用於預測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物的製作方法

2023-12-09 08:53:01 7

專利名稱：用於預測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物，更具體地，本發明涉及利用新鑑別的2型糖尿病易感基因Caspase9的一個單核苷酸多態性(SNP)位點設計的預測2型糖尿病易感性的試劑盒和引物。本發明還涉及Caspase9基因在製備預測2型糖尿病易感性的診斷劑中的應用。
背景技術：
大量流行病學資料表明，糖尿病是一種具有明顯遺傳傾向的複雜的多基因遺傳病。遺傳因素可明顯影響機體對胰島素的敏感性。最近幾年，大多數研究者致力於通過定位克隆法尋找糖尿病相關基因，即尋找患病家系成員間共享的染色體DNA區域間的連鎖。已發現2型糖尿病中的一些相對較少見的單基因形式，稱為青年晚髮型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)，是由於突變導致了β細胞功能低下。這些病人通常在青春期到成人早期發病，表現為葡萄糖反應性胰島素分泌缺陷。這些致病基因中有6個分別編碼葡萄糖激酶、轉錄因子HNF1α、1β、4α及胰島素啟動因子(IPF1)，神經細胞分化蛋白(NeuroD1)。這些基因突變最終導致高血糖血症。這些單基因糖尿病的發病率還不確切，估計佔所有2型糖尿病的5％。但是，單純利用定位克隆的策略來確定多基因遺傳病的成功報導還不多。
除了定位克隆法外，目前對多基因遺傳病的相關基因進行研究還有一種方法最常用的方法，即候選基因法，即直接研究疾病候選基因的變異與疾病表型之間的關係。該法主要基於對家系或人群的病例-對照關聯分析。關聯分析不需要大的家系研究而是比較某個或某一套標記在患者和正常個體的分布程度。某種標記如果在患病個體中分布十分明顯，那麼就可以認為該標記與疾病表型相關聯。但是，候選基因法中由於對致病基因所在位置沒有足夠了解，在選擇候選基因上存在較大的盲目性，主要針對與疾病發生發展相關的一些代謝通路進行研究。將上述兩種方法相結合的定位候選克隆法在一定程度上彌補了任何單一一種方法的局限性，為目前多基因遺傳病研究中所普遍採用的策略。
同遺傳病研究策略相對應，其研究工具—多態性標記也從第一代的限制性片段長度多態性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP)，第二代的微衛星標記(Microsatellite Marker)發展到第三代的單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。尤其在對多基因遺傳病進行病例-對照關聯分析中，需要利用大量高密度的標記物，前兩代多態性標記已不能滿足這種要求。因此，近年來，SNP作為第三代遺傳圖譜的構建者已越來越引起人們的廣泛關注。
單核苷酸多態性(SNP)主要是指基因組水平上由單核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，佔所有已知多態性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛分布，平均每500-1000個鹼基中就有1個，其總數估計可達300萬個甚至更多。近年來，隨著人類基因組及遺傳學研究的進展，SNP在全面深入地了解個體和群體間基因組的變異或多態性及疾病研究等方面也越來越顯示出其重要意義。將SNP用於疾病易感基因定位的一個最大的優點就是它的分布廣泛性。其次是它有比微衛星更高的穩定性，可以最大限度地減少遺傳過程中由於序列變異所導致的信息遺失。另外，SNP很容易實現高通量的分型，短時間內可以產生大量的結果，這一點是微衛星所無法比擬的。SNP的上述特點決定了它非常適合於進行象糖尿病這樣的多基因疾病，尤其是多個微效基因所導致的疾病的定位研究。選擇合適的病例和正常對照，採取關聯分析的研究方法，對SNP而言，是非常適合的。
本發明人近幾年來一直從事中國北方漢族人群2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)基因定位研究。在先前進行的全基因組掃描工作中，本發明人已經分別鑑定出多個易感基因位點，它們分別位於1號，12號，18號及20號染色體上。其中在1號染色體上共有5個存在易感基因的區域。在此基礎上，本發明人嘗試從定位區域選擇合適的候選基因，利用SNP進行了病例-對照關聯分析，最終終於鑑定了一個糖尿病易感基因(即CASP9基因)，以及該基因上的一個與中國北方漢族人2型糖尿病特別相關的SNP位點。由此經過深入研究完成了本發明。

發明內容
根據本發明的一個方面，提供了一種預測2型糖尿病易感性的試劑盒，所述試劑盒包含基於圖1B或圖1A的序列設計的用於PCR擴增的特異引物以及通過核酸擴增進行檢測的試劑盒所含的常規組件。所述引物針對圖中所示的SNP位點而設計，長度為18bp-21bp。優選地，所述引物選自SEQ ID NO1-30組成的一組，更優選地，所述引物為具有SEQ ID NO31，SEQ ID NO32所示序列的單鹼基延伸(SBE)引物。
根據本發明的另一方面，提供了用於預測2型糖尿病易感性的引物，所述引物為基於圖1B或圖1A的序列設計的用於PCR擴增的特異引物，所述引物針對圖中所示的SNP位點而設計，長度為18bp-21bp。優選地，所述引物選自SEQ ID NO1-30組成的一組。根據本發明的一個更優選的實施方案，本發明的引物為SEQ ID NO31，SEQID NO32所示的單鹼基延伸(SBE)引物。
根據本發明的再一方面，提供了Caspase9基因作為2型糖尿病易感基因在製備用於糖尿病診斷的診斷劑中的應用，Caspase9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO33所示。


圖1A為本發明的SNP位點(R)所在的Caspase9基因區域的核苷酸序列。
圖1B為圖1A序列的互補序列。
具體實施例方式
定義單核苷酸多態性(SNP)主要是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，佔所有已知多態性的90％以上。
微衛星位點把長度為2-6個核苷酸的串聯重複序列(VNTR)稱為微衛星(Microsatellite)，微衛星位點有兩個最突出的優點一是它出現頻率很高，遍布於整個基因組，而且，由於短序列在進化上不受選擇，因而在同一位點上可變重複單位數目變化很大，一個位點可能有多達幾十種的等位基因，信息含量高；二是STR兩側的特異性單拷貝序列穩定性高，可作為檢測其多態性的PCR引物。以PCR技術操作，可以實現自動化大規模操作基因分型及等位基因頻率分布同一種群生物中，相同等位基因核苷酸序列順序分析，在此表示相同SNP位點在不同個體中的組成成分的確定，為基因分型。等位基因頻率是指所研究的同一種類等位基因裡，所期望出現的等位基因佔的比例，也就是出現變化的等位基因的所佔比例。
疾病易感性(糖尿病易感性)人群對疾病容易感受程度。
病例-對照關聯分析是一種由因及果的回顧性研究。它是先按疾病狀態確定調查對象，分為病例和對照組，通過比較病例組與對照組間所研究的遺傳標誌出現頻率的差異而獲得該標誌與疾病間關聯的信息。
單鹼基延伸(SBE)反應它是指在缺乏四種dNTP、存在四種ddNTP的情況下，測序酶可在引物的3』端加上一個ddNTP，但因為不能形成磷酸二酯鍵，故不會繼續延伸，鹼基延伸一個後即告終止。只需檢測這一個鹼基即可。又稱微測序法(Minisequencing)。
參數連鎖分析和非參數連鎖分析根據基因的重組率來計算兩個基因之間的染色體圖距即連鎖分析，用分類變量(離散變量)來進行分析，把測量指標按某一標準歸類，計數，然後進行分析為參數分析，用實際測量後的結果進行的分析為非參數連鎖分析，細胞凋亡是在發育過程中，正常生理狀況下的細胞死亡。這一個過程的很重要的特徵caspase基因，活性氧，鈣離子。β細胞的凋亡程度的增加和糖尿病相關。
Caspase-9位於染色體的1p36.3-p36.1，是Caspase家族成員的半胱氨酸—天門冬氨酸蛋白酶，Caspase蛋白家族成員的順序活化在凋亡的執行階段起到重要的作用。Caspase蛋白以無活性的前體蛋白形式存在，通過在保守的天門冬氨酸殘基處斷裂產生兩個亞基，這兩個亞基結合成有活性的蛋白酶。
1997年，Li等人報導了從hela細胞中純化了第三種凋亡活性因子APAF3，在體外參與caspase-3的活化。APAF3被確認為caspase家族的一個成員，並且叫做caspase-9。在cytochrome c和dATP存在的情況下，caspase-9和APAF1通過他們各自的N-端的CED-3同源結構域相互作用，導致caspase-9的活化，活化的caspase-9反過來剪切和活化caspase-3。caspase-9的活性位點的突變降低了caspase-3的活化和對凋亡的應答。表明caspase-9是凋亡過程中非常上遊的蛋白，並且由cytochrome c和dATP觸發。
Procaspase-9在cytochrome c和dATP的存在下被APAF1切割活化，產生了成熟的caspase蛋白。caspase-9的活化起始了一系列下遊的蛋白因子如caspase-3，caspase-6，caspase-7。XIAP和caspase-9相互作用並且抑制它的活性，而SMAC通過和XIAP相互作用解除這種抑制。
2002年，Marsden等人建立了由BCL2控制的細胞死亡途徑，並不需要caspase-9及其活化因子APAF1的參與。由於凋亡過程在缺失caspase-9和APAF1的時候受到的影響很小，Marsden認為凋亡複合體並不是凋亡過程中的一個觸發機制，只不過是放大了凋亡的過程。
早在1998年，Kuida等人敲除小鼠的人caspase-9基因的同源基因，大多數基因敲除小鼠死於大腦的明顯的增大和畸形，這是由於在發育過程中凋亡過程的減弱引起的。Hakem等人也得到了caspase9敲除的小鼠。caspase-9缺失的胚胎幹細胞和胚胎纖維細胞系對包括UV和伽馬射線的數種凋亡刺激都有抵抗。
2型糖尿病的病因十分複雜，在大多數情況下都會發生胰島素抵抗和β細胞的功能缺陷。隨著病情的發展，β細胞的功能缺陷加劇，使得胰島素的分泌不足，病人必須補充胰島素來維持正常的代謝。研究表明，在出現臨床症狀之前，β細胞的缺損就已經出現了。已經通過不同的途徑表現出來在葡萄糖或者其他促分泌劑的刺激下胰島素的分泌減少，胰島素的分泌特點上出現了問題，前胰島素原到胰島素的轉變的效率的改變，還有，胰島細胞澱粉小體多肽(Islet AmyloidPolypeptide，IAPP)釋放的減少。
胰島素的抵抗會引起β細胞分泌功能的提高。這一提高需要胰島素的生物合成和釋放，這一現象提示，經過一段時間，和胰島素的抗性的增加引起的對胰島素需求的增加導致了β細胞的「衰竭」，因此最終會失去功能。在沒有遺傳缺陷的個體中在胰島素抵抗的時候，β細胞會有適應性改變，並且防止最終防止發生高血糖。因為，幾乎在所有的肥胖個體中都有存在不同程度的胰島素抵抗，只有一小部分的個體最終發展成為糖尿病。這說明，正常的β細胞可以適應胰島素的抵抗，遺傳易感個體攜帶的突變，使得個體無法完全適應胰島素的抵抗，而導致遺傳性的β細胞程序型死亡。這樣，增加的胰島素分泌因此暴露了β細胞功能的缺陷。
血液中葡萄糖不正常的代謝狀態導致了細胞凋亡的加速。在人的體外培養的人的胰腺的朗罕氏細胞中發現高糖可以調控bcl基因家族的表達，來誘導細胞的凋亡。有一系列的研究表明在2型糖尿病患者中都發生減少。β細胞質量的減少導致了胰島素的分泌的減少，然而質量的減少並不能解釋觀測到的所有的功能改變，質量減少的病理學原因可能是多因素的。
最近的研究發現，飽和自由脂肪酸(Free Fatty Acid，FFA)的含量的升高會誘導胰島素的抗性和β細胞的凋亡。並且有證據表明FFA可以影響caspase，bcl-2基因的表達，引發β細胞的調亡。另外，在糖尿病並發視網膜疾病的小鼠中，發現在小鼠患有糖尿病之後的2個月之內，有數個Caspase基因被激活，包括caspases-1，-2，-6，-8，and-9，說明糖尿病引發了凋亡的產生。
本課題組的先期工作表明，1、12、18和20號染色體上均存在有中國北方漢族人2型糖尿病的易感基因位點，其中1號染色體上有4個區域(1p36、1p31、1q22及1q42-43)顯示與2型糖尿病相連鎖(本組前人作出，不需要文獻)。如下述實施例所示，進一步對該區域進行的精細掃描結果顯示，其中有3個區域(1p36.33-36.23、1q24.3-25.1及1q42.12-42.13)仍存在連鎖。
目前有多個公共資料庫儲存了幾百萬條SNP信息，人們可以通過多種方式，如以基因名、登記號、染色體號、功能級別等，進行查尋。但是，這些資料庫中的SNP絕大多數只是「候選者」，而非經過驗證的真正SNP。它們是利用計算機在對多個克隆序列進行比對時發掘出來的，其中必然存在一部分假陽性SNP。另外，這些SNP大多數是利用高加索人和黑人測序尋找的SNP，在中國人群中的分布有些不一定相同，我們利用中國北方漢族人群的糖尿病患者和正常對照，重新測序尋找SNP。並利用我們在中國北方漢族糖尿病人群中發現的高頻的SNP進行基因分型。
為尋找2型糖尿病易感基因，本發明人根據美國國家生物信息學(National Center for Biotechnology Information) 中心公布的信息選取位於1p36.23-36.33、1q24.3-25.1及1q42.12-42.13區域的2型糖尿病34個候選基因，對這些基因的外顯子，Promotor區2kb，以及臨近的內含子的區域進行測序篩查中國北方漢族人群中的SNP。並對其中部分高頻的SNP進行基因分型，通過SBE反應(包括直接的SBE反映，SnapshotTM試劑盒，SnupeTM試劑盒)，酶切，序列測定等方法對其在病例組及對照組進行分型及病例-對照關聯分析。
如以下實施例所詳細討論的，所選擇的124個高頻的SNP位點中，Caspase9基因內選取了9個位點進行基因分型，發現本位點和糖尿病相關，分別位於第八號內含子的-237位處的一個SNP位點(K，即G/T)，NCBI中的編號是rs884363，其等位基因頻率分布在病例組和對照組中的差異有統計學意義(P＜0.05)，提示這一SNP位點與2型糖尿病相關，進一步得出結論，其所在基因Casp9基因為中國北方人2型糖尿病的易感基因。
因此，本發明的一個方面涉及糖尿病易感基因Casp9基因在預測糖尿病易感性中的應用。基於Casp9基因，可以獲得各種診斷劑和試劑盒以用於預測2型糖尿病易感性。
Casp9所在基因組序列如SEQ ID NO33所示，全長為31,971bp，本發明所揭示的SNP位點(K)位於該序列的30,250-31,700位之間，這一區域的核苷酸序列如圖1A所示，圖中K為SNP位點，其代表鹼基G/T多態性，即該位點可以為G，也可以為T。這一區域的互補序列如圖1B所示，圖中M代表本發明的SNP位點的互補鹼基，其代表鹼基C/A。
本發明還涉及用於預測糖尿病易感性的引物。優選地，所述引物基於圖1A的序列而設計，由此，PCR擴增後的產物測序可以直接測得SNP位點。當然，本發明的引物也可以基於圖1B的序列設計，這樣PCR擴增後的產物測序得到SNP的互補鹼基。優選地，本發明的引物具有SEQ ID NO1-30所示的序列，特別優選的是SEQ ID NO31SEQ ID NO32所示的SBE引物。下表1舉例示出了本發明的引物的一些組合，引物的解鏈溫度(Tm)以及這些組合得到的產物大小。本領域技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這些列出的引物及其組合。
表1


本發明進一步涉及包含本發明的一或多種引物的試劑盒，該試劑盒用於檢測糖尿病的易感性。除了本發明的引物之外，所述試劑盒還包含運用PCR擴增而進行檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩衝液等，本領域技術人員熟悉這些常規組件和檢測方法。
以下將參照實施例進一步描述本發明。
實施例1中國北方漢族人群2型糖尿病易感基因的精細定位1、2型糖尿病家系的收集收集中國北方漢族人群中滿足以下要求的2型糖尿病家系1)家系中連續2代或2代以上出現2型糖尿病患者，每代至少有一個患者、一個正常人。
2)糖尿病患者應是在正規醫院確診的、對胰島素不敏感者(除外1型糖尿病)。入選的對照個體年齡應在35歲以上(以儘量排除尚未發病的家系成員)。
3)除糖尿病外，不合併其它明顯器質性疾病，如高血壓、冠心病(除外糖尿病所導致的併發症)等。
在採集家系前應確保所有家系成員都了解採血目的，即有知情權，血樣提供人在了解了所有情況後，若同意，要在「知情同意書」上簽字，才能實施抽血和其它個人情況的調查。若不同意，則尊重其個人意見。將收集的資料嚴格保密，不對外公布供血成員的姓名、年齡、疾病等所有資料。
對入選家系的每一個成員，除已明確診斷的2型糖尿病患者外，均應進行口服葡萄糖糖耐量試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)，以確認每一個成員是否可作為正常對照。OGTT試驗過程抽取空腹靜脈血及口服75g葡萄糖(5分鐘內喝完)後30分鐘、60分鐘、120分鐘及180分鐘的靜脈血，觀察血糖濃度的動態變化情況。此外，記錄每一個體一般情況，包括性別、出生年月、籍貫、發病年齡、身高、體重、心率、呼吸、血壓、用藥情況、有無合併症、以及血脂、血電解質等項目，必要時行特殊檢查，以排除合併有高血壓、心臟病、動脈粥樣硬化等疾病的家系。
2型糖尿病的診斷嚴格按照WHO於1985年頒發的標準執行。即空腹血葡萄糖濃度≥7.8mmol/L或餐後2小時血糖≥11.1mmol/L為糖尿病。OGTT的判斷標準為服糖後2小時血葡萄糖濃度＜7.8mmol/L為正常，≥11.1mmol/L為糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之間為糖耐量低減(impaired glucose tolerance，IGT)。
共採集到60個符合以上條件的2型糖尿病家系，成員共計367人。其中2型糖尿病患者180例，正常人171例，IGT患者16例。這些家系分別來自北京、山東、河北、內蒙古、河南等地的漢族人群。繪製所有家系的家系圖，並對每一家系及家系成員進行編號，此編號同DNA入庫號一致。在所收集到的家系中，15％(9/60)為三代家系，85％(51/60)為二代家系。患者中男性為83人，女性為97人；IGT者16人。家系成員平均年齡為50.03歲，其分布情況(分患病和正常)見表2表2 2型糖尿病家系成員年齡構成

取所有家系每一成員的外周血樣備用。
2、PCR擴增微衛星片段、基因分型常規方法提取上述血樣中的基因組DNA，提取後的DNA均溶解於TE緩衝液中，註明樣品所屬家系、編號等資料，-20℃保存待用。
在以往全基因組掃描陽性區(1p36，1p31，1p12，1q22，1q42-43區，20p12，20q13區，12p12區及18q23區)選擇雜合度較高、分布較為均勻的微衛星位點進行第二輪掃描。共選擇了60個位點，其中1號染色體5個陽性區域內34個，平均密度3.2cM；12號染色體4個，平均密度2.2cM；18號染色體4個，平均密度1.9cM；20號染色體上3個區域內18個，平均密度2.6cM。這些微衛星位點的最低雜合度為0.64，最高為0.88，平均值0.748。部分微衛星位點的遺傳學位置自http//www-genome.wi.mit.edu查找所得(在「Human PhysicalMapping Project」欄下)，部分自法國Genethon的人類多態性中心的資料上獲得。在所用的60個微衛星位點中，16個在ABI公司Version2.0試劑盒中已有引物，46個需新設計合成引物。新合成的一對引物中的一條用螢光物質FAM或HEX標記。所有引物在合成時綜合考量PCR擴增片段長度的大小及可能的合理分組情況來確定螢光標記的顏色。反應所用的引物序列參見法國Genethon遺傳圖譜的Microsatellite Markers Data Set。各微衛星位點擴增片段長度及引物信息見表3。
表3 60個微衛星位點的大小範圍與標記螢光位點名稱片段大小(bp)標記螢光位點名稱片段大小(bp)標記螢光D1S243 142-170 HEX D1S2709 191-197 FAMD1S468 173-191 HEX D1S2800 195-225 FAMD1S2845 193-233 FAM D1S235 175-195 FAMD1S214 122-152 NED D1S2850 145-153 FAMD1S2663 183-205 FAM D12S1625264-280 FAMD1S472 228-244 FAM D12S77 163-193 FAMD1S2892 93-129 FAM D12S336 117-135 NEDD1S2722 195-223 FAM D12S89 254-288 HEXD1S463 223-233 HEX D18S465 233-251 HEXD1S211 170-198 HEX D18S61 213-243 NEDD1S2627 265-279 FAM D18S1125268-286 FAMD1S2868 210-224 FAM D18S488 239-264 HEXD1S497 250-278 EAM D20S906 229-247 FAMD1S206 208-226 NED D20S842 156-180 HEXD1S495 138-164 FAM D20S889 93-129 FAMD1S2707 137-159 FAM D20S849 214-236 FAMD1S2878 152-178 NED D20S95 82-100 FAMD1S196 322-338 HEX D20S892 205-223 FAMD1S2815 210-237 FAM D20S115 238-250 NEDD1S218 266-286 NED D20S851 128-150 FAMD1S466 155-175 FAM D20S901 260-268 FAM
D1S2692 187-217 HEX D20S186 121-143 HEXD1S245 235-253 FAM D20S852 152-176 HEXD1S205 94-112 FAM D20S112 217-241 FAMD1S425 336-360 NED D20S912 267-283 FAMD1S419 162-194 FAM D20S857 204-220 FAMD1S2860 168-184 FAM D20S840 141-165 FAMD1S2880 113-135 FAM D20S120 213-241 FAMD1S213 107-133 NED D20S100 213-239 HEXD1S2833 92-108 FAM D20S102 169-177 FAMPCR擴增後，在377電泳儀(ABI公司)上進行電泳，用377電泳圖象收集軟體(ABI PrismTM377-96 Collection或ABI PrismTM377XL Collection)收集結果，在GENEHUNTER2.0軟體(美國麻省理工學院遺傳系編寫，從http//cmag.cit.nih.gov上可自由下載)上運算，計算相關的位點與表型連鎖的P值、Z值。結果顯示在所研究的10個區域中有3個區域繼續顯示出與糖尿病連鎖的證據，如表4所示表4 3個陽性區域內有意義位點的遺傳位置、P值及Z值位點名稱距p末端距離(cM)細胞遺傳學位置統計P值統計Z值D1S243 0.01p36.33 0.008341.653D1S468 6.21p36.33 0.0015 2.135D1S2845 11.1 1p36.32 0.033 1.292D1S214 16.4 1p36.31 0.0025 2.005D1S2663 16.9 1p36.23 0.002051.996D1S2815 193.8 1q24.30.001262.17D1S218 196.5 1q25.10.043 1.2D1S2800 256.2 1q42.12 0.0128 1.579D1S235 258.7 1q42.13 0.0547 1.363從上表可以看出，1p36.33-36.23區有意義(P＜0.05)的陽性位點最多，共有5個，最低的P值為0.0015，Z值2.135，5個位點分布在長達16.9cM的區域內。1q24.3-25.1區有2個位點，1q42.12-42.13區有1個位點滿足P＜0.05的標準，另外D1S235的P值雖然略高於0.05，但其Z值已達統計學界值(Z＞1.36)，因此可以認為該位點與糖尿病還是有連鎖關係的。這兩個區域已分別精細定位至2.7cM(D1S2815-D1S218)和2.5cM(D1S2800-D1S235)的狹窄範圍內。引人注目的是在1p36.33-36.23區，連續5個位點都出現了P值小於0.05的情況，因此下一步選擇此區域克隆易感基因。
實施例2 糖尿病易感基因CASP9的鑑定及該基因內SNP的相關研究1、中國北方漢族人群2型糖尿病患者及正常對照標本的收集正常組及2型糖尿病組人群外周血樣本均採自北京協和醫院內分泌科門診。標本來源均為我國北方地區，包括北京、山東、河北、內蒙古自治區等地，以北京為主。糖尿病可為散發，也可為糖尿病家系的成員(但此時每一家系中通常只有一個患者入選，同一家系中沒有任何血緣關係的成員可以選擇一個以上)；正常對照來自正常人群，要求其家庭三代以內沒有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，對照組與患病組年齡及性別相匹配。
2型糖尿病診斷同實施例1。入選的每個成員記錄一般情況，包括性別、出生年月、籍貫、發病年齡、身高、體重、心率、呼吸、血壓、用藥情況、有無合併症等，對每個成員檢查血脂、血電解質等項目，必要時行特殊檢查，以排除合併有高血壓、心臟病、動脈粥樣硬化等疾病。入選的每個成員都應在「知情同意書」上簽字。
共採集到325份標本，其中病例組173份，對照組152份。兩組在性別、年齡上相匹配，糖尿病患者的平均年齡為51.99歲，正常對照採樣時的平均年齡為48.8歲。在所有成員中，男女的比例為169∶156，病例組男性92人，女性81人；對照組男性77人，女性75人。兩組成員的年齡分布情況如下表5患病組和對照組成員的年齡構成

2、候選基因的確定及候選基因中用於基因分型的SNP位點的選擇基於實施例1的結果，即染色體1p36.33-36.23區域與2型糖尿病相連鎖，利用生物信息學方法從NCBI SNP資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中選出位於這一區域或其附近的37個與葡萄糖代謝相關基因測定基因的promotor區2kb，外顯子及其鄰近的內含子區，和3』非翻譯區。並對其中的80個高頻的snp進行基因分型，所述的34個候選基因如下(1)CASP9位於染色體的1p36.3-p36.1，是caspase家族成員的半胱氨酸精氨酸蛋白酶，caspase蛋白的順序活化在凋亡的執行階段起到重要的作用。caspase蛋白以無活性的前提蛋白形式村子，通過在保守的精氨酸殘基處斷裂產生兩個亞基，這兩個亞基結合成有活性的蛋白酶。
(2)CDC2L2基因編碼p34Cdc2蛋白激酶家族成員，位於1p36.3。該激酶家族成員對真核細胞的細胞周期調控起著關鍵的作用。
(3)磷酸葡萄糖脫氫酶(PGD)是戊糖磷酸旁路途徑中的第二個脫氫酶，位於人染色體的1p36.3-p36.13。
(4)PRKCZ是蛋白激酶Cζ成員，位於染色體的1p36.33-p36.2位置。是絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶家族中的ζ成員，它參與數種細胞代謝過程，(5)SAC基因編碼一個與典型的哺乳動物不同的腺苷酸環化酶，位於染色體的1q24。
(6)Urotensin II基因位於染色體1p36，編碼一個成熟的多肽具有活性的環12肽，從七腮鰻到人類具有很高的保守性。
(7)GNB1基因位於染色體1p36.33，在信號接受分子和效應分子之間傳遞信號，由三個不同的亞基組成，這個基因編碼beta亞基。
(8)GPR52基因位於染色體1q24，G蛋白耦聯的受體家族成員。
(9)氨氯吡咪敏感性鈉離子通道δ亞基(dNaCh，SCNN1D)基因位於1p36.32區NT_002209中，編碼產物屬非電壓敏感型通道蛋白，可被利尿劑氨氯吡咪抑制，介導腔內離子的電擴散，以異源四聚體的形式存在於膜上。
(10)乙醯CoA硫酯水解酶(HBACH)基因位於1p36.23區NT_002530中。編碼產物屬乙醯輔酶家族成員之一，可水解棕櫚酸CoA的CoA硫酯及其它長鏈脂肪酸。
(11)Urotensin II位於1p36.23區NT_002530中。目前對其蛋白功能所知甚少，但已知其保守性很高。一個G蛋白偶聯受體GPR14可作為其受體。
(12)DJ-1(RNA結合蛋白調節亞基)位於1p36.23區NT_002163中。
(13)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因位於1p36.21區AL354994克隆中。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶參與葉酸代謝，是同型半胱氨酸葉酸依賴的再甲基化過程的關鍵酶，以同源二聚體形式發揮催化活性，受S-腺苷蛋氨酸別構調節。
(14)氯離子通道B(CLCNKB)基因位於1p36.13區bA254I4.00143(長47068bp，屬unfinished sequence)中，編碼電壓門控型氯離子通道蛋白B型，主要在腎中表達，它和A型有94％的同源性。氯離子通道可參與調節細胞體積、膜電位穩定性、信號傳導及跨上皮轉運等。
(15)TNFSF4位於染色體的1q25，編碼一個腫瘤壞死因子受體超家族的個體。
(16)TNFSF6位於染色體的1q23，編碼一個腫瘤壞死因子受體超家族的個體。
(17)SLC19A2位於染色體的1q23.3，編碼維生素b1的轉運蛋白，屬於葉酸轉運超家族的成員。
(18)CDC42BPA又叫做PK428，位於染色體1q42.11，和肌強直性營養不良相關的蛋白激酶相似，絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶，和cAMP依賴的蛋白激酶相似。
(20)KCNK1位於染色體的1q42-q43，這個基因編碼一個鉀離子通道蛋白超家族的成員，包含有2個形成孔蛋白的p結構域，這個基因的產物看起來不是一個功能性的通道，他需要其他的蛋白的參與才具有活性。
(21)ATP2B4位於染色體的1q25-q32，這個基因編碼一個質膜鈣離子泵。
(22)CACYBP位於染色體的1q24-q25，這個基因編碼一個鈣結合蛋白的結合蛋白，這個蛋白的結合的作用還不清楚。
(23)氯離子通道A(CLCNKA)基因，位於1p36.13區bA254I4.00143(長47068bp，屬unfinished sequence)中，編碼電壓門控型氯離子通道蛋白A型，主要在腎中表達。
(24)ENO1位於染色體的1p36.3-p36.2，這個基因編碼哺乳動物中的3個烯醇化酶異構酶中的一個，它編碼一個alpha烯醇化酶，一個同源二聚體可溶性酶。
(25)DFFA位於染色體的1p36.3-p36.2，這個基因編碼一個DNA片段化因子DFF，這個是個異源二倍體蛋白包括DFFB和DFFA兩個亞基。
(26)G蛋白伽馬4蛋白(GNG4)，是異源三聚體的G蛋白複合體中的一個組分，三聚體蛋白從G蛋白耦聯的受體產道信號到細胞內的效應器。
(27)ICMT異戊基半胱氨酸羰基甲基轉移酶，位於染色體的1p36.21，這個基因編碼一個翻譯後修飾蛋白的轉移酶。
(28)RE2是G蛋白耦聯的受體，位於染色體的1q23.2，這個基因是視紫質家族的G蛋白耦聯受體，協助調控攻擊和進食。
(29)PKLR是肝臟丙酮酸激酶的L型的糖分解酶，位於染色體的1q23.2，將磷酸烯醇式丙酮酸轉變成丙酮酸，並且生成ATP。
(30)ALPL是一種非組織特異性的鹼性磷酸酶，位於染色體的1p36.1-p34，在肝臟，骨骼，腎臟都有分布。準確的生理功能現在未知。
(31)PLA2G2D是磷酸酯酶A2，IID組，位於染色體的1p36.12，優先水化磷脂的sn-2酯鍵，也許在感染的過程中有重要的功能。
(32)CA14是羰基脫水酶家族中的一個，位於染色體的1q21，催化二氧化碳的可逆性水化，參與數種不同的生理過程。
(33)CA6是羰基脫水酶家族中的一個，位於染色體的1p36.2，催化二氧化碳的可逆性水化，主要在唾液腺裡邊發現。
(34)PANK4是泛酸酯激酶家族的成員，位於染色體的1p36.23，在細菌和哺乳動物中催化輔酶A的生物合成。並受到輔酶A的反饋調節。
所選擇的用於基因分型的80個SNP位點如表6所示。



3、SNP位點基因分型分析主要採用3種方法進行SNP的分型長度多重性單鹼基延伸(LengthMultiplexed Single Base Extension，LM-SBE)反應，SnaPshot法，限制性片段長度多態性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP-PCR)及測序分型。
1).LM-SBE反應進行SNP分型1.1)引物設計與合成針對上述23個SNP位點中的每一個SNP位點設計3條引物，其中的2條為PCR引物，用於擴增包含SNP位點的一段序列，另外一條是SBE引物，用於單鹼基延伸反應。PCR引物通過Primer 3.0程序在線設計，擴增片段長度為150～300bp。
SBE引物設計原則引物要位於SNP位點的5′端，其3′端的最後一個鹼基恰好是與SNP緊鄰的前一個鹼基。引物長度在18～46base之間，Tm值在55～80℃之間。預備同組的幾個位點為不同類型交替出現，其長度相差4個(或其倍數)鹼基，且它們之間不能形成發卡結構，較長的SBE引物不能形成回折等二級結構。參照文獻(Lindhlad-Toh K，Winchester E，Daly MJ，et al.Lange-scale discoveryand genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse.Nat.Genet..2000，24381-386)。
另外，設計用作分子量大小標準的FAM標記的DNA片段，其大小分別為19bp、23bp、27bp、31bp、35bp、39bp、43bp、47bp，所有序列均為AT重複而成。
1.2)PCR反應及產物鑑定將不同類型及不同SBE引物長度的多個SNP位點(一般為3-5個)組合為一組，先進行多重PCR擴增包含SNP位點的相應數目DNA片段。反應體系5μl，各組分如下名稱原液濃度加樣量(μl)體系終濃度Mg2+25mM0.63mM緩衝液 10× 0.51×
dNTP2mM 0.075 30nM引物10μM 0.05×n各0.1μMAmpliGold 5U/μl 0.05 0.05U/μl模板50ng/μl1 5ng/μlddH2O 補齊至5μl採用Touch-down PCR，其程序如下94℃、12分鐘後，進行15個循環的94℃ 30秒、63℃ 30秒(每一循環溫度下降0.5℃)、72℃50秒，隨後24個循環的94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 50秒，最後72℃ 10分鐘兩次。反應結束後用1％瓊脂糖電泳鑑定，在UV燈下觀察有無產物，並在紫外凝膠成像儀拍照，記錄時間、位點名稱、樣品號等。
1.3)PCR產物純化PCR反應後體系中殘存的dNTP及沒有參與反應的單鏈引物會影響下一步的SBE反應，故用作SBE反應模板的PCR產物需要清除這兩者。蝦鹼性磷酸酶(Shrimp AlkalinePhosphatase，SAP)可以將dNTP 5′端的磷酸基團去除，使之不能形成磷酸二酯鍵，從而不能參與DNA鏈的延伸；核酸外切酶I(Exonuclease I，ExoI)可從單鏈DNA的3′端到5′端方向逐個降解核苷酸，從而避免PCR反應剩餘的引物影響下一步的SBE反應。
在每5μl PCR產物中加入2μl酶混合液，其中含SAP 0.5U/μl，Exo I lU/μl，混勻，置入37℃水浴箱消化1小時，取出後離心，85℃ 15min滅活SAP及Exo I，用作SBE反應模板。
1.4)LM-SBE反應由於體系中只有螢光標記的ddNTP(本實驗中分別為JOE-ddATP，FAM-ddGTP，TAMRA-ddCTP ROX-ddUTP)，使用對螢光標記ddNTP摻入率比較高的熱測序酶(ThermoSequenase)來進行反應，可使每個SBE引物在反應中僅延伸一個鹼基即告終止。儘管擴增只是線性增長的，但40個循環後，在ddNTP足量的情況下，其總量也達到了模板的40倍，足以進行檢測。
反應體系為5μl，各組分如下
名稱 原液濃度加樣量(μl)體系終濃度Mg2+25mM0.52.5mM緩衝液 10× 0.51×JOE-ddATP0.12μM 0.12.4nMFAM-ddGTP0.12μM 0.12.4nMTAMRA-ddCTP 0.12μM 0.12.4nMROX-ddUTP0.60μM 0.112nMSBE引物 2μM0.05×n40nMTheromo Sequenase10U/μl 0.025 0.05U/μl模板 1ddH2O 補齊至5μl反應程序為95℃、3分鐘後，進行40個循環的95℃ 30秒、50℃30秒、60℃40秒，最後60℃ 2分鐘。
1.5)電泳SBE產物1μl與上樣緩衝液等比例混合，在377測序儀上進行電泳。加樣時可分別於電泳時及加樣後30分鐘2次加樣，在加樣孔的兩端分別各加一個孔的大小標準。電泳結束後通過觀察SBE產物電泳位置並與大小標準比較，即可判斷是哪一個位點。
1.6)基因型判定及數據整理根據條帶顏色判定SNP基因型，藍色為G/G，綠色為A/A，黃色為C/C，紅色T/T，藍/綠色為A/G，黃/紅色為C/T。將各位點分型結果整理為Excel格式以進行統計處理。
2)SnaPshotTM進行基因分型SnaPshotTM是PE公司基於單鹼基延伸(SBE)的原理開發的基因分型的試劑盒，多重引物特異性延伸用於多個SNP位點同時做基因分型，必須在ABI3700測序儀上運行。
2.1)需要分型的SNP位點，一般把7～8個位點放入同一個體系中，分型，必須在ABI3700測序儀上運行。
2.1)需要分型的SNP位點，一般把7～8個位點放入同一個體系中，引物的3』末端必須設計在SNP位點的上遊或下遊的鄰近位點，規則同普通的PCR反應。各引物的Tm值最好接近，不能低於50℃；2.2)在引物前加上適當長度的polyT，使各個位點之間至少相差4bp，並儘可能使鄰近的兩個位點沒有重合的鹼基，(例如3個位點依次是C/T，A/G，C/T)；2.3)分別用常規方法PCR含有各SNP位點的DNA片段，標定濃度後等量混合、純化；2.4)將各個SNP位點的延伸引物等量混合併稀釋到分別為0.5μM。將SNaPshot反應混合物2μl、引物混合物2μl和純化後的PCR產物混合物1μl混勻，96℃10s，50℃5s，60℃30s，30個循環進行引物特異性延伸。反應產物中加入9倍體積的70％乙醇，常溫下靜置20分鐘，4℃4000轉離心45分鐘，棄上清，再加入9倍體積的70％乙醇，靜置20分鐘，同樣條件離心，棄上清，1300轉倒置離心。空氣中晾乾30分鐘，加入6μl雙蒸水。
2.5)SNaPshot上樣和判讀每孔加甲醯胺(Hi-Di Formamide)9μl，長度標記0.2μl，SNaPshot反應產物3μl，95℃變性5分鐘，冷卻後在在ABI PRISM 3700 DNA測序儀上進行毛細管電泳，運行Genescan 3.7進行數據分析，Genotyper3.7輸出各樣本各位點的基因型。
3)RFLP-PCR進行SNP分型對於改變酶切位點的SNP，可先進行PCR擴增，擴增產物用相應的內切酶消化，電泳後根據條帶位置判定基因型。完全酶切或不能被酶切的為兩種不同的純合型，不完全酶切的為雜合型。
4)測序分型對於不適合用以上兩種方法分型或分型結果不理想的位點進行測序分型。
以上各SNP位點的分型均先在96個隨機選取的正常對照個體中進行。
在病例組和對照組中，上述80個位點均符合Hardy-Weinberg平衡。經SPSS統計軟體10.0版(免費下載於http//linkage.rockefeller.edu/soft/)分析，有1個SNP位點位於Casp9的第8號內含子的第-237位，在NCBI的SNP資料庫中的編號是(rs884363)，等位基因頻率分布在兩組中差異有統計學意義(P＜0.05)，如表7所示。
表7病例組與對照組SNP分型SPSS統計分析結果等位基因SNP C T A G 總計 P值病例組194 256 450 0.043rs884363對照組108 194 302總計位於CASP9基因的L2N4片斷中的1個SNP位點rs884363的等位基因頻率在病例組和對照組存在顯著差異，因此提示這一位點與2型糖尿病相關。進而提示CASP9基因為一種新的糖尿病易感基因。
CASP9的基因組序列如SEQ ID NO33所示，全長為31,971bp，所揭示的SNP位點(K)位於該基因的30,250-31,700位之間，這一區域的核苷酸序列如圖1A所示，圖中K為SNP位點，其代表鹼基G/T多態性，即該位點可以為G，也可以為T。這一區域的互補序列如圖1B所示，圖中M代表所述SNP位點的互補鹼基，其代表鹼基C/A。
基於這一SNP位點，可以設計適當長度的引物，用於經PCR擴增而預測2型糖尿病易感性。
實施例3 預測2型糖尿病易感性引物的設計及2型糖尿病易感性的預測1.SBE引物引物要位於SNP位點的5』端，其3』端的最後一個鹼基恰好是與SNP緊鄰的前一個鹼基。該引物有一條。長度為18-46個鹼基之間。要避免含有過多的G+C，Tm值在50～65℃之間。由於SNP位點中轉換型較多，因此應避免連續幾個出現相同的序列類型(如連續幾個C/T型)，如遇到準備放入同一個組的幾個位點都是C/T型時，可以將其中的數個從反鏈設計，即變為A/G型，最好是C/T與A/G間隔出現。另外預備同組的幾個位點之間不能有發卡等形成，較長的SBE引物不能形成回折等二級結構。根據以上原則設計的一個引物為5′CAG ACT GAA ATA TTT GCA AGG AGC 3′(SEQ ID NO31)，或者5′AGGCTG GGG CCACTC CT 3′(SEQ ID NO32)其為該鏈的同序引物，即與其互補鏈結合。以此SBE引物對待測個體基因組DNA進行SBE反應檢測SNP位點的序列。
2、普通PCR擴增引物根據SNP位點所在的序列(圖1A和1B)，設計如SEQ ID NO1-30所示的引物。如表1所示進行各種組合。以所述組合為引物，以得自待測個體血樣的基因組DNA為模板進行PCR擴增，對擴增產物進行測序檢測所述SNP位點的單核苷酸多態性。
SEQUENCE LISTING110中國醫學科學院基礎醫學研究所北京諾賽基因組研究中心有限公司國家人類基因組南方研究中心中國醫學科學院北京協和醫院120用於預測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物130I20030512CB16033170PatentIn version 3.1210121121212DNA213人工序列4001ctcagagcag ttgcttcctc t 21210221121212DNA213人工序列4002gaaggaagaa ttcaagaggg g 21210321121212DNA213人工序列4003atagaaaccc gactcagagc a 21210421121212DNA213人工序列4004catagaaacc cgactcagag c 21210521121212DNA213人工序列
4005aggcccagtc ctactccata g 21210621121212DNA213人工序列4006actcagagca gttgcttcct c 21210721121212DNA213人工序列4007gaggaaacag atagggaagg g 21210821121212DNA213人工序列4008ataggcccag tcctactcca t 21210921121212DNA213人工序列4009ggaaacagat agggaagggt g 212101021121212DNA213人工序列40010ccagtgagga aacagatagg g 212101121121212DNA213人工序列40011atcctgtggg catcatgtag t 21
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權利要求
1.用於預測2型糖尿病易感性的引物，所述引物為基於圖1B或圖1A的序列而設計的用於PCR擴增的特異引物，所述引物針對圖中所示的SNP位點R而設計，長度為18-46個核苷酸。
2.如權利要求1所述的引物，其包含選自SEQ ID NO1-30組成的一組的一種序列。
3.如權利要求2所述的引物，其為具有SEQ ID NO31 SEQ IDNO32所示的序列的單鹼基延伸引物。
4.用於預測2型糖尿病易感性的試劑盒，其包含如權利要求1-3任一項所述的引物。
5.CASP9基因在製備用於預測2型糖尿病易感性的診斷劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及用於預測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物，更具體地，本發明涉及利用新鑑別的2型糖尿病易感基因CASP9的一個單核苷酸多態性(SNP)位點設計的預測2型糖尿病易感性的試劑盒和引物。本發明還涉及CASP9基因在製備預測2型糖尿病易感性的診斷劑中的應用。
文檔編號C12Q1/68GK1548554SQ03136978
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月21日 優先權日2003年5月21日
發明者吳國棟, 李雲峰, 左瑾, 方福德, 強伯勤, 沈巖, 姚志建, 陳竺, 黃薇, 王姮 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所, 北京諾賽基因組研究中心有限公司, 國家人類基因組南方研究中心, 中國醫學科學院北京協和醫院