人類17p13.3區域內人腫瘤相關基因CT120及其編碼蛋白的製作方法

2023-12-09 04:45:31 1

專利名稱：人類17p13.3區域內人腫瘤相關基因CT120及其編碼蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的位於人17號染色體短臂1區3帶3亞帶(17p13.3)的編碼人腫瘤相關蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。
背景技術：
惡性腫瘤的死亡率在我國僅次於心、腦血管疾病名列第二。人們普遍認為腫瘤是多因子，多步驟引起的疾病。
腫瘤的發生與發展實質是一個克隆演化過程。在此過程中伴隨一系列細胞核內遺傳物質的改變，包括序列改變如點突變，缺失，插入；結構畸變，如大範圍缺失，重排，基因擴增。越來越多的證據表明，在克隆演化過程中的不同階段存在不同基因的激活和/或失活及其複雜的相互作用。因此，分離與鑑定腫瘤相關基因，可以加深人們對腫瘤發生機制的深入理解並有助於對腫瘤的預防、診斷、治療與預後。
肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種在亞洲人群中高發的惡性腫瘤，對於HCC發生的分子機制，腫瘤生物學家20世紀90年代初期前後，許多實驗室即已陸續注意到HCC患者在染色體17p13.3區段存在著雜合性丟失(Fujimoriet al.Cancer Res.1991，5189-93；Boige et al，Cancer Res.1997，571986-1990；Nagai etal，Oncogene，1997，142927-2933)；幾乎在同一時期，上海市腫瘤研究所的實驗室也發現，在中國人群肝癌患者中，在染色體17p13.3區段內存在著高頻率的染色體雜合性丟失，由此提示在染色體17p13.3高頻率雜合性缺失區內可能還存在著一個或幾個其它的抑癌基因，有別於位於17p13.1區的p53抑癌基因，在肝癌的發生發展過程中起重要作用。隨後，在肝癌患者中，該實驗室首先在國際上確定了該雜合性缺失的最小範圍為0.5Mb(Wang et sl，GenesChromosomes Cancers，2001，31221-227)。
由於癌症是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來越關注腫瘤的早期診斷和基因治療。因此，本領域迫切需要開發研究新的癌症相關的人蛋白及其激動劑/抑制劑。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的腫瘤相關蛋白-人CT120蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種分離的人CT120蛋白多肽，它包括具有SEQID NO2所示胺基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進NIH/3T3細胞生長功能的由(a)衍生的多肽。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列；更佳地，該多核苷酸具有選自下組的序列SEQ ID NO1中所示的編碼區序列(第91-861位)或全長序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備腫瘤相關CT120蛋白活性的多肽的製備方法，該方法包含(a)在適合表達蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有腫瘤相關CT120蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的腫瘤相關CT120蛋白多肽特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的20-150個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的腫瘤相關CT120蛋白的拮抗劑(如反義序列或抗體)以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌症以及細胞異常增殖等病症。
在本發明的第七方面，提供了一種檢測肺細胞是否發生癌變或存在癌變易感性的方法，包括步驟檢測肺細胞樣品中是否有CT120轉錄本，存在CT120轉錄本就表示該肺細胞發生癌變或存在癌變易感性；或者檢測肺細胞樣品中是否存在CT120蛋白，存在CT120打靶就表示該肺細胞發生癌變或存在癌變易感性。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測肺癌的試劑盒，它包括(1)特異性擴增人CT120基因的引物對，或(2)特異性與CT120蛋白結合的抗體。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了CT120與四種同源物的多序列比對結果。
圖2顯示了CT120的多組織膜片Northern雜交結果。其中，各泳道如下1.心；2.腦；3.胎盤；4.肺；5.肝；6.骨骼肌；7.腎；8.胰。
圖3顯示了CT120在不同腫瘤組織中的表達(RT-PCR)情況。各泳道如下1.SPC-A-1；2.C-33A；3.SMMC-7721；4.BEL-7402；5.SK-OV-3；6.5637；7.A431；8.MCF-7。
圖4顯示了CT120轉染NIH/3T3細胞結果。
圖5顯示了Western印跡檢測CT120在穩定轉染細胞系中的表達泳道1-6分別代表6個克隆。
圖6顯示了免疫組織化學檢測CT120在肺癌及癌旁組織中的表達。A 肺癌組織；B 肺癌癌旁組織。
具體實施例方式
在肝癌的研究中，本發明人首先確定了肝癌組織在17p13.3範圍內有高頻率LOH(60-100％)。最近，通過對肝癌全基因組掃描也證明17p13.3是LOH的最高區域。本發明人對人17號染色體短臂13.3位點的癌相關表達序列(EST)進行了分離和全長克隆。用對應於17p13.3區段內926位點的噬菌體人工染色體(PAC)579號(P579)克隆，通過九倍鳥槍法(shotgun)測序得到其序列，應用計算機分析在其中找到1個代表新基因的EST，通過RACE方法獲得全長核苷酸序列和編碼的胺基酸，命名為CT120。Northern、Southern雜交等實驗證實，CT120在肺癌及癌旁組織中的表達肺癌細胞中高表達，癌旁組織幾乎不表達。這表明CT120與腫瘤相關，體外實驗證明對小鼠NIH/3T3細胞具有促進細胞轉化功能。因此，CT120基因是一種侯選癌基因，可應用於腫瘤的診斷、治療和預後。
如本文所用，術語「CT120蛋白」、「CT120多肽」、「腫瘤相關CT120蛋白」或「腫瘤相關蛋白CT120」可互換使用，都指具有人腫瘤相關蛋白CT120胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。該術語還包括含有或不含起始甲硫氨酸的腫瘤相關蛋白CT120。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的腫瘤相關CT120蛋白或多肽」，「分離的CT120蛋白或多肽」是指腫瘤相關CT120蛋白多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化CT120蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。CT120蛋白多肽的純度能用胺基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括腫瘤相關的人CT120蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然腫瘤相關人CT120蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「人腫瘤相關蛋白CT120多肽」或「人NIP2 AP蛋白多肽」可互換使用，都指具有人腫瘤相關蛋白CT120活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人腫瘤相關蛋白CT120相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人腫瘤相關蛋白CT120的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人腫瘤相關蛋白CT120 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人腫瘤相關蛋白CT120多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人腫瘤相關蛋白CT120多肽或其片段的融合蛋白(如包含SEQ ID NO2所示序列的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人腫瘤相關蛋白CT120多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人腫瘤相關蛋白CT120多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供人腫瘤相關蛋白CT120或多肽的類似物。這些類似物與天然人腫瘤相關蛋白CT120多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人腫瘤相關蛋白CT120保守性變異多肽」指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表A

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列(第91-861位)相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼CT120蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離DNA。這些技術包括但不局限於1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特徵的克隆的DNA片段。
編碼CT120蛋白的特異DNA片段序列產生也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。當需要的多肽產物的整個胺基酸序列已知時，DNA序列的直接化學合成是經常選用的方法。如果所需的胺基酸的整個序列不清楚時，DNA序列的直接化學合成是不可能的，選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA並進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法。還可得到商業供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限於)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標誌基因的功能出現或喪失；(3)測定CT120蛋白的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2kb之內，較佳地為1kb之內。此處所用的探針通常是在本發明的基因DNA序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測CT120蛋白基因表達的蛋白產物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉澱法，酶聯免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段等的核苷酸序列的測定可用常規方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或CT120蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的CT120蛋白多肽(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼腫瘤相關人CT120蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，腫瘤相關的人CT120蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含CT120蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可包被於細胞內、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發明人研究已表明，在正常肺組織中，CT120不表達，而在發生癌變的肺細胞中，CT120表達。因此，可通過檢測CT120轉錄本或蛋白來檢測肺癌。
因此，本發明重組的人腫瘤相關CT120蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)篩選促進或對抗CT120蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用於抑制CT120蛋白的功能。用表達的重組CT120蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激CT120蛋白功能的多肽分子。
本發明也提供了篩選藥物以鑑定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)CT120蛋白的藥劑的方法。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達CT120蛋白的膜製劑與標記的CT120蛋白一起培養。然後測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
CT120蛋白的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、缺失物和類似物等。CT120蛋白的拮抗劑可以與CT120蛋白結合併消除其功能，或是抑制CT120蛋白的產生，或是與多肽的活性位點結合使多肽不能發揮生物學功能。CT120蛋白的拮抗劑可用於治療用途。
本發明的多肽的拮抗劑(如反義序列和抗體)可直接用於疾病治療，例如，各種惡性腫瘤和細胞異常增殖等，尤其是用於肺癌和肝癌的治療。
本發明的多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞可以用來作為抗原以生產抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過將此多肽直接注射動物的方法得到。製備單克隆抗體的技術包括雜交瘤技術，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。
可以將本發明的多肽或拮抗劑與合適的藥物載體組合後使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩衝液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用於疾病治療。
本發明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由製造、使用或銷售藥品或生物製品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。CT120蛋白以有效地治療和/或預防具體的適應症的量來給藥。施用於患者的CT120蛋白的量和劑量範圍將取決於許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。
CT120蛋白的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於CT120蛋白的表達異常所致的細胞增殖、發育或代謝異常。
抑制CT120蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，並進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析。
本發明還提供了針對CT120蛋白抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限於)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。
抗CT120蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的CT120蛋白。
與CT120蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這种放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用於腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發明中的抗體可用於治療或預防與CT120蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷CT120蛋白的產生或活性。
抗體也可用於設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如CT120蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅CT120蛋白陽性的細胞(如表達CT120的肺癌細胞)。
多克隆抗體的生產可用CT120蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
CT120蛋白單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.PatNo.4946778)也可用於生產抗CT120蛋白的單鏈抗體。
能與CT120蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對CT120蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測CT120蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
CT120蛋白的多聚核苷酸可用於CT120蛋白相關疾病(尤其肺癌)的診斷和治療。在診斷方面，CT120蛋白的多聚核苷酸可用於檢測CT120蛋白的表達與否，或檢測在疾病狀態下CT120蛋白的異常表達。而CT120蛋白DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷CT120蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CT120蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測CT120蛋白的轉錄產物。
檢測CT120蛋白基因的突變也可用於診斷CT120蛋白相關的疾病(尤其是肺癌)。CT120蛋白突變的形式包括與正常野生型CT120蛋白DNA序列(如SEQ IDNO1所示的正常序列)相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的CT120蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明首次證實了CT120在不同腫瘤組織有不同程度的表達，尤其在肺癌中誘導並高表達；體外DNA轉染實驗更證明CT120克隆對NIH/3T3細胞生長具有明顯的促進作用。因此，CT120是一個新的腫瘤相關基因，腫瘤的診斷、治療及預後上具有潛在的應用價值。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1PAC579克隆中新基因的計算預測D17S926位點所在的PAC579(P579)克隆(Genome System公司提供)，經鳥槍法測序得到的DNA序列(在基康公司完成)，用Celera公司生物信息學系統及「Undergo」軟體(Axys Pharmaceuticals)對PAC579基因組序列進行新基因的計算識別與預測，結果顯示有一個新基因，其在PAC579上的位置及預測的外顯子見下表符號 外顯子編號(bp)在PAC579中的位置 鏈外顯子1(122) 50808-50687CT120 外顯子2(169) 45607-45406 -外顯子3(123) 42939-42817外顯子4(599) 42143-41545實施例2新基因CT120全長cDNA的克隆用預測的外顯子序列查詢人EST資料庫，根據返回的EST序列，可以對其進行拼接，獲得一cDNA序列FLJ22282(GenBank No.AK025935)。根據此序列設計引物進行RACE反應。
2.1 所用主要試劑cDNA池(Human kidney Marathon-Ready cDNAs，Clontech)，聚合酶系統(Advantage cDNA polymerase Mix，Clontech)TA克隆系統(TOPO TA cloning)。
2.2 引物設計用於RACE(Rapid amplification of cDNA ends)反應的基因特異引物應符合下列條件(a)長度23-28nt；(b)GC含量50-70％；(c)Tm值大於65℃。設計併合成以下基因特異引物引物120G R 5′GTGCGACTGGCACAAGGACAAAGAG3′(SEQ ID NO3) 5′RACE120QNG R5′CGAATGATGACGATCCCCGAGCC3(SEQ ID NO4) 5′RACE2.3 RACE反應PCR擴增反應可在12.5μl或25μl的反應體積中進行，按下列條件設置RACE反應總體積12.5μlMarathon-Ready cDNAs 1.25μl銜接引物 0.25μl10mM dNTP 0.25μl10×PCR反應緩衝液 1.25μl50×聚合酶混合物 0.25μlH2O 9.0μl基因特異性引物(10pmol/μl) 0.25μlPCR反應條件94℃1分鐘 1循環94℃30秒 5循環72℃4分鐘94℃30秒 5循環70℃4分鐘94℃20秒 25循環68℃4分鐘RACE產物的亞克隆取回收的PCR產物0.5-2.5μl，加PCR-TOPO載體(Clontech公司)0.5μl混勻室溫放置5分鐘置冰上，再按常規方法進行細菌轉化，塗板37℃生長12-16小時，蘭、白斑篩選。
2.4 RACE產物的篩選鑑定在96孔板中，每孔加入含Amp抗性的LB 30μl，對於每個RACE反應，挑取10-20個白斑重組子至上述96孔板的LB中，用該菌液作模板，直接進行PCR反應，初步篩出候選陽性RACE克隆。對候選陽性克隆進行小量液擴，抽提質粒DNA，內切酶酶切，電泳分析，篩選出大片段RACE克隆，再進行PCR鑑定。
2.5 RACE產物的測序及序列分析
對候選大片段陽性克隆進行測序，依據RACE產物的長度和該基因的mRNA大小，確定是否已獲得該基因的全序列，全序列即包括完整的閱讀框架，在第一個起始編碼子ATG前面相同閱讀框架內有終止編碼子。在閱讀框架的3′端有polyA序列。另外也含有相應的5′端和3′端非編碼區。用RACE方法獲得CT120序列和相應的編碼框架，結果如SEQ ID NO1-2所示。
其中，CT120全長cDNA為2145個鹼基(SEQ ID NO1)，其ORF為第91-861位，編碼全長為257胺基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)。
2.6 同源比較同源比較結果顯示CT120的同源物存在於不同的物種之中。CT120在人類有兩個同種型(isoform)其中一個是本發明蛋白CT120A，另一個是CT120B(AAH26023)。CT120B比CT12A少第四個外顯子(96個鹼基，32個胺基酸)。在人類，還存在另一個CT120-like基因(NP-113666.1)。鼠中存在兩個同源物XP-133706(稱之為mCT120-like 1)和BAB23923(mCT120-like 2)。同源比較圖見圖1。其中，CT120與CT120B有223/257(86％)相同性，與CT120-like同源有104/210(49％)相同性，與mCT120-like 1有126/260(48％)相同性，與mCT120-like 2有98/228(42％)相同性。
2.7 CT120的結構分析對CT120的核苷酸序列和胺基酸序列進行結構分析，發現CT120多肽含有以下潛在的功能域，並且具有7個跨膜區

2.6 CT120的全長克隆根據RACE反應後所拼得的全長序列設計引物進行全長克隆，所用引物見下表。
120F1F5′CCGATGCTGCTGACGCTGGCCG3′(SEQ ID NO5)120ER 5』TGTTGGCACCAGAAAATCCTGCTTG3』(SEQ ID NO6)擴增條件用RACE 25μl反應體系及PCR反應條件。PCR擴增後獲得CT120的全長序列1907bp，然後裝入T-A載體(Clontech公司)，得到載體CT120-T-A。
實施例3CT120的多組織膜Northern雜交人多組織Northern雜交膜片(MTN)購自Clontech公司，在42℃預雜交3-4小時。CT120-T-A克隆經EcoRI酶切，回收插入片段，電泳定量。取25ng DNA，加入2.5μl隨機引物與適量水，使總體積達到13.5μl。煮沸5分鐘，離心將液體甩至管底，加入2.5μl反應緩衝液，dATP、dTTP、dGTP各1μl，1μl Klenow酶，5μl32P-α-dCTP。輕彈混勻，稍加離心。37℃溫育20分鐘，加入2μl 0.5M EDTA終止反應。1ml注射器中塞入玻璃棉，加入TE飽和的Sephadex G-50。2000rpm 5分鐘。重複一次，加G-50至刻度1ml附近。用100μl TE平衡三次。標記反應加75μl TE，上柱，離心回收。探針100℃5分鐘變性，放至冰上。然後加入預雜交液中42℃雜交12-16小時。取膜片用1×SSC-0.05％SDS溶液42℃洗2次，每次30分鐘，再用0.1×SSC-0.1％SDS42℃洗2次，每次30分鐘，最後X光片自顯影。
Northern雜交結果如圖2所示。CT120基因全長約為2.3kb，在心、腦、胎盤、肝、腎、胰臟、骨骼肌皆有表達，但肺中不表達。
實施例4半定量反轉錄PCR(RT-PCR)本實施例通過反轉錄PCR檢測CT120在不同的腫瘤細胞系中的表達。所用腫瘤細胞係為肺癌SPC-A-1，宮頸癌C-33A，肝癌SMMC-7721，BEL-7402，卵巢癌SK-OV-3，膀胱癌5637，表皮癌A431，乳腺癌MCF-7。
4.1反轉錄取組織總RNA 1ul總反應體積20按Superscript II RTkit(GIBCO，BRL)操作程序合成第一鏈cDNA。合成後反應體積稀釋至120，1ul約含8ng總RNA，反轉錄後得到的第一鏈cDNA。
4.2 PCR反應體系依次加入下列試劑反轉錄第一鏈cDNA 1ul
10×PCR緩衝液1.5ul2mM dNTP 1.5ulBA1引物(上遊)1.5ulBA2引物(下遊)1.5ulCT120 F(上遊)1.5ulCT120 G(下遊)1.5ulTaq酶(promega 0.5u/ul) 1ulH2O Xul總體積25ul4.3 PCR反應程序94℃，3min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，26-28循環；72℃ 5min.PCR反應結束後，取5ulPCR產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。
β-肌動蛋白 BAl F 5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′ SEQ ID NO7BA2 R 5′TCAAGTTGGGGGACAAAAAG3′ SEQ ID NO8CT120120G R 5′GTGCGACTGGCACAAGGACAAAGAG3′ SEQ ID NO9120F F 5′GGGGATCGTCATCATTCGCTCCT3′SEQ ID NO104.3 結果如圖3所示。CT120在肺腺癌細胞系SPC-A-1中表達最高；BEL-7402和A431中等程度表達；C-33A，SMMC-7721，5637，MCF-7次之；SK-OV-3表達較低。
鑑於CT120在正常肺中不表達，在肺癌細胞中表達，因此可通過檢測CT120來診斷肺癌。
實施例5CT120裝入真核表達載體選擇pcDNA4/HisMax(Invitrogen公司)為真核表達載體，以cDNA池(Clontech公司)為模板，用引物120HM-F5′ATGCTGCTGACGCTGGCCGG3′(SEQ ID NO12)；120HM-R5′TTAGCCATCCTTTTTGGCTT3′(SEQ ID NO13)進行擴增，獲得CT120的ORF，T-A克隆(Clontech公司)進pcDNA4/HisMax真核表達載體，獲得質粒pcDNA4/HisMax-CT120，並經測序驗證。挑取克隆擴增、抽質粒、酶切鑑定，用於轉化細胞。
實施例6用脂質體試劑盒轉染細胞的體外實驗6.1 細胞株NIH/3T3細胞。
6.2 DNA來源於pcDNA4/HisMax-CT120表達質粒的DNA。
6.3 脂質體LIPOFECT AMINETMReagent Kit(BRL公司)6.4 培液無血清培液簡稱SF-DMEM全培液(10％小牛血清)含Zeocin(Invitrogen公司)的全培液6孔板(Corning產品)。
6.5 DNA-脂質體複合物(DNA-liposome complex)的製備lipofectin 10μl加90μl SF-DMEM混勻。DNA 1μg加100μl SF-DMEM混勻。將稀釋的DNA加入稀釋的lipofectin溶液中，混勻置室溫30-45分鐘。加0.8mlSF-DMEM進入DNA-lipofectin complex中，終體積為1.0ml。
6.6 轉染細胞細胞長到50-60％滿度為好，實驗前換培液一次。加1.0mllipofectin Reagent-DNA complex入細胞表面，輕輕搖動，鋪均勻，37℃溫育5小時。加入1.ml含20％小牛血清DMEM，混勻，37℃生長過夜。換培液過夜，第二天換含含Zeocin的全培液，常規換液篩選至克隆出現，記克隆數。
結果如圖4所示。CT120對NIH/3T3細胞生長有明顯的促進作用。
6.7 CT120穩定轉染NIH/3T3細胞系的建立挑取CT120穩定轉染NIH/3T3細胞單克隆，擴大培養。單克隆細胞裂解液，12％SDS-PAGE電泳，轉膜，用抗HisG(Invitrongen)標籤單克隆抗體檢測穩定轉染NIH/3T3細胞系中CT120融合蛋白的表達。
結果如圖5所示。在所測試的6個克隆中5個克隆有CT120的表達，分子量約為34KDa。
實施例7免疫組織化學檢測CT120在肺癌及癌旁組織中的表達7.1 兔抗CT120蛋白多克隆抗體的製備用肽合成儀(Applied Biosystem公司)合成CT120蛋白的C-端15肽胺基酸序列CRKAVRLFDTPQAKK(SEQ ID NO11)的寡肽，用Maleimide Activated BSA，KLH偶聯試劑盒(Sigma)把合成的多肽偶聯到KLH上，然後免疫紐西蘭大白兔，製備兔抗CT120多克隆抗體。
7.2 免疫組織化學檢測CT120在肺癌及癌旁組織中的表達肺癌及癌旁組織取自肺癌患者臨床手術切除組織。用於免疫組織化學檢測的肺癌和癌旁肺組織標本用10％中性緩衝福馬林固定，石蠟包埋，5μm厚切片，用兔抗CT120多克隆抗體(1∶150稀釋)作為第一抗體，應用Envision System兩步法檢測Kit(mouse)，DAB顯色，Mayer氏蘇木素復染核。
結果如圖6所示。CT120基因在肺癌組織的癌細胞中高表達(++)，而在癌旁肺組織中幾乎不表達(--)。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海市腫瘤研究所120人類17p13.3區域內人腫瘤相關基因CT120及其編碼蛋白13002483216013170PatentIn version 3.121012112145212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(91)..(861)223
4001cggagggttg aaatcgcgcg gccgggccgg ggcgcgccga gccgaaccca gccacgcggc60gccagcgagg cggccggacc cgcagccccg atg ctg ctg acg ctg gcc ggg ggc114Met Leu Leu Thr Leu Ala Gly Gly1 5gcg ctc ttc ttc ccg ggg ctc ttc gcg ctc tgc acc tgg gcg ctg cgc 162Ala Leu Phe Phe Pro Gly Leu Phe Ala Leu Cys Thr Trp Ala Leu Arg10 15 20cac tcc cag ccc gga tgg agc cgc acc gac tgc gtg atg atc agc acc 210His Ser Gln Pro Gly Trp Ser Arg Thr Asp Cys Val Met Ile Ser Thr25 30 35 40agg ctg gtt tcc tcg gtg cac gcc gtg ctg gcc acc ggc tcg ggg atc 258Arg Leu Val Ser Ser Val His Ala Val Leu Ala Thr Gly Ser Gly Ile45 50 55gtc atc att cgc tcc tgc gac gac gtg atc acc ggc agg cac tgg ctt 306Val Ile Ile Arg Ser Cys Asp Asp Val Ile Thr Gly Arg His Trp Leu60 65 70gcc cgg gaa tat gtg tgg ttt ctg att cca tac atg atc tat gac tcg 354Ala Arg Glu Tyr Val Trp Phe Leu Ile Pro Tyr Met Ile Tyr Asp Ser75 80 85
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1 5 10 15Ala Leu Cys Thr Trp Ala Leu Arg His Ser Gln Pro Gly Trp Ser Arg20 25 30Thr Asp Cys Val Met Ile Ser Thr Arg Leu Val Ser Ser Val His Ala35 40 45Val Leu Ala Thr Gly Ser Gly Ile Val Ile Ile Arg Ser Cys Asp Asp50 55 60Val Ile Thr Gly Arg His Trp Leu Ala Arg Glu Tyr Val Trp Phe Leu65 70 75 80Ile Pro Tyr Met Ile Tyr Asp Ser Tyr Ala Met Tyr Leu Cys Glu Trp85 90 95Cys Arg Thr Arg Asp Gln Asn Arg Ala Pro Ser Leu Thr Leu Arg Asn100 105 110Phe Leu Ser Arg Asn Arg Leu Met Ile Thr His His Ala Val Ile Leu115 120 125Leu Val Leu Val Pro Val Ala Gln Arg Leu Arg Gly Asp Leu Gly Asp130 135 140Phe Phe Val Gly Cys Ile Phe Thr Ala Glu Leu Ser Thr Pro Phe Val145 150 155 160Ser Leu Gly Arg Val Leu Ile Gln Leu Lys Gln Gln His Thr Leu Leu165 170 175Tyr Lys Val Asn Gly Ile Leu Thr Leu Ala Thr Phe Leu Ser Cys Arg180 185 190Ile Leu Leu Phe Pro Phe Met Tyr Trp Ser Tyr Gly Arg Gln Gln Gly195 200 205
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221MISC_FEATURE222(1)..(15)223對應於CT120蛋白C-端的寡肽40011Cys Arg Lys Ala Val Arg Leu Phe Asp Thr Pro Gln Ala Lys Lys1 5 10 152101221120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物
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221misc_feature223引物40013ttagccatcc tttttggctt20
權利要求
1.一種分離的人CT120蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進NIH/3T3細胞生長功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQID NO2所示的胺基酸序列，或者該多核苷酸具有選自下組的序列SEQ ID NO1中所示的91-861位的編碼區序列或1-2145位的全長序列。
5.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權利要求5所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求3所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
7.一種製備多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達蛋白的條件下，培養權利要求6所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人蛋白CT120活性的多肽。
8.一種能與權利要求1所述的人CT120蛋白特異性結合的抗體。
9.一種檢測肺細胞是否發生癌變或存在癌變易感性的方法，其特徵在於，它包括步驟檢測肺細胞樣品中是否有CT120轉錄本，存在CT120轉錄本就表示該肺細胞發生癌變或存在癌變易感性；或者檢測肺細胞樣品中是否存在CT120蛋白，存在CT120蛋白就表示該肺細胞發生癌變或存在癌變易感性。
10.一種檢測肺癌的試劑盒，其特徵在於，它包括(1)特異性擴增人CT120基因的引物對，或(2)特異性與CT120蛋白結合的抗體。
全文摘要
本發明公開了－種新的與腫瘤相關的人蛋白CT120，編碼此多肽的多核苷酸和經重組技術產生該多肽的方法。本發明還公開了此多肽用於診斷和治療諸如癌症等疾病的方法。本發明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發明還公開了編碼這種與腫瘤相關的人蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C07K14/435GK1502627SQ02150730
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月27日 優先權日2002年11月27日
發明者萬大方, 顧健人, 何祥火 申請人:上海市腫瘤研究所