴CRF1基因(登錄號P45815)、慄酒裂殖酵母OSb/^osacc/7ara附;;c&y/70w&)CUF2基因(登錄號094588)、釀酒酵母HAA1基因(登錄號Q12753)和煙麴黴(J^ergzY/M^/wm/ga^s)銅拳DNA結合域蛋白基因(copperfistDNAbindingdomainproteingene)(登錄號Q4WN33)。在優選的方面，轉錄激活子基因是釀酒酵母^C5/基因(登錄號P15315)(Thiele和Hamer，1986，Mo/.Ce〃.Ao/.6:1158-1163)(DNA為SEQIDNO:13,推定的胺基酸序列為SEQIDNO:14)。在另一個優選的方面，轉錄激活子基因是光滑念珠菌基因(登錄號P41772)(Zhou和Thide,1991,屍tN^S1WS^88:6112-6116)(DNA為SEQIDNO:15，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:16)。在另一個優選的方面，轉錄激活子基因是解脂西洋蓍黴CRF1基因(登錄號P45815)(DNA為SEQIDNO:17，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:18)。在另一個優選的方面，轉錄激活子基因是慄酒裂殖酵母CUF2基因(聲錄號094588)(DNA為SEQIDNO:19，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:20)。在另一個優選的方面，轉錄激活子基因是釀酒酵母HAA1基因(登錄號Q12753)(DNA為SEQIDNO:21，推定的胺基酸序列為SEQIDNO:22)。在另一個優選的方面，轉錄激活子基因是煙麴黴銅拳DNA結合域蛋白基因(登錄號Q4WN33)(DNA為SEQIDNO:23,推定的胺基酸序列為SEQIDNO:24)。在本發明的方法中，真菌宿主細胞包含至少一個轉錄激活子基因。所述轉錄激活子基因對於該宿主細胞可以是天然的或外源的。在優選的方面，宿主中存在轉錄激活子基因的多個拷貝。或者，真菌宿主細胞中可以存在至少兩種不同的轉錄激活子基因的組合，這兩種不同的轉錄激活子基因各自以一個或多個(幾個)拷貝存在。轉錄激活子基因的拷貝數的增加可以通過如下獲得將至少一個額外拷貝的所述基因整合入宿主細胞基因組；或將可擴增選擇性標記基因包括在轉錄激活子基因內，其中可通過在適當的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，並且因此含有轉錄激活子基因的額外拷貝的細胞。轉錄激活子基因可以整合入宿主細胞的染色體，或可以作為染色體外元件存在，或這些情況的組合。在優選的方面，將轉錄激活子基因整合入宿主細胞的染色體。多肽所述多肽對於感興趣的真菌宿主細胞可以是天然的或異源的。術語"異源多肽"在本申請中定義為這樣的多肽，其對於宿主細胞不是天然的；或在其中進行了改變該天然多肽的結構修飾的天然多肽。所述多肽可以是具有感興趣的生物學活性的任何多肽。術語"多肽"在本文不指特定長度的編碼產物，並且因此包括肽、寡肽和蛋白質。術語"多肽，，還包括雜合多肽，其包含部分和/或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的多肽獲得，其中一個或多個(幾個)對於所述真菌細胞可以是異源。多肽還包括多肽的天然存在的等位基因變異和工程的變異。在優選的方面，所述多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、15激素、免疫諷節^(immunodilator)、神經遞質、受體、報導蛋白、結構蛋白和轉錄因子。在更優選的方面，多肽是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。在最優選的方面，所述多肽是a-葡糖苷酶、氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、葡糖腦苷脂酶、a-葡糖苷酶、p-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一個優選的方面，所述多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明月交。編碼多肽的核酸序列可以獲得自任何原核、真核或其它來源。就本發明而言，用於本申請與給定的來源有關的術語"獲得自"，應該表示所述多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的基因的細胞產生。用於分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域已知的，並且包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用聚合酶鏈式反應(PCR)實現從這種基因組DNA克隆所述核酸序列。參見，例如，Innis等,1990,屍Ci/Votoco/s:jfoAfeAodi^pp/Zcado",AcademicPress,NewYork。所述克隆方法可以包括切下和分離包含編碼所述多肽的核酸序列的期望核酸片段，將所述片段插入載體分子，和將重組載體併入真菌細胞，其中所述核酸序列的多個拷貝或克隆將被複製。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。核酸構建體本發明還涉及核酸構建體，其包含含有編碼感興趣多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活的銅誘導型啟動子序列可搡作地連接；和第二多核苷酸，其包含至少一個在所述啟動子上遊的銅響應性上遊激活序列(UAS)，和一個或多個(幾個)調控序列，該調控序列在與之兼容的條件下指導所述多核苷酸的編碼序列在合適的宿主細胞中表達。表達應理解為包括多肽產生中涉及的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉16錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。"核酸構建體"在本申請中定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或者所述核酸分子經修飾而含有以本來不存在於(nototherwiseexist)自然中的方式組合和並置的核酸區H當所述核酸構建體含有編碼序列和表達該編碼序列所需的所有調控序列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。行操作來為所述多肽或轉錄因子提供改進的表達。依賴於表達載體，在將核酸序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾核酸序列的技術是本領域熟知的。在本發明的方法中，為了改進宿主細胞中編碼序列的表達，編碼多肽或銅依賴性反式作用轉錄因子的核酸序列可以包含一個或多個(幾個)天然調控序列，或者一個或多個(幾個)天然調控序列可能被對於所述核酸序列是外源的一個或多個(幾個)調控序列替代。術語"調控序列，，在本申請中定義為包括對多肽的表達是必需的或有利的所有成分。各個調控序列對於編碼所述多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。除本申請描述的銅誘導型啟動子和銅響應性上遊激活序列之外，這樣的調控序列還包括，但不限於，啟動子、前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括銅誘導型啟動子、銅響應性上遊激活序列和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和目的在於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核酸序列編碼區的連接。在本申請中已經討論了對編碼感興趣多肽的多核苷酸的啟動子的搡作。對於銅依賴性反式作用轉錄因子，調控序列可以是適當的啟動子序列，其是由用於表達編碼該轉錄因子的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導轉錄因子表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動<曰狄付。用於指導在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列的基因獲得的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性a-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性a-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(g/a4)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、裡氏木黴p-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶IV、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴卩-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性a-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子是從以下各項的基因獲得的啟動子釀酒酵母烯醇化酶(五;V07)、釀酒酵母半乳糖激酶(04丄/)、釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶04Z)i^，^D7/2/G/lP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(7P7)、酉良酒酵母金屬硫蛋白(C77屍/)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它對於酵母宿主細胞有用的啟動子由Romanos等，1992,8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核酸序列的3'末端可操作地連接。可以將在所選的真菌宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從以下各項的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對於酵母宿主細胞優選的終止子從以下各項的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CTC7)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氬酶。其它對於酵母宿主細胞有用的終止子由Romanos等，1992,見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核酸序列的5'末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、構巢麴黴丙糖磷酸異構酶、鑲片鐮孢胰蛋白酶和鑲片鐮孢葡糖澱粉酶。對於酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶010//2/04巧。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核酸序列的3，末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，宿主細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA。可以將在所選真菌宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴a-葡糖苷酶。對於酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mo/ecw/orCe/Zw/ar5z'o/ogy15:5983-5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基末端相連的胺基酸序列，並且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區，其與編碼分泌多肽的編碼區片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5，端可含有對於所述編碼序列外源的信號肽編碼區。外源信號肽編碼區在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區時可為必需的。或者，外源信號肽編碼區可以簡單地替代天然信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選真菌宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區可在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶和疏棉狀腐質黴脂肪酶。對於酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區由Romanos等，1992,見上文描述。調控序列還可以是前肽編碼區，其編碼位於多肽氨基末端的胺基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽。可以從釀酒酵母a因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴(MycWo;/^oraAermo;^z7a)漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區。當信號肽和前肽區二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽區置於緊接著(nextto)多肽氨基末端，並且將信號肽區置於緊接著前肽區的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽或銅依賴性反式作用因子的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子、米麴黴葡糖澱粉酶啟動子和鑲片鐮孢葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含含有編碼感興趣的多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與包含銅響應性上遊激活序列的銅誘導型啟動子序列可操作地連接，所述銅響應性上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄。上文描述的多種核酸和調控序列可以結合在一起產生重組表達載體，該重組表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。可供選擇的是，可以通過在適當的用於表達的載體中插入所述第一多核苷酸和第二多核苦酸來表達核酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，從而將該編碼序列與銅誘導型啟動子、銅響應性上遊激活序列和一個或多個適當的用於表達的調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段20(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的總DNA(totalDNA),或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選4奪經轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。對於酵母宿主細胞合適的標記是^D五2、//ZS3、丄￡^72、丄F52、M￡73、77屍/和WM3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限於am必(乙醯胺酶)、arg^(鳥氨酸氨曱醯基轉移酶)、6ar(膦絲菌素(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、/zygB(潮黴素磷酸轉移酶)、m'aZ)(硝酸還原酶)(nitratereductase)、(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、sC(石克酸腺苦醯轉移酶)、//7C(鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase)),以及它們的等價物。優選用在麴黴屬C^pwg/〃w)細胞中的是構巢麴黴或米麴黴的am必和；,G基因和吸水鏈黴菌(5^eptowyces/7ygrasco//cws)的基因。優選用在鐮孢屬CFwan'ww)糹田月包中的是6w、awdS、或/2少g5基因。本發明的載體優選含有元件，其允許載體穩定整合入宿主細胞基因組或允許載體在所述細胞中獨立於基因組自主複製。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至10,000鹼基對，優選400至10，000鹼基對，並且最優選800至10,000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核普酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主複製，載體可以還包含複製起點，其使載體能夠在宿主細胞中自主地複製。可用於酵母細胞的質粒複製子(replicator)的實例是2微米複製起點，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。可用於絲狀真菌細胞的質粒複製子的實例是AMA1和ANSI(Gems等,1991，G認98:61-67;Cullen等，1987，泡由'cie廳rc/z15:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據公開於WO00/24883中的方法完成。複製的起點可以是一種具有突變的複製起點，該突變使該複製起點在宿主細胞中發揮溫度敏感性的功能(參見，例如，Ehrlich,1978,屍raceWwgsq/"AeyV加'owa/^4ca<iew_y。/5WewceyC7S^75:1433)。可以將多於一個拷貝的編碼多肽的核酸序列插入宿主細胞以增加該基因產物的產生。核酸序列拷貝數的增加可如下方法獲得通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或者通過將可擴增選擇性標記基因包括在所述核酸序列內，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有所述選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，和由此得到核酸序列的額外拷貝。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。真菌宿主細胞本發明還涉及重組真菌宿主細胞，其包含含有編碼感興趣多肽的核酸子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；並進一步包含第三多核苷酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因。將如本文所述的表達載體或核酸構建體引入宿主細胞，從而使所述載體或構建體作為如前文所述的染色體整合體或自複製染色體外載體保留。術語"宿主細胞，，涵蓋親本細胞的任何子代，其由於複製過程中發生的突變而與該親本細胞不同。宿主細胞的選擇將很大程度上依賴於編碼所述多肽的多核苷酸及其來源，以及編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的多核苷酸。宿主細胞可以是可用於本發明的方法中的任何真菌細胞。"真菌，，如用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口才妄合菌門(Zygomycota)(3口由Hawksworth等，於A,似衡rt/75W_y》D/Wowa^yy7Tze屍w"g7'，第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上,171頁中所引用),和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfiingi)(Hawksworth等，1995,見上)。在優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母'，如用在本申請中包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內孑包黴目(Endomycetales))、產4旦子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬於半^口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包糹岡(Blastomycetes》的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，^j尋酵母定義為如歷o/ogyJcHvto'ayo/I^aW(Skinner,F.A.,Passmore,S,M.，禾口Davenport,R.R.，eds，5bc.Bacten.o/.iS戸pos/謂iSen'esNo.9，1980)中所述。在更優選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬(Cam/Wa)、漢遜酵母屬(Harae"w/fl)、克魯維酵母屬(幻炒vmw7ycas)、畢赤酵母屬(Pfc/z/a)、酵母屬((Sacc/2"raw少cas)、裂殖酵母屬(5"c/2/zosacc/wram^yces)或西洋蓍黴屬(Kj7r。w/a)細胞。在最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母OSacc/^rawyc^car&6erge""'s)、酉良酒酵母、jf唐4匕酵母(Sacc/7aram少c&sfiz'osto/7'cz^)、道格4立氏酵母(iS"acc/2"raw;Kcesdowg/os")、克魯弗酵母CSacc/7flf廠0附7casA/w_yv￡"〕、諾地酵母(5^ccA0!ram7c&swo^)era/s)或卵形酵母(5^cc/zi3raw77casovi/b/7m.力細月包。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(幻w，eram，yc^/ac他)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍黴細胞。在甚至最優選的方面，酵母宿主細胞是釀酒酵母(Sacc/zaraw;/c&ycar/Aergms/scerev&Zae)JG169(M4r-oc,wra3-52，/ew2-3,p印m37'/2&3zl2,p^/.'.7ew2,4^e/.v/z/d)(美國專利No.5,770,406)。在另一個優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌，，包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬G4cmo"/wm)、麴黴23屬、短梗黴屬(Jt^oZosWwm)、煙管黴屬(掛eAa"c^ra)、擬蠟菌屬(CenJDcWo/w》、金孑包子菌屬(C7zo^o^PO"'Mw)、鬼傘屬(Co/W"w)、革蓋菌屬(Cbr/o/w力、隱J求菌屬(Oy/tococc"力、i^7/6(2wWM附、鐮孑包屬、腐質黴屬(//wm/co/a)、梨孢菌屬(Magwopo^/ze)、毛黴屬(Mwco。、毀絲黴屬(MycWo;/z^2ora)、新考瑪月旨黴屬(iVeoca〃fmari;c)、脈孑包菌屬(iVeMmspora)、擬青黴屬(屍aec77o附ycas)、青黴屬(Pew/c/〃/ww)、平革菌屬(戶/^"￡/-0(^"6&)、射月永菌屬(屍/z/e6/a)、瘤胃壺菌屬(屍/romyc&y)、側耳屬(屍/ewrafw》、裂褶菌屬(5*c/H'zo//z_y〃wm)、3果節菌屬(7^/aramyces)、p耆熱子嚢菌屬(77zermo^yctw)、才發孑包殼屬(J7z/e/謂'fl)、彎頸黴屬(7b/，oc/flc/,訓)、檢菌屬(Trawefes)或木黴屬(7Hc/70za)、幹才以錯菌、Cen)oWo/w7'scaregr'ea、Ce")on'ops^gZ/vasrera、Ce"》or/o/wz\y/a朋oc,"to、Cm》on'o戸-sn'vw/osa、Ce一o"'o戸isw6n^、蟲擬蠟菌(CenjoWo/757'ssw6verm/jpora)、嗜角質金孑包子菌(C7z^sos/on'MwA:era"wo_p/z//wTW)、C7w3^o^spon'w附/wc^wowe/we、帶金3包子菌(C723^05poWw附fra//cwm)、CT^ysospor/ww附eraan'w附、C7wy^w/on'w附/"o/w、植金孑包子菌zcwaf騰、灰蓋鬼傘(Cb戸'"iwc/"erea)、毛革蓋菌(Con'o/船/z/raw加)、特異腐質黴(Z/w附/co/a/rao/em1)、3危才帛^)犬腐質黴(//"附//<3/a"wg/"asa)、米黑毛黴(Afwcorm/e/ze/)、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、產紫青黴(屍em'c/〃/wm/wr;Mragewwm)、黃孑包平革菌(屍/za"erac/zaefec/z/^^o^pon'wm)、豐S射射菌(屍/z/eZ)/ara&ato)、刺芽側耳CP/ewro/iwe^ywgf/)、土生衝炎孑包霧(77'e/av/flerresfn.s)、長糹成毛一全菌(7h3wefesW〃cwa)、變色^全菌(rn3metesverw'co/or)、口合茨木黴(7Wc/7o^fe，a/mtz/""騰)、康亍木黴(7h'c/zO(ie/7w"^o"/"g")、長技木黴(7Hc/zo<5ferma/oMg7'Zrac/zz'afem)、裡氏木黴或糹錄色木黴(7HcAo(iermavzWcfe)糹田月包。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用於轉化麴黴屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984，屍raceW打gso/AeAto/o""/爿cflde，。/5We"c&s81:1470-1474中描述。用於轉化裡氏木黴宿主細胞的合適方法在Penttila等，1987,67:155-164,和Gruber等，1990,C^r18(1):71-6中描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989,78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉化酵母Becker和Guarente,於Abelson，J.N.和Simon,M.I.(編者)，GWcfeto腸WGWWcsa"<iM/ecw/ar^z.o/ogy,Afef/zo(isz'w五"^ywo/c^y,Volume194,pp182-187，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,Towma/o/Bac&Wo/ogy153:163;和Hinnen等，1978,屍raceW"g5o/f/zejVa/7'owa/」cacfe，。/5Wewcest/5L475:1920。通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明範圍的限制。實施例作為緩衝液和底物使用的化學品是至少試劑等級的商業產品。DNA測序DNA觀'J序4吏用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems3130X型遺傳分鬥斤<義)(AppliedBiosystems，FosterCity,CA，USA)使用染料終止子化學(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992,Jozww/o/Mra/,MeAoA38:47-60)進行。使用Phred/Phrap/Consed程序(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)用序列特異性引物裝配序列。菌抹使用酉良酒酵母JG169(M4r-a,wra3-52，/e"2-3，/ep/-7"7，A/dzU25/rW:.7ez^，4^eU/d)(美國專利No.5,770，406)作為本申請實施例中的宿主菌抹。培養基每升YPD培養基由10g酵母提取物、20g細菌用蛋白腖和2。/。葡萄糖組成。每升CUP減ura培養基(CUPminusuramedium)(pH7.0)(原始培養基)由1ml的100mMCuS04.5H20、1.7g不含胺基酸和硫酸銨的酵母氮鹼基(yeastnitrogenbase;YNB)(BIO101,Carlsbad,CA,USA)、0.8g含40mg腺噤呤的CSM-um(BIOIOI，Carlsbad,CA,USA)、5g酪蛋白胺基酸(Becton,DickensonandCompany,Sparks,MD，USA)、100ml50%葡萄糖、50ml0.5MK2HP04和1ml100mg/ml氨千青黴素。每升酵母減ura優化培養基(最優培養基)由1ml100mMCuS04-5H20、6.7g含硫酸銨的酵母氮鹼基(YNB)、0.8g含40mg腺噤呤的CSM-ura、5.9g琥珀酸(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)、20g半乳糖、10g葡萄糖和1ml100mg/ml氨千青黴素。每升酵母減ura選擇培養基由6.7g含硫酸銨的酵母氮鹼基(YNB)、5g酪蛋白胺基酸、100ml0.5M琥珀酸pH5、40ml50%葡萄糖和2ml10mg/ml氯黴素。酵母減ura選擇平板由每升補充了20g純化瓊脂(Nobleagar)的酵母減ura選擇培養基組成。每升SC減ura培養基由7.5g不含胺基酸的酵母氮鹼基(Fluka,Buchs，Switzerland),11.3g琥珀酸、6.8g氬氧化鈉、5.6g酪蛋白胺基酸和0.1gL畫色氨酸，以及100ml50%果糖的無菌溶液和400pi250mg/ml氨千青黴素的無菌溶液，二者均在高壓滅菌之後添加。SC減ura平板由SC減ura培養基組成，只是使用100ml無菌的20%果糖和20g瓊脂(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO，USA)。每升SDMUA培養基由1.7g不含胺基酸的酵母氮鹼基、5.0g酪蛋白胺基酸、0,8g含40mg/lADE的CMS-Ura(MPBiomedicals,Irvine,CA,USA)、10ml10mMCuS04.5H20和10ml的1MK2HP04,以及100ml無菌50%果糖和400pi無菌250mg/ml氨千青黴素，二者均在高壓滅菌之後添加。每升LB培養基由10g胰蛋白腖、5g酵母提取物和5g氯化鈉組成。LB平板由LB培養基和每升15g細菌用瓊脂組成。SOC培養基由2%胰蛋白腖、0.5%酵母提取物、10mMNaCl、2.5mMKC1、10mMMgCl2和10mMMgSO4組成，通過高壓滅菌法滅菌，然後添加過濾除菌的葡萄糖至20mM。每升2XYT平板由16g胰蛋白腖、10g酵母提取物、5gNaCl和15g細菌用瓊脂組成。實施例1:銅誘導型啟動子(CM0/啟動子)的PCR擴增設計了下文所示的PCR引物997247和997248用於從質粒pCu426(Labbe和Thiele，1999，MeAoA五"z少mo/ogy306:145-153)擴增釀酒酵母銅誘導型啟動子(0/屍/啟動子)。為了克隆到釀酒酵母表達質粒pMB1537(參見實施例2)中，在引物設計中納入了限制酶位點I和￡coRI。引物997247:5，-CACCGGTGCATGCCTGCAGGAGCTCCTAGTTAGAAA-3，(SEQIDNO:25)I引物997248:5，-AACTA^OTGAA^GGAAITCTAGTCGA^GACT^CT-3,(SEQIDNO:26)使用EXPANDHighFidelityPCRSystem(EXPAND高保真PCR系統)(Roche，Indianapolis,IN,USA)通過PCR擴增了CC/屍啟動子片段。所述PCR的擴增反應混合物含有約50ngpCu426質粒DNA、1pi引物997247(50pmol/pl)、1pi引物997248(50pmo寧)、5pi含15mMMgCl2的10XPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN，USA)、1pidNTP混合物(每種10mM)、40,25|il水和0.75pi(3.5U/fil)DNA聚合酶混合物(Roche，Indianapolis,IN,USA)。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(Eppendorf,Westbury,NY，USA)擴增所述片段，程序為1個循環的94。C2分鐘；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72。C15秒(在每個連續循環遞加5秒延長)；1個循環的72。C7分鐘；和在10。C保溫。通過使用TAE緩沖液(每升4.84gTris鹼、1.14ml水醋酸和2ml0.5M27EDTApH8.0)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳來純化246bp的PCR產物，並使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)進一步純化。使用pCR2.1-TOPO(InvitrogenCorporation,Carlsbad，CA,USA)根據製造商的說明書連接所述246bpPCR產物。溫育後，使用2pl混合物轉化ONESHOTTOP10化學感受態大腸桿菌細胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)。將2pi體積的連接混合物添加至大腸桿菌細胞並在水上溫育5分鐘。隨後，將細胞在42。C熱休克30秒，然後在水上放置2分鐘。將250pl體積的SOC培養基添加至細胞並將混合物在37。C和250rpm溫育1小時。溫育後，將菌落塗布在每毫升補充有100iig氨千青黴素的2XYT平板上並在37。C溫育過夜，以進行質粒選擇。用無菌牙籤挑取在平板上生長的8個菌落並在裝有3ml每ml補充有100|ig氨苄青黴素的LB培養基的15mlFALCON⑧管中在37。C、250rpm培養過夜。使用BioRobot9600(QIAGENInc.:Valencia,CA，USA)分離質粒。用&oRI消化4pl體積的所得質粒微量製備物。通過瓊脂糖凝膠層析和UV分析來分析消化反應物，如先前關於PCR反應所述。使用1W質粒^^莫板、1.6ngM13引物(正向的或反向的)(MWGBiotech,HighPoint,NC，USA),並補水至6pl，對包含插入物的分離的質粒測序。將具有正確序列的所得質粒命名為pBM128a(圖1)。實施例2:表達載體pMB1537的構建表達載體pMB1537包含驅動編碼細毛嗜熱黴(772ermowycasto"wg/"ows)脂肪酶的野生型基因表達的酵母TPI啟動子(SEQIDNO:27是DNA序列，SEQIDNO:28是推導的胺基酸序列；登錄號059952)、CYC1終止子和作為選4奪性標記的17^43基因。使用EXPAND長模板PCR系統(Roche，Germany)PCR擴增酵母表達質粒pSTED226(WO05/045018)，其中使用作為模板的pSTED226和如下兩種引物。引物319137:5'-TCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTAG-3，(SEQIDNO:29)引物19138:5，-GACGCCATGGTGAAGCTTTCTTTTAATCGT-3，(SEQIDNO:30)PCR擴增反應混合物含有約50ng的pSTED226質粒DNA、1|il引物319137(50pmol/|il)、1pl引物19138(50pmol/|il)、5pl含15mMMgCl2的10XPCR緩衝液(Roche，Indianapolis,IN,USA)、1pidNTP混合物(每種10mM)、40.25|il水和0,75pi(3.5U/pl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)來擴增片段，程序為1個循環的94°C2分鐘；10個循環每個為94°C15秒、55。C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(在每個連續循環遞加5秒延長)；1個循環的72°C7分鐘；和在10。C保溫。PCR規程終止後，使用GFX⑧PCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒根據製造商的i兌明書(AmershamBiosciences,UnitedKingdom)純化和洗脫5826bp的PCR片段。使用EXPAND高保真PCR系統PCR擴增包含細毛嗜熱黴野生型脂肪酶基因的基因片段，其中使用作為模板的pENI1298(WO00/24883)和如下兩種引物引物349699:5，-CAAGAAGAITACAAACTArCAArTTCArACACAArArAAACGArTAAAAGAAAGCTCACCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTCnTGTCTCTG-3，(SEQIDNO:31)引物353031:5,-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAAITACArGArGCGGCCCTCTAGATTArCAAAGACArGTCCCAAITAACCCGAAGTAC-3，(SEQIDNO:32)PCR擴增反應混合物含有約50ngpENI1298質粒DNA、1jil引物349699(50pmol/pl)、1pi引物353031(50pmol/nl)、5pi含15mMMgCl2的10XPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN，USA)、1pidNTP混合物(每種10mM)、40.25|il水和0.75fil(3.5U/nl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀來擴增片段，程序為1個循環的94°C2分鐘；10個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55。C30秒和72。C15秒(在每個連續循環遞加5秒延長)；1個循環的72。C7分鐘；和在10。C保溫。PCR規程終止後，使用GFXPCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒依照製造商的說明書純化和洗脫927bp的PCR片段。將所得兩種片段(5826bp和927bp)通過電穿孔轉化入釀酒酵母JG169,其中根據製造商的規程使用設定為1.5千伏(kvolts)的GENEPULSER⑧和脈沖控制儀(Bio-Rad,Hercules，CA，USA)及2mm縫隙的電擊杯(cuvette)。轉化反應物含有混合的100ngPCR擴增的載體DNA及100ng包含脂肪酶基因的PCR產物。將轉化反應物塗布到酵母減ura選擇平板上並在30°C溫育5天。將來自上述規程的一個酵母克隆在SC減ura平板上再劃線(restreak)，並將一個酵母單菌落接種入50ml搖瓶中的10mlSC減ura培養基並在30°C、250rpm溫育過夜。使用2ml培養液進行質粒製備，其中使用用於酵母質粒製備的QIAPREP⑧旋轉微量製備試劑盒(QIAGENInc.,Germany)。稍後將質粒測序並^r證了預期的DNA序列。將該質粒命名為pMB1537(圖2)。實施例3:表達載體pBM126a的構建用爿geI和￡coRI消化質粒pBM128a,並且用五coRI和M/eI消化質粒pMB1537,並分別通過使用TAE緩沖液的1.8%和0.7%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒來純化分別為265bp和661bp的片段。為了創建載體片段，用爿geI和A^eI消化pMB1537。通過使用TAE緩衝液的0.7%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒來純化所得5148bp片段。隨後^/111和AWeI消化質粒pJLinl68,32並通過使用TAE緩衝液的0.7%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒來純化所得5.5kb片段。隨後使用快速DNA連接試劑盒連接兩片段。命名為pBM143b(圖7)的所得表達質粒包含驅動細毛嗜熱黴變體脂肪酶基因表達的Cf/屍7啟動子。如此，22個胺基酸的信號/前肽序列通過消除最後五個胺基酸(SPIRR)變成了17個胺基酸。實施例7:表達載體pMB1682的構建使用包含細毛嗜熱黴野生型脂肪酶基因的質粒pMB1537構建細毛嗜熱黴脂肪酶信號肽的隨機誘變文庫。使用EXPAND⑧高保真PCR系統和以下引物(DNA-Technology,Aarhus，Denmark)通過PCR擴增了信號肽編碼序列和側翼DNA區的隨機誘變PCR片段。引物309787:5'-CTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAG-3，(SEQIDNO:39)引物373172:NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN麗CATGGTGAAGCTTTCTTTTAA-3，(SEQIDNO:40)其中，在SEQIDNO:40的位置41、50、51、60、64、66、68、70、71、72、74、75、77、80、82、83和87的N99%是A,而1%是G、C或T;在SEQIDNO:40的位置40、46、47、52、53、56、62、65、67、73、78、84、85、86和88的N99%是G，而1。/。是A、C或T;在SEQIDNO:40的位置42、43、45、48、49、54、55、58、59、61、63、69、76、79、81、89、91和92的N99%是C,而1。/。是A、G或T;和在SEQIDNO:40的位置44、57、90和93的N99%是T，而1%是A、C或G。遵循以下規則設計了引入多樣性的引物在隨機位置野生型鹼基始終以99%機率出現，而其它三種鹼基以1%機率出現，並且全部三種石鹹基出現機率相等(equallyrepresented)。使用EXPAND⑧高保真PCR系統通過PCR擴增信號肽編碼序列的誘變片段。PCR擴增反應混合物含有約50ngpMB1537、1pl引物309787(50pmol/jul)、1pi引物373172(50pmol/jul)、5|il含15mMMgCl2的10XPCR33緩衝液(Roche，Indianapolis,IN,USA)、1dNTP混合物(每種10mM)、40.25pi水和0.75pi(3.5U/)il)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier熱循環儀來擴增片段，程序為94°C2分鐘的1個循環；10個循環每個為94。C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15個循環每個為94°C15秒、55。C30秒和72。C15秒(在每個連續循環遞加5秒延長)；72°C7分鐘的1個循環；和在10。C保溫。通過PCR製備細毛嗜熱黴野生型脂肪酶基因的基因片段，其中在使用EXPAND高保真PCR系統的PCR反應中使用pMB1537作為模板。所述PCR中使用的引物是上文所述的引物309787和373172。PCR擴增後，使用GFX⑧PCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒根據製造商的方案純化600bp的PCR片段，並在50pi10mMTris-HClpH8.0中洗脫。通過在信號肽編碼序列內的DNA位置用&cI消化將質粒pMB1537線性化。使用線性化載體作為釀酒酵母JG169轉化中的受體DNA，其中使用信號肽編碼序列及側翼DNA區(與受體質粒的受體DNA100%同源)的PCR片段作為供體DNA。具體而言，將約3嗎經&cI消化的pMB1537與約1600bpPCR片段一起電穿孔入100pi電感受態釀酒酵母JG169細胞，其中使用設定為1.5kvolt的GENEPULSER⑧和脈沖控制儀及2mm縫隙的電擊杯。電穿孔後，給經轉化的細胞提供1ml1M山梨醇，並在30。C溫育1小時，之後將1.1ml塗布到每ml補充有100pg氨千青黴素的SC減ura平板上。自每ml補充有100|ug氨節青黴素的SC減um平板挑取總共8400個菌落並轉移至96孔聚苯乙烯微孔板，即將挑取的克隆施加至B-H行1-12列的孔，讓A行空著，在A行接種釀酒酵母JG169中的野生型質粒構建體作為野生型參照。所有孔裝有每升添加40mg腺嘌呤的SD培養基-URA(稱為SDMUA)(遵循製造商的推薦，Qbiogene，Inc.,BIO101系統，由AHDiagnostics,Aarhus,Denmark提供)。將平板在30。C和250rpm溫育5天。5天後，在使用下文所述對硝基苯基戊酸酯測定法測量脂肪酶活性之前將平板保持在4°C。在如下測定法中使用對硝基苯基戊酸酯作為底物測量了培養物上清液的脂肪酶活性。在50mMTrispH7、10mMCaCl2、0.4%TritonX陽100緩衝液(稀釋緩沖液)中稀釋培養物上清液。採用兩倍步驟(two-foldstep)在樣品緩34衝液中稀釋LIPOLASETM標準品(NovozymesA/S,Bagsv2erd，Denmark),自1.0LU/ml濃度開始，到0.125LU/ml濃度結束。在聚苯乙烯微孔板中，將10pl上清液與90pl稀釋緩衝液混合。將100(!l對硝基苯基戊酸酯底物溶液(U7^對硝基苯基戊酸酯溶解於10ml異丙醇)添加至每個孔，簡單混合，然後在3分鐘裡每12秒測量405nm吸光度。評估測定數據以鑑定活性比釀酒酵母JG169中pMB1539構建體(A行的孔)高的所有樣品。收集活性比參照高的所有克隆作為陽性命中(positivehit)，並在相同設置中再次分析它們，將活性仍比參照高的所有克隆作為接種材料用於微孔板中的新鮮SDMUA培養基。A行再次用於參照菌抹。如上所述接種平板，並如上所述分析。取出活性比參照高的所有克隆並在SC-瓊脂平板上再劃線。收集所有克隆的單菌落用於在微孔板中在200SDMUA培養基中和在裝有10mlSDMUA培養基的50ml管中在30。C再培養5天，之後使用上文所述對硝基苯基戊酸酯測定法將產物與參照菌抹的產物進行比較。在3個鄰近的^f鼓孔和3個單獨的50ml管中培養每個克隆。使用這3個培養實驗的平均值來比較活性水平。最後，將在微孔板和50ml管中都具有最高脂肪酶活性的克隆接種至裝有10mlSDMUA培養基的搖瓶(帶有兩個擋板的250ml圓錐型帶擋板搖瓶)並在30°C以250rpm溫育5天。使用上文所述對硝基笨基戊酸酯測定法對上清液測定脂肪酶活性。對具有最高脂肪酶活性的克隆進行DNA測序。將顯示出最高活性的克隆命名為MB1665,其在脂肪酶信號肽中具有R2K取代(信號肽的第二個密碼子自AGG變成AAG)。通過使用與實施例4所述相同的原理，將編碼這種信號肽的DNA轉移至編碼細毛嗜熱黴脂肪酶變體的pMB1539構建體。在這種情況中使用與實施例4中所述相同的規程製備了更小的PCR片段。然而，也根據實施例4，但是使用來自MB1539的質粒DNA作為模板製備了更大的片段。如上所述實施了釀酒酵母JG169的GAP修復和轉化。此克隆產生了具有更高細毛嗜熱黴脂肪酶變體表達的克隆。將此克隆命名為釀酒酵母MB1681。將來自SC-瓊脂平板(在30。C培養5天)的釀酒酵母MB1681細胞材料用於接種50ml搖瓶中的10mlSC減ura培養基並在30°C和250rpm溫育過夜。使用來自此培養物的2ml培養液進行質粒製備，其中使用用於酵母質粒製備的QIAPREP⑧旋轉微量製備試劑盒。根據製造商的說明書，將經過純化的質粒轉化入大腸桿菌ToplOF，(Invitrogen,Carlsbad，CA,USA)。將經過轉化的大腸桿菌細胞塗布到每ml補充有100pg氨節青黴素的LB平板上。分離單菌落，再劃線，接種入LB培養基，並在30。C溫育過夜。使用1ml過夜培養物進行質粒製備，其中使用QIAPREP⑧旋轉微量製備試劑盒。最後，將分離的質粒作為模板用於DNA測序，驗證了變體信號序列(SEQIDNO:41)和細毛嗜熱黴脂肪酶變體編碼區(SEQIDNO:33及推導的胺基酸序列SEQIDNO:34)的序列。將所得質粒命名為pMB1682(圖8)。質粒pMB1682包含TPI啟動子和細毛嗜熱黴脂肪酶變體編碼區(不含SPIRR、具有R2K變化)。實施例8:表達載體pJLin195的構建構建了質粒pJLin195以包含利用釀酒酵母CW37啟動子的細毛嗜熱黴脂肪酶變體(具有含R2K變化且不含SPIRR的信號序列)表達載體。將pMB1682的///"dm-A^/eI片段克隆入用歷"dIII和iVcfeI消化的pBM143b，即將第二個胺基酸Arg的編碼序列(AGG)替換成Lys的編碼序列(AAG)。將pMB1682和pBM143b二者用歷"dIII和I消化，並用QIAQUICK⑧凝膠提取柱凝膠提取來自pMB1682的1kb片段和來自pBM143b的5kb片段。使用快速DNA連接試劑盒根據製造商的說明書將片段連接到一起，其中載體對插入物的摩爾比為1:2、1:1和3:1且載體量為50ng。將通過DNA測序確認的所得質粒命名為p幾inl95(圖9)。實施例9:表達載體pBM165a的構建使用以下引物來生成用於構建含有四個釀酒酵母上遊激活序歹'J(UAS)的表達載體的PCR片段引物999003:5，-CCGGTGCATGCCTGCAGGAGCTCCT-3，(SEQIDNO:42)I引物999005:5，-ACCGGTCTTTTTTGCTGGAACGGTTCA-3'(SEQIDNO:43)々"使用EXPAND高保真PCR系統通過PCR擴增所述片段。PCR混合物36含有0.5nl約25ngpBM143bDNA、1|il引物999003(50pmol/(al)、1引物999005(5Opmo11)、5nl含有15mMMgCl2的10XPCR緩沖液、1(ildNTP混合物(每種10mM)、40.25pl水和0.75plDNA聚合酶混合物(3.5U/pl)。使用EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧擴增所述片段，程序為94°C2分鐘的l個循環；10個循環每個為94。C15秒、55。C30秒和72。C30秒；15個循環的94°C15秒、55°C30秒和72°C30秒(在每個連續循環遞加5秒延長)；72°C7分鐘的1個循環；和在10。C保溫。通過使用TAE緩沖液聯合QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒的1.8%瓊脂糖凝膠電泳純化所得147bpPCR片段，並且根據製造商的說明書將所述147bpPCR產物與pCR2.1-TOPO⑧連接。將lpl體積的新鮮PCR產物、3|il的雙蒸水和1pi的TOPO⑧克隆載體用移液器混合，並且在室溫溫育5分鐘。溫育之後，使用2^的所述混合物轉化ONESHOTTOP10化學感受態大腸桿菌細胞。將2nl體積的連接混合物添加至大腸桿菌細胞並且在冰上保溫5分鐘。然後，將細胞在42。C熱激30秒，其後置於冰上2分鐘。將250j^1體積的SOC培養基添加至細胞，並且將混合物在37。C和250rpm溫育1小時。溫育之後將菌落塗布在每ml補充有100pg氨千青黴素的2XYT平板上並且在37。C溫育過夜，以進行質粒選擇。用無菌牙籤挑取在平板上生長的8個菌落並在裝有3ml每ml補充有100|ag氨苄青黴素的LB培養基的15mlFALCON⑧管中在37°C、250rpm培養過夜。使用BioRobot9600分離質粒。用￡coRI消化4jal體積的所得質粒微量製備物。通過瓊脂糖凝膠層析來分析消化反應物，如先前關於PCR反應所述。使用1pl質粒模板、1.6ngM13引物(正向的或反向的)，並補水至6pl，對包含插入物的分離的質粒測序。將通過DNA測序確認的所得質粒命名為pBM163a(圖10)。為了製備含有四個UAS序列的最終表達載體，將pBM163a用I和爿geI消化，並且將質粒pJLinl68用^geI和歷"dIII消化。將132bpSp/zUgeI片段和340bp^geIII片段克隆入之前已經經過Sp/zI和///"dIII消化的細毛嗜熱黴變體脂肪酶表達載體pBM143b。將所得質粒命名為pBM165a(圖11)。實施例10:JC￡/過表達載體的構建設計了以下PCR引物自釀酒酵母菌抹S288C(ATCC20458)的基因組DNA擴增」C￡/基因。將HI限制位點併入，用於克隆進入表達質粒pBM143b和pJLin195。引物999262:5，-TCATGATACGATCGTGAAAGAATAT-3，(SEQIDNO:44)%別引物999263:5，-TCATGAGGATGATGACAAAGAAGAC-3，(SEQIDNO:45)使用EXPAND⑧高保真PCR系統通過PCR擴增了爿C五/基因片段。使用YEASTARtm基因組DNA試劑盒(ZYMOResearch,Orange,CA，USA)根據製造商的說明書自釀酒酵母菌林S288C分離基因組DNA。PCR反應含有0.1嗎釀酒酵母S288C基因組DNA、1]il引物999262(50pmol/nl)、1pi引物999263(50pmol/Vl)、5pi含有15mMMgCl2的10XPCR緩沖液、1^dNTP混合物(每種10mM)、40.25jal水和0.75pi(3.5U/pl)DNA聚合酶混合物，終體積為50nl。使用EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧擴增所述片段，程序為94°C2分鐘的1個循環；10個循環每個為94°C15秒、55。C30秒和72°C1分45秒；15個循環每個為94°C15秒、55°C30秒和72°C1分45秒(在每個連續循環遞加5秒延長)；72。C7分鐘的1個循環；和在10°C保溫。通過使用TAE緩衝液的1.8%瓊脂糖凝膠電泳聯合QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化所得1589bpPCR片段。將所述1589bpPCR產物與pCR2.1-TOPO根據製造商的說明書連接。通過核苷酸測序確認了命名為pBM168a(圖12)的所得質粒。將質粒pBM168a用^s/HI消化，並且將^C￡/基因片段(1583bp)克隆入已經用相同的酶消化的表達載體pBM143b、pJLinl95和pBM165a。用QIAQUICK⑧凝膠提取柱凝膠提取片段。使用快速DNA連接試劑盒根據製造商的說明書將片段連接到一起，其中載體與插入物的摩爾比為1:2、1:1和3:1且載體量為50ng。將所得質粒命名為pBM169a(圖13)、pBM171a(圖14)和pBM170a(圖15)。實施例11:使用pBM143b、pJLinl95、pBM165a、pBM169a、pBM170a和pBM171a的酵母轉4H38將質粒pBM143b、pJLin195、pBM165a、pBM169a、pBM170a和pBM171a各自轉化入釀酒酵母JG169細胞，其中根據製造商的說明書使用YEASTMAKERtm酵母梓化系統(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)。簡單來說，使用一個釀酒酵母JG169的菌落接種50ml的YPD培養基，並且在定軌搖床(250rpm)上在30°C溫育過夜。當細胞達到0.4-0.5的600nm吸光度時，將細胞在700離心5分鐘，棄去上清，並且將沉澱物重懸在30ml去離子水中。在SorvallRT6000D離心機中以700xg離心5分鐘之後，將細胞沉澱物重懸於1.5ml1.1XTE/醋酸鋰溶液(110mM醋酸鋰、11mMTris，pH8、l.lmMEDTA)。在微型離心機中以12,000xg離心15秒之後，將細胞沉澱物重懸在600plUXTE/醋酸鋰溶液中。在向50pl感受態細胞添加了約0.5jugpBM143b、pJLinl95、pBM165a、pBM170a或pBM171a,250plPEG/醋酸鋰溶液(40。/。PEG4000、0.1M醋酸鋰、10mMTris-HCl,pH8、1mMEDTA)和5pl10mg/ml變性HerringTestes(緋魚精巢)載體DNA之後，將混合物以550rpm在30°C搖動30分鐘，並且通過每10分鐘進行的顛倒來混合細胞。向每個轉化混合物添加總體積20)il的DMSO，並且在42°C溫育15分鐘，並且每5分鐘對混合物進行顛倒。將轉化混合物在微型離心機中以12，000xg離心15秒，並且將細胞重懸在1mlYPDPLUSTM液體培養基(YEASTMAKERTMYeastTransformationSystem,Clonetech,PaloAlto,CA,USA)中並且在550rpm和30°C搖動90分鐘。離心之後，將細胞用1ml0.9%NaCl溶液洗滌，並且重懸在1ml酵母減ura選擇培養基中，其中存在15%甘油。將每個轉化反應的50微升一式兩份塗布到酵母減ura選擇平板上，並且在30。C溫育直到菌落出現。使用包含pBM143b、pJLinl95、pBM165a、pBM169a、pBM170a或pBM171a的釀酒酵母JG169轉化體接種96孔板中180pl的減ura選擇培養基，並且在30°C、250rpm溫育過夜。然後將過夜培養物在180pl銅誘導"原始"或"最優，，培養基中稀釋100倍，並且在30。C培養5天。使用對硝基苯基丁酸酯(pNB)作為底物在以下測定法中測量培養物上清的脂肪酶活性首先將培養物上清以1/15倍稀釋在0.1MMOPS、4mMCaCl2、0.01%TritonX-100緩衝液、pH7.5(樣品緩衝液)中，接著是從稀釋樣品的0倍到1/3倍到1/9倍的系列稀釋。將LIPOLASETM標準品(NovozymesA/S,Bagsv《rd，Denmark)在樣品緩衝液中使用兩倍步驟稀釋，從1.0LU/ml39濃度開始，至0.125LU/ml濃度結束。將總共20ial的每種稀釋液(包括標準品)轉移至96孔平底板。向每孔添加200^f鼓升對硝基苯基丁酸酯底物溶液(對硝基苯基丁酸酯:DMSO:0.1MMOPSpH7.5的比例為1:99:400),然後在25°C溫育15分鐘。溫育完成之後，測量96孔平板在405nm的吸光度。通過從生成的標準曲線進行外推來確定樣品濃度。對於搖瓶分析，將代表轉化體接種入2ml減ura選擇培養基並且在30。C、250rpm溫育過夜。然後將過夜培養物在125ml玻璃搖瓶中的25mlCUP減ura培養基中稀釋200倍，並且在30。C培養6天。收穫樣品，在微型離心機中以12,000xg離心10秒，並且使用上文所述的對硝基苯基丁酸酯測定法測試上清液的脂肪酶活性。將IO微升的培養物上清與Laemmli樣品緩衝液(Bio-RadLaboratories,Inc.:Hercules,CA,USA)以1:2比例混合。煮沸2分鐘之後，將樣品連同15|ilPRECISIONPLUSPROTEIN"TM標準品(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA:USA)加載到10-20%SDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)上。在IXTris-甘氨酸-SDS電泳緩衝液(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)中以200V運行凝膠1小時。然後將凝膠用水漂洗3次，每次5分鐘，並用BIO-SAFETM考馬斯染料(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)染色1小時，接著用水脫色至少30分鐘。將包含pBM143b、pJLinl95、pBM169a或pBM171a的釀酒酵母JG169轉化體(每種質粒24個)在96孔板中的"原始"含銅培養基中培養5天。使用對硝基苯基丁酸酯作為底物如上所述測定培養液樣品中的脂肪酶活性。pBM143b、pBM169a、pJLinl95和pBM171a轉化體的平均相對脂肪酶活性分別是100、202、196和506，如表I所示。表I.tableseeoriginaldocumentpage40表I中顯示的結果說明了通過用高拷貝質粒過量產生Acelp轉錄激活子，使細毛嗜熱黴變體脂肪酶表達水平加倍。已經顯示對於生長在含有琥珀酸作為緩沖劑和半乳糖和葡萄糖的混合物作為主要碳源的"最優"培養基中的轉化體，酵母轉化體中的細毛嗜熱黴變體脂肪酶活性得到了改進。為了測試過量產生Acelp的轉化體中細毛嗜熱黴變體脂肪酶表達水平是否能夠在"最優，，培養基中進一步提高，從生長在96孔平板中"原始"或"最優"含銅培養基中的含有pBM143b、pJLinl95、pBM169a或pBM171a的釀酒酵母菌林JG169轉化體測量了細毛嗜熱黴變體脂肪酶活性。如上所述評估全部四種表達質粒。在"原始"培養基中pBM143b、pBM169a、pJLinl95或pBM171a轉化體的平均相對脂肪酶活性分別為100、190、170和402。生長在"最優"培養基中的pBM143b、pBM169a、pJLinl95或pBM171a轉化體的平均相對脂肪酶活性分別為240、318、285和266,如表II所示。從全部質粒觀察到了生長在"最優"培養基中的轉化體的整體表達較高。將質粒pBM143b與質粒pBM169a比4交時，Acelp過表ii^"細毛嗜熱黴變體脂肪酶的產生的作用高大約30%。然而，在"最優"培養基中從pBM171a過表達爿C5/基因與p幾inl95相比導致細毛嗜熱黴變體脂肪酶表達的少量降低。表IItableseeoriginaldocumentpage41在搖弁瓦中評估了細毛嗜熱黴變體脂肪酶自pBM143b、pJLinl95、pBM169a或pBM171a的表達。將每種質粒的兩個代表轉化體培養在一式兩份25ml搖瓶培養基中，其中使用"原始"或"最優，，培養基。在第4曰、第5日和第6日收穫搖瓶樣品。使用上文所述的對硝基苯基丁酸酯測定法測定第5日樣品的上清的細毛嗜熱黴變體脂肪酶活性。在搖瓶中，由於」C￡7基因過表達的作用，在將"最優培養基"中的pBM143b與pBM169a比較時，細毛嗜熱黴變體脂肪酶的表達高大約U倍，相比之下，在將"原始，，培養基中的pBM143b與pBM169a比較時，細毛嗜熱黴變體脂肪酶的表達高大約1.6倍。此外，"原始"培養基中自pBM171a過表達的」C57基因與自pJLinl95相比產生了表達上大約3.5倍的增加，而在"最優"培養基中觀察到了表達上1.6倍的減少，如表m所示。在兩種培養基中pBM171轉化體的相對表達水平是相同的，而在pJLinl95轉化體中脂肪酶表達水平在"最優"培養基中明顯更高。通過增加的培養物濁度(OD600)監控培養，並且通過塗布在瓊脂培養基上來測定總CFU/ml。通常，"原始"培養基中的細胞的生長至少是"最優"培養基中生長的細胞的兩倍那麼快，可能是由於對葡萄糖作為碳源的偏好。通過顯微觀察，"最優"培養基中生長的酵母細胞表現出因大液泡而膨脹(bloat),與"原始，，培養基中生長的酵母細力包相比液泡大小增加為至少三4咅。表m質粒野生型啟動子額外的信號ACE1培養基相對UAS序列UAS序列序列活性pBM143b20野生型無原始100pJLinl9520變體無原始162pBM169a20野生型有原始162pBM171a20變體有原始566pBM143b20野生型無最優174pJLinl9520變體無最優240pBM169a20野生型有最優190pBM171a20變體有最優465如上所述，進行了SDS-PAGE，對於來自代表性搖瓶的上清和細毛嗜熱黴變體脂肪酶條帶的強度與對硝基苯基丁酸酯測定法結果一致。將質粒pBM165a和pBM170a轉化入釀酒酵母JG169細胞，如上所述。選擇轉化體(每種質粒24個)並且如上所述在％孔板中的"原始"培養基中培養。結果證明了在"原始，，培養基中pBM165a、pBM170a和pBM169a轉化體的平均相對脂肪酶活性分別為100、277和173，如表IV所示。42表IVtableseeoriginaldocumentpage43通過加倍Acelp轉錄因子的主要結合位點，並且通過從多拷貝質粒增加爿C^/基因的表達，在96孔板中觀察到了細毛嗜熱黴變體脂肪酶表達1.6倍的;t曽力口。本文描述和要求保護的發明並不受限於本文所公開的具體實施方案的範圍，因為這些實施方案意欲作為本發明幾個方面的說明。任何等價的實施方案意欲在本發明的範圍之內。實際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發明的多種修改對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附權利要求的範圍內。在衝突的情況下，將以包括定義部分的本7>開為準。本文引用了包括登錄號的多篇參考文獻，其公開的內容通過引用整體併入。權利要求1.一種用於產生多肽的方法，其包括(a)在有益於產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含含有編碼所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與包含銅響應性上遊激活序列的銅誘導型啟動子序列可操作地連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；和第三多核苷酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因；和(b)從培養基分離所述多肽。2.權利要求1的方法，其中所述銅誘導型啟動子序列是從選自下組的基因獲得的釀酒酵母金屬硫蛋白基因、釀酒酵母超氧化物歧化酶基因、酉良酒酵母胞質過氧化氫酶基因、釀酒酵母銅耐受抑制基因、光滑念珠菌金屬硫蛋白基因、粗糙脈孢菌金屬硫蛋白基因、解脂西洋蓍黴(Jamw'aZ^o/,'ca)金屬硫蛋白基因、雙孢蘑菇金屬硫蛋白基因、灰梨孢菌金屬疏蛋白基因和鵝柄孢殼菌金屬硫蛋白基因。3.權利要求l的方法，其中所述一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列是從選自下組的基因獲得的釀酒酵母金屬硫蛋白基因、釀酒酵母超氧化物歧化酶基因、釀酒酵母胞質過氧化氬酶基因、釀酒酵母銅耐受抑制基因、光滑念珠菌金屬硫蛋白基因、粗糙脈孢菌金屬硫蛋白基因、解脂西洋蓍黴金屬硫蛋白基因、雙孢蘑菇金屬硫蛋白基因、灰梨孢菌金屬硫蛋白基因、鵝柄孢殼菌金屬硫蛋白基因，和它們的組合。4.權利要求l的方法，其中所述一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列是SEQIDNO:46和/或SEQIDNO:47。5.權利要求l的方法，其中所述銅依賴性反式作用轉錄因子基因選自下組釀酒酵母^CW基因、光滑念珠菌^M77基因、解脂西洋蓍黴CRF1基因(登錄號P45815)、粟酒裂殖酵母CUF2基因(登錄號094588)、釀酒酵母HAA1基因(登錄號Q12753)和煙麴黴(A/e^7/w/wm/ga^s)銅拳DNA結合域蛋白基因(登錄號Q4WN33)。6.權利要求l的方法，其中所述真菌宿主細胞包含一個或多個(幾個)拷貝的第一多核苷酸。7.權利要求l的方法，其中所述多肽選自下組抗原、酶、生長因子、激素、免疫調節劑、神經遞質、受體、報導蛋白、結構蛋白和轉錄因子。8.權利要求1的方法，其中所述多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。9.權利要求1的方法，其中所述多肽對於所述真菌宿主細胞是天然的或外源的。10.權利要求l的方法，其中所述第一和第二多核苷酸包含在所述真菌宿主細胞的染色體中或在染色體外元件上。11.權利要求1的方法，其中所述第三多核香酸包含在所述真菌宿主細胞的染色體中或在染色體外元件上。12.權利要求1的方法，其中所述真菌宿主細胞是絲狀真菌或酵母細胞。13.通過權利要求1-12中任一項的方法獲得的多肽。14.一種核酸構建體，其包含含有編碼多肽的核酸序列的第一多核苷該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源15.權利要求14的核酸構建體，其中所述銅誘導型啟動子序列是從選自下組的基因獲得的釀酒酵母金屬硫蛋白基因、釀酒酵母超氧化物歧化酶基因、釀酒酵母胞質過氧化氬酶基因、釀酒酵母銅耐受抑制基因、光滑念珠菌金屬硫蛋白基因、粗糙脈孢菌金屬硫蛋白基因、解脂西洋蓍黴(&m3w/a/^0/^/ca)金屬硫蛋白基因、雙孢蘑菇金屬硫蛋白基因、灰梨孢菌金屬硫蛋白基因和鵝柄孢殼菌金屬硫蛋白基因。16.權利要求14的核酸構建體，其中所述一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列是從選自下組的基因獲得的釀酒酵母金屬硫蛋白基因、釀酒酵母超氧化物歧化酶基因、釀酒酵母胞質過氧化氬酶基因、釀酒酵母銅耐受抑制基因、光滑念珠菌金屬硫蛋白基因、粗糙脈孢菌金屬硫蛋白基因、解脂西洋蓍黴金屬硫蛋白基因、雙孢蘑菇金屬硫蛋白基因、灰梨孢菌金屬硫蛋白基因、鵝柄孢殼菌金屬硫蛋白基因，和它們的組合。17.權利要求14的核酸構建體，其中所述一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列是SEQIDNO:46和/或SEQIDNO:47。18.—種重組表達載體，其包含權利要求14-17中任一項的核酸構建體。19.一種重組真菌宿主細胞，其包含權利要求14-17中任一項的核酸構建體和第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因。20.權利要求19的重組真菌宿主細胞，其中所述銅依賴性反式作用轉錄因子基因選自下組釀酒酵母^CS/基因、光滑念珠菌^W77基因、解脂西洋蓍黴CRF1基因(登錄號P45815)、粟酒裂殖酵母CUF2基因(登錄號094588)、釀酒酵母HAA1基因(登錄號Q12753)和煙麴黴(^"/e/^7/w/ww'go^s)銅拳DNA結合域蛋白基因(登錄號Q4WN33)。全文摘要本發明涉及產生多肽的方法，包括(a)在有益於產生所述多肽的培養基中培養真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含含有編碼所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其與包含銅響應性上遊激活序列的銅誘導型啟動子序列可操作地連接，該上遊激活序列通過銅依賴性反式作用轉錄因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地連接於所述啟動子序列上遊的一個或多個(幾個)額外的銅響應性上遊激活序列，其中所述啟動子序列對於編碼所述多肽的核酸序列是外源的，並且所述銅響應性上遊激活序列負責該啟動子序列的銅誘導型轉錄；和第三多核苷酸，其包含至少一個拷貝的編碼銅依賴性反式作用轉錄因子的基因；和(b)從培養基分離所述多肽。文檔編號C12N15/81GK101512001SQ200780033608公開日2009年8月19日申請日期2007年7月13日優先權日2006年7月14日發明者巴巴拉·徹裡,戴比·亞弗,馬茲·E·比約恩瓦德申請人:諾維信股份有限公司;諾維信公司