稻瘟病抗性基因Pik及其應用的製作方法

2023-12-09 08:45:16

專利名稱：稻瘟病抗性基因Pik及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pik的克隆及 其應用。
背景技術：
植物在生長的過程中，常常受到多種病原物的侵害，而植物則採取多種防禦策略 以保護自身，避免受其侵襲。植物中一個最重要的防禦機理就是能夠識別專性致病微生物 的存在並啟動自身的防禦應答系統。植物對病原菌的識別由抗病基因所介導。因此，對抗 病基因產物結構進行分析與研究，是了解植物抗病機制的基礎，對於其病害的預防和控制 也具有重要的指導意義。迄今為止，已經從植物中分離了 80多個抗病基因。對這些抗病基因的結構和 產物的研究發現，雖然寄主植物不同，所對應的病原物也有真菌、細菌、病毒和線蟲等差 異，但抗病基因的結構和產物卻有許多共同的結構特徵，如C-端存在富亮氨酸重複序列 (leucine-rich repeat, LRR), N-端存在核苷酸結合位點(nucleotide binding site, NBS)，亮氨酸拉鏈(leucine zipper, LZ)，捲曲螺旋結構域(coiled-coil，CC)，跨膜結構域 (transmembrane domain, TM)，蛋白激酶(proteinkinase，PK)，以及果蠅 iToll 蛋白及哺乳 動物白介素-1受體(Toll and interleukin-1 receptor, TIR)等。根據它們所編碼蛋白 的結構特徵，可將抗病基因分為 7 類(Hammond-Kosack&Jones，1997 ；Dangl & Jones 2001 ； Iyer & McCouch 2004)。第一類，毒素還原酶類抗病基因。如玉米抗病基因Hml，它是第1個被克隆的植物 抗病基因，它控制對真菌Cochliobolus carbonum小種1的抗性。Hml編碼的解毒酶能鈍化 病原真菌所產生的HC毒素，而HC毒素是真菌C. carbonum小種1產生的致病因子，它決定該 病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二類，NBS-LRR類抗病基因。它們編碼 的蛋白近N端為 NBS，而近C端則由 LRR組成。如 RPS2(Bent et al. , 1994) ,RPMl (Grant et al.，1995)、I2(Simonet al.，1998) ；RPP5 (Parker et al. , 1997) > N (Dodd et al. ,2001) > L6(Lawrence et al. ,1995)> Mlal(Zhou et al. ,2001)> Mla6(Halterman et al. ,2001)； 7K稻的抗病基因如 Xal(Yoshimuraet al.，1998)、Pib (Wang et al.，1999)、Pita (Bryan et al. ,2000)等。第三類，1 類抗病基因。如番茄Pto基因，其產物是一種位於細胞內的絲氨 酸-蘇氨酸蛋白激酶，沒有LRR結構域(Martinet al.，1993)。第四類，LRR-TM類抗病基 因。番茄抗葉黴病不同生理小種的基因Cf-2 (Dixon etal.，1996)、Cf-4 (Thomas et al.， 1997)、Cf-5 (Dixon et al.，1998)、Cf-9 (Jones et al.，1994)，以及甜菜抗胞囊線蟲的基 因Hslpra-1 (Cai et al. , 1997)等。第五類，LRR-TM-PK類抗病基因，以水稻抗白葉枯病基因 Xa2KSong et al. , 1995)為代表。第六類，以擬南芥的RPW8為代表，其編碼的蛋白僅含有 完整的CC和NBS結構域(Xiao et al.，2001)。第七類，以水稻的xa5基因為代表，其編碼 的蛋白為一個轉錄因子(TFIIAy) (Iyer&McCouch，2004)。編碼NBS-LRR類抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一類抗病基因，根據NBS-LRR類抗病蛋白N末端的結構特點，又可將該類基因分為兩大類TIR-NBS-LRR和 CC-NBS-LRR(Meyers et al. ,2002 ；Pan et al. ,2000 ；Cannon et al. ,2002 ；Richly et al.，200幻。TIR-NBS-LRR類抗病基因主要發現在雙子葉植物，至今還沒有在單子葉植物 基因組中發現(Baiet al. ,2002 ；Meyers et al.，2002)。目前在單子葉植物中鑑定到的 抗病基因主要編碼CC-NBS-LRR類抗病蛋白，雙子葉植物中也存在大量的CC-NBS-LRR類抗 病基因，相對而言，單子葉植物中的CC-NBS-LRR類抗病基因比雙子葉植物中的更豐富多樣 (Cannon et al.，2002)o研究表明，NBS、CC、TIR結構域可能參與信號傳導(Hammond-Kosack&Jones 1997)，儘管這類R蛋白不具有內在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有結 合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。IlR結構可能參與植物抗病防衛反 應下遊的信號傳導(Jones et al.，1994)。最近的證據表明，亞麻的L族多樣性選擇也發生 在TIR區域，這個區域與相應的LRR區域共進化形成特異性(Luck et al.，2000)。LRR結 構域的功能主要涉及到蛋白質-蛋白質和與配體的相互作用(Jones&Jones，1996 ；Kajava et al.，1998)，據推測是抗病基因產物直接和病原菌無毒基因編碼的產物或間接產物相互 作用的部位(Bent，1996 ;Baker et al.，1997)。Jia et al. Q000)通過酵母雙雜交證明 AVR-Pita編碼的蛋白加工為一個176胺基酸的活性蛋白AVR-Pite176小種特異性的激發子， 傳遞到植物細胞質特異地與Pita受體的LRD區域結合，從而激活細胞內Pita介導的防衛 反應。當Pita中的Ala變為Ser後AtrPitami不能與LRD結合，因而表現感病。這一結 果直接證明了 LRR結構域可能就是病原菌識別的區域；Pita與AvrPita的互作第一次從分 子水平驗證了水稻與稻瘟病菌的「基因對基因」關係。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由病 原真菌Magnapothe oryzae (無性態=Pyricularia oryzae)引起的稻癌病是對水稻生產危 害最嚴重的病害之一，每年都造成嚴重的糧食損失。從環境保護與農業的可持續發展的觀 點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由於稻瘟病菌群體 的多樣性及易變性，加之人們缺乏對抗性基因的有效利用，以及對抗性機理缺乏充分的了 解，以致抗病品種的感病化問題不但沒有得到解決，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品 種的短命化而成為育種學家最為棘手的問題。因此，發掘、鑑定和克隆抗病基因併合理地應 用於抗病育種計劃中，已成為農業科研中優先解決的重要問題。隨著分子生物學的快速發展，迄今，至少有80多個水稻稻瘟病主效抗性基因已經 被報導，其中60個已經被分子定位。目前，除了水稻的第3染色體上還沒有被鑑定到稻瘟 病主效抗性基因之外，其餘的11條染色體上均被鑑定到有主效抗性基因位點，並且有的 染色體上含有多個稻瘟病抗性位點，而且有些基因位點的抗性基因是成簇存在的。目前， 在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式報導的已有13個抗性基因，Pib (Wang et al., 1999), Pita (Bryan et al. ,2000), Pi9 (Qu et al.，2006)，Pid2(Chen et al.,2006), Piz-t 和 Pi2(Zhou et al.，2006b)，Pi36 (Liu et al.，2007a)，Pi37 (Lin et al. ,2007), Pik-m(Ashikawa et al. ,2008), Pit(Hayashi et al.,2009), Pi5(Leeet al.,2009), Pid3(Shang et al.，2009)禾口 pi21(Fukuoka et al. ,2009) 克隆抗病基因是對水稻抗性機理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子機理 可以更好地控制和降低稻瘟病菌對水稻的危害。同時，對克隆的抗病基因進行修飾和改造，可以人為地控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是採用常規植物育種和 改良技術所不能達到的。

發明內容
本發明的目的是提供一種水稻稻瘟病抗性基因和包含調控這個基因的啟動子的 DNA片段。本發明的另一個目的是提供上述稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白質。本發明的另 一個目的是提供上述含有上述抗性基因的載體。本發明的另一個目的是提供上述載體的宿 主細胞。本發明的另一個目的是提供上述基因在製備轉基因植物中的應用。本發明的進一 步目的是提供上述抗性基因產生的分子標記及其在選育對稻瘟病具有抗病性的水稻中的 應用。本發明從水稻品種Kusabue中分離得到Pik基因，包括2個編碼NBS-LRR類蛋 白的基因Pik-I和Pik-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示，它們分 別編碼SEQ ID NO. 3以及SEQ ID NO. 4所示的胺基酸序列，結構如圖6和圖7所示。它 們的蛋白都包含2個主要的結構域NBS和LRR區域，其中Pik-INBS結構域含有保守的 kinase la :GLPGGGKTTVAR, kinase 2 =NKKYLIVIDDIff, kinase 3a=DLGGRIIMTTRLNSI, GLPL EDNSCYDIV匪CYGMPLALIW ；Pik_2NBS 結構域含有保守的 kinase la :VLSIVGFGGVGKTTIA, kinase 2 =LEQLLAEKSYILLIDDIff, kinase 3a =EQVPEEIffKICGGLPLAIVT, GLPL EQVPEEIWKICGGLPLAIV, RNBS-D :CLLYLSIFPKGWK，MHDV :KTFQVHDMVLEYI。而 Pik-1 蛋白的 C-末端為16個不完整的LRR重複，其亮氨酸含量為14.0% (附圖6)。Pik_2蛋白的C-末 端為13個不完整的LRR重複，其亮氨酸含量為17.0% (附圖7)。應當理解，在不影響蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本領域技術人員 可對SEQ ID NO. 3或SEQ ID N0. 4所示的胺基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個 或幾個胺基酸獲得具有同等功能的胺基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡併性，例如可在其 編碼區，在不改變胺基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條件下，對編 碼上述蛋白的基因序列進行修改。本發明還包括基於所述基因的正義序列或反義序列，包 括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞、含有 所述核苷酸序列或其片段的轉化的植物細胞和轉基因植物。本發明同樣包括將Pik抗性基因的主要結構部分有效地連接上合適的調節序列 所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。這種基因可 以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達的啟動子連接，該啟 動子可以在任何條件下和細胞發育的任何時期表達。這種組成型表達的啟動子包括花椰菜 花葉病毒的35S啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表達的啟動子或 發育時期特異性表達的啟動子或精確環境誘導的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導型啟 動子。這樣，環境的改變，發育時期的不同都可以改變該基因的表達。同樣地，也可以將該 基因的表達限定在某一個組織內，使由該基因誘導的抗病反應得到人為的控制。其中環境 條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件和光等，組織和發育時期包括葉、果實、種子和花等。本發明還進一步克隆得到所述基因的啟動子，包含調控該基因的啟動子的DNA片 段分別如SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6所示。根據本發明提供的Pik基因序列信息(SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，本領域技術人員可以通過以下方法容易地獲得與Pik等同的基因(1)通過資料庫檢索獲得；(2) 以Pik基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3)根據Pik 基因序列信息設計寡核苷酸引物，用PCR擴增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和 cDNA中獲取；(4)在Pik基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學合成的方 法獲得該基因。本發明提供的稻瘟病抗性基因Pik具有重要的應用價值，其賦予植物對稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)所引起的病害產生特異性的抗病反應(圖幻。其適用於對所有對該 病原菌敏感的植物，這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。應用之一是將所述的Pik基 因序列連接到任何一種植物轉化載體，用任何一種轉化方法將Pik抗病基因導入水稻或其 他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉基因抗病品種，從而應用於生產。本發明所述的基因 構建到植物轉化載體中，可以對所述基因或其調控序列適當修飾，也可以在其轉錄起始密 碼子前用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬和增強植物對病原菌的抗性。本發明提供的抗性基因的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的分 子標記，包括但不限於SNP(單核苷酸多態)、SSR(簡單序列重複多態)、RFLP(限制性內切 酶長度多態)、CAPS (切割擴增片段多態)。用此標記可鑑定水稻或其它植物的抗性基因型， 用於分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。本發明具有明顯的優點和效果。將克隆的抗病基因轉入感病的植物，有助於產生 新的抗病植物。特別是可以用轉化技術在植物中累加多個抗病基因，而不會產生傳統育種 技術中伴隨出現的基因組中不良基因的連鎖問題，並且可以縮短育種時間。抗病基因的克 隆是克服傳統育種中不能在植物種間轉移抗病基因的問題的前提。本發明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植株和相 應的種子，以及用本發明的基因或基於該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種 子。可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其他的植株中。


圖1.水稻稻瘟病抗性基因Pik的圖位克隆技術路線圖。圖2. 4個Pik簇等位基因對10個中國稻瘟病菌群體抗譜的比較。圖中縱坐標為抗性頻率，橫坐標為10個稻瘟病菌群體(GD，廣東；FJ，福建；HN，湖 南；YN，雲南；GZ，貴州；SC，四川；JS，江蘇；LN，遼寧；幾，吉林；HLJ，黑龍江)。4個Pik簇等 位基因(Shin 2，Pik-s ；K60, Pik-p ；Kusabue, Pik ；Tsuyuake，Pik-m)。由此可以看出，Pik 對廣東、福建、湖南、貴州、四川、江蘇的稻瘟病菌群體表現高度的抗性。圖3A. Pik基因位點的連鎖標記圖。圖中橫線上面的數字為標記之間的物理距離[用鹼基(bp)表示]；括號內的數字 為該標記檢測出的重組體/配子體。圖3B. Pik基因位點在日本晴類型基因組上存在的具有NBS-LRR保守結構的6個 抗性候選基因。圖3C. Pik基因位點在Kusabue/K60/Tsuyuake類型基因組上存在的具有NBS-LRR 保守結構的2個抗性候選基因。由此可以看出，在Pik基因位點存在兩種類型的基因組，彼此之間存在很大的缺失/插入；Pik基因只有2個候選基因(Pikl-KU和Pik2-KU)。圖4(左桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik-I (K3)之遺傳互補Ttl植 株的抗性鑑定實物圖。由於受體品種Q1063存在與Pik-I (K3)匹配(序列完全相同)的Pik_2 (K4)，圖中 的轉化植株中出現抗病個體(實線箭頭)，說明單一的Pik-I導入與之匹配的背景中也能產 生抗性。圖4(中桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik_2(K4)之遺傳互補Ttl植 株的抗性鑑定實物圖。由於受體品種Q1063不存在與Pik_2(K4)匹配的Pik_l (K3)，圖中所有轉化植株都 表現感病(虛線箭頭)，說明單一的Pik-2不具備抗性功能。圖4(右桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik(由Pik-I和Pik-2組成)之遺傳互補Ttl 植株的抗性鑑定實物圖。圖中實線箭頭所指的是抗病植株，虛線箭頭所指的是感病植株，說明抗性基因Pik 由Pik-I和Pik-2組成才能表現功能。圖5.水稻稻瘟病抗性基因Pik遺傳互補的部分Ttl轉化體的選擇標記HPT基因的 PCR檢測圖。圖中由左至右，泳道1 分子量標記DL2000 ；泳道2 空載體(Vector)，陽性對照； 泳道3 =H2O,陰性對照；泳道4 受體品種龍粳24，陰性對照；泳道5-14 =T0轉化體。結果表 明，所有抗病的轉化體都檢測到了選擇性標記的PCR擴增產物，而大部分的感病轉化體沒 有檢測到選擇性標記的PCR擴增產物，說明抗病的轉化體是由於轉化構建體已經整合到了 高感的受體品種中獲得了表達而恢復了抗性。其中出現的陽性中感個體(泳道1 可能是 由於外源基因的整合等問題，在受體品種中並沒有得到充分的表達。R 高抗；MR 中抗；MS 中感；S 感病。圖6A.水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik-I的基因結構圖。圖中淺色方框表示5』和3』 -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內含子；該基因 編碼區的啟動子(ATG)和終止子(TAG)以及各個區域的大小(bp)亦標示於其中。圖6B.水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik-I編碼的胺基酸多肽序列結構 圖。圖中CC結構域中的斜體字表示形成CC motif的胺基酸，NBS區域的黑體字表示 NBS中保守的胺基酸序列。下部分獨立列出的胺基酸殘基為C-末端LRR區域，黑體字表示 形成LRR區域的xLDL保守基序。LRR區域後面還帶有一段CNL (C端非LRR區域)胺基酸序 列。星號標示的胺基酸序列為Pik特異的胺基酸替換[substitution，與Pik簇的其他其他 等位基因(Pik-h，Pik-p, Pik-m)相比]。圖7A.水稻稻瘟病抗性基因Pik之另一組成基因Pik-2的基因結構圖。圖中淺色方框表示5』和3』 -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內含子；該基因 編碼區的啟動子(ATG)和終止子(TAG)以及各個區域的大小(bp)亦標示於其中。圖7B.水稻稻瘟病抗性基因Pik之另一組成基因Pik-2編碼的胺基酸多肽序列結 構圖。圖中CC結構域中的斜體字表示形成CC結構的胺基酸，NBS區域帶下劃線的黑體字表示NBS中保守的胺基酸序列。下部分獨立列出的胺基酸殘基為C-末端LRR區域，黑體 字表示形成LRR區域的xLDL保守基序。圖8.水稻稻瘟病抗性基因Pik表達特性的定量RT-PCR檢測圖。左圖為組成基因Pik-I在不同的接種時間點(0hr，iair，Mhr，7air)的相對表 達水平，由此可以看出，該基因呈逐步上調的表達類型。中圖為另一個組成基因Pik-2在 不同的接種時間點的相對表達水平，由此可以看出，該基因也呈逐步上調的表達類型，但是 前者上調的幅度比後者的大。右圖為病原菌誘導表達基因PBZl (pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作為對照的相對表達水平，由此可以看出，該基因在接種對 照(H2O)和接種病原菌之間表現明顯不同的誘導型表達。2個組成基因都表現為組成型表 達，因為接種之前和之後都能檢測到2個基因的表達。圖9.利用水稻稻瘟病抗性基因Pik特異性分子標記的基因型鑑定圖。由此可以看出，利用該分子標記可以把抗性品種Kusakue(Ku)的基因型(Pik/ Pik)；感病品種IR36(IR)的基因型(pik/pik)；含有與Pik等位的抗性品種Tsuyuake (TS) 的基因型(Pikm/Pikm)；抗性品種K60的基因型(Pikp/Pikp)；抗性品種K3的基因型(PiWi/ Pikh)；以及抗性品種Kusabue與感病品種頂36的雜交F2之感病個體S1-S4的基因型(pik/ pik) ；R1-R2的雜合基因型(Pik/pik)鑑別出來。圖中，M 分子量標記DL2000。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明 的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。在本發明的實施例部分，我們闡述了 Pik基因的分離過程(附圖1)和該基因的特 點，分離的Pik基因能夠與載體連接，轉入植物體中，使該植物體帶有抗性。實施例1 抗性基因Pik的抗性特徵首先，為了比較和明確在Pik位點上4個等位基因(Pik，Pik-p, Pik-s, Pik-m)的 抗譜，利用從廣東(GD, 60個菌株)，福建(FJ，40個)，湖南(HN, 40個)，貴州(GZ, 60個)，雲 南(YN，43個)，四川6(，66個)，江蘇(幾，72個)，遼寧(1^，108個)，吉林(幾，60個)和黑 龍江(HLJ，63個)，收集的總計612個菌株對上述4個等位基因所持品種(分別是Kusabue， K60, Shin 2和Tsuyuake)進行了抗譜比較分析。結果表明，Pik對廣東、福建、湖南、貴州、 四川、江蘇的稻瘟病菌群體表現高度的抗性。由此說明該基因可在上述地區使用。生物材 料水禾S品禾中 Kusabue, Shin 2, K60, Tsuyuake 已在文獻(Wang et al. Characterization of riceblast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus. Phytopathology, 2009,99 :900-905)中公開。實施例2 :水稻稻瘟病抗性基因Pik的定位及電子物理作圖本發明對由粳稻抗病品種Kusabue與頂36等秈稻感病品種的雜交組合由來的F2 群體，接種CHL346等對雙親品種表現分明的非親和性/親和性反應的菌株(稻瘟病菌單一 孢子分離的菌株)。結果表明，這些&群體中抗病植株與感病植株的分離比都符合3 1。由 此推斷，Kusabue所表現的對這些接種菌株的抗性都是由一對顯性基因控制的。對這些&群體對應的抗性基因進行連鎖分析，結果表明它們受同一顯性基因控制，因此，構建了由499 個體組成的一個作圖群體(相當於998個配子體)。生物材料水稻品種頂36已在文獻(Lin et al. A high-resolution map ofthe rice blast resistance gene Pil5constructed by sequence-ready markers. Plant Breeding，2007，126 :287-290)中公幵。生物材料水稻品 禾中 CHL346 已在文獻(Ma et al. Identification and fine mappingof AvrPi 15, a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea. Theor Appl Genet，2006，113 :875-883)中公 開。前期的遺傳分析表明Pik基因與Pik-m基因是等位的，而申請人所在的研究室已 經對 Pik-m 基因進行了精細定位(Li et al. 2007,Molecular Breeding，20 179-188)。因 此，申請人利用Li et aK2007)開發的分子標記進行了連鎖分析。結果表明，在標記K34 和RM5766分別檢測出了 7個和11個重組體(附圖3)。為了縮小Pik位點的染色體區域 並找到與之共分離的標記(沒有重組體發生的標記)，進一步在K34-RM5766區域內，從Li et al (2007)開發的標記中獲得了 2個多態性標記(K33，以8)，並對上述18個不同的重組 體進行了連鎖分析。結果表明，在標記K33和以8分別檢測出了 0個和7個重組體。因此， Pik位點最終被界定於1(34—以8之間的區域內，其中標記K33與之完全共分離。為了構建Pik位點的電子物理圖，把與之連鎖的標記通過生物信息學方法著陸於 水稻品種日本晴(Nipponbare)的參考序列上，並由此構建了該基因位點的重疊群。由參考 序列可以推測Pik位點被界定於側翼標記K34和以8之間約1271Λ的範圍內。實施例3 水稻稻瘟病抗性基因Pik候選基因的注釋及序列分析為了確定Pik的候選基因，申請人利用日本晴的參考序列，通過3種基因預測軟 件 RiceGAAS (http //ricegaas. dna. affrc. go. jp)、Gramene (http ://143. 48. 220. 116/ resources/)禾口 Softberry 的 FGENESH(http://www. softberry. com)對目的基因區域進 行了基因預測及注釋分析，初步確定了 Pik的候選抗性基因為6個核苷酸結合位點和富 亮氨酸重複(nucleotide binding site-leucine-rich repeat, NBS-LRR)的候選基因 (Pikl-NP, Pik2-NP, Pik3_NP，Pik4_NP，Pik5_NP，和 Pik6_NP)。對6個候選基因進行基於基因特異性標記的存在/缺失(presence/absence，P/ Α)分析，結果表明，在日本晴參考序列存在的4個候選基因(Pikl-NP，Pik2-NP, Pik3_NP， Pik4-NP)在Kusabue中是不存在的。因此，Pik的候選抗性基因實際上只有2個Pik-I和 Pik-2(圖3)。下一步通過以下的基因功能互補實驗確認其功能。實施例4 水稻稻瘟病抗性基因Pik的遺傳互補實驗及轉化子的抗性鑑定首先，利用高保真酶phusion結合長片段PCR(long_range PCR，LR-PCR)技術， 以 Kusabue 的總 DNA 為模板，根據或參考 Liu et al. (2007, Genetics, 176 :2541-2549)和 Lin et al. (2007, Genetics，177 1871-1880)描述的實驗方法和程序，分別擴增、克隆了 Pik-I (正向引物:TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA ；反向引物:TTTTGGCGCGC CGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTC)和 Pik_2 (正向引物:TTTTGGCGCGCCGCAAGATCAGTACCAT CACGAGTAATAGCA ；反向引物:TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG)，並進行了 遺傳互補實驗。結果表明，候選基因Pik-I在感病受體品種Q1063(Lin et al. ,The blast resistance gene Pi37encodesan NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1. Genetics, 2007,177 :1871-1880)中實現了功能互補(附圖4左桶)；而候選基因Pik-2在感病受體品種Q1063中則沒有實現功能互補(表 1 ；附圖4中桶)。對感病受體品種Q1063進行序列比較分析發現，該品種中存在與候選基 因Pik-I匹配的Pik-2，而不存在與候選基因Pik-2匹配的Pik-I。表1. Pik 2個組成基因的遺傳互補實驗分析結果候選基因/ 構建體受體品種T0轉化植株的反應型a功能互補RMRMSS總數成功率(％)bPik-IQ1063535425514.5Pik-2Q10630001101100Pik-12Q10631OO48492.0龍粳24136O52479.2a自各個構建體的Ttl轉化植株接種對Pik無毒性的菌株CHL381或CHL346。R，抗 病；MR，中抗；MS，中感；S，感病。b 功能互補成功率(0A)為 R+MR/R+MR+MS+S*100。進一步將上述2個候選基因拼接為一個整體的基因在上述感病受體品種Q1063以 及完全沒有這2個候選基因的感病受體品種龍粳M中進行遺傳互補實驗。結果表明，該拼 接基因在上述2個感病受體品種中都實現了功能互補(表1 ；附圖4右桶)。利用轉化載體 中的潮黴素基因(HPT)標記對轉化體進行了 PCR檢測。結果表明，目的基因片段已經導入 所有抗病轉化體中，而沒有導入大部分的感病轉化體中(部分結果見附圖5)。上述遺傳互補的實驗結果表明，抗性基因Pik由2個基因Pik-I和Pik-2組成才 能表現其功能。實施例5 =Pik基因的結構採用移步法對Pik的DNA序列進行了測定。利用RACE技術，獲得了 Pik的全長 cDNA序列並對其進行了測序。Pik基因DNA長度為16. 91Λ (包含Pik-I和Pik_2)，其中， Pik-I的全長cDNA序列為3695bp，含有一個3432bp的開放讀碼框，5，和3，非翻譯區分別 為73bp和190bp。通過比較基因組DNA和cDNA序列，發現該基因的開放讀碼框含有2個 內含子和3個外顯子(附圖6A)。另一個組成基因Pik-2的全長cDNA為351 lbp，含有一個 3066bp的開放讀碼框，5，和3，非翻譯區分別為162bp和^!3bp。通過比較基因組DNA和 cDNA序列，發現該基因的開放讀碼框含有1個內含子和2個外顯子(附圖7A)。實施例6 =Pik抗性蛋白的結構Pik基因包含的2個組成基因編碼的蛋白序列如序列表中Pik-ISEQ ID No. 3和 Pik-2SEQID No. 4所示。Pik-I基因編碼1個由1143個胺基酸殘基組成的蛋白多肽，分子 量為126.80KD，等電點為6. 16。利用COIL工具分析表明該蛋白多肽有CC(Coiled-Coil) 結構域。Pik-I蛋白屬於NBS-LRR蛋白，NBS結構域中保守的kinase Ia(GLPGGGKTTVAR) 位於該多肽的第291個胺基酸殘基；kinase 2 (NKKYLIVIDDIff)位於該多肽的第376 個胺基酸殘基；kinase 3a (DLGGRIIMTTRLNSI)位於該多肽的第403個胺基酸殘基， GLPL(EDNSCYDIVNMCYGMPLALI)位於該蛋白多肽462個胺基酸殘基。而該蛋白的C-端的 611-961個胺基酸殘基為16個不完整LRR重複，其亮氨酸含量為14. 0%，其C末端還有個非 LRR結構(CNL)的胺基酸序列(附圖6B)。圖中星號標示的胺基酸序列為Pik基因特異的胺基酸替換(substitution)，由此可以鑑別Pik基因與其他等位基因(Pik-s，Pik-h，Pik-m， Pik-p)的不同。Pik-2基因編碼1個由1021個胺基酸殘基組成的蛋白多肽，分子量為114. 57kd， 等電點為8. 39。利用coil工具分析表明該蛋白多肽沒有cc結構域，但是利用更為強 大的預測工具i^aircoiU分析發現有cc結構域。Pik_2蛋白屬於nbs-lrr蛋白，NBS結 構域中保守的kinase la (gfggvgkttia)位於該多肽的第211個胺基酸殘基；kinase 2 (KSYILLIDDIff)位於該多肽的第330個胺基酸殘基；kinase 3a (ggriivttrfqav)位於該多 肽的第358個胺基酸殘基，glpl(eqvpeeiwkicgglplaiv)位於該多肽的第415個胺基酸殘 基，Rnbs-Wcllylsifi3KGWK)位於該多肽的第488個胺基酸殘基，mhdv (ktfqvhdmvleyi)位 於該多肽的第553個胺基酸殘基。而該蛋白的c-末端的610-960個胺基酸殘基為13個不 完整lrr重複，其亮氨酸含量為17.0% (附圖7b)。實施例7 =Pik基因的表達特性分析利用定量RT-PCR技術對Pik基因的表達模式進行了分析。在抗病品種 Kusabue接種後不同的時間點(Ohr，12hr, 24hr, 72hr)上採集葉片並提取其總RNA,利 用反轉錄試劑盒 SuperScript Reverse TranscriptaseII (Invitrogen 公司)進行 反轉錄 cDNA 第一條鏈的合成。RT-PCR 的引物為，RRT5F GAAGCTCTGATCAACGGTATTCC, RRT5R :TCTTTGATCATCTTCGGGATACG；RRT17F :TGAACTTCCACGATTGGATCCAC, RRT17R ACATGGTTCTTGAATACATCATGTC。實時定量RT-PCR 使用 CFX96Real_time PCR 檢測系統和 STOR Premix Ex Taq 試 劑盒(寶生物公司)，操作按照試劑盒說明進行。附圖8(左)為組成基因Pik-I在不同的 接種時間點的相對表達水平，由此可以看出，該基因呈逐步上調的表達類型。附圖8(中)為 另一個組成基因Pik-2在不同的接種時間點的相對表達水平，由此可以看出，該基因也呈 逐步上調的表達類型，但是前者逐步上調的幅度比後者的大。附圖8(右)為病原菌誘導表 iiSElPBZl (pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作為對照白勺才百對表達 水平，由此可以看出，該基因在接種對照(H2O)和病原菌接種之間表現明顯不同的誘導型表 達。2個組成基因都表現為組成型表達，因為接種之前和之後都能檢測到2個基因的表達。實施例8 轉化Pik基因產生的抗性植株的應用將Pik 基因克隆到植物轉化載體 pCAMBIA1300(Lin et al.，The blast resistance gene Pi37encodes an NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1. Genetics, 2007,177 :1871-1880),導入農桿菌菌株 EHA105中，用於轉化感病的水稻品種龍粳24，獲得了 M株轉化植株，其中19株表現抗性反 應(表1)。這說明可以用Pik基因轉化水稻感病品種，結合現有技術經過自交、純化選擇等 一系列育種程序之後，即可產生抗病品種而應用於生產。實施例9 =Pik基因序列在分子標記輔助選擇育種中的應用利用本發明提供的Pik基因序列信息可開發基因特異性的dCAPS分子標記 (Pik-SNP-IF TTCGAGGCCCTACCAAGACA ；Pik-SNP-IR CATGGAAGGCTATCCTTGGTA,擴增產物用 限制性內切酶KpnI進行酶切)，既可用於鑑別Pik基因與其他等位基因(Pik-h，Pik-m, Pik-p, Pik-s)的不同，也可在雜交後代用於鑑定Pik位點上的各種基因型，即PiWi/PiWi、 Pikh/pikh和pilih/pilch的植株，這些信息可在分子標記輔助選擇育種過程中加以應用，以提高育種的目的性和效率(附圖9)。序列說明SEQ ID NO. 1&2 是Pik-1 和 Pik_2 的核苷酸序列；SEQ ID NO. 3&4 是 SEQ ID NO. 1&2 的編碼產物；SEQ ID NO. 5&6是帶有啟動子的Pik-I和Pik_2核苷酸序列。SEQ ID NO. 7&8 和SEQ ID NO. 9&10是分別用來擴增Pik-I和Pik-2的引物對；SEQ ID NO. 11&12和SEQ IDN0. 13&14 分別是引物對 RRT5F、RRT5R 和 RRT17F、RRT17R ；SEQ ID NO. 15&16 是引物對 Pik-SNP-IF 和 Pik-SNP-IR ；SEQ ID N0. 17 26 分別是 Pik-I 的 kinase la、kinase 2、 kinase 3a、GLPL 序列以及 Pik-2 的 kinase la、kinase 2、kinase 3a、GLPL> RNBS-D> MHD 序列。
權利要求
1.稻瘟病抗性基因Pik，其至少編碼a)和b)所述胺基酸序列中的一種，其中a)SEQ ID NO. 3所示的胺基酸序列；b)SEQID NO. 4所示的胺基酸序列。
2.如權利要求1所述的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
3.權利要求1或2所述基因的cDNA序列。
4.權利要求1或2所述基因編碼的蛋白。
5.由權利要求1或2所述基因或權利要求3所述cDNA與啟動子構建的表達盒。
6.含有權利要求1或2所述基因或權利要求3所述cDNA的表達載體。
7.權利要求1或2所述基因、權利要求3所述cDNA、權利要求4所述蛋白、權利要求5 所述表達盒或權利要求6所述表達載體在製備轉基因植物中的應用。
8.權利要求1或2所述基因、權利要求3所述cDNA、權利要求4所述蛋白、權利要求5 所述表達盒或權利要求6所述表達載體在提高水稻抗稻瘟病中的應用。
9.根據權利要求1或2的所述基因產生的分子標記。
10.權利要求9所述的分子標記在水稻抗稻瘟病的輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種稻瘟病抗性基因Pik及其應用。本發明提供了水稻稻瘟病抗性基因Pik的核苷酸序列及其編碼的胺基酸多肽序列。該序列包含有2個基因，都屬於CC-NBS-LRR抗性基因家族的成員，且皆為組成型表達的基因。本發明還提供了應用該基因轉化水稻或其它植物培育抗病品種以及根據該基因序列產生的分子標記應用於育種。
文檔編號A01P3/00GK102051368SQ20101010568
公開日2011年5月11日 申請日期2010年2月2日 優先權日2010年2月2日
發明者林菲, 潘慶華, 王玲, 翟純, 董忠秋 申請人:華南農業大學