具有副作用降低的特性的新型重組腺病毒載體的製作方法

2023-12-09 09:20:16 2

專利名稱：具有副作用降低的特性的新型重組腺病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於基因治療的重組腺病毒載體，和生產該載體的方法。具體而言，本發明涉及一種新型重組腺病毒載體，其通過抑制插入腺病毒基因組中的外源啟動子誘導腺病毒基因表達，能減輕體內施用該載體後的炎症，還涉及一種生產該載體的方法，用於生產該重組腺病毒載體的一種細胞系，或應用該重組腺病毒載體的一種基因治療方法。
背景技術：
腺病毒載體是適用於動物細胞的極好的基因轉移載體，因為它們具有較高的基因轉移效率，使基因轉移到未分裂細胞的能力，易於製備高效價的病毒原液，等等，其臨床用途已嘗試作為基因治療的載體。當前廣泛應用的腺病毒載體是複製缺陷型載體，其中腺病毒複製和所有腺病毒蛋白質表達必需的E1基因缺失，該載體被稱為第一代腺病毒載體(有些還缺失E3基因)。
眾所周知，由於第一代腺病毒載體缺乏E1基因，所以在不表達E1基因的正常細胞(如人類細胞)中沒有任何腺病毒蛋白質表達。然而，最近的研究證明，當利用第一代腺病毒載體體內轉移一種基因時，轉基因的表達是暫時的，並且在基因轉移部位發生炎症反應(Yang Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914407-4411(1994)，Wilmott R.W.等人，Hum.Gene Ther.，7301-318(1996))。
提出了下列假說，作為其原因的一種解釋。在第一代腺病毒載體感染的細胞中，腺病毒早期基因(如E2A基因)由細胞產生的轉錄因子低水平表達，從而激活腺病毒主要晚期啟動子(MLP)。之後，主要晚期蛋白質表達，針對它們的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)開始產生，CTL清除轉移有外源基因的細胞。因此，這一理論是，通過腺病毒早期蛋白質的表達，腺病毒晚期蛋白質的表達是炎症反應和缺乏轉基因持續表達的一個原因(Engelhardt J.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916196-6200(1994)，Yang Y.等人，Nature Gnent.7362-368(1994))。
根據這一假說，構建了多種改進的腺病毒載體，其中除E1基因之外，腺病毒複製必需的基因缺失，然後提供由來自產病毒細胞的基因編碼的蛋白質，該病毒變得能夠複製。例如，曾經報導E2A基因缺失的一種腺病毒載體(Zhou H.等人，J.Virol.，707030-7038(1996)，Gorziglia M.I.等人，J.Virol.，704173-4178(1996))，和E4基因(如E2A基因一樣，它是一種早期基因)缺失的一種腺病毒載體(Krouglicak V.等人，Hum.Gene Ther.，61575-1586(1995)，Wang Q.等人，GeneTher.，2775-783(1995)，Yeh P.等人，J.Virol.，70559-565(1996))，等等。然而，對於E2A基因缺失的腺病毒載體，觀察到延長轉基因表達時間和減少炎症反應的極小影響(Morral N.等人，Hum.Gene Theer.，81275-1286(1997)，Lusky M.等人，J.Virol.，722022-2032(1998)，O』neal W.K.等人，Hum.Gene Ther.，91587-1598(1998))。此外，曾經報導在E4基因缺失的腺病毒中觀察到適當的改進，但還不令人滿意(Gao G-P.等人，J.Virol.，708934-8943(1996)，Wang Q.等人，GeneTher.，4393-400(1997)，Dedieu J-F.等人，J.Virol.，714626-4637(1997))。
因此，提出一種依賴輔助病毒的腺病毒載體(HD載體)作為進一步改進的載體，其中除了末端反向重複序列(ITR)和包裝信號外所有腺病毒基因都缺失，其複製依賴於輔助病毒(Kochanek S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935731-5746(1996)，Parks R.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9313565-13570(1996))。這種HD載體也被稱為gutted載體或gutless載體。據報導這種HD載體顯示改良載體的作用，如轉基因表達時間延長，炎症反應減少(Morsy M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 957866-7871(1998)，Schiedner G.等人，Nature Gnet.18180-183(1998)，Morral N.等人，Hum.Gene Ther.92709-2716(1998))。
然而，當這種HD載體在臨床上用作藥物時，存在載體產率低的重要問題。原因如下第一，在HD載體的產生過程中，HD載體依賴於輔助腺病毒作為來源供應複製所需的所有蛋白質。根據使HD載體能夠複製而始終保持恆定比例輔助病毒的生產原則，報導的每個細胞產生的HD載體的產量明顯低於第一代腺病毒載體(Morsy M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 957866-7871(1998)，Schiedner G.等人，Nature Gnent.18180-183(1998))。而且，由於希望的HD載體總是汙染用於生產的輔助病毒，必須根據病毒比重的微小差異，通過超速離心分離病毒，除去輔助病毒。有時通過超速離心純化第一代腺病毒載體，但是其目的在於從腺病毒顆粒中除去汙染蛋白質。另一方面，在HD載體的純化過程中，不僅必須如上所述除去汙染蛋白質，而且必須分離輔助病毒，因此一輪離心純化的產量少於第一代腺病毒載體。如果輔助病毒沒有完全除去，病毒安全性本身就是一個問題。而且，儘管第一代腺病毒載體也能通過可比超速離心法處理更大量病毒的柱層析法純化(Huyghe B.D.等人，Hum.Gene Ther.61403-1416(1995))，但是由於HD載體必須除去輔助病毒，現有技術水平不能應用柱層析法。由於上述原因，在培養細胞產生和隨後的純化步驟中，HD載體的產率明顯低於第一代腺病毒載體。因此，認為生產足夠臨床應用的HD載體極其困難，並且不切實際。
此外，病毒來源的啟動子，如巨細胞病毒(CMV)啟動子和勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，已經廣泛用於基因治療的載體，包括腺病毒載體，因為它們的啟動子活性是高水平的。然而據報導，為了由這些啟動子體內長期表達希望的基因，需要腺病毒E4基因編碼的蛋白質(Armentano D.等人，J.Virol.，712408-2416(1997)，Brough D.E.等人，J.Virol.719206-9213(1997))。基於持久啟動子活性的觀點，插入來自病毒的高活性啟動子的腺病毒載體必須採用結構類似於第一代腺病毒載體的載體。

發明內容
本發明的一個目的在於提供一種能夠不依賴於輔助病毒複製的新型腺病毒載體，該載體具有在體內幾乎不表達腺病毒蛋白質，因此不誘發炎症反應，並且能夠持續表達轉基因的特性。另外，本發明的一個目的在於在基因治療中提供這種腺病毒載體。
關於在向個體動物施用E1基因缺失的第一代腺病毒載體時發生炎症反應的原因，本發明的發明者已經進行了廣泛和深入的研究。結果發現，當第一代腺病毒載體感染不產生E1蛋白的細胞時，表達腺病毒蛋白質的機制不同於傳統假說。於是發明的發明者解釋，觸發腺病毒蛋白質表達的不是通常認為的早期基因的表達，而是插入腺病毒載體中的外源啟動子。特別闡明了一種新的機制外源啟動子的特定成分(增強子等)作用於該啟動子附近的腺病毒啟動子，於是腺病毒基因得到表達。除此之外，我們還發現表達的主要腺病毒基因不是由公認的主要晚期啟動子(MLP)調節並且編碼六鄰體等的主要晚期基因，而是含有獨立啟動子的蛋白IX基因。
蛋白IX不是腺病毒複製所必需的蛋白質，而是形成完整腺病毒顆粒所需的。因此，第一代腺病毒載體中僅蛋白IX基因缺失就不能產生發明者希望獲得的正常的腺病毒載體。因此，發明者進一步進行了廣泛和深入的研究，發現這一問題能用兩種不同的方法解決。一種方法是將腺病毒載體的蛋白IX基因由正常位置重新定位到不受外源啟動子作用的位置(稱為蛋白IX重新定位的腺病毒載體)。另一種方法是從腺病毒載體中缺失蛋白IX基因，構建產生蛋白IX的新細胞系，由該細胞系產生蛋白IX基因缺失的腺病毒載體(蛋白IX缺失的腺病毒載體)。
此外，發明者的研究還證明，儘管由於外源啟動子的作用誘導表達的腺病毒基因主要是蛋白IX基因，但是蛋白IVa2基因和L1基因也可能誘導表達。因此，蛋白IVa2基因和L1基因的啟動子已經修飾而不受外源啟動子作用的腺病毒載體，能夠單獨使用或與蛋白IX基因的修飾聯合使用，作為不表達腺病毒蛋白質並且幾乎不誘發炎症的載體。
本發明根據上述發現完成。
因此，本發明涉及1.一種重組腺病毒載體，其體內施用過程中的炎症減輕，該載體具有下列特徵(1)-(4)(1)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(2)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；(3)具有下列特徵(A)和/或(B)(A)由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組的基因從正常位置重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置，或者該基因缺失；和(B)由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組基因啟動子的核苷酸序列被置換，以致不受外源啟動子的作用；和(4)形成與腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒顆粒，2.一種根據上述1的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組的啟動子是MLP和/或IVa2基因啟動子，3.一種根據上述1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特徵(5)-(8)(5)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(6)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；(7)腺病毒基因組的蛋白IX基因從正常位置重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置；和(8)含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒，4.一種根據上述1-3中任意一項的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因，5.一種根據上述1-4中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因之外的至少一種基因全部或部分缺失，6.一種根據上述3-5中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失，7.一種根據上述1-6中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失，8.一種根據上述1-7中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失，9.一種根據上述1-8中任意一項的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個ORF，10.一種根據上述9的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3，11.一種根據上述10的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失，12.一種根據上述3-11中任意一項的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子18kb或更遠的位置，13.一種根據上述12的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於腺病毒基因組的L3基因與E2A基因之間，14.一種根據上述3-11中任意一項的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子24kb或更遠的位置，15.一種根據上述14的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於腺病毒基因組的E3基因缺失位點，16.一種根據上述3-11中任意一項的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子30kb或更遠的位置，17.一種根據上述16的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於腺病毒基因組的E4基因上遊區與3』端ITR之間，18.一種根據上述1-17中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有來自哺乳動物和/或動物病毒的元件，19.一種根據上述18的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有CMV增強子，20.一種根據上述19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CMV啟動子，
21.一種根據上述19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CAG啟動子，22.一種根據上述18的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種RSV啟動子或一種SRα啟動子，23.一種根據上述18的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體，24.一種根據上述23的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒，25.一種根據上述1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特徵(9)-(11)(9)腺病毒基因組的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；(10)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；和(11)含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒，26.一種根據上述25的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失，27.一種根據上述25或26的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點或E3基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因，28.一種根據上述25-27中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因、E3基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失，29.一種根據上述25-28中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失，30.一種根據上述25-29中任意一項的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個ORF，31.一種根據上述30的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3，32.一種根據上述31的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失，33.一種根據上述25-32中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有來自哺乳動物和/或動物病毒的元件，34.一種根據上述33的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有CMV增強子，35.一種根據上述34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CMV啟動子，36.一種根據上述34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CAG啟動子，37.一種根據上述33的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種RSV啟動子或一種SRα啟動子，38.一種根據上述25-37中任意一項的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體，39.一種根據上述38的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒，40.一種來源於哺乳動物的細胞，其具有下列特徵(12)-(13)(12)表達腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；和(13)能使根據上述25-39中任意一項的重組腺病毒載體繁殖，41.一種根據上述40的細胞，其中腺病毒的蛋白IX基因的表達由外源啟動子而不是該基因的原始啟動子調節，42.一種根據上述40或41的細胞，其進一步表達除腺病毒的E1基因和蛋白IX基因之外的至少一種腺病毒基因，43.一種根據上述42的細胞，其表達腺病毒的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因，44.一種生產根據上述25-39中任意一項的重組腺病毒載體的方法，其中應用根據上述40-43中任意一項的細胞，45.一種重組腺病毒載體，其體內施用過程中的炎症減輕，該載體具有下列特徵(14)和(15)(14)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；和
(15)腺病毒基因組中插入一種不誘導腺病毒基因表達的外源啟動子，46.一種根據上述45的重組腺病毒載體，其具有下列特徵(16)-(18)(16)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(17)腺病毒基因組的蛋白IX基因在原始位置處保留；和(18)腺病毒基因組中插入一種不誘導蛋白IX基因表達的外源啟動子，47.一種根據上述45或46的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因，48.一種根據上述45-47中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子不含CMV增強子，49.一種根據上述45-48中任意一項的重組腺病毒載體，其中含外源啟動子的外源基因以朝左的方向插入，50.一種根據上述45-49中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子是一種EF1α啟動子，51.一種重組腺病毒載體，其體內施用過程中的炎症減輕，該載體具有下列特徵(19)-(21)(19)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(20)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；和(21)在外源啟動子與腺病毒基因之間插入具有抑制外源啟動子誘導腺病毒基因表達的特性的鹼基序列，52.一種根據上述51的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因，53.一種根據上述51或52的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有CMV增強子，54.一種藥用組合物，它在體內施用過程中可減輕或不誘發炎症，含有一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體作為活性成分，55.一種減輕體內施用過程中的炎症的方法，其中對哺乳動物施用一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體，56.一種減輕體內施用過程中的炎症的基因治療方法，其中對哺乳動物施用一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體，57.一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用於生產在體內施用過程中可減輕或不誘發炎症的藥用組合物，58.一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用於生產在基因治療中使用的藥用組合物，它在體內施用過程中可減輕或不誘發炎症。
圖2顯示通過尾靜脈注射腺病毒載體Ax1CAHGH或ΔE2A-CAHGH的C57BL/6小鼠(每組5隻小鼠)血清GPT水平日變化的平均值。圖中，●是注射1×109PFU腺病毒載體組，○是注射3×108PFU組，▲是注射1×108PFU組。
該實驗以每組5隻小鼠進行。在Ax1CAHGH 1×109PFU施用組和ΔE2A-CAHGH 3×108PFU施用組中，有一隻小鼠的血清hGH水平明顯低於(1/10或更低，數據未顯示)其它4隻小鼠。因此，對於這兩組，在計算平均值時忽略該小鼠的值，顯示每組4隻小鼠的平均GPT值。
圖3顯示通過尾靜脈注射不同結構的腺病毒載體或紫外線滅活的腺病毒顆粒的C57BL/6小鼠(每組5隻小鼠)血清GPT水平日變化的平均值。圖中，●是注射1×109PFU載體組，○是注射3×108PFU組，▲是注射1×108PFU組，Δ是注射3×107PFU組。鹽水代表注射生理鹽水組，紫外線滅活代表注射紫外線滅活的腺病毒顆粒組。
圖4是一張照片，顯示Northern印跡分析的結果。A549細胞或HepG2細胞用以下所示的每種腺病毒載體以moi＝100感染，24小時後由細胞製備RNA。各5μg RNA電泳後，通過Northern印跡分析檢測(A)L3 RNA，(B)IVa2 RNA，和(C)pIX RNA。凝膠上的符號代表Mock假感染，lwlAxlwl，CAwtAxCAwt，HGHAx1CAHGH，ΔE2AΔE2A-CAHGH。凝膠右側的箭頭和數字顯示希望的條帶的位置和大小。
右側標為Ad5的三個道是陽性對照。HepG2細胞用來自5型腺病毒野生株(Ad5-dlXSaito I.等人，J.Virol.54711-719(1985))、只缺失E3基因的病毒以moi＝10感染，24小時後製備RNA，並對圖中所示的RNA進行電泳。
圖5是一張照片，顯示蛋白IX(pIX)基因的Northern印跡分析結果。A549細胞用AxCAwt或AdCMVlacZ以圖中所示的moi感染，24小時後由細胞製備RNA。對各5μg RNA進行電泳，然後通過Northern印跡分析檢測pIX RNA。圖中縮寫代表Mock假感染，CAGAxCAwt，CMVAdCMVlacZ。
右側標為Ad5的三個道是陽性對照。A549細胞用Ad5-dlX(見圖4)以moi＝10感染，24小時後製備RNA，對圖中所示的RNA進行電泳。
圖6是一張照片，顯示pIX基因的Northern印跡分析結果。A549細胞用圖中所示的每種腺病毒載體以moi＝30或100感染，24小時後由細胞製備RNA。對各5μg RNA進行Northern印跡分析以檢測pIXRNA。
圖7顯示注射含有不同啟動子的腺病毒載體的C57BL/6小鼠(每組5隻小鼠)血清GPT水平日變化的平均值。圖中，●是注射1×109PFU載體組，○是注射3×108PFU組，▲是注射1×108PFU組。
圖8是一張照片，顯示應用抗pIX-融合蛋白(GST-pIX)抗血清的Western印跡分析的結果。用Ad5-dIX(見圖4)以moi＝10感染A549細胞，大約1天後收穫細胞，溶解於SDS樣品緩衝液中。細胞裂解液或純化的病毒顆粒(7.5×107PFU)在還原條件下進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨後用抗-pIX抗血清#1(抗-pIX)或免疫前血清(免疫前)進行Western印跡分析以檢測pIX。圖中縮寫代表Mock未感染的細胞，Ad5Ad5-dIX感染的細胞，病毒體純化的病毒顆粒。圖右側的數值是分子量標記物的分子量。用預染色的分子量標記物(GIBCO BRL，目錄號10748-010)作為分子量標記物，並根據未染色的分子量標記物(New England Biolabs，目錄號P7702S)的遷移率修正分子量。括號中的數值是未用未染色分子量標記物修正的值。
圖9是一張照片，顯示pIX的Western印跡分析的結果。用AxCAwt(moi＝100)、Awlwl(moi＝100)或Ad5-dIX(moi＝10)感染A549細胞，大約1天後收穫細胞，溶解於SDS樣品緩衝液中。待SDS-PAGE後，進行Western印跡分析以檢測pIX。圖中縮寫代表Ad5Ad5-dIX感染的細胞，CAwtAxCAwt感染的細胞，lwlAwlwl感染的細胞，Mock未感染的細胞。圖右側的數值是分子量(見圖8)。


圖10是顯示蛋白IX重新定位的腺病毒載體、pIX缺失的腺病毒載體等的結構的示意圖。圖中，lacZ代表大腸桿菌lacZ基因的表達單元，pIX代表蛋白IX基因，psi代表包裝信號，CAG代表CAG啟動子，hGH代表人類生長激素cDNA，pA代表poly(A)序列。箭頭表示每種基因的轉錄方向。
圖11是顯示構建粘粒載體pAxΔpIXcw和pAxΔpIXCAHGH的方法的示意圖。圖中，空框表示5型人類腺病毒基因組，細線部分表示大腸桿菌來源的DNA序列。限制酶上的數值表示5型人類腺病毒中每種限制酶識別位點處的核苷酸數。APR代表氨苄青黴素抗性基因，ori代表大腸桿菌複製起點，COS代表λ噬菌體的COS位點。
圖12是一張照片，顯示表達pIX的細胞系的蛋白IX基因的Northern印跡分析結果。將表達pIX的細胞系的4個克隆(#2，#5，#6，#10)傳代培養至第30代，每5代由細胞系製備RNA，並進行Northern印跡分析。圖中，P1、P5、P10、P15、P20、P25和P30表示傳代數。左側三個道是陰性對照和陽性對照。Mock代表由不含病毒的293細胞製備的RNA，8hr和24hr代表用Axlwl以moi＝10感染293細胞8小時(8hr)和24小時(24hr)後製備的RNA。
圖13是一張照片，顯示表達pIX的細胞系的pIX的Western印跡分析結果。將表達pIX的細胞系的4個克隆(#2，#5，#6，#10)傳代培養至第25代，溶解於SDS樣品緩衝液中。在SDS-PAGE後，進行Western印跡分析檢測pIX。右側三個道是陰性對照和陽性對照。詳見圖12。用未染色的分子量標記物(New England Biolabs，目錄號P7702S)作為分子量標記物。
實現本發明的最佳模式以下將更詳細地說明本發明。
根據本發明，第一次揭示了在體內施用重組腺病毒載體後發生的炎症是由外源啟動子引起的。特別是第一次闡明，原來不應表達的腺病毒基因組的基因由於外源啟動子的作用而表達，來源於腺病毒的表達蛋白質引起炎症。
因此，為了減輕體內施用腺病毒載體後的炎症，顯然應當在適當時修飾重組腺病毒載體的基因組結構，以使腺病毒基因的表達不受外源啟動子作用的影響。因此，本領域技術人員能利用標準重組DNA技術對重組腺病毒載體的基因組結構進行修飾，以使腺病毒基因的表達不受外源啟動子作用的影響。
根據本發明，本發明的重組腺病毒載體包括重組腺病毒載體的基因組結構已經修飾，使得腺病毒基因的表達不受外源啟動子影響的任何載體。
本發明的重組腺病毒載體的優選實施方案包括具有下列特徵(1)-(4)的載體(1)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(2)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；(3)具有下列特徵(A)和/或(B)(A)由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組的基因從正常位置重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置，或者該基因缺失；和
(B)由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組基因啟動子的核苷酸序列被置換，以致不受外源啟動子的作用；和(4)形成與腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒顆粒。
在此使用時，用於構建本發明的重組腺病毒載體的腺病毒是一種利用動物作為天然宿主的病毒，特別是，優選使用利用人作為宿主的人類腺病毒，更優選地使用C亞組的人類腺病毒，如2型或5型人類腺病毒。在本說明書中，為了顯示一種基因在腺病毒基因組中的位置，可以使用圖距單位(下文稱為m.u.；1m.u.＝約360個鹼基對)，其值基於5型腺病毒。該腺病毒基因組的結構已知，例如，2型人類腺病毒基因組的完整核苷酸序列已經在GenBank中登記(保藏號J01949)，5型人類腺病毒基因的完整核苷酸序列已經在GenBank中登記(保藏號M73260)。
在上述(1)中，腺病毒的E1A和E1B基因缺失是指這兩種基因的全部或部分鹼基不存在，如果缺失導致不產生功能性E1A蛋白和E1B蛋白，則不具體限制缺失範圍。此外，儘管蛋白IX基因存在於與E1B基因部分完全重疊的位置，但E1B基因的缺失通常不包括蛋白IX基因的缺失。E1A和E1B基因缺失的例子包括5型腺病毒的1.3-9.3m.u.的缺失(E1A基因的全部和E1B基因的大部分缺失；Trapnell B.C.，Advanced Drug Delivery Reviews，12185-199(1993)，Elsevier SciencePublishing B.V.)。根據基礎教材如《分子克隆實驗室手冊》，T.Maniatis等人編寫，第二版(1989)，冷泉港實驗室，本領域技術人員可容易地實現這種缺失。
根據本發明，E1A和E1B基因可以簡單地通稱為E1基因或E1區。
在上述(2)中，外源啟動子是腺病毒原始啟動子之外的啟動子，外源基因是進行轉錄的核苷酸序列，包括啟動子、編碼蛋白質的基因、poly(A)序列等。當進行基因治療時，外源基因是指表達用於治療所述疾病的蛋白質的基因。例如，通過向市售的不同表達載體中插入編碼希望的蛋白質的基因，能容易地構建外源基因。向腺病毒基因組中插入構建的外源基因也可根據參考文獻所述的周知的方法進行(GrahamF.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918802-8806(1994)，Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)等)。外源基因優選地插入上述E1基因缺失位點中。
在上述(3)中，由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組的基因是指腺病毒基因組的一種基因，其轉錄通過外源啟動子中特定組分的作用發生。具體包括蛋白IX基因、蛋白IVa2基因和L1基因等。
在上述(3)之(A)中，由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組的基因可以從正常位置重新定位到不受外源啟動子作用的位置，或者該基因可以缺失，以防止該基因在體內施用後表達。具體例子包括蛋白IX基因。因此，能夠達到減輕體內施用後炎症的本發明的目的。當基因如上缺失時，必須預先向細胞中導入已經缺失的基因，並且應當在允許重組腺病毒載體複製形成正常病毒顆粒的細胞中表達該基因。
儘管下文更詳細地描述了基因重新定位或缺失的具體例子，構建基本上不同的重新定位或缺失的重組腺病毒載體，通過如實施例5所述研究在體內施用後是否發生炎症，或者通過如實施例6所述的Northern印跡分析等，評價哪種重新定位或缺失能夠滿足本發明的目的。
上述(3)之(B)的基因的具體例子包括主要晚期啟動子(MLP)和/或IVa2基因啟動子。通過置換腺病毒基因組啟動子中的鹼基，使其不受外源啟動子的影響，以至不影響其原始功能，能夠防止體內施用後在該腺病毒基因組啟動子控制下的基因表達。因此，能夠達到減輕體內施用腺病毒載體後的炎症的本發明的目的。參照下列實施例，本領域技術人員在適當時能夠進行特定鹼基置換。因此，可以構建具有不同鹼基置換的重組腺病毒載體，通過如實施例5所述研究在體內施用後是否發生炎症，或者通過如實施例6所述的Northern印跡分析，評價哪種鹼基置換能夠滿足本發明的目的。
如以上(3)之(A)和(B)所述的腺病毒基因重新定位、缺失和置換的具體方法可由本領域技術人員進行，根據基本教材，如《分子克隆實驗室手冊》，T.Maniatis等人編寫，第二版(1989)，冷泉港實驗室，或用於重組腺病毒構建的已知技術(Graham F.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918802-8806(1994)，Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)等)，等等。
在上述(4)中，與腺病毒野生株具有相同特性是指在病毒顆粒的組成比，如病毒顆粒的蛋白質和物理化學性質，以及細胞感染性的保持等方面，具有與野生株幾乎相同的特性。
在上述本發明的重組腺病毒載體中，上述E1A和E1B基因之外的腺病毒基因組的至少一種基因可能進一步全部或部分缺失。具體而言，E3基因、E2A基因和/或E4基因可能全部或部分缺失。在此使用時，當E4基因缺失時，優選地缺失但保留E4基因的至少一個ORF。特別是，優選地至少保留ORF3。下文將詳細說明這些缺失。
本發明的重組腺病毒載體的優選實施方案包括具有下列特徵(5)-(8)的載體(5)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(6)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；(7)腺病毒基因組的蛋白IX基因從正常位置重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置；和(8)含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
下面將以具有這些特徵的重組腺病毒載體為例，詳細解釋這些特徵。
上述(6)的外源基因優選地插入E1基因缺失位點。更優選地，外源基因插入病毒基因組的1.3-11.2m.u.已經缺失的位點，和E1基因和蛋白IX基因全部缺失(由於重新定位)的位點。
上述(7)的腺病毒蛋白IX(下文稱為pIX)是構成腺病毒病毒體殼體的九個六鄰體的一種次要成分，與病毒體的熱穩定性和能夠包裝的病毒基因組的大小有關。蛋白IX不是腺病毒複製必需的成分，但鎖定pIX的病毒體傾向於熱不穩定(Colby W.W.等人，J.Virol.39977-980(1981))，只能包裝大小約為野生株90％的基因組DNA(Ghosh-Choudhury G.等人，EMBO J.61733-1739(1987))。因此，形成正常的病毒顆粒需要pIX。
在上述(7)中，腺病毒基因組的蛋白pIX基因從正常位點重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置是指，在蛋白IX基因最初存在於野生型腺病毒基因組中的位點，即5型人類腺病毒基因組中9.7-11.2m.u.的位點(Maat J.等人，Gene 1027-38(1980))，不存在蛋白IX基因，蛋白IX基因存在於腺病毒基因組的其它任何位點。此外，蛋白IX基因不受外源啟動子誘導表達是指蛋白IX基因的轉錄不由外源啟動子誘導。在下文中，蛋白IX基因重新定位於其中的腺病毒載體可以稱為「蛋白IX基因重新定位的腺病毒載體」。
在上述(7)中，不具體限制蛋白IX基因重新定位的位點，只要蛋白IX基因不受外源啟動子誘導表達，並且在載體複製循環中蛋白IX的表達不被明顯抑制。然而，優選地蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子幾十個kb的位置，和容易進行外源基因克隆的位置。此位置的一個優選例子是，距外源啟動子約18kb或更遠的位置，具體例子包括腺病毒基因組L3基因與E2A基因之間的位置(日本未審查專利文本(Kokai)號-308585)。另一個優選例子是，距外源啟動子約24kb或更遠的位置，具體例子包括腺病毒基因組E3基因的缺失位點。此外，另一個優選例子是，距外源啟動子約30kb或更遠的位點置，具體例子包括腺病毒基因組的E4基因上遊區與3』端ITR(末端反向重複序列)之間的位置(Saito I.等人，J.Virol.54711-719(1985))。從蛋白IX基因的正常位置缺失和上述位置的重新定位通過標準重組DNA技術和周知的上述重組腺病毒構建技術容易進行。構建的蛋白IX重新定位的腺病毒載體是否滿足本發明的目的能如下評價如實施例5所述研究在體內施用後是否發生炎症，如實施例6所述的Northern印跡分析，等等。
在上述(8)中，含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX的病毒顆粒是指一種腺病毒顆粒，它含有與野生型腺病毒顆粒所含蛋白IX幾乎相同比例的蛋白IX。此外，正常病毒顆粒是指保持細胞感染力的腺病毒顆粒，其熱穩定性和能夠包裝的基因組DNA的大小與野生型腺病毒幾乎相同。
在上述蛋白IX重新定位的腺病毒載體中，E1A和E1B基因能夠缺失，蛋白IX基因能夠重新定位，而且腺病毒基因組的其它基因也能全部或部分缺失。具體而言，E3基因、E2A基因和/或E4基因可能全部或部分缺失。在此使用時，不具體限制「全部或部分」的長度，只要缺失不引起功能性蛋白質產生。腺病毒基因組(如上述E3基因、E2A基因和E4基因)的核苷酸序列在參考文獻中已有描述(《腺病毒》，Ginsberg H.S.編寫，1984，Plenum Press，紐約)，本領域技術人員能容易地進行從腺病毒載體中缺失這些基因的方法。
通過在上述基因中缺失E3基因的全部或一部分，能夠插入更長的外源基因。當E3基因全部或部分缺失時，不需要在重組腺病毒載體複製的細胞中表達E3基因。另一方面，當E2A和E4基因全部或部分缺失時，為了形成正常的病毒顆粒，必須導入先前缺失的基因，並使其在重組腺病毒載體複製的細胞中表達。
當E4基因缺失時，優選地保留E4基因的至少一個開放閱讀框(ORF)。特別是，優選地保留E4基因的ORF3。在5型和2型腺病毒中，由於轉錄後的RNA剪切不同，E4基因編碼七種不同的多肽，ORF3是這些多肽之一。在腺病毒的多個循環中，ORF3具有促進病毒基因表達和DNA複製的功能。另一方面，為使以下所述的一些CMV啟動子的外源啟動子在體內長期保留其啟動子活性，E4基因的ORF3是必要的(Lusky M.等人，J.Virol.738308-8319(1999)，Yeew N.S.等人，Hum.Gene Ther.101833-1843(1999))。基於上述原因，優選地保留ORF3。
不具體限制產生本發明的蛋白IX重新定位的腺病毒載體的細胞系，只要它們表達E1基因，並且適於產生腺病毒載體，如來源於人胚胎腎細胞的293細胞(ATCC CRL-1573)。然而，如果在整合到細胞系染色體中的腺病毒DNA與載體基因組之間存在同源DNA序列，通過重源重組可能產生不希望的腺病毒。因此，為了產生這種腺病毒載體，優選地使用只含E1基因最小部分的細胞系，使得載體基因組與細胞系染色體之間儘可能不存在重疊DNA序列。一個實例是來源於人胚胎視網膜(HER)的PER細胞系(Fallaux F.J.等人，Hum.Gene Ther.91909-1917(1998))。除了E1基因之外，必要時也可使用表達其它腺病毒基因(如E2A基因)的細胞系。表達其它腺病毒基因的細胞系可以如下構建例如，向合適的表達載體中插入腺病毒基因，通過標準方法用這樣構建的表達載體轉染表達E1基因的細胞。
本發明的重組腺病毒載體的另一個優選實施方案是一種腺病毒載體，其基因組缺失E1基因和蛋白IX基因，病毒顆粒中含有正常含量的蛋白IX。因此，包括具有下列特徵(9)-(11)的重組腺病毒載體(9)腺病毒基因組的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；(10)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；和(11)含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
這種載體在下文中可稱為「蛋白IX缺失的腺病毒載體」。
在上述(9)中，不具體限制蛋白IX基因缺失的範圍，只要缺失不引起蛋白IX的部分肽或來源於蛋白IX基因的肽表達。優選地至少蛋白IX基因的全部編碼區缺失。此外，更優選地病毒基因組的1.3-11.2m.u.缺失，並且E1基因和蛋白IX基因全部缺失。這些缺失能用標準重組DNA技術實現。
為了產生蛋白IX缺失的腺病毒載體，需要表達蛋白IX的細胞系，該細胞系在下文說明。
上述(10)中的外源基因優選地插入E1基因缺失位點。更優選地，外源基因插入病毒基因組1.3-11.3m.u.已經缺失的位點，即E1基因和蛋白IX基因全部缺失的位點。如同上述蛋白IX重新定位的腺病毒載體，在蛋白IX缺失的腺病毒載體中，腺病毒E3基因也能全部或部分缺失，也能向E3基因缺失位點插入外源基因。
在上述(11)中，含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX的病毒顆粒是指一種腺病毒顆粒，它含有與野生型腺病毒顆粒所含蛋白IX幾乎相同比例的蛋白IX。正常病毒顆粒是指保持細胞感染力的腺病毒顆粒，它們在熱穩定性和能夠包裝的基因組DNA的大小方面具有與野生型腺病毒幾乎相同的特性。通過用蛋白IX缺失的腺病毒感染表達蛋白IX的細胞系，並使其複製，能夠產生這種病毒顆粒。
對於本發明的蛋白IX缺失的腺病毒載體，E1A和E1B基因以及蛋白IX基因能夠缺失，而且腺病毒基因組其它基因也能全部或部分缺失。特定缺失與上述蛋白IX重新定位的腺病毒載體相同，E3基因、E2A基因和/或E4基因能夠全部或部分缺失。在此使用時，不具體限制進行缺失的「全部或部分」的長度，只要缺失不引起功能性蛋白質產生。腺病毒基因組(如上述E3基因、E2A基因和E4基因)的核苷酸序列在參考文獻中已有描述(《腺病毒》，Ginsberg H.S.編寫，1984，Plenum Press，紐約)，本領域技術人員能夠容易地進行從腺病毒載體中缺失這些基因的方法。
通過在上述基因中缺失E3基因的全部或一部分，能夠插入更長的外源基因。當E3基因缺失時，不需要在重組腺病毒載體複製的細胞中表達E3基因。另一方面，當E2A基因和E4基因全部或部分缺失時，必須導入先前缺失的基因，並使其在重組腺病毒載體複製的細胞中表達。
當E4基因缺失時，優選地保留E4基因的至少一個開放閱讀框(ORF)。特別是，優選地保留E4基因的ORF3。至於保留ORF3的優點，參見蛋白IX重新定位的腺病毒載體部分。
對於以本發明的蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體為代表的本發明的重組腺病毒載體，為了表達希望的外源基因，如治療基因，載體中必須含有外源啟動子。對於外源啟動子，只要在哺乳動物細胞中起作用，並且能夠以希望的量表達希望的基因，能夠不加限制地使用任何啟動子，如動物病毒來源的啟動子、哺乳動物細胞來源的啟動子或這兩種啟動子的雜合啟動子等。作為外源啟動子的一個實例，由於在許多情況下希望高水平地表達治療基因，優選地使用所謂的高表達啟動子，如CMV啟動子(Foecking M.K.等人，Gene 45101-105(1986))和CAG啟動子(Niwa H.等人，Gene 108193-200(1991))等。CMV啟動子包含巨細胞病毒(CMV)直接早期(IE)基因的增強子和啟動子，CAG啟動子包含CMV的IE增強子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白的剪接受體和poly(A)序列。因此，CMV啟動子和CAG啟動子都含有CMV的IE基因的增強子(Boshart M.等人，Cell 41521-530(1985))。在此使用時，CMV的IE基因的增強子簡稱為「CMV增強子」。
在以下實施例中說明時，當使用CMV啟動子和CAG啟動子(它們均含有CMV增強子)之一時，注意到蛋白IX基因表達的誘導。另一方面，當使用EF-1α啟動子(它不含CMV增強子)時，未發現蛋白IX基因表達的誘導。因此，應當理解，CMV啟動子和CAG啟動子共有的CMV增強子是引起腺病毒基因(如蛋白IX)表達誘導的因素。因此，認為CMV增強子作用於啟動子，如蛋白IX基因，結果是蛋白IX等表達。
根據啟動子活性強度，現在進行臨床研究的幾乎所有腺病毒載體都採用含有CMV啟動子或CMV增強子的雜合啟動子。因此，在臨床應用中，可以十分有效地使用本發明的重組腺病毒載體，它們能減輕體內施用後的炎症。
除了上述含有CMV增強子的啟動子之外，也能使用類似地來源於病毒的啟動子，如SV40啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子(TakebeY.等人，Mol.Cell Biol.8466-472(1988))。
不具體限制插入本發明的腺病毒載體中的外源基因，可以使用編碼如細胞因子、酶、受體、病毒結構蛋白等蛋白質的基因，編碼反義RNA和核酶的基因等。
上述本發明的蛋白IX缺失的腺病毒載體甚至在表達E1基因但不表達蛋白IX的細胞系(如人胚胎腎細胞來源的293細胞)中也能夠複製。但是，由於不表達蛋白IX的細胞系產生的蛋白IX缺失的腺病毒載體在病毒顆粒中不含希望含量的蛋白IX，所以不可能獲得具有本發明目的特性的腺病毒載體。因此，為了產生本發明的蛋白IX缺失的腺病毒載體，需要至少表達E1基因和蛋白IX的特殊細胞系。也就是說，為了使本發明的蛋白IX缺失的腺病毒載體能夠複製，使用具有下列特徵(12)和(13)的哺乳動物細胞(12)表達腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；和(13)能使蛋白IX缺失的腺病毒載體繁殖。
作為構建表達蛋白IX的細胞系的一種方法，可以用含有蛋白IX基因的表達載體進一步轉化表達E1基因的細胞系，如人胚胎腎細胞來源的293細胞(ATCC CRL-1573)，或者可以用含有E1基因的表達載體和含有蛋白IX基因的表達載體連續或同時轉化不表達E1基因的細胞。然而，由於用含有E1A、E1B和蛋白IX基因全部1.3-11.2m.u.的DNA片段轉化細胞不產生表達蛋白IX的細胞系，必須用在蛋白IX基因上遊添加適當啟動子的DNA片段轉化。因為據報導，儘管插入了含有全長蛋白IX基因的5型人類腺病毒位點1-4344處的核苷酸(LouisN.，Virology 233423-429(1997))，但293細胞表達極少的蛋白IX(Krougliak V.等人，Hum.Gene Ther.61575-1586(1995))，而且，儘管插入了含有全長蛋白IX基因的E1基因，但其它細胞系表達極少的蛋白IX(Fallaux F.J.等人，Hum.Gene Ther.91909-1917(1998))。可以認為，這些細胞不表達蛋白IX的原因是，當E1B基因通過蛋白IX啟動子轉錄時，蛋白IX基因的轉錄受到抑制(Vales L.D.，Genes Dev.349-59(1989))。
關於表達本發明的蛋白IX的細胞系，不具體限制用於表達蛋白IX的啟動子，可以是外源啟動子或蛋白IX基因的原始啟動子。當使用外源啟動子時，可以是組成型啟動子或誘導型啟動子，只要目的細胞系能夠建立並保存，而且該細胞系中繁殖產生的蛋白IX缺失的腺病毒載體形成含有正常含量的蛋白IX的病毒顆粒。組成型啟動子的實例包括CAG啟動子、CMV啟動子、EF-1α啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(MLP)等。誘導型啟動子的實例包括金屬硫蛋白基因啟動子、小鼠乳腺癌病毒(MMTV)啟動子等。此外，也能使用由四環素或蛻皮激素誘導組成型啟動子表達的系統.包括這種啟動子的表達載體和表達誘導系統可以購得，或者可從公開機構獲得。商品能購自Invitrogen Inc.，Clontech Inc.等。
表達上述蛋白IX的細胞系能夠如下構建通過PCR方法克隆蛋白IX基因的編碼區，將其插入市售表達載體(例如pcDNA3.1(+)，Invitrogen Inc.)，然後導入人胚胎腎細胞來源的293細胞，使細胞表達蛋白IX。詳見以下實施例。
此外，當腺病毒E1基因和蛋白IX基因之外的腺病毒基因進一步缺失的蛋白IX缺失的腺病毒載體將要複製時，有時可能需要進一步表達這種缺失基因的細胞系。例如，當腺病毒載體的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因缺失時，使用表達這三種基因的細胞系。E2A基因能轉導細胞，使之以類似於上述蛋白IX基因所述的方式表達。
本領域技術人員周知用上述細胞系構建重組腺病毒載體的方法，例如可以用COS-TPC法(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA931320-1324(1996))進行構建。
因此，本發明的重組腺病毒載體的一個代表性實施方案是具有上述特徵(1)-(4)的重組腺病毒載體，作為優選實施方案，說明了蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體。上述之外的實施方案包括外源啟動子已被修飾而不誘導腺病毒基因表達的重組腺病毒載體，或採用不誘導腺病毒基因表達的外源啟動子的重組腺病毒載體。因此，本發明的重組腺病毒載體的另一個優選實施方案是具有下列特徵(14)和(15)的重組腺病毒載體(14)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；和(15)腺病毒基因組中插入一種不誘導腺病毒基因表達的外源啟動子。
在此使用時，「不誘導腺病毒基因表達的外源啟動子」可以是至少不誘導蛋白IX基因表達的任何啟動子。當使用這種外源啟動子時，蛋白IX基因不需要上述重新定位和/或缺失，只需要位於腺病毒基因組的原始位置。通過構建插入含外源啟動子的外源基因的重組腺病毒載體，並如實施例5所述研究在體內施用後是否發生炎症，或如實施例6所述進行Northern印跡分析，能夠評估哪種外源啟動子不誘導蛋白IX的表達。這種外源啟動子至少不含CMV增強子，特別是EF-1α啟動子(Kim D.W.等人，Gene 91217-223(1990))。關於EF-1α啟動子不誘導蛋白IX表達並且不誘發炎症的事實，見以下的實施例8和9。
而且，含有不誘導蛋白IX表達的外源啟動子(如EF-1α啟動子)的表達單元優選地以朝左的方向插入(E1基因轉錄的相反方向)。因為當表達單元以朝右的方向插入時，由外源啟動子開始的轉錄在正常位置不會終止，轉錄恐怕會延伸到蛋白IX基因。
此外，本發明的重組腺病毒載體的另一個實施方案是具有下列特徵(19)-(21)的重組腺病毒載體(19)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(20)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；和(21)在外源啟動子與腺病毒基因之間插入具有抑制外源啟動子誘導腺病毒基因表達的特性的鹼基序列。
在此使用時，「具有抑制外源啟動子誘導腺病毒基因表達的特性的鹼基序列」是指一種DNA序列，它具有抑制外源啟動子中含有的增強子激活腺病毒基因組的啟動子的活性。一個例子是以「scs」和「gypsy」為代表的隔離體(insulator)，它們最初是在果蠅(Drosophila)中發現的。隔離體是一種DNA序列，當它位於增強子與啟動子之間時，能阻止增強子激活啟動子(Chung J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94575-580(1997)，Bell A.C.等人，Curr.Opin.Genet.Dev.9191-198(1999))。
因此，在插入到E1基因缺失位點的外源基因(含有增強子/啟動子)的右側(MLP側)插入一個隔離體的腺病毒載體不表達包括蛋白IX在內的腺病毒蛋白質，或者不誘發炎症，甚至在腺病毒基因組的原始位置處存在蛋白IX基因時仍然如此。
隔離體的具體實施方案除了上述「scs」和「gypsy」外，還包括位於雞β-珠蛋白基因座5』HS4位點的約1.2kb的DNA片段(Chung J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94575-580(1997))和人T細胞受體α/δ基因座的BEAD-1(Bell A.C.等人，Curr.Opin.Genet.Dev.9191-198(1999))等。不具體限制插入本發明的腺病毒載體的隔離體，也不限制所用DNA片段的來源和大小等，只要隔離體具有不使外源增強子/啟動子誘導腺病毒基因表達的功能。關於插入隔離體的腺病毒載體，曾經報導了一種插入上述β-珠蛋白隔離體和誘導型啟動子的腺病毒載體(Steinwaerder D.S.等人，Gene Ther.7556-567(2000))、插入牛生長激素轉錄終止信號中的隔離體和組織特異性啟動子的腺病毒載體(Vassux G.等人，Gene Ther.61192-1197(1999))等。然而，它們均非用於抑制外源增強子/啟動子引起的腺病毒基因表達，其目的在於抑制腺病毒增強子對外源啟動子的激活。因此，對於兩篇報導中的腺病毒載體，沒有證據表明外源增強子/啟動子引起的腺病毒基因表達受到抑制，因而這些報導本質上不同於本發明，本發明是為了抑制腺病毒基因表達和炎症的誘導，插入隔離體。
下面解釋了本發明的腺病毒載體的發明歷史。說明了本發明的本質的歷史，或第一代腺病毒載體引起的炎症起因於外源啟動子對腺病毒基因表達的誘導這一發現。
在此使用時，第一代腺病毒載體是指腺病毒E1基因缺失的複製缺陷型腺病毒載體。第一代腺病毒載體只能在表達E1基因的細胞系(如293細胞)中複製。第一代腺病毒載體可能有或者可能沒有E3基因的缺失。
為了證明「第一代腺病毒載體引起的炎症是由E2A基因(是一種腺病毒早期基因)的表達引發的」這一傳統假說——也在「現有技術」部分作了解釋，發明者也構建了一種E2A基因缺失的腺病毒載體。由於發明者構建E2A缺失的腺病毒載體的方法已經在日本未審查專利文本(kokai)號8-308585中公開，此處只解釋構建方法的概述。首先，我們構建了第一代腺病毒載體(圖1，Ax2LD3LCAHGH)，其中在兩個位點(腺病毒L3基因和E2A基因之間(61.5m.u.)和E3基因缺失位點(78.0m.u.))之間插入一個loxP位點，該位點是P1噬菌體重組酶Cre的識別序列(Abremski K.等人，J.Biol.Chem.2591509-1514(1984)，HoessR.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811026-1029(1984))。通過用Ax2LD3LCAHGH和表達重組酶Cre的第一代腺病毒載體(圖1，AxCANCre)共轉染293細胞，產生了一種E2A缺失的腺病毒載體(圖1，ΔE2A-CAHGH)，其中側翼為兩個loxP位點的E2A基因和L4基因被剪切。然後，通過氯化銫密度梯度超速離心，根據病毒顆粒的比重分離每種病毒，純化E2A缺失的腺病毒載體，純度為97-98％。向這種E2A缺失的腺病毒載體ΔE2A-CAHGH中插入表達單元，使得人生長激素(hGH)能在上述CAG啟動子控制下作為報導基因表達。而且還構建了含有相同表達單元的第一代腺病毒載體(圖1，Ax1CAHGH)作為E2A缺失的腺病毒載體的對照載體。
然後證實這樣構建的E2A缺失的腺病毒載體缺失E2A基因。ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH感染的A549細胞(人肺癌來源的細胞系)中E2A基因編碼的DBP(單鏈DNA結合蛋白)的表達水平通過螢光抗體法比較，由於DBP的表達在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中明顯降低，證實了E2A基因的缺失。此外，L3基因(屬於晚期基因)編碼的六鄰體(是病毒顆粒的一種主要結構蛋白)的表達水平類似地也用螢光抗體法比較，發現六鄰體的表達在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中明顯降低。結果表明，傳統假說「痕量表達的E2A基因激活腺病毒主要晚期啟動子(MLP)，從而主要晚期蛋白得到表達」在這點上是正確的。
因此，研究了注射E2A缺失的腺病毒載體的動物的體內炎症反應是否降低。對小鼠靜脈內注射ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH，測定肝臟釋放的酶GPT(谷丙轉氨酶)的血清水平作為炎症指標。首先，為了證實每種腺病毒載體的感染效率，測定腺病毒載體施用3天後的血清hGH水平。因為兩個腺病毒載體施用組的血清hGH水平沒有顯著性差異，證實了兩種腺病毒載體對動物的感染效率沒有差異。因此，用血清GPT水平作為指標評價E2A缺失的腺病毒載體，發現與施用Ax1CAHGH的小鼠一樣，施用ΔE2A-CAHGH的小鼠血清GPT水平升高。而且某些小鼠在施用腺病毒載體後，以固定間隔製備肝切片進行組織分析。施用Ax1CAHGH的小鼠在施用5天或更多天以後，觀察到炎症反應，如白細胞浸潤肝臟，包括T細胞，和肝細胞的凋亡，在施用ΔE2A-CAHGH的小鼠中也觀察到類似的炎症反應。因此，施用這兩種腺病毒載體的小鼠在組織病理學上也沒有差異。
上述結果表明，E2A基因的缺失對減輕炎症沒有作用。因此，關於E2A缺失的腺病毒載體與第一代腺病毒載體在誘發炎症上沒有差異的原因，考慮以下4種可能性1)除E2A基因之外的腺病毒基因(如E4基因)由細胞產生的因子直接激活，表達的腺病毒蛋白質自身誘導細胞介導的免疫，或者誘導另一種腺病毒蛋白質表達，該蛋白質誘導細胞介導的免疫，從而引起炎症；2)用作報導基因的hGH蛋白誘導細胞介導的免疫，從而引起炎症；3)插入載體中的外源啟動子(CAG啟動子)作為表達腺病毒蛋白質的腺病毒啟動子的增強子，該腺病毒蛋白質誘導細胞介導的免疫，從而引起炎症；和4)不是在載體感染的細胞中從頭合成的蛋白質，而是構成可侵入細胞的腺病毒顆粒的蛋白質本身誘導細胞介導的免疫，從而引起炎症。此外，腺病毒顆粒進入細胞本身也是一種刺激，誘發炎性細胞因子等的產生，從而引起炎症。
因此，為了闡明上述1)-4)中哪一個是E2A基因缺失的腺病毒載體不能減輕炎症誘發的可能的原因，用下列4種腺病毒載體研究了炎症的起因(a)表達hGH的第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH陽性對照)(b)只插入CAG啟動子、不含hGH cDNA的第一代腺病毒載體(圖1，AxCAwt也插入poly(A)序列)(c)未插入外源基因(如啟動子)的第一代腺病毒載體(圖1，Axlwl)(d)紫外線滅活的腺病毒顆粒(Ax1CAHGH已滅活)。
對小鼠靜脈內注射這4種載體，測定血清GPT水平。製備紫外線滅活的腺病毒顆粒的定義和方法細節在現有公開文本中已有描述(Brinstiel M.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896094-6098(1992)，Birnstiel M.L.等人，Virology 205254-261(1994))，其定義簡述如下。紫外線滅活的腺病毒顆粒是指這樣的腺病毒顆粒它們保留細胞感染力並且能侵入細胞，但是甚至在滅活前腺病毒能夠複製的細胞中也不能複製，被滅活為插入的外源基因不能表達的狀態。
總結結果，用紫外線滅活的腺病毒顆粒處理的小鼠和用未插入外源基因的Axlwl處理的小鼠，血清GPT水平根本未升高。另一方面，用只插入CAG啟動子的AxCAwt處理的小鼠，血清GPT水平升高到類似於表達hGH的Ax1CAHGH處理小鼠的程度。由於在AxCAwt處理的小鼠中也發生炎症，否定了2)的hGH蛋白是起因的可能性。此外，由於用紫外線滅活的腺病毒顆粒處理的小鼠不發生炎症，否定了4)的腺病毒顆粒是起因的可能性。此外，由於Axlwl處理的小鼠不發生炎症，否定了1)的原因單獨引起炎症的可能性。因此，由於AxCAwt處理的小鼠發生程度上類似於Ax1CAHGH處理的小鼠的炎症，但Axlwl處理的小鼠不發生炎症，而AxCAwt與Axlwl結構的唯一不同是存在或不存在CAG啟動子，因此揭示了第一代腺病毒載體引起炎症的原因是由3)中插入載體中的CAG啟動子引起的。
因此，鑑定了由CAG啟動子誘導表達的腺病毒基因，即與炎症有關的腺病毒基因。用一種E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)或上述(a)-(c)中的三種第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH、AxCAwt、Axlwl)以較高的moi(感染複數)感染A549細胞(人肺癌來源的細胞系)或HepG2細胞(人肝癌來源的細胞系)，24小時後通過Northern印跡分析表達的腺病毒基因。研究其表達的腺病毒基因有下列8種基因早期基因E2A基因、E4基因；在主要晚期啟動子(MLP)控制下的主要晚期基因L1、L2、L3、L5；晚早期基因蛋白IX、IVa2。希望的腺病毒，即由CAG啟動子誘導表達並且與炎症有關的腺病毒基因的定義是一種基因，如果向載體中插入CAG啟動子，該基因在E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)感染的細胞中表達，程度類似於第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH和AxCAwt)感染的細胞，但是在未插入CAG啟動子的第一代腺病毒載體(Axlwl)感染的細胞中其表達極少誘導。
首先，在研究E2A基因的表達後，證實了本發明使用的E2A缺失的腺病毒載體中E2A基因完全缺失，因為在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中E2A基因極少表達，無論在其它3種第一代腺病毒載體感染的細胞中是否存在CAG啟動子，基因表達程度幾乎相同。同時，還揭示了CAG啟動子不誘導E2A基因的表達。另一種早期基因——E4基因，在4種腺病毒載體感染的所有細胞中幾乎程度相同地表達，從而也揭示了CAG啟動子也不誘導E4基因的表達。
然後，研究了MLP控制的主要晚期基因的表達。對於HepG2細胞，在主要晚期基因中，3種基因(L2、L3和L5)的表達只在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中降低，而對於A549細胞，ΔE2A-CAHGH感染的細胞和Axlwl感染的細胞中的表達明顯降低。因此，不僅是在上述蛋白質水平上，而且在基因水平上，傳統假說「E2A基因誘導主要晚期基因的表達」都得到證實，但是證明了CAG啟動子不誘導這些主要晚期基因的表達。此外，L1基因的表達隨所用細胞系的不同而不同。對於HepG2細胞，L1基因的表達只在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中增強，未觀察到CAG啟動子誘導表達。另一方面，對於A549細胞，L1基因的表達只在Axlwl感染的細胞中降低，觀察到CAG啟動子誘導表達。
最後，研究了各自具有獨特啟動子的兩種晚早期基因——IVa2基因和蛋白IX基因的表達。IVa2基因的表達模式隨對於L1基因所用的細胞系的不同而不同。因此，對於HepG2細胞，所有4種腺病毒載體感染的細胞都以幾乎相同的水平表達IVa2基因，而未注意到CAG啟動子誘導表達。相反，對於A549細胞，IVa2基因的表達只在Axlwl感染的細胞中降低，注意到CAG啟動子對表達的誘導。
另一方面，兩種細胞系的蛋白IX基因表達獲得相同的結果，在ΔE2A-CAHGH-、Ax1CAHGH-和AxCAwt-感染的細胞中，蛋白IX基因幾乎程度相同地表達，但在Axlwl感染的細胞中表達極低。因此，對於蛋白IX基因，明顯觀察到CAG啟動子對表達的誘導。
根據上述結果，證明了明顯由CAG啟動子誘導表達的腺病毒基因主要是蛋白IX基因。這強烈表明，蛋白IX基因的表達是體內施用第一代腺病毒載體時發生炎症的一個原因。
此外，根據上述結果，也證明了在某些細胞中，蛋白IVa2基因和L1基因的表達由CAG啟動子誘導。由於蛋白IVa2基因含有獨立的啟動子，預計它由CAG啟動子直接激活。然而，L1基因是主要晚期基因之一，受與其它晚期基因(如L3基因和L5基因)共有的MLP調節，不能認為CAG啟動子只誘導L1基因的表達。然而，由於眾所周知L2-L5基因只在感染晚期表達，而周知L1基因也在感染早期表達(Shaw A.R.等人，Cell 22905-916(1980))，L1基因的表達只由CAG啟動子誘導的原因可能是基於早期與晚期基因表達機制的不同。而且，由於據報導蛋白IX和蛋白IVa2都有激活MLP的作用(Lutz P.等人，J.Virol.715102-5109(1997)，Tribouley C.等人，J.Virol.684450-4457(1994))，可能是通過蛋白IX或蛋白IVa2間接激活MLP，而不是CAG啟動子直接激活MLP。與蛋白IX基因表達的誘導相比，CAG啟動子引起的蛋白IVa2基因和L1基因表達的程度較弱，但可能是通過與蛋白IX加合作用誘發炎症。
然後，研究了CAG啟動子的哪種成分誘導包括蛋白IX基因在內的腺病毒基因表達。CAG啟動子包含CMV的IE增強子、雞β-肌動蛋白啟動子、兔β-珠蛋白的剪接受體和poly(A)序列。在本發明使用的腺病毒載體中，CAG啟動子以朝左的方向(與E1轉錄相反的方向)插入E1基因的缺失位點中(1.3-9.2m.u.)，CAG啟動子的插入方向與向右轉錄的蛋白IX基因(9.7-11.2m.u.)的方向相反。因此認為誘導蛋白IX基因表達的可能不是β-肌動蛋白啟動子，而是CMV的IE增強子。於是，利用插入含IE增強子部分(與CAG啟動子的唯一共同成分)的CMV啟動子的腺病毒載體(AdCMVlacZ)，研究了蛋白IX基因的表達。結果對於AdCMVlacZ感染的A549細胞，蛋白IX基因的表達水平幾乎類似於只插入CAG啟動子的AxCAwt感染的細胞。因此，證實了CMV IE增強子(CMV增強子)誘導包括蛋白IX基因在內的腺病毒基因的表達。
為了進一步證實這一結果，利用插入EF-1α啟動子(不含CMV增強子)的腺病毒載體(AxEFlacZ-L)研究了蛋白IX的表達，發現在AxEFlacZ-L感染的細胞中蛋白IX基因根本不表達。另外用插入CAG啟動子和lacZ基因的腺病毒載體(AxCAlacZ-L)作為陽性對照，通過測定接受靜脈內施用腺病毒載體的小鼠的血清GPT水平比較AdCMVlacZ和AxEFlacZ-L引起的炎症程度。結果證實，AdCMVlacZ處理的小鼠的血清GPT水平升高到等於或高於AxCAlacZ-L處理的小鼠的水平，而AxEFlacZ-L處理的小鼠的血清GPT水平升高極小。因此，不含CMV增強子的EF-1α啟動子不能誘導蛋白IX的表達，表明在不誘導蛋白IX表達的腺病毒載體中不發生炎症。
綜合以上一系列結果，本發明者發現了傳統上不知的一個極其重要的新機制第一代腺病毒載體引起的炎症是由於CMV增強子對腺病毒基因表達的誘導。
含有CMV增強子的啟動子，如CMV啟動子，由於高啟動子活性，已經用於當前進行臨床研究的多種腺病毒載體。例子包括採用CMV啟動子本身的載體腫瘤抑制基因、表達p53的腺病毒載體(Clayman G.L.等人，J.Clin.Oncol.162221-2232(1998)，Swisher S.G.等人，J.Natl.Cancer Inst.91763-771(1999))、表達白介素-2的腺病毒載體(Stewart A.K.等人，Gene Ther.6350-363(1999))、表達血管內皮生長因子VEGF121的腺病毒載體(Rosengart T.K.等人，Circulation100468-474(1999))；採用含CMV IE增強子的雜合啟動子的腺病毒載體的例子包括表達囊性纖維化跨膜轉導調節蛋白(CFTR)的腺病毒載體(Knowles M.R.等人，N.Eng.J.Med.333823-831(1995)，Zuckerman J.B.等人，Hum.Gene Ther.102973-2985(1999))。
因此，發明者關於外源啟動子誘導腺病毒基因表達引發炎症的發現不是一種只限於含CAG啟動子的重組腺病毒載體的現象，而是適用於當前正在進行臨床研究的其它許多腺病毒載體的廣泛現象。因此，根據這一發現，預計修飾後不能誘導腺病毒基因表達的腺病毒載體可減輕施用後的炎症，從而持久表達治療基因，有極高的使用價值。
此外，本發明關於外源啟動子誘導腺病毒基因表達的發現可能不僅適用於含有CMV IE增強子的腺病毒載體而且適用於含有其它病毒啟動子的腺病毒載體。這類啟動子的例子包括RSV啟動子、含有SV40早期基因增強子的啟動子或SRα啟動子等。
下面以蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體為例，具體描述了實現本發明的方法。
首先描述了構建蛋白IX重新定位的腺病毒載體的方法。蛋白IX基因的核苷酸序列和位置在參考文獻中有描述(Maat J.等人，Gene 1027-38(1980))。不具體限制製備重新定位的蛋白IX基因的方法，可利用限制酶消化從含有蛋白IX基因的質粒或粘粒上酶切(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))，但是為了便於隨後的構建，優選地用PCR方法擴增。將要擴增的蛋白IX基因的範圍優選地不僅含有蛋白IX基因的編碼序列而且含有5』-非翻譯區和3』-非翻譯區。5』-非翻譯區優選地含有蛋白IX基因的啟動子區，一個例子含有5型腺病毒位點3525和其後的序列，更優選地位點3213和其後的序列。不具體限制3』-非翻譯區的範圍，只要它含有直到蛋白IX基因終止密碼子的鹼基序列，可以在緊接終止密碼子之後添加另一種基因的poly(A)序列，或者可以採用蛋白IX基因的原始poly(A)序列。後者的一個例子是，優選地含有聚腺苷酸化信號和含poly(A)實際添加位點的可達位點4070的鹼基序列，更優選地含有可達位點4076的鹼基序列。不具體限制PCR引物的核苷酸序列，只要該序列能夠擴增上述範圍內的蛋白IX基因，但是為了便於在擴增後向質粒中克隆含有蛋白IX基因的DNA片段，優選地含有適當限制酶的識別序列。
含有PCR擴增的蛋白IX基因的DNA片段可以直接插入腺病毒基因組的希望的位點，但是為了證實在PCR反應中核苷酸序列不含突變，首先將擴增的片段克隆到合適的質粒等中，然後優選地證實該核苷酸序列可以使用。不具體限制克隆擴增片段的質粒，例子包括pUC19等。
如上所述，重新定位蛋白IX基因的位點包括L3基因與E2A基因之間的位點，E3基因的缺失位點等，但是作為一個更優選的例子，以下描述了一種在E4基因上遊區與3』端ITR之間重新定位的方法。構建蛋白IX基因重新定位於上述位點的腺病毒載體的一種方法是，用含有腺病毒基因組的質粒或粘粒載體轉化一種細胞系，如293細胞，基因組結構中蛋白IX基因從原始位置(9.7-11.2m.u.)缺失，插入E4基因上遊區與3』端ITR之間，一步獲得希望的重組腺病毒載體。然而，另一種方法使用兩步法也是可能的，該方法首先構建一種重組腺病毒，其中蛋白IX保留於原始位置，也在E4基因上遊區與3』端ITR之間插入蛋白IX基因，然後刪除原始位點的蛋白IX基因，構建蛋白IX基因重新定位的腺病毒載體。儘管後一種方法中包括多個步驟，但它肯定能獲得目的重組腺病毒載體，因此是一種優選方法，這種構建方法包括兩步，在下文詳述。以下描述的構建重組腺病毒載體的方法是，用含有腺病毒基因組大部分和限制酶消化末端蛋白質-腺病毒DNA複合物(DNA-TPC)獲得的DNA的粘粒載體轉化293細胞等，然後通過粘粒載體與腺病毒DNA-TPC之間的同源重組獲得目的重組腺病毒載體，其原理和步驟已在現有參考文獻(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))和專利(日本未審查專利文本(Kokai)號7-298877)中公開。
粘粒載體pAx4w是這樣一種載體，它含有5型腺病毒基因組的2.6-98.0m.u.(E3基因缺失)和2型腺病毒基因組的98.0-100m.u.，在E4基因啟動子上遊區與3』端ITR之間(99.3m.u.)含有一個限制酶SwaI位點作為克隆位點(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)，在該參考文獻中pAx4w描述為pAdex4w)。向pAx4w的SwaI位點插入通過上述PCR方法製備的蛋白IX基因，獲得粘粒載體pAx4pIX。另一方面，重組腺病毒載體Adex4SRlacZL是一種複製缺陷型腺病毒載體，它來源於5型腺病毒(E1A、E1B、E3基因缺失)，在與pAx4w相同的99.3m.u.位置處插入大腸桿菌lacZ基因的表達單元。用限制酶AseI和EcoRI消化，在基因組右半段消化幾次，由Adex4SRlacZL製備腺病毒基因組DNA，用從該DNA獲得的DNA-TPC和粘粒載體pAx4pIX轉化293細胞，然後產生重組腺病毒載體pAx4pIX，其中Adex4SRlacZL的大腸桿菌lacZ基因的表達單元已經替換為蛋白IX基因。pAx4pIX是一種重組腺病毒載體，它在兩個位點處含有蛋白IX基因蛋白IX基因的原始位點和E4基因上遊區與3』端ITR之間。
然後說明了在蛋白IX基因原始位點處缺失的核苷酸序列的範圍。蛋白IX基因向右轉錄，而蛋白IX基因的3』-非翻譯區與向左轉錄的IVa2基因和E2B基因的3』-非翻譯區部分重疊，因此蛋白IX基因的缺失範圍必須是不影響IVa2基因和E2B基因功能的範圍。以5型腺病毒為例，認為IVa2基因和E2B基因的聚腺苷酸化位點是位點4060處的基礎，缺失範圍必須在其左側更遠。不限制缺失範圍，只要滿足這一條件並且蛋白IX不表達，一個例子是從5型腺病毒的PvuII位點(Ad5452-457)到AlwNI位點(Ad54048-4056)的缺失。含有缺失這段鹼基的腺病毒基因組的載體能由粘粒載體pAxcw(日本未審查專利文本(Kokai)號8-308585，第15頁，pAdexlcw與pAxcw相同)構建。pAxcw是一種粘粒載體，它含有5型腺病毒基因組的大部分，其中E1基因缺失(Δ454-3328)，以pAxcw作為原材料通過幾步構建，能獲得粘粒載體pAxΔpIXcw，它含有從PvuII位點到AlwNI位點缺失的腺病毒基因組。pAxΔpIXcw是這樣一種載體，其中E1A、E1B和蛋白IX基因缺失(Δ454-4053)，缺失位點中插入一個用於外源基因的克隆位點(ClaI和SwaI位點)。
用限制酶EcoT22I(在基因組左側含有多個識別位點)消化由上述腺病毒Ax4pIX製備的基因組DNA，獲得DNA-TPC，用該DNA-TPC和上述粘粒載體pAxΔpIXcw轉化293細胞，能夠獲得蛋白IX基因重新定位的目的重組腺病毒載體pAxRpIXcw。該AxRpIXcw中沒有插入外源基因如啟動子，插入任一種外源基因的蛋白IX重新定位的腺病毒載體能夠如下獲得使EcoT22I消化AxRpIXcw的基因組DNA獲得的DNA-TPC與在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點或ClaI位點插入外源基因的粘粒載體同源重組。此外，插入任何外源基因的蛋白IX重新定位的腺病毒載體也能如下獲得使EcoT22I消化Ax4pIX的基因組DNA獲得的DNA-TPC與在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點或ClaI位點插入外源基因的粘粒載體同源重組。
如上所述，以5型腺病毒為例，說明了一種構建蛋白IX重新定位的腺病毒載體的方法。重新定位的蛋白IX基因不需要採用來自相同血清型腺病毒的基因，能採用另一種血清型的蛋白IX基因，只要該蛋白質在腺病毒複製循環中充分起作用。例如，2型蛋白IX基因重新定位於5型基本骨架的一種載體，或者相反，5型蛋白IX基因重新定位於2型基本骨架的一種載體。
然後說明了一種構建蛋白IX缺失的腺病毒載體的方法。為了構建這種載體，需要表達蛋白IX的細胞系，因此說明了一種構建表達蛋白IX的細胞系的方法。不具體限制向細胞中導入的蛋白IX基因的範圍，只要它含有蛋白IX的編碼區。含有蛋白IX編碼區的DNA片段可通過限制酶消化從含有該基因的質粒等上切下，或者可以通過PCR方法製備。不具體限制用於表達蛋白IX的啟動子，可以使用在動物細胞中組成型作用的啟動子，或者可以使用誘導型啟動子。此外，也可以使用蛋白IX基因的原始啟動子。通過用含有蛋白IX基因表達單元的質粒轉化任何細胞，能夠獲得表達蛋白IX的細胞系。然而，用於構建該細胞系的細胞優選地是表達腺病毒E1基因的細胞，該細胞能夠高效產生E1基因缺失的第一代腺病毒載體。這種細胞的例子包括293細胞。而且，為了防止載體基因組與細胞基因組的同源重組產生複製型腺病毒(RCA)，優選地使用只導入E1基因所需最小區域的細胞系構建表達蛋白IX的細胞系。此外，首先由不表達E1基因的細胞構建表達蛋白IX的細胞系，然後用E1基因轉化該細胞系，也能獲得希望的細胞系。不具體限制細胞轉化和目的細胞系選擇的方法，可以使用能為蛋白IX缺失的腺病毒載體提供足量蛋白IX的任何細胞系。
其次，更加具體地說明了一種構建蛋白IX缺失的腺病毒載體的方法。如對於蛋白IX重新定位的腺病毒載體所述，蛋白IX基因的缺失範圍可以是不影響IVa2基因和E2B基因功能並且不能使蛋白IX表達的任何範圍，其例子包括上述PvuII位點(Ad5452-457)到AlwNI位點(Ad54048-4056)的缺失。上述粘粒載體pAxΔpIXcw是一種對應於此範圍腺病毒基因組缺失的載體。用限制酶如EcoT22I消化第一代腺病毒載體(如AxCAwt或Axlwl)的基因組DNA獲得DNA-TPC，用pAxΔpIXcw和這種DNA-TPC轉化上述表達蛋白IX的細胞系，能夠獲得蛋白IX缺失的目的腺病毒載體。這樣構建的蛋白IX缺失的腺病毒載體AxΔpIXcw中未插入外源基因如啟動子。然而，類似於蛋白IX重新定位的腺病毒載體，插入外源基因的蛋白IX缺失的腺病毒載體能夠如下獲得使在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點或ClaI位點插入外源基因的粘粒載體與用EcoT22I等消化AxΔpIXcw的基因組DNA獲得的DNA-TPC重源重組。此外，插入外源基因的蛋白IX缺失的腺病毒載體也能如下獲得用EcoT22I消化第一代腺病毒載體(如AxCAwt和Axlwl)的基因組DNA獲得的DNA-TPC與在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點或ClaI位點插入外源基因的粘粒載體同源重組。
如上所述，以5型腺病毒為例，說明了一種構建蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體的方法。然而，本發明不限於5型腺病毒，適用於含有其它血清型的腺病毒骨架的任何腺病毒載體，包括2型腺病毒。
然後說明了一種含有本發明的重組腺病毒載體作為活性成分的藥用組合物，和炎症減輕的一種基因治療方法。如上所述獲得的本發明的重組腺病毒載體是一種十分安全的載體，當對人施用時能夠減輕炎症，並且能夠作為藥用組合物的活性成分用於多種疾病的基因治療。當本發明的重組腺病毒載體作為藥用組合物時，根據所治療的疾病、靶器官等，能夠恰當地選用體內或離體方法。在此使用時，體內方法是將用於基因治療的藥用組合物直接導入患者體內的方法，而離體方法是從患者中取出某些細胞，將上述藥用組合物離體導入該細胞中，然後將細胞回輸到患者體內的方法。
對於本發明的重組腺病毒載體，不具體限制體內施用途徑，可以對患者器官(如肝臟、肺、腎、腦等)靜脈內、動脈、皮下、經皮膚或肌內施用。也不具體限制用於體內施用的劑型，例如，當採用注射時，能夠用標準方法準備注射。因此，在將本發明的重組腺病毒載體無菌溶解於合適的溶劑(緩衝液，如PBS、生理鹽水、無菌水等)中後，可以填充到無菌容器中備用。需要時可以向這種藥物製劑中添加常用的載體。
當在離體方法中使用本發明的腺病毒載體時，不具體限制使用的細胞，可以使用用於預期用途的任何細胞，如白細胞，如淋巴細胞，來自患者的不同腫瘤細胞，等等。
本發明的藥用組合物用於患者的劑量可以根據所治療的疾病、患者的年齡和體重等適當確定。通常每次施用約106-1014(PFU)，優選地約108-1012(PFU)本發明的重組腺病毒載體，或者連續幾天，或者約一個月一次。
如上所述，當前正進行臨床研究的腺病毒載體，已知有腫瘤抑制基因p53表達載體、白介素2表達載體、血管內皮生長因子(VEGF)121表達載體、囊性纖維化跨膜轉導調節蛋白(CFTR)表達載體等。本發明的重組腺病毒載體能夠代替常規腺病毒載體，作為能夠減輕使用常規腺病毒載體引起的炎症的載體。
例如，使用腫瘤抑制基因p53表達載體的臨床研究方案等在參考文獻中已有描述(Roth J.A.等人，Hum.Gene Ther.71013-1030(1996))，因而按照該方案能夠進行本發明的基因治療。
本發明的重組腺病毒載體不僅可以用作人類基因治療藥物，而且可以用作向動物轉移基因的載體。該方法可以按照上述人類基因治療方法進行，如體內和離體方法。
也可參考許多已知的公開文本和以下所述的實施例。本發明的腺病毒載體的特徵在於是一種能夠減輕炎症的載體，具有甚至在用於動物時仍優於常規腺病毒載體的主要優點，因為在許多用途中，如製備疾病動物模型，人類疾病的治療模型，基因的功能分析等，不需要考慮載體的副作用，如炎症。
下面將參照實施例更詳細地說明本發明，但是應當指出，本發明決不限於這些實施例，可以進行本發明領域常用的改變。除非另外說明，這些實施例中處理噬菌體、質粒、DNA、多種酶、大腸桿菌、培養的細胞等的方法根據「《分子克隆實驗室手冊》，T.Maniatis等人編寫，第二版(1989)，冷泉港實驗室」所述的方法進行。
本發明實施例中使用的粘粒載體pAxCAwt(Kanegae Y.等人，Nucleic Acids Res.233816-3821(1995))和pAxcw(日本未審查專利文本(Kokai)號8-30858858，第15頁，pAdexlcw與pAxcw相同)是含有5型腺病毒基因組中除腺病毒E1和E3基因之外的大部分的載體。此外，pAxCAwt在E1基因缺失位點還導入一個CAG啟動子(Niwa H.等人，Gene 108193-200(1991)，日本專利號2824434)，在該啟動子與poly(A)序列之間有一個克隆位點。pAxcw只在E1基因缺失位點插入一個ClaI位點和一個SwaI位點。用這些粘粒載體和腺病毒DNA-末端蛋白質複合物轉化293細胞(ATCC CRL-1573)和通過同源重組(COS-TPC法)構建重組腺病毒載體的方法根據現有參考文獻(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))和專利(日本未審查專利文本(Kokai)號7-298877)進行。此外，除非另外說明，通過超速離心純化腺病毒載體的方法(Kanegae Y.等人，Jpn.J.Med.Sci.Biol.47157-166(1994))和應用293細胞通過有限稀釋測定病毒效價的方法(日本未審查專利文本(Kokai)號7-298877)也根據現有的方法進行。
實施例1表達人生長激素的腺病毒載體的構建(1)人生長激素cDNA的克隆為了通過PCR方法複製人生長激素cDNA，進行下列方法。
由商品人垂體腺瘤來源的cDNA文庫(CLONTECH)製備噬菌體DNA，用作PCR的模板DNA。設計PCR引物，在兩端添加限制酶識別位點，5』端引物含有起始密碼子和一個NheI識別位點，3』端引物含有終止密碼子和一個SphI識別位點。每條引物的序列如下所示
5′-端引物5-TGGCTAGCTCACCTAGCGGCAATGGCT-3′NheIMet(SEQ ID NO1)3′-端引物5-CAGGCATGCCACCCGGGCAGCTAGAA-3′SphI 終止(SEQ ID NO2)用來源於上述cDNA文庫的DNA作為模板，在標準PCR反應中使用聚合酶pfu(Takara Shuzo)，獲得含有hGH cDNA的約700bp的擴增片段。用Klenow酶使擴增片段成為平端，插入pUC19的HincII位點，獲得質粒pUCHGH(3.4kb)。通過對pUCHGH的cDNA部分測序證實該序列與參考文獻中所述的序列相同(Chen E.Y.等人，Genomics 4479-497(1989))。
(2)表達人生長激素的重組腺病毒載體的構建用NheI和BglI消化pUCHGH，使其成為平端，獲得含有hGHcDNA編碼區的約0.7kb DNA片段。將該cDNA片段插入粘粒載體pAxCAwt的啟動子與poly(A)序列之間的SwaI位點，獲得粘粒pAx1CAHGH。
為了證實hGH的表達單元已經精確整合到粘粒pAx1CAHGH中，由pAx1CAHGH構建含有hGH的表達單元的質粒，使得在COS7細胞(猴腎來源的細胞系)中瞬時表達hGH蛋白。用NruI消化後使pAx1CAHGH自身連接，獲得已經去除腺病毒DNA大部分的表達hGH的質粒Px1CAHGH(含有左端的約0.4kb)。然後通過DEAE-葡聚糖法用Px1CAHGH轉染COS7細胞，兩天後用ELISA法(PicoiaTMHGH板Sumitomo Pharmaceuticals)測定條件培養基中hGH的濃度。在未導入質粒的COS7細胞的條件培養基中，hGH濃度低於檢測限度，但在Px1CAHGH轉化的COS7細胞的條件培養基中檢測到1ng/ml或更高的hGH。此結果證實hGH的表達單元已經精確整合到粘粒pAx1CAHGH中。
最後，通過上述COS/TPC法，用粘粒pAx1CAHGH和腺病毒DNA-末端蛋白質複合物轉化293細胞，獲得表達hGH的重組腺病毒Ax1CAHGH(圖1，E1基因和E3基因缺失)。
實施例2表達hGH的E2A基因缺失的腺病毒載體的構建(1)用於構建E2A缺失的腺病毒載體的重組腺病毒載體的構建粘粒載體pAx2LD3LCAwt(日本未審查專利文本(Kokai)號8-308585第19頁中的pAdex2LD3LCAwt，與pAx2LD3LCAwt相同)是上述粘粒載體pAxCAwt的衍生物。pAx2LD3LCAwt是在腺病毒L3基因與E2A基因之間(61.5圖距單位)和E3基因缺失位點(78.0圖距單位)插入loxP位點的一種粘粒，loxP插入位點之外的核苷酸序列與pAxCAwt相同。
用NheI和BglI消化實施例1中構建的質粒pUCHGH，使其成為平端，獲得含有hGH cDNA編碼區的約0.7kb DNA片段。該DNA片段插入粘粒載體pAx2LD3LCAwt的啟動子與poly(A)序列之間的SwaI位點，獲得粘粒pAx2LD3LCAHGH。
腺病毒載體Adex2LD3LCANLacZ(圖1，日本未審查專利文本(Kokai)號8-308585，第21頁)是一種重組腺病毒，其中在與粘粒載體pAx2LD3LCAwt相同的位置插入兩個loxP位點，它表達大腸桿菌β-半乳糖苷酶。
為了構建Adex2LD3LCANLacZ的插入基因由lacZ替換為hGH的重組腺病毒，根據現有方法(日本未審查專利文本(Kokai)號7-298877)進行下列方法。首先，由Adex2LD3LCANLacZ製備腺病毒DNA-末端蛋白質複合物，然後用EcoT221消化。用這種DNA-末端蛋白質複合物和粘粒pAx2LD3LCAHGH轉染293細胞，獲得含有hGH表達單元和兩個loxP位點的重組腺病毒Ax2LD3LCAHGH(圖1)。該Ax2LD3LCAHGH與實施例1構建的腺病毒載體Ax1CAHGH在結構上除表達單元之外均相同。
(2)E2A缺失的腺病毒載體的構建為了構建通過重組酶Cre的作用從腺病毒載體Ax2LD3LCAHGH中刪除側翼為兩個loxP位點的E2A基因和L4基因的重組腺病毒(E2A缺失的腺病毒載體)，進行下列方法。
首先，利用超速離心法(同上文)純化腺病毒載體Ax2LD3LCAHGH和表達重組酶Cre的腺病毒載體AxCANCre(圖1，Kanegae Y.等人，Nucleic Acids Res.233816-3821(1995))，利用293細胞通過有限稀釋法(同上文)測定每種病毒的效價。
然後向膠原蛋白包被的225cm2培養瓶中幾乎鋪滿的293細胞中加入含有3.0×107PFU/ml Ax2LD3LCAHGH(moi＝2)和1.5×107PFU/mlAxCANCre(moi＝1)的4ml培養基(含有5％FCS的Dulbecco’s改良Eagle’s培養基DMEM)，在37℃下感染兩種病毒1小時。感染後，加入21ml含有5％FCS的DMEM培養基，在5％CO2存在下37℃培養。兩天後，用細胞刮棒刮取附著於瓶底的細胞，將含有條件培養基的細胞懸液置於50ml離心管中，在4℃下以2500轉/分(1130×g)離心5分鐘，棄去上清液後，細胞級分在-80℃下凍存。
(3)E2A缺失的腺病毒載體的純化儘管在用上述Ax2LD3LCAHGH和AxCANCre共感染的293細胞中產生表達hGH的E2A缺失的目的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH28.1kb)，但還存在Ax2LD3LCAHGH(34.4kb)和AxCANCre(34.7kb)，因而這三種病毒存在於一種混合物中(括號中的數字表示每種病毒的基因組大小)。因此，為了根據病毒比重的差異分離ΔE2A-CAHGH，進行以下氯化銫(CsCl)密度梯度超速離心，純化E2A缺失的腺病毒載體。用於純化的CsCl溶液均在50mM Hepes緩衝液(pH7.4)中製備，離心和超速離心在4℃下進行。
1)融化凍存於-80℃的含ΔE2A-CAHGH的293細胞級分，懸浮於25ml 50mM Hepes緩衝液(pH7.4)中，細胞來自8個225cm2搖瓶。然後將細胞懸液置於200ml超聲杯中，用密閉型超聲儀(Cosmo Bio生產，UCD-200T型)超聲處理(200W，3分鐘(30秒×6次)，4℃)。將細胞勻漿轉移到30ml離心管中，以10000轉/分(11850×g)離心10分鐘。對離心後的上清液進行三步超速離心。
2)為了濃縮細胞勻漿中的腺病毒，8ml比重為1.43的CsCl溶液置於用於Beckman轉頭SW28的超速離心管中，使上述1)製備的約25ml上清液在其上分層，以23000轉/分(95400×g)超速離心約1.5小時。離心後，回收水相與CsCl相界面周圍的含腺病毒的帶(每管約2.5ml)，加入與回收的病毒溶液等量的飽和CsCl溶液。
3)在用於Beckman轉頭SW41的超速離心管中，下列溶液從底部連續分層。上述2)中製備的病毒溶液(約5ml)/比重為1.32的CsCl溶液(4.5ml)/比重為1.25的CsCl溶液(2.5ml)。以35000轉/分(210000×g)超速離心3小時。通過超速離心，蛋白質在比重為1.25和1.32的CsCl溶液界面周圍形成一條寬帶，病毒在比重為1.32的CsCl溶液中部周圍形成一條銳帶，回收病毒帶(每管約1.5ml)，加入與回收的病毒溶液等量的比重為1.36的CsCl溶液。
4)向用於SW41的超速離心管中加入3)中製備的約2ml病毒溶液和10ml比重為1.34的CsCl溶液，充分混合，以30000轉/分(154000×g)超速離心約19小時。通過超速離心，根據每種病毒的比重，病毒帶均被分離。由於Ax2LD3LCAHGH(34.4kb)和AxCANCre(34.7kb)有幾乎相同的基因組大小，其比重幾乎相等，超速離心後的病毒帶重疊，而ΔE2A-CAHGH(28.1kb)比重小於這些病毒，通過超速離心在管的上部形成一條帶。用注射器針頭在超速離心管側面穿一個洞，回收ΔE2A-CAHGH帶。
5)最後，為了從病毒溶液中除去CsCl，使回收的病毒溶液對含有10％甘油的PBS(-)透析，獲得最終純化的ΔE2A-CAHGH產物。透析後的病毒等分後凍存於-80℃。
(4)E2A缺失的腺病毒載體的感染效價和純度的測定1)感染效價的測定由於E2A缺失的腺病毒載體在293細胞中不能複製，所以不能象第一代腺病毒載體(E1基因缺失)那樣，利用在293細胞中的複製作為指標，用標準方法測定其效價。於是，以報導基因產物hGH的量作為指標，比較效價已知的表達hGH的第一代腺病毒載體Ax1CAHGH與ΔE2A-CAHGH的hGH產量，測定ΔE2A-CAHGH的相對效價(感染效價)。
將要檢測的腺病毒載體用含有2％FCS的DMEM培養基連續稀釋，然後將50μl加入在96孔微孔板中培養的A549細胞(人肺癌來源的細胞系)中，37℃感染1小時。然後除去病毒溶液，細胞用培養基洗滌一次，加入100μl含2％FCS的DMEM培養基，培養2天。培養完成後，利用ELISA法(PicoiaTMHGH板Sumitomo Pharmaceuticals)測定條件培養基中的hGH量。
首先，用第一代腺病毒載體Ax1CAHGH進行預檢測，發現病毒感染期間在moi＝0.01-1的範圍內，添加的病毒量與hGH產量相關，證實hGH的產量反映添加的病毒量。
因此，用效價已知的Ax1CAHGH(B批，效價3.0×1010PFU/ml)作為對照病毒，測定ΔE2A-CAHGH(第3批)的感染效價。感染中每種病毒的稀釋比為30000、90000和270000倍，比較兩天後hGH的產量。在任一稀釋比，Ax1CAHGH(B批)的hGH產量都高於ΔE2A-CAHGH(第3批)，平均約1.1倍。因此，ΔE2A-CAHGH(第3批)的效價計算為3.0×1010PFU/ml×1/1.1＝2.7×1010PFU/ml(等價)。
根據該值計算ΔE2A-CAHGH(第3批)的總產量，來自48個225cm2搖瓶的293細胞產生4.7×1010PFU(等價)的病毒。而且，根據純化病毒的260nm吸光度測定，ΔE2A-CAHGH的顆粒與噬斑形成單位(PFU)之比為63。
對另一批ΔE2A-CAHGH進行類似的測定，發現來自20個225cm2搖瓶的293細胞的ΔE2A-CAHGH(第2批)總產量為1.9×1010PFU(等價)病毒，顆粒與噬斑形成單位(PFU)之比為47。
2)純度的測定儘管E2A缺失的腺病毒載體通過超速離心純化，但仍有純化不能除去的第一代腺病毒載體(Ax2LD3LCAHGH和AxCANCre)的輕微汙染。由於汙染的第一代腺病毒載體能在293細胞中複製，利用293細胞通過標準方法(有限稀釋法)測定的效價反映了汙染的第一代腺病毒載體的量。因此，為了測定ΔE2A-CAHGH(第3批)的純度，利用293細胞通過有限稀釋法測定效價。ΔE2A-CAHGH(第3批)的效價是7.8×108PFU/ml，Ax1CAHGH(B批)的效價為4.4×1010PFU/ml，比例為1.8％。由於根據1)的結果，Ax1CAHGH(B批)的感染效價是ΔE2A-CAHGH(第3批)的1.1倍，修正該值，ΔE2A-CAHGH(第3批)的純度計算為(1-0.018×1.1)×100＝98％。
通過類似的測定，另一批(第2批)ΔE2A-CAHGH的純度為97％。
(5)E2A缺失的腺病毒載體的腺病毒蛋白表達降低的證實對於用E2A缺失的腺病毒載體感染的細胞，用螢光抗體法測定E2A基因編碼的DBP(單鏈DNA結合蛋白)和六鄰體(腺病毒顆粒的一種主要結構蛋白)的表達是否降低。
向膠原蛋白包被的8孔培養片(Becton Dickinson，#40630)中培養的鋪滿的A549細胞中，加入100μl含ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH的病毒溶液，這兩種載體用含5％FCS的DMEM培養基稀釋為moi＝100或10，在37℃下感染1小時。感染後，棄去病毒溶液，加入0.3ml含5％FCS的DMEM培養基，培養兩天。兩天後，棄去條件培養基，用PBS(-)洗滌細胞，加入0.4ml 2％低聚甲醛/PBS(-)，細胞在室溫下固定10分鐘，用PBS(-)洗滌兩次。另外，用1mg/ml皂苷進行膜通透性處理(室溫，30分鐘)，之後對細胞進行DBP或六鄰體檢測。
為了檢測DBP，在用10％正常山羊血清封閉載玻片後，兔抗-DBP肽(RPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKR；對應於DBP位點22-46的胺基酸殘基)抗體和FITC-標記的山羊抗-兔抗體(JACKSON，#111-096-003)連續反應，用DAPI(4』，6-二氨基-2-苯基-吲哚)溶液進行核染色，在落射光螢光顯微鏡(Olympus BX-50)下檢查。
為了檢測六鄰體，在用10％正常山羊血清封閉載玻片後，山羊抗-六鄰體抗體(CHEMICON，AB-1056)和FITC-標記的兔抗-山羊抗體(Vector Laboratories，FI-5000)連續反應，用DAPI進行核染色，在落射光螢光顯微鏡下檢查。
在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中，DBP和六鄰體的表達水平明顯降低，用ΔE2A-CAHGH以moi＝100感染的細胞中DBP陽性和六鄰體陽性細胞之比與用Ax1CAHGH以moi＝10感染的細胞幾乎相同。因此，如開始時預期的那樣，證實ΔE2A-CAHGH中腺病毒基因的表達降低。
實施例3E2A缺失的腺病毒載體的炎症誘發作用的研究為了確定腺病毒E2A基因的缺失是否導致炎症誘發作用降低，對小鼠注射表達hGH的E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)或表達hGH的第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH)，以血清GPT水平(谷丙轉氨酶)為指標，比較兩種腺病毒載體誘發炎症的作用。方法與結果如下所示。
(1)方法使用的小鼠是C57BL/6小鼠(7周齡，雌性)。使用的腺病毒載體是ΔE2A-CAHGH(第3批)或Ax1CAHGH(C批)。腺病毒載體的劑量為1×109PFU、3×108PFU或1×108PFU(每組5隻動物)，鹽水稀釋的腺病毒載體以每隻小鼠0.2ml的量通過尾靜脈施用。腺病毒載體施用3天前和3、5、7、10、14、21、28、35、42、49、56、63天後，用肝素化的血球壓積管從乙醚麻醉的動物的眼窩靜脈部分採血。血液以10000轉/分離心5分鐘分離血清，貯存於-20℃直到使用。用轉氨酶CII-試驗Wako(Wako Pure Chemicals)通過POP-TOOS法測定血清GPT水平。
(2)結果對C57BL/6小鼠施用腺病毒載體後以固定間隔測定的血清GPT水平的平均值示於圖2中。為了證實每個處理組中載體的施用效率，也在腺病毒載體施用3天後和5天後測定血清hGH水平。在用相同劑量的腺病毒載體處理的組中，Ax1CAHGH處理組與ΔE2A-CAHGH處理組的血清hGH水平沒有顯著差異，證實這兩種載體以相同的效率施用。
然後測定了血清GPT水平。對於ΔE2A-CAHGH處理的小鼠，血清GPT水平隨腺病毒載體劑量升高而升高，與用第一代腺病毒載體處理的小鼠沒有差異。此結果表明，腺病毒E2A基因的缺失不會導致減輕炎症誘發作用。
實施例4紫外線滅活的腺病毒顆粒的製備為了闡明對小鼠施用腺病毒載體時發生的炎症是否由腺病毒載體本身引起，用下列方法製備紫外線滅活的腺病毒顆粒。
向通過實施例2-(2)所述方法純化的1.8ml表達hGH的腺病毒載體Ax1CAHGH(3.0×1010PFU/ml，1.4×1012顆粒/ml)中加入18μl33mg/ml 8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)(8-MOP的終濃度為330μg/ml)，然後按0.6ml等分到三個直徑35mm的組織培養皿(Sumitomo Bakelite，目錄號MS-10350)中。將培養皿置於冰上，置於配備有波長365nm的紫外燈(8瓦，5隻燈)的紫外交聯儀(1800型StratalinkerTM紫外交聯儀，STRATAGENE)的紫外燈下5cm，使蓋保持關閉。紫外線照射1小時(紫外線強度約為1.8kW)，每10分鐘改變一次培養皿的位置。紫外線照射後，從培養皿中回收病毒溶液，為了除去8-MOP，對含10％甘油的PBS(-)透析過夜。最後，回收顆粒濃度為1.1×1012顆粒/ml的約1.7ml病毒溶液，貯存於-80℃。
通過上述處理滅活腺病毒載體用兩種測定hGH產量和測定效價的方法證實。hGH產量的測定用以上實施例2-(4)所述的方法進行，不同之處在於在腺病毒載體感染1天後測定hGH的濃度。在紫外線滅活前用1×105顆粒/ml的腺病毒載體Ax1CAHGH感染的細胞的hGH產量約為0.2ng/ml，用1×1010顆粒/ml感染的細胞的產量約為28μg/ml。另一方面，對於上述滅活的腺病毒載體，在用1×1010顆粒/ml感染時，hGH的產量為0.4ng/ml。因而根據計算hGH的產量，證實滅活使腺病毒載體的感染力下降為1/105。效價測定也通過使用293細胞的標準方法進行。滅活前病毒的效價約為3×1010PFU/ml，而滅活後的效價低於2×103PFU/ml，因而病毒的效價下降為1/107或更低。
上述結果證實，本發明的接受紫外線照射處理的病毒(紫外線照射的腺病毒顆粒)被完全滅活。
實施例5關於第一代腺病毒載體施用後炎症起因的研究實施例3顯示，甚至在對小鼠施用E2A缺失的腺病毒載體時，處理小鼠的血清GPT水平與用第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH)處理的小鼠相比仍不降低。對於此結果的解釋，考慮以下四種可能性1)E2A基因的表達與炎症無關，2)作為報導分子的hGH蛋白是細胞介導的免疫的抗原，從而引起炎症，3)由外源啟動子(CAG啟動子)誘導表達的病毒基因產物作為細胞介導的免疫的抗原，4)不是在感染動物中從頭合成的病毒蛋白，而是在病毒感染過程中進入細胞的病毒顆粒組成型蛋白，作為細胞介導的免疫的抗原。
於是，對小鼠施用不同結構的腺病毒，通過測定血清GPT水平作為指標，研究第一代腺病毒載體施用後炎症的起因。所用的腺病毒載體、實驗方法和結果如下所示。
(1)腺病毒載體使用的腺病毒載體如下所示。均為第一代腺病毒載體。
-表達hGH的腺病毒載體Ax1CAHGH-只插入CAG啟動子而不含hGH cDNA的腺病毒載體AxCAwt(圖1也插入poly(A)序列)(Kanegae Y.等人，Nucleic AcidsRes.233816-3821(1995))-無外源基因(如啟動子)插入的腺病毒載體(只插入限制酶SwaI位點)Axlwl(圖1Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)，在該參考文獻中描述為Adexlw)-通過紫外線照射Ax1CAHGH滅活的病毒紫外線滅活的顆粒(見實施例4)
該方法與實施例3所示基本相同。以下只描述了不同之處。
載體的劑量為1×109PFU、3×108PFU、1×109PFU或3×107PFU(每組5隻動物)。由於不能根據PFU確定紫外線滅活的腺病毒顆粒的劑量，它們以顆粒數相同的量施用。
施用前3天及施用後第3、5、7、10(或11)、14、21、28天採血。
(3)結果實驗分開進行兩輪。第一輪，比較Ax1CAHGH和AxCAwt(圖3，上面的柱圖)。第二輪，比較Ax1CAHGH、Axlwl和紫外線滅活的腺病毒顆粒(圖3，下面的柱圖)。在這兩輪中，只施用用於稀釋載體的鹽水的組作為陰性對照。在圖3中，鹽水處理組的數據只來自第一輪，但在第二輪獲得類似的結果。
在CAG啟動子控制下表達hGH的腺病毒載體(Ax1CAHGH)處理組，和只含CAG啟動子的腺病毒載體(AxCAwt)處理組，它們在血清GPT水平升高程度上有極小的差異。因此證明，報導基因hGH的表達與炎症無關。另一方面，未插入外源基因的腺病毒載體(Axlwl)處理組，和紫外線照射的腺病毒顆粒處理組，血清GPT水平不升高。由於AxCAwt與Axlwl的結構差異只是存在或不存在CAG啟動子和poly(A)序列，說明血清GPT水平升高的原因，即炎症的原因，是CAG啟動子。
實施例6由CAG啟動子誘導表達的腺病毒基因的鑑定對於第一代腺病毒載體，為了鑑定由CAG啟動子誘導表達從而引發炎症的腺病毒基因，用以下所示的不同腺病毒載體感染第一代腺病毒載體在其中不能複製的細胞系(A549細胞或HepG2細胞)，並通過Northern印跡法分析表達的腺病毒基因。用於該研究的腺病毒載體是含CAG啟動子的第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH、AxCAwt)，不含外源啟動子的第一代腺病毒載體(Axlwl)，和含CAG啟動子的E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)。在此使用時，目的腺病毒基因，即CAG啟動子誘導其表達的基因，是在三種載體(Ax1CAHGH、AxCAwt、ΔE2A-CAHGH)感染的細胞中相同程度地表達，但在Axlwl感染的細胞中極少表達的腺病毒基因。方法與結果如下所示。
(1)方法在25cm2培養瓶中幾乎鋪滿的(約5×106個細胞)A549細胞(人肺癌來源的細胞系)或HepG2細胞(人肝癌來源的細胞系)用以含5％FCS的DMEM培養基稀釋的各0.3ml腺病毒載體感染1小時(moi＝100)。感染後，棄去病毒溶液，加入5ml含5％FCS的DMEM培養基，細胞培養24小時。24小時後，棄去條件培養基，細胞用PBS(-)洗滌兩次，然後用ISOGEN(Nippongene)洗滌，按照使用說明由每種病毒感染的細胞製備RNA。
用於Northern印跡分析的探針如下獲得以粘粒載體pAxcw(同上文)為模板，利用BcaBESTTM標記試劑盒(Takara Shuzo)以[α-32P]dCTP標記PCR擴增的DNA。用於PCR的引物序列如下所示(括號中的數值表示5型腺病毒的鹼基數和序列數)L15′-引物 5′-ACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACA-3′(12,818-12,842/序列 3)3′-引物 5′-CGGCCGCGCGATGCAAGTAGTCCAT-3′(13,440-13,416/序列 4)L25′-引物 5′-AGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACG-3′(15,098-15,122/序列 5)3′-引物 5′-ATGCCCAGGGCCTTGTAAACGTAGG-3′(15,834-15,810/序列 6)L35′-引物 5′-GGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAA-3′(21,735-21,759/序列 7)
3′-引物5′-CTGCGCACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3′(22,305-22,281/序列 8)L55′-引物5′-GACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAA-3′(31,484-31,508/序列 9)3′-引物5′-GCCAAACAGCCTTTAACAGCCAAAA-3′(32,378-32,354/序列 10)pIX5′-引物 5′-ATGAGCACCAACTCGTTTGATG-3′(3,609-3,630/序列 11)3′-引物5′-TGTTTTAAACCGCATTGGGAGGGGA-3′(4,035-4,011/序列 12)Iva25′-引物 5′-AAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGA-3′(4,554-4,577/序列 13)3′-引物5′-TGTGGGACCGCCTGGAACTGCTTG-3′(5,181-5,158/序列 14)E45′-引物5′-GGCAGTGGTCTCCTCAGCGA-3′(33,301-33,320/序列 15)3′-引物5′-TGAGGAAGTGTATGCACGTG-3′(33,800-33,781/序列 16)E2A5′-引物 5′-TGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTA-3′(22,769-22,798/序列 17)3′-引物5′-GTATGCGGACGCAAGAGGAAGAGGAAGAGC-3′(23,584-23,555/序列 18)
各5μg RNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，用毛細管轉移法在尼龍濾紙(Hybond-N+，Amersham)上印跡，然後進行紫外線交聯。用0.02％亞甲基藍溶液使濾紙染色，證實28S和18S RNA的位置，加入50ml緩衝液A(0.5M Na2HPO4(pH7.2)7％SDS/1mM EDTA)，在65℃下預雜交2小時。然後向濾紙添加含有12.5ng32P-標記探針的50ml緩衝液A，在65℃下雜交過夜。此外，還加入200ml緩衝液B(40mMNa2HPO4(pH7.2)/1％SDS)，在65℃下洗滌濾紙兩次後，進行放射自顯影。
(3)結果Northern印跡結果示於圖4A-C中，結果概述示於表1中。對於A549細胞，由腺病毒主要晚期啟動子(MLP)控制的主要晚期基因(如含六鄰體的L3基因)在Axlwl感染的細胞中的表達比在AxCAwt感染的細胞中明顯降低，在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中類似地降低(圖4A)。此外，對於HepG2細胞，L3基因的表達只在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中降低。儘管數據未顯示，但其它主要晚期基因(如L2基因和L5基因)的結果類似於L3基因，對於這些晚期基因，沒有注意到CAG啟動子對表達的誘導。
儘管在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中，E2A基因的表達自然降低，但是在Axlwl感染的細胞和AxCAwt感染的細胞中，E2A基因的表達沒有差異，在這兩種病毒感染的細胞中E2A基因以相似的水平表達。E4基因的表達在所有載體感染的細胞中都沒有差異，E4基因在所有病毒感染的細胞中均以相似的水平表達(數據未顯示)。因此證明，E2A基因的表達和E4基因的表達都不是由CAG啟動子誘導的。
對於HepG2細胞，IVa2基因(是一種不受MLP控制的晚早期基因)的表達在Axlwl感染的細胞中和在AxCAwt感染的細胞中沒有差異，在兩種細胞中均程度相似地表達。另一方面，對於A549細胞，IVa2基因的表達只在Axlwl感染的細胞中降低(圖4B)。
L1基因(受MLP控制的晚期基因之一)的表達也類似於IVa2基因，在HepG2細胞和A549細胞中結果不同(見表1)。
另一方面，蛋白IX基因(下文稱為pIX基因，如IVa2基因一樣，是一種不受MLP控制的晚早期基因)的表達在A549細胞和HepG2細胞中得到類似的結果。因此，pIX基因的表達在ΔE2A-CAHGH感染的細胞中不降低，只是在Axlwl感染的細胞中，表達明顯降低(圖4C)。
根據上述結果，在A549細胞中和HepG2細胞中顯示與血清GPT水平改變類似的表達模式，即在AxCAwt-、Ax1CAHGH-和ΔE2A-CAHGH-感染的細胞中的表達幾乎相同，而只在Axlwl感染的細胞中表達降低的基因，是pIX基因。這表明，由CAG啟動子誘導表達並引發炎症的基因是pIX基因。
表1 Northern印跡結果

實施例7CMV啟動子誘導pIX基因表達的證實研究了pIX基因的表達是否由CMV啟動子以類似於CAG啟動子的方式誘導。用重組腺病毒AdCMVlacZ(Osada S.等人，Kidney Int.551234-1240(1999))作為一種插入CMV啟動子的重組腺病毒，其中在5型腺病毒的E1基因缺失位點以朝右的方向插入一個CMV啟動子和大腸桿菌lacZ基因。用實施例6所示的AxCAwt作為插入一個CAG啟動子的對照病毒。
以類似於實施例6所述的方法用AdCMVlacZ或AxCAwt感染A549細胞，24小時後回收RNA。然而，對於AdCMVlacZ，感染的moi為6或2，對於AxCAwt，moi為300或100。Northern印跡分析用實施例6所示的pIX探針進行。
結果示於圖5中。在用AdCMVlacZ以moi＝6感染的細胞中，pIX基因以等於或高於用AxCAwt以moi＝100感染的細胞的水平表達。由於兩種病毒感染時的moi不同，啟動子的插入方向不同，啟動子距pIX基因的距離不同，所以CAG啟動子和CMV啟動子誘導pIX基因表達的強度無法比較。然而，在插入CMV啟動子的AdCMVlacZ感染的細胞中，pIX基因以較低的moi表達，因此揭示，pIX基因的表達也能由CMV啟動子誘導。
實施例8關於SRα啟動子和EF-1α啟動子是否誘導pIX基因表達的研究研究了不含CMV啟動子的外源啟動子是否誘導pIX基因的表達。用於該研究的啟動子是SRα啟動子(Takebe Y.等人，Mol.Cell Biol.8466-472(1988))和EF-1α啟動子(Kim D.W.等人，Gene 91217-223(1990))，和以朝左的方向插入每種啟動子和大腸桿菌lacZ基因的腺病毒載體(AxSRlacZ-L和AxEFlacZ-L)。用只插入CAG啟動子的腺病毒載體AxCAwt(見實施例5)和以朝左的方向插入CAG啟動子和大腸桿菌lacZ基因的腺病毒載體(AxCAlacZ-L)作為陽性對照。Saito等人(日本未審查專利文本(Kokai)號7-298877)公開了構建AxSRlacZ-L、AxEFlacZ-L和AxCAlacZ-L的方法，其中 Adex1SRlacZ-L與AxSRlacZ-L，Adex1EFlacZ-L與AxEFlacZ-L，Adex1CAlacZ-L與AxCAlacZ-L分別相同。用未插入外源啟動子的腺病毒載體Axlwl(見實施例5)作為陰性對照。此外，再次研究了實施例7使用的含CMV啟動子的腺病毒載體(AdCMVlacZ)。
用上述六種腺病毒載體(AxSRlacZ-L、AxEFlacZ-L、AxCAlacZ-L、AdCMVlacZ、AxCAwt、Axlwl)以moi＝30或100感染A549細胞，24小時後回收RNA，用pIX探針進行Northern印跡分析(方法詳見實施例6)。
結果示於圖6中。在用含CMV啟動子的腺病毒載體(AdCMVlacZ)感染的細胞中，pIX基因確實表達，其表達量等於或高於用含CAG啟動子的腺病毒載體(AxCAlacZ-L和AxCAwt)感染的細胞，用作陽性對照。
另一方面，在含EF-1α啟動子的腺病毒載體(AxEFlacZ-L)感染的細胞中，根本未觀察到pIX基因的表達。在含SRα啟動子的腺病毒載體(AxSRlacZ-L)感染的細胞中，觀察到pIX基因的表達。
上述結果證明，外源啟動子引起的pIX基因的表達與啟動子的特異性有關，存在根本不誘導pIX基因表達的外源啟動子，如EF-1α啟動子。此外也證明，誘導pIX基因表達的主要是CMV IE增強子，因為CAG啟動子與CMV啟動子的共同部分只是CMV IE增強子。
實施例9關於含不同啟動子的腺病毒載體誘發炎症能力的研究為了證明外源啟動子對pIX基因表達的誘導與對動物施用腺病毒載體時發生的炎症有關，對C57BL/6小鼠施用了實施例8使用的腺病毒載體中的4種載體(AxEFlacZ-L、AxCAlacZ-L、AdCMVlacZ和Axlwl)，並以血清GPT水平作為指標比較了炎症的程度。
腺病毒以1×109PFU(除了AdCMVlacZ之外)、3×108PFU和1×108PFU通過尾靜脈施用(每組5隻動物)，施用3天前和3、5、7、10、14、21、28、35天後採血，測定GPT水平。每種方法的細節按照實施例3所述的方法進行。
結果顯示於圖7中。在含CMV啟動子的AdCMVlacZ處理的小鼠中，血清GPT水平升高超過含CAG啟動子的AxCAlacZ-L處理的小鼠，炎症程度與實施例8所示的pIX基因表達量相關。另一方面，在含EF-1α啟動子的AxEFlacZ-L處理的小鼠中，血清GPT水平幾乎沒有升高，與不含外源啟動子的Axlwl處理的小鼠水平相同。
上述結果證明，pIX基因的表達與體內施用後的炎症直接相關，即不能誘導pIX基因表達的含有一種啟動子的腺病毒載體也不能誘發炎症，外源啟動子誘導pIX基因表達是炎症的原因。
實施例10抗-pIX抗體的製備和蛋白IX的檢測(1)蛋白IX(pIX)基因的克隆為了通過PCR方法克隆5型人類腺病毒(Ad5)pIX基因的編碼區，進行下列方法。用上述粘粒載體pAxCw作為模板，用具有下列序列的引物進行PCR反應。設計5』-引物使之包含Ad5位點3585-3605的核苷酸序列和一個EcoRI識別位點，設計3』-引物使之包含Ad5位點4034-4015的鹼基序列和一個XhoI識別位點。
5′-端引物5′-TAGAATTCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCC-3′(SEQ ID NO19)EcoRI3′-端引物5′-TACTCGAGGTTTTAAACCGCATTGGGAG-3′(SEQ ID No.20)XhoI 終止用Pfx DNA聚合酶(GIBCO BRL)進行PCR反應，擴增含有pIX基因編碼區的470bp DNA片段。市售質粒載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen)在CMV啟動子下遊含有一個多克隆位點。用EcoRI和XhoI共消化PCR擴增的470bp DNA片段，然後插入pcDNA3.1(+)多克隆位點的EcoRI位點與XhoI位點之間，獲得一種表達pIX的質粒pCMV-IX(5.9kb)。通過對該pCMV-IX的含pIX基因編碼區的部分測序，證實其序列與現有序列(GenBank保藏號M73260)相同。
(2)pIX-融合蛋白的製備製備pIX與穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白，作為用來獲得抗-pIX抗體的抗原。
1)pIX-融合蛋白的表達質粒的構建用EcoRI和XhoI共消化質粒pCMV-IX，獲得含有pIX基因的470kb DNA片段。構建用來在大腸桿菌中表達GST-融合蛋白的市售質粒載體pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech)在GST的C端含有一個多克隆位點。於是，將由pCMV-IX獲得的470bp DNA片段插入pGEX-5X-1多克隆位點的EcoRI位點與XhoI位點之間，獲得表達GST-pIX的質粒pGST-IX(5.4kb)。
2)pIX-融合蛋白的製備用質粒pGST-IX轉化大腸桿菌JM109株。由於轉化子表達的GST-pIX是可溶的，所以按照用於包涵體蛋白質的純化方法純化GST-pIX。首先，在40ml LB培養基中37℃過夜培養轉化的大腸桿菌，之後加入800ml LB培養基，再培養1小時。加入IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)(終濃度為0.2mM)培養6小時後，收集細胞。細胞用PBS洗滌，懸浮於20ml含有溶菌酶(1mg/ml)的裂解緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA/100mM NaCl)中，室溫溫育20分鐘，然後加入1ml含10％去氧膽酸鈉的裂解緩衝液裂解細胞。然後向裂解液中加入100μl 1M MgCl2溶液、100μl 1M MnCl2溶液和20μl DNase I溶液(70U/μl)，在37℃下溫育15分鐘，之後離心(11850×g)15分鐘。離心後，棄去上清液，沉澱用20ml含0.5％Triton X-100/10mM EDTA的裂解緩衝液洗滌兩次，然後將沉澱懸浮於1ml PBS中。溶液中加入等量的6M尿素，室溫溫育1小時，之後離心(11850×g)15分鐘。離心後，棄去上清液，沉澱懸浮於2ml PBS中。溶液中加入6ml 8M鹽酸胍(終濃度為6M)，離心(11850×g)15分鐘後，回收上清液。用該上清液作為純化的GST-pIX，製備抗-pIX抗體。
(3)抗-pIX抗體的製備用含有6M鹽酸胍的純化GST-pIX免疫兔(日本白兔)。
免疫和採血參見Asahi Techno Glass Corporation。用0.2-0.4mg抗原(GST-pIX)免疫兩隻兔子，每兩周5次。第四次免疫一周後，部分採血，用ELISA法證實抗GST-pIX抗體的效價充分提高，第五次免疫一周後，採集全血獲得抗血清(#1和#2)。
然後通過Western印跡分析證實，該抗血清可與pIX反應。用下列兩種樣品作為含有pIX的陽性對照。一種是用來源於5型腺病毒野生株(Ad5-DixSaito I.等人，J.Virol.54711-719(1985))的病毒以moi＝10感染A549細胞約一天後回收的細胞，其中只有E3基因缺失，另一種是純化的腺病毒顆粒。用未用腺病毒感染的A549細胞作為陰性對照。
每種樣品都在還原條件下進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然後印跡到硝酸纖維素膜(Hybond ECL，AmershamPharmacia Biotech)上。該膜用5％脫脂奶封閉，加入1000倍稀釋的抗血清或免疫前血清，在4℃下溫育過夜。洗滌該膜後，加入辣根過氧化物酶偶聯的F(ab』)2片段猴抗-兔Ig抗體(Amersham PharmaciaBiotech，目錄號NA9340)，室溫溫育1小時。另外，在洗滌該膜後，加入化學發光檢測試劑(ECL Plus檢測試劑，Amersham PharmaciaBiotech)，使該膜暴露於X-射線膠片。
在兩種抗血清中，例如，抗血清#1的結果顯示於圖8中。當使用免疫後的抗血清時，在加樣Ad5-dIX感染的細胞和純化病毒顆粒的道中清楚地檢測到對應於pIX的分子量的約14kDa帶，而在加樣未用病毒感染的A549細胞的道中未檢測到這條帶。另外，當使用免疫前血清時，在任何道中根本未檢測到這條14kDa帶。#2抗血清獲得類似的結果，數據未顯示。上述結果證實，用這些抗血清檢測到的14kDa帶來源於pIX。因此，在下列實驗中用這些抗血清作為抗-pIX抗體。
(4)由CAG啟動子誘導表達的pIX的檢測在實施例6-8中，通過Northern印跡分析證明CAG啟動子誘導pIX RNA的表達。因此，通過Western印跡分析研究了pIX的表達是否不僅能在RNA水平上誘導，而且能在蛋白質水平上誘導。
用只插入CAG啟動子的腺病毒載體AxCAwt(見實施例5)或無外源啟動子插入的腺病毒載體Axlwl(見實施例5)以moi＝100感染A549細胞，一天後收集細胞。用Ad5-dIX以moi＝10感染並在一天後回收的A549細胞作為陽性對照。在類似於上述(3)所述的方法中，進行Western印跡分析以用抗-pIX抗體(#1)檢測pIX。如圖9所示，在AxCAwt感染的細胞以及Ad5-dIX感染的細胞中檢測到14kDa的pIX。另一方面，在Axlwl感染的細胞中根本未觀察到這條14kDa帶。這證實，CAG啟動子也在蛋白質水平上誘導pIX的表達。
實施例11pIX重新定位的腺病毒載體的構建pIX重新定位的腺病毒載體通過下列步驟(1)-(3)構建(1)在E4基因上遊區與3』端ITR之間插入pIX基因的重組腺病毒載體(Ax4pIX)的構建為了克隆包含5型人類腺病毒(Ad5)全長pIX基因的區域，進行下列方法。用含有5型腺病毒基因組除E1基因和E3基因外的大部分的粘粒載體pAxcw(同上文)作為模板，用下列引物進行PCR反應。向每條引物中添加限制酶識別位點。5′-端引物5′-CCTGAATTCGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTA-3′EcoRIRsaI(SEQ ID NO21)(Ad53513-3536)
3′-端引物5′-CCTGGATCCGTACATTAATTGCTTGATCCAAATCCAAACAG-3′BamHI RsaIAseI(SEQ ID No.22)(Ad54076-4054)用EcoRI和BamHI共消化含有PCR擴增的pIX基因的約0.6kbDNA片段，然後插入市售質粒pUC19多克隆位點的EcoRI位點與BamHI位點之間，獲得質粒pUCfpIX(3.3kb)。通過對該pUCfpIX含pIX基因的插入部分測序，證實其序列與現有序列(GenBank保藏號M73260)相同。
然後，為了構建在E4基因上遊區與3』端ITR之間插入pIX基因的粘粒載體，進行下列方法。粘粒載體pAx4w是一種含有5型腺病毒基因組的2.6-98.0m.u.(E3基因缺失)和2型腺病毒基因組的98.0-100m.u.的載體，在E4基因啟動子上遊區與3』端ITR之間(99.3m.u.)含有一個克隆位點，限制酶SwaI位點(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)，在該參考文獻中pAx4w稱為pAdex4w)。用RsaI消化質粒pUCfpIX，獲得含有pIX基因的約0.6kbDNA片段。將該0.6kb DNA片段插入粘粒載體pAx4w的SwaI位點，獲得粘粒pAx4pIXL和pAx4pIXR。在pAx4pIXL中pIX基因以朝左的方向插入，在pAx4pIXR中pIX基因以朝右的方向插入。
最後，為了構建在E4基因上遊區與3』端ITR之間插入pIX基因的重組腺病毒，進行下列方法。重組腺病毒載體Adex4SRlaczL(見Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)和圖10)是一種複製缺陷型腺病毒載體，它來源於5型腺病毒(E1A基因和E3基因缺失)，在99.3m.u.位點以朝左的方向插入大腸桿菌lacZ基因的表達單元。由Adex4SRlaczL製備腺病毒DNA-末端蛋白複合物(DNA-TPC)，然後用限制酶AseI和EcoRI共消化該DNA-TPC。由於在Adex4SRlaczL的基因組DNA中，在含有lacZ基因表達單元的右半段基因組中含有幾個AseI和EcoRI位點，用這兩種酶消化Adex4SRlaczL的DNA-TPC產生基因組右半段已經被消化的DNA-TPC。用這種限制酶消化的DNA-TPC和粘粒pAx4pIXL或pAx4pIXR轉化293細胞。通過用限制酶BspEI和PmlI消化產生的重組腺病毒的基因組DNA，鑑定目的病毒克隆，並獲得重組腺病毒pAx4pIXL或pAx4pIXR(圖10)，其中Adex4SRlaczL的大腸桿菌lacZ基因的表達單元被替換為pIX基因。pAx4pIXL和pAx4pIXR是在兩個位點(pIX基因的原始位點(9.7-11.2m.u.)和E4基因上遊區與3』端ITR之間)處含有pIX基因的重組腺病毒。pAx4pIXL與pAx4pIXR的結構差異只是E4基因與ITR之間的pIX基因插入方向，pAx4pIXL是pIX基因以朝左的方向插入的重組腺病毒，而pAx4pIXR是pIX基因以朝右的方向插入的重組腺病毒。
(2)含有E1A、E1B和pIX基因缺失的腺病毒載體基因組的粘粒載體(pAxΔpIXcw)的構建為了構建含有5型腺病毒基因組左端17％(含pIX基因)的質粒，進行下列方法。上述粘粒載體pAx4w(圖11)是一種含有5型腺病毒基因組除E1基因(Δ454-3328)和E3基因(Δ28592-30470)之外的大部分的載體。用HindIII和EcoRV消化pAxcw，用Klenow酶使其成為平端，之後自身連接，獲得質粒pAx17cw(6.5kb圖11)。pAx17cw是含有5型腺病毒左端除E1基因之外的大約17％(1-453，3329-6241)的一種質粒。
為了由pAx17cw構建pIX基因缺失的質粒，製備下列三條DNA片段(a)-(c)(a)用SwaI和XhoI消化pAx17cw獲得的，不含pIX基因的約4.0kb DNA片段，(b)用AlwNI和XhoI消化pAx17cw獲得的，對應於5型腺病毒基因組位點4054-5788的約1.7kb DNA片段，(c)設計含有SwaI消化的片段-ClaI識別位點-SalI識別位點-NruI識別位點-AlwNI消化的片段的雙鏈DNA片段，其通過磷酸化含有下列序列的合成DNA的5』端，然後使其退火獲得(SwaI)ClaISalINruI(A1wNI)5′-AAATCGATT GTCGAC TCGCGA CAGACT-3′ (SEQ ID NO23)3′-TTTAGCTAA CAGCTG AGCGCT GTC-5′(SEQ ID NO24)連接上述三條片段(a)、(b)和(c)，獲得質粒pAx17ΔpIXcw(5.8kb；圖11)，其中E1A、E1B和pIX基因缺失(Δ454-4053)。
然後，為了構建粘粒載體pAx4w的BamHI位點與BstZ17I位點之間的序列已被替換為質粒pAx17ΔpIXcw的BamHI位點與BstZ17I位點之間的序列的粘粒載體，製備下列三條DNA片段(d)-(f)(d)用BamHI和BstZ17I消化pAx17ΔpIXcw獲得的，含有一個SwaI識別位點的約2.2kb DNA片段，(e)用BamHI和Csp45I消化pAxcw獲得的，不含腺病毒基因組DNA的約10kb DNA片段，(f)用Csp45I和BstZ17I消化pAxcw獲得的，含有腺病毒基因組DNA的約30kb DNA片段。
連接上述三條片段(d)、(e)和(f)，獲得粘粒載體pAxΔpIXcw(41.8kb；圖11)，其含有E1A、E1B和pIX基因缺失的腺病毒基因組。
最後，為了構建在粘粒載體pAΔpIXcw的E1A、E1B和pIX基因缺失位點插入人生長激素(hGH)表達單元的粘粒載體，進行下列方法用限制酶PmeI消化含有hGH表達單元(其中hGH DNA連接於CAG啟動子下遊)的粘粒pAx1CAHGH(實施例1)，獲得含有hGH表達單元的約3.0kb DNA片段。將該DNA片段插入粘粒載體pAΔpIXcw的SwaI位點，獲得粘粒pAΔpIXCAHGH(44.8kb圖11)。
(3)蛋白IX重新定位的腺病毒載體的構建為了通過(1)所述的重組腺病毒Ax4pIXL或Ax4pIXR與(2)所述的粘粒載體pAxΔpIXCAHGH之間的同源重組構建蛋白IX重新定位的腺病毒載體，進行下列方法。由Ax4pIXL和Ax4pIXR製備腺病毒DNA-TPC，然後用限制酶EcoT22I消化每種DNA-TPC。由於在Ax4pIXL和Ax4pIXR基因組DNA的左半段含有幾個EcoT22I位點，EcoT22I消化產生基因組左半段已被消化的DNA-TPC。用EcoT22I消化的Ax4pIXR和粘粒pAxΔpIXCAHGH轉化293細胞。通過用限制酶(XhoI、NruI、BspEI等)消化產生的重組腺病毒的基因組DNA，鑑定目的病毒克隆。結果能夠獲得pIX重新定位的腺病毒載體(AxRpIXRCAHGH，圖10)，其中在pIX基因的原始位點(9.7-11.2m.u.)不含pIX基因，pIX基因重新定位到E4基因上遊區與3』端ITR之間。類似地，用EcoT22I消化的Ax4pIXL和粘粒pAxΔpIXCAHGH的DNA-TPC轉化293細胞，也能獲得pIX重新定位的腺病毒載體(AxRpIXLCAHGH，圖10)。AxRpIXRCAHGH與AxRpIXLCAHGH的結構差異只是pIX基因的插入方向，AxRpIXRCAHGH是pIX基因以朝右的方向插入的重組腺病毒，而AxRpIXLCAHGH是pIX基因以朝左的方向插入的重組腺病毒。
實施例12表達pIX的細胞系的構建為了用於生產pIX缺失的腺病毒載體，轉化293細胞，構建表達pIX的細胞系。
使用實施例10-(1)中構建的表達pIX的質粒pCMV-IX，用lipofection法(FuGENETM6轉染試劑Roche Diagnostics Corp.)轉化293細胞。由於pCMV-IX中已經插入新黴素抗性基因，轉化3天後將培養基替換為含有600μg/ml硫酸G418(遺傳黴素GIBCO BRL)的培養基，轉化的細胞再培養13天後，克隆這些細胞。對G418抗性細胞系中的任意10個克隆，通過Northern印跡分析檢測pIX基因的表達。結果證實，pIX基因在4個克隆中表達(#2、#5、#6、#10)。於是，為了檢測這4個克隆中pIX基因表達的穩定性，將這4個克隆傳代培養到第30代，期間每5代製備一次RNA，通過Northern印跡分析證實pIX基因的表達(圖12)。結果證實，所有4個克隆，至少到第30代，pIX基因仍能穩定表達，但是不同克隆的pIX基因的表達量不同。
此外，利用第25代的細胞，在蛋白質水平上證實了pIX的表達，也用實施例10-(3)所述的Western印跡分析證實。在該實驗和圖12的實驗中，用未插入外源啟動子的腺病毒載體Axlwl感染的293細胞作為陽性對照。甚至在用Axlwl感染不表達腺病毒E1A或E1B基因的細胞(如A549細胞)時，pIX在RNA水平(圖4，圖6)或蛋白質水平(圖9)上幾乎不表達。然而，當用Axlwl感染表達E1A和E1B基因的293細胞時，它們相當於E1基因缺失的第一代腺病毒載體的普通複製循環，表達足量的pIX。如圖13所示，在蛋白質水平上證實所有4個克隆都表達pIX，但是表達量略低於Axlwl感染的293細胞的pIX表達量。
上述結果清楚地表明，獲得了表達pIX的細胞系的4個克隆(#2、#5、#6、#10)，它們組成並且穩定地表達pIX。
實施例13pIX缺失的腺病毒載體的構建為了通過實施例5所用的腺病毒載體AxCAwt與pIX缺失的粘粒載體pAxΔpIXCAHGH之間的同源重組構建pIX缺失的腺病毒載體，進行下列方法由AxCAwt製備腺病毒DNA-TPC，然後用EcoT22I消化。用這種DNA-TPC和粘粒載體pAxΔpIXCAHGH轉化293細胞或實施例12所述的表達pIX的細胞系。通過用限制酶(ClaI、NruI、SalI等)消化產生的重組腺病毒的基因組DNA，鑑定目的病毒克隆，並能獲得pIX缺失的腺病毒載體AxΔpIXCAHGH(圖10)。AxΔpIXCAHGH是一種來源於5型腺病毒的重組腺病毒，其中E1A、E1B和pIX基因缺失(Δ454-4053)，E3基因也缺失(Δ28592-30470)。
當通過轉化表達pIX的細胞系獲得pIX缺失的腺病毒載體時，表達pIX的細胞系用於病毒的大規模傳代和製備。另一方面，當通過轉化293細胞獲得pIX缺失的腺病毒載體時，表達pIX的細胞系用於病毒的大規模製備。
然後純化pIX缺失的腺病毒載體，製備病毒顆粒，利用抗-pIX抗體通過Western印跡分析證實病毒顆粒中存在正常含量的pIX蛋白。
實施例14關於施用pIX重新定位的腺病毒載體和pIX缺失的腺病毒載體是否引發炎症的研究為了證實pIX重新定位的腺病毒載體和pIX缺失的腺病毒載體的炎症減輕，如實施例3和5所述，通過測定血清GPT水平作為炎症的指標，進行體內實驗。測試的腺病毒載體如下—表達hGH的pIX重新定位的腺病毒載體AxRpIXRCAHGH、AxRpIXLCAHGH(實施例11)—表達hGH的pIX缺失的腺病毒載體AxΔpIXRCAHGH(實施例13)—表達hGH的第一代腺病毒載體Ax1CAHGH(實施例13)—無外源基因插入的第一代腺病毒載體Axlwl(實施例5)包括小鼠株和腺病毒載體劑量的實驗方法根據實施例3所述的方法進行。
結果如實施例3和5所述，施用Ax1CAHGH的小鼠，血清GPT水平顯著升高。然而，施用AxRpIXRCAHGH、AxRpIXLCAHGH和AxΔpIXCAHGH的小鼠，如同施用Axlwl的小鼠一樣，血清GPT水平根本不升高。上述結果表明，甚至在體內施用時，pIX重新定位的腺病毒載體和pIX缺失的腺病毒載體幾乎不引發炎症。
工業用途本發明能提供高度安全的用於基因治療的腺病毒載體，使病毒蛋白的表達受到抑制，炎症減輕。
權利要求
1.一種重組腺病毒載體，其體內施用過程中的炎症減輕，該載體具有下列特徵(1)-(4)(1)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(2)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；(3)具有下列特徵(A)和/或(B)(A)由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組的基因從正常位置重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置，或者該基因缺失；和(B)由外源啟動子誘導表達的腺病毒基因組基因啟動子的核苷酸序列被置換，以致不受外源啟動子的作用；和(4)形成與腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒顆粒。
2.根據權利要求1的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組的啟動子是MLP和/或IVa2基因啟動子。
3.根據權利要求1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特徵(5)-(8)(5)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(6)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；(7)腺病毒基因組的蛋白IX基因從正常位置重新定位到不受外源啟動子誘導表達的位置；和(8)含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
4.根據權利要求1-3中任意一項的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因。
5.根據權利要求1-4中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因之外的至少一種基因全部或部分缺失。
6.根據權利要求3-5中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失。
7.根據權利要求1-6中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失。
8.根據權利要求1-7中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失。
9.根據權利要求1-8中任意一項的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個ORF。
10.根據權利要求9的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3。
11.根據權利要求10的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失。
12.根據權利要求3-11中任意一項的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子18kb或更遠的位置。
13.根據權利要求12的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於腺病毒基因組L3基因與E2A基因之間。
14.根據權利要求3-11中任意一項的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子24kb或更遠的位置。
15.根據權利要求14的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於腺病毒基因組的E3基因缺失位點。
16.根據權利要求3-11中任意一項的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於距外源啟動子30kb或更遠的位置。
17.根據權利要求16的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位於腺病毒基因組的E4基因上遊區與3』端ITR之間。
18.根據權利要求1-17中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有來自哺乳動物和/或動物病毒的元件。
19.根據權利要求18的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有CMV增強子。
20.根據權利要求19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CMV啟動子。
21.根據權利要求19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CAG啟動子。
22.根據權利要求18的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種RSV啟動子或SRα啟動子。
23.根據權利要求18的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體。
24.根據權利要求23的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒。
25.根據權利要求1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特徵(9)-(11)(9)腺病毒基因組的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；(10)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；和(11)含有含量類似於腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
26.根據權利要求25的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失。
27.根據權利要求25或26的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點或E3基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因。
28.根據權利要求25-27中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因、E3基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失。
29.根據權利要求25-28中任意一項的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失。
30.根據權利要求25-29中任意一項的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個ORF。
31.根據權利要求30的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3。
32.根據權利要求31的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失。
33.根據權利要求25-32中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有來自哺乳動物和/或動物病毒的元件。
34.根據權利要求33的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有CMV增強子。
35.根據權利要求34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CMV啟動子。
36.根據權利要求34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種CAG啟動子。
37.根據權利要求33的重組腺病毒載體，其中該外源啟動子是一種RSV啟動子或SRα啟動子。
38.根據權利要求25-37中任意一項的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體。
39.根據權利要求38的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒。
40.一種來源於哺乳動物的細胞，其具有下列特徵(12)和(13)(12)表達腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；(13)能使根據權利要求25-39中任意一項的重組腺病毒載體繁殖。
41.根據權利要求40的細胞，其中腺病毒的蛋白IX基因的表達受該基因原始啟動子之外的外源啟動子調節。
42.根據權利要求40或41的細胞，其進一步表達除腺病毒的E1基因和蛋白IX基因之外的至少一種腺病毒基因。
43.根據權利要求42的細胞，其表達腺病毒的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因。
44.一種生產根據權利要求25-39中任意一項的重組腺病毒載體的方法，其中使用根據權利要求40-43中任意一項的細胞。
45.一種重組腺病毒載體，其體內施用過程中的炎症減輕，該載體具有下列特徵(14)和(15)(14)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；和(15)腺病毒基因組中插入一種不能誘導腺病毒基因表達的外源啟動子。
46.根據權利要求45的重組腺病毒載體，其具有下列特徵(16)-(18)(16)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(17)腺病毒基因組的蛋白IX基因在原始位置處保留；和(18)腺病毒基因組中插入一種不誘導蛋白IX基因表達的外源啟動子。
47.根據權利要求45或46的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因。
48.根據權利要求45-47中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子不含CMV啟動子。
49.根據權利要求45-48中任意一項的重組腺病毒載體，其中以朝左的方向插入含外源啟動子的外源基因。
50.根據權利要求45-49中任意一項的重組腺病毒載體，其中外源啟動子是一種EF1α啟動子。
51.一種重組腺病毒載體，其體內施用過程中的炎症減輕，該載體具有下列特徵(19)-(21)(19)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(20)腺病毒基因組中插入含外源啟動子的外源基因；和(21)在外源啟動子與腺病毒基因之間插入具有抑制外源啟動子誘導腺病毒基因表達的特性的鹼基序列。
52.根據權利要求51的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點插入含外源啟動子的外源基因。
53.根據權利要求51或52的重組腺病毒載體，其中外源啟動子含有CMV增強子。
54.一種藥用組合物，它在體內施用過程中可減輕或不誘發炎症，含有一種選自權利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體作為活性成分。
55.一種減輕體內施用過程中的炎症的方法，其中對哺乳動物施用一種選自權利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體。
56.一種減輕體內施用過程中的炎症的基因治療方法，其中對哺乳動物施用一種選自權利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體。
57.選自權利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用於生產在體內施用過程中可減輕或不誘發炎症的藥用組合物。
58.選自權利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用於生產在基因治療中使用的藥用組合物，它在體內施用過程中可減輕或不誘發炎症。
全文摘要
本發明提供一種新型腺病毒載體，其通過抑制插入腺病毒基因組中的外源啟動子誘導腺病毒基因表達，能減輕體內施用該載體期間的炎症，還涉及一種生產該載體的方法，用於生產該重組腺病毒載體的一種細胞系，或應用該重組腺病毒載體的一種基因治療方法。
文檔編號A61K48/00GK1439055SQ01811685
公開日2003年8月27日 申請日期2001年5月24日 優先權日2000年5月26日
發明者中井通雄, 小宮和雄, 村田真志, 東藤直樹, 齊藤泉 申請人:住友製藥株式會社