一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口蹄疫非結構蛋白3ab抗體的檢測方法

2023-12-09 06:41:41 1

專利名稱：一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口蹄疫非結構蛋白3ab抗體的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種利用斑點免疫金滲濾法(DIGFA)檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體 的檢測方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄動物共 患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病以口腔黏膜、舌面、唇、鼻鏡、蹄部和乳房皮膚 發生水皰和潰爛為特徵。世界動物衛生組織(OIE)將該病列為A類動物傳染病之首。由於 該病發病率高，傳播速度快，流行範圍廣，一旦暴發則不易控制和消滅，嚴重影響畜牧業生 產和國際貿易，造成巨大經濟損失，該病流行歷史長久，在世界各地分布很廣。包括中國在 內的大多數發展中國家主要是通過注射滅活疫苗的方法預防FMD。因此，建立能區分滅活疫 苗免疫動物與感染動物的鑑別診斷方法非常必要。成熟的鑑別診斷方法既能真實的反映一 個地區或畜群中FMDV的感染狀況，也是OIE判定一個地區或國家有無FMD的依據之一。口蹄疫的病原為口蹄疫病毒(FMDV)，屬於小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。病毒有A、 C、0、SAT I、SAT II、SAT III和Asia I七個主型，每個型內又有亞型，亞型內還有抗原性差 異的毒株，各型之間抗原性不同，且幾乎沒有交叉免疫性，這給FMD的診斷和防制帶來了極 大的困難。FMDV基因組含有一個大的開放閱讀框，編碼一個大的聚蛋白，聚蛋白逐級成熟 裂解為病毒結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結構蛋白(NSP :L、2A、2B、2C、3A、3B、3ABC、 3D等)。包括中國在內的大多數發展中國家主要是靠疫苗注射免疫來預防口蹄疫，而免疫 注射後的動物血清中也能夠檢測到口蹄疫抗體，利用傳統口蹄疫病毒抗原包被檢測口蹄疫 抗體未能達到區分是野毒感染動物還是滅活疫苗免疫動物的目的。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供了一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口 蹄疫非結構蛋白3AB抗體的檢測方法，本發明具有操作簡便快速，不需特殊儀器設備，斑點 色澤鮮豔，特異性強，靈敏性高，結果易於判斷，且檢測樣本可以保存的特點。為達到上述的目的，本發明採用如下技術方案一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體的檢測方法，具體包 括如下步驟a) 口蹄疫FMD 3AB非結構蛋白的合成；b) SPA膠體金的製備；c)反應試劑盒的製作；d)應用反應試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結構蛋白抗原點於NC 膜上，封閉後加待測樣品，洗滌後用步驟b)中製備的SPA作為膠體金標記蛋白檢測口蹄疫 非結構蛋白3AB抗體。
所述的口蹄疫FMD 3AB非結構蛋白的合成步驟為首先經GenBank檢索分析，參照 已公布的亞洲株(AY687333)選取3AB基因，根據密碼子的簡併性和大腸桿菌的密碼子喜好 性原則，在不影響胺基酸序列的前提下，修改3AB序列中的部分稀有密碼子，將其分為9條 長引物，各長引物之間設計12個互補序列，經重疊PCR法得到2條3AB基因，基因的核苷酸 序列分別為SEQIDN0. 1 P 3AB 5，NdeI 5，-GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG-3 』 ；SEQIDN0. 2 P 3AB 3，SalI 5，-ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3，；然後在上述2條3AB基因中引入的酶切位點為NdeI和SalI ；所引入的表達載體 PET-28(a+)(購於Novagen公司，代理商為廈門鷺隆生物科技發展有限公司)；利用表達載 體PET-28 (a+)構建重組表達質粒，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，篩選重組質粒，命 名為ΡΕΤ-28-3ΑΒ ；接著進行重組質粒的誘導表達；然後將誘導表達後的菌體利用超聲破碎 儀破碎後進行純化和復性。所述的超聲破碎時採用的超聲破碎緩衝液的配方為20mMTris-HCl，0. 5Μ NaCl, IMm EDTA PH8. 0，lmg/ml溶菌酶(BBI原裝，上海生工生物工程技術服務有限公司代理)。所述的純化過程中採用的包涵體洗滌液配方為20mM Tris_HClPH8. 0，0. 5M NaCl，2M碳醯二胺(Urea)，2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton)；採用的包涵體變性緩衝液配 方為20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl，8M 碳醯二胺(Urea)，IOOmM β-巰基乙醇，2% 聚 乙二醇辛基苯基醚(Triton)；所述的復性過程中採用的復性緩衝液配方為20mM Tris-HCl PH8. 0,50Mm NaCl，甘油。所述的SPA為為金黃色葡萄球菌重組A蛋白(購於北京本元正陽基因技術股份有 限公司)。所述的SPA膠體金的製備包括採用檸檬酸三鈉還原法製備膠體金溶液，然後膠體 金溶液中逐滴加入金黃色葡萄球菌重組A蛋白；其中所採用的重懸緩衝液為含酪蛋白， 0. 05%聚乙二醇 6000(PEG6000) ,0. 05% 吐溫-20，0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩衝液；所採 用的膠體金稀釋液為含含1 %酪蛋白，0. 05%聚乙二醇6000 (PEG6000)，5 %蔗糖，0. 05%吐 溫-20，0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩衝液。所述的反應試劑盒為塑料方形小盒，大小為4. 8cmX3cmX0. 7cm，分底和蓋兩部 分，蓋面有直徑0. 5cm圓孔，盒內有兩層，第一層為硝酸纖維素膜(NC膜)，NC膜下緊貼著第 二層為吸水紙墊。所述的步驟d)為在反應試劑盒圓孔內的NC膜上點兩點，一點為口蹄疫FMD 3AB 抗原lul，作為檢測點；另一點為已知口蹄疫FMD3AB抗體陽性的豬血清IuL作為質控點；室 溫乾燥後加入IOOuL封閉液，滲入乾燥後加入待檢血清IOOuL ；滲入後加入IOOuL衝洗；滲 入後加入標記好的SPA膠體金SOuL ；待滲入後再加入洗滌液IOOuL,洗去未結合的SPA膠體 金；5min內若在膜上檢測點和質控點均出現紅色斑點即為陽性，若只有質控點出現紅色斑 點，則為陰性，而檢測點和質控點均不出現紅色斑點，則說明試劑無效。所述的封閉液為含酪蛋白和0. 05%吐溫-20的0. 01mol/L pH 7. 2的PBS緩 衝液；所述的洗滌液為含0. 05%吐溫-20的0. 01mol/LpH 7. 2的PBS緩衝液；所述的PBS緩衝液配方為NaH2PO4 · H2O 0. 276g，無水 Na2HPO4 1. 136g，NaCl 8. 76g，KCl 0. 187g，加適 量蒸餾水溶解後定容至1000mL。所述的口蹄疫FMD 3AB抗原蛋白點樣時濃度為0. 0875mg/mL。本發明的有益效果是首先在疫苗生產過程中，絕大部分的非結構蛋白已被消除， 因此免疫動物後，體內不產生非結構蛋白抗體；而自然感染動物體內有非結構蛋白的表達， 可刺激產生相應的抗體。本發明是以重組表達的口蹄疫3AB非結構蛋白作為抗原，利用SPA 膠體金的特性，研究膠體金免疫滲濾技術快速檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體，建立一種 能夠區分口蹄疫疫苗免疫動物和野毒感染的快速檢測方法。主要應用微孔濾膜(NC膜)作 載體的免疫檢測技術，先將抗原點於NC膜上，封閉後加待測樣品，洗滌後用膠體金探針檢 測相應抗體。通過金顆粒來放大免疫反應系統，使反應結果在固相載體NC膜上顯示出來。 該法操作簡便、快速，不需特殊儀器設備，斑點色澤鮮豔，易於判斷，且檢測樣本可以保存。 本發明是將純化的口蹄疫病毒3AB非結構蛋白抗原包被在硝酸纖維膜上，利用膠體金標記 SPA顯色，建立一種能夠區分口蹄疫疫苗免疫與野毒感染動物的快速檢測方法。通過應用 DIGFA法和ELISA方法同時對150份豬血清進行檢測，結果DIGFA法陽性率為6%，ELISA法 陽性率為5.3%，兩者符合率達99. 3 %。本發明選用的口蹄疫病毒3AB非結構蛋白抗原特 異性好，與膠體金標記的SPA組成檢測試劑盒用於檢測口蹄疫病毒3AB非結構蛋白抗體，具 有特異性強，靈敏性高，操作簡單，耗時短，結果易於判斷，且與口蹄疫免疫豬血清、豬細小 病毒、豬瘟、豬藍耳病和豬偽狂犬病毒陽性血清不發生交叉反應。該方法的成功研製，能夠 簡單快速地判斷動物中是否感染口蹄疫病毒，為有效控制該病將發揮重要作用。特別對於 是養豬和養牛大國的中國，建立簡便、快速、準確的區分口蹄疫疫苗抗體還是野毒感染產生 的抗體的檢測方法，以便更加廣泛地應用到廣大養殖戶，隨時進行檢測；基層獸醫部門定期 進行大面積普查和監測以及口岸一線部門開展快速通關放行，這對於有效地控制口蹄疫的 傳播起到非常積極地效果，可以為預防這些傳染病提供診斷依據。


圖1是本發明FMD最佳點樣抗原濃度的選擇實驗結果圖；圖2是本發明一種配方，不同用量的封閉液的選擇實驗結果圖；圖3是本發明另一種配方，不同用量的封閉液的選擇實驗結果圖；圖4是本發明膠體金標記SPA最佳濃度的選擇實驗結果圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。1、本實施例首先合成FMD 3AB非結構蛋白表達引物和表達重組質粒構建所用的抗原為原核表達的口蹄疫3AB蛋白，FMD非結構蛋白3AB基因的合成經GenBank檢索分析，參照已公布的亞洲株(AY687333)選取3AB 基因，根據密碼子的簡併性和大腸桿菌的密碼子喜好性原則，在不影響胺基酸序列的前提 下，修改3AB序列中的部分稀有密碼子，將其分為9條長引物，各長引物之間設計12個互補 序列，經重疊PCR法得到2條3AB基因，基因的核苷酸序列分別為SEQIDN0. 1
P 3AB 5，NdeI 5，~GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG~3 』 ；SEQIDNO. 2 P 3AB 3，Sail 5，-ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3，。引入酶切位點NdeI和SalI用表達載體PET-28 (a+)構建重組表達質粒，轉化到DH5 α感受態，篩選重組質粒，命名為ΡΕΤ-28-3ΑΒ。重組質粒的表達將測序正確的表達質粒轉化到表達菌株BL21 (DE3)感受態，挑取 陽性單菌落到含卡那黴素的LB培養基中，按1 100接種於含50 μ g/ml卡那黴素的LB培 養基培養至0D0. 6 0. 8時加入IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導表達6h後收集菌體，取樣 用12% SDS-PAGE觀察分析結果。表達蛋白的純化、復性將誘導表達後的菌體用超聲破碎緩衝液(20mM Tris-HCl， 0. 5M NaCl，IMm EDTA，PH8. 0，lmg/ml溶菌酶)按20ml/g菌體重懸沉澱，用超聲破碎儀進行 超聲破碎，分別收集超聲破碎上清和沉澱，取樣進行SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白表達情 況。超聲沉澱經包涵體洗滌液(20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl, 2M Urea, 2% Triton) 洗滌後用包涵體變性緩衝液(20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5MNaCl,8M Urea IOOmM β -巰基乙 醇，2% Triton)重懸，4°C攪拌過夜。溶解後的包涵體用鎳離子親和層析柱進行純化，純化 方法參照說明書進行。將純化洗脫的蛋白用復性緩衝液(20mM Tris-HCl PH8. 0, 5OMmNaCl,
甘油)稀釋一倍後再用復性緩衝液至4°C進行透析復性，每隔6 8h換液一次，共透析 24h，最後用超純水或用5mM Tris-HC1PH8.0進行透析二次。為提高蛋白濃度可以用蔗糖或 PEG20000進行濃縮，濃縮後的蛋白用紫外分光光度計測定蛋白含量，-80°C保存備用。2、SPA膠體金的製備1)膠體金溶液的製備用檸檬酸三鈉還原法製備，取氯金酸ImL加入到99mL 超純水中，所得氯金酸溶液濃度為0.01%，用水浴磁力攪拌鍋加熱至沸騰，在磁力攪拌器以 一定轉速不斷攪拌下迅速加入2mL的1 %檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱約15min至溶液 顏色穩定不變。此法製得的膠體金呈葡萄酒色，經紫外分光光度計測其吸收峰在520nm處， 得到的膠體金顆粒直徑約為20nm左右，冷卻後置4°C冰箱避光保存。2) SPA標記取需製備量的膠體金溶液，用0. lmol/L K2CO3和0. lmol/L的HCl調 其pH至6.0。然後在磁力攪拌下逐滴加入SPA (每mL膠體金溶液加入6ug SPA)，繼續磁力 攪拌30min後加入5% PEG(MW6000)至終濃度0. 1 %，再繼續攪拌15min，最後放置4°C冰 箱，靜置過夜。次日將標記好的SPA膠體金4000r/min離心lOmin，取上清液12000r/min 離心30min，小心吸棄上清。沉澱用重懸緩衝液(含酪蛋白，0.05% PEG6000,0. 05% Tween-20,0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩衝液)恢復至原體積。12000r/min 離心 30min,棄 上清。沉澱用膠體金稀釋液(含酪蛋白，0.05% PEG6000，5%蔗糖，0.05% Tween-20， 0.01mol/L pH7. 2的PBS緩衝液)恢復至原體積的十分之一，置4°C冰箱備用。PBS緩衝液 配方為=NaH2PO4 .H2O 0. 276g，無水 Na2HPO4L 136g，NaCl 8. 76g，KCl 0. 187g，加適量蒸餾水 溶解後定容至1000mL。3、反應試劑盒的製作反應盒為塑料方形小盒，大小為4. 8cmX3cmX0. 7cm,分底和蓋兩部分，蓋面有直 徑0. 5cm圓孔，盒內有兩層，朝蓋的第一層為硝酸纖維素膜(NC膜)，NC膜下緊貼著第二層 吸水紙墊。
4、應用反應試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結構蛋白抗原點於NC 膜上，封閉後加待測樣品，洗滌後用步驟b)中製備的SPA作為膠體金標記蛋白檢測口蹄疫 非結構蛋白3AB抗體。1)具體步驟在圓孔內的NC膜上點兩點，一點為FMD 3AB抗原lul，作為檢測點； 另一點為已知FMD 3AB抗體陽性的豬血清IuL作為質控點；室溫乾燥後加入IOOuL封閉液 (含酪蛋白和0.05%吐溫-20的O.Olmol/L pH 7. 2的PBS緩衝液)PBS緩衝液配方為 NaH2PO4 · H2O 0. 276g，無水 Na2HPO4 1. 136g，NaCl 8. 76g，KC10. 187g，加適量蒸餾水溶解後 定容至1000mL。滲入乾燥後加入待檢血清IOOuL ；滲入後加入IOOuL洗滌液(含0. 05%吐 溫-20的0. 01mol/LpH 7. 2的PBS緩衝液)衝洗(可根據情況洗1遍 3遍)；滲入後加入 標記好的SPA膠體金80uL ；待滲入後再加入洗滌液IOOuL (1遍 3遍)，洗去未結合的SPA 膠體金。5min內若在膜上檢測點和質控點均出現紅色斑點即為陽性，若只有質控點出現紅 色斑點則為陰性，而檢測點和質控點均不出現紅色斑點，則說明試劑無效。2)最佳點樣抗原濃度的選擇將重組表達純化的FMD 3AB抗原用pH 9. 6的 0. 05mol/L碳酸鹽緩衝液進行倍比稀釋，然後根據濃度高低依次點樣在NC膜上，分別進行 DIGFA實驗，如圖1所示，本實施例所做的實驗為1號板為檢測FMDV 3AB陽性血清結果； 2號板為檢測FMDV 3AB陰性血清結果1 5.依次為濃度為0. 35,0. 175,0. 0875,0. 044和 0. 022mg/ml的重組3AB抗原；C.質控點。由圖1可見點樣抗原量最小且實驗結果斑點顏 色最清晰抗原濃度作為最佳點樣抗原濃度。實驗結果顯示，FMDV 3AB蛋白以0.0875mg/mL 點樣時，抗原包被量最小且斑點顏色清晰。因此選擇0.0875mg/ml的FMDV 3AB蛋白點樣 IyL作為最佳抗原包被量。3)封閉液的選擇用不同配方的封閉液封閉NC膜進行DIGFA實驗，如圖2和圖3所示，本實施例所做的實驗為圖2所用封閉液為(1)含酪蛋白、0.5% Tween-20的 0. 01mol/L ρΗ7·2 的 PBS ； (2)含 0. 5%酪蛋白、0. 5% Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7·2 的 PBS ； (3)含 酪蛋白、0. 05% Tween-20 的0. 01mol/L PH7. 2 的PBS ； (4)含0. 5%酪蛋白、0. 05% Tween-20 的 0. 01mol/L PH7. 2 的 PBS ；圖 3 所用封閉液為(1)含 BSA,0. 5% Tween-20 的 0.01mol/L ρΗ7·2 的 PBS ； (2)含 0. 5% BSA、0. 5% Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ； (3)含 1 % BSA,0. 05 % Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ； (4)含 0. 5 % BSA,0. 05 % Tween-20的0. 01mol/L pH7. 2的PBS。並將實驗結果進行對比，選擇斑點顏色清晰且背景 較淺的一組作為最適封閉液。結果顯示，用含酪蛋白、0.05% Tween-20的0. Olmol/L ρΗ7· 2 的 PBS 和 0. 5%酪蛋白、0. 05% Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 封閉效果最好， 斑點顯色清楚，背景較淺。4)膠體金標記SPA最佳濃度的選擇將SPA膠體金做倍比稀釋後與點有FMDV 3ΑΒ 抗原的NC膜作用，選擇背景顏色淺而效果最好的稀釋倍數作為膠體金標記SPA濃度。如圖 4所示，本實施例所做的實驗為1 4號板分別為按原體積1/15、1/10、1/5、1/2.5稀釋的 SPA膠體金，結果顯示，按原體積1/10的稀釋倍數效果較好，且背景顏色淺。
權利要求
一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體的檢測方法，其特徵在於具體包括如下步驟a)口蹄疫FMD 3AB非結構蛋白的合成；b)SPA膠體金的製備；c)反應試劑盒的製作；d)應用反應試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結構蛋白抗原點於NC膜上，封閉後加待測樣品，洗滌後用步驟b)中製備的SPA作為膠體金標記蛋白檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體。
2.如權利要求1所述的一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體的 檢測方法，其特徵在於所述的口蹄疫FMD 3AB非結構蛋白的合成步驟為首先經GenBank檢 索分析，參照已公布的亞洲株(AY687333)選取3AB基因，根據密碼子的簡併性和大腸桿菌 的密碼子喜好性原則，在不影響胺基酸序列的前提下，修改3AB序列中的部分稀有密碼子， 將其分為9條長引物，各長引物之間設計12個互補序列，經重疊PCR法得到2條3AB基因， 基因的核苷酸序列分別為SEQIDN0. 1 P 3AB 5' Ndel 5' -GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG-3』 ；SEQIDN0. 2 P 3AB 3' Sail 5' -ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3'；然後在上述2條3AB基因中引入的酶切位點為Ndel和Sail ；所引入的表達載體 PET-28 (a+)；利用表達載體PET-28 (a+)構建重組表達質粒，轉化到大腸桿菌DH5 a感受態 細胞中，篩選重組質粒，命名為PET-28-3AB ；接著進行重組質粒的誘導表達；然後將誘導表 達後的菌體利用超聲破碎儀破碎後進行純化和復性。
3.如權利要求2所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵 在於所述的超聲破碎時採用的超聲破碎緩衝液的配方為20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl,lMm EDTA PH8. 0, lmg/ml 溶菌酶。
4.如權利要求2所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵 在於所述的純化過程中採用的包涵體洗滌液配方為20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl, 2M碳醯二胺，2%聚乙二醇辛基苯基醚；採用的包涵體變性緩衝液配方為20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl，8M碳醯二胺，100mM ^ -巰基乙醇，2%聚乙二醇辛基苯基醚；所述的復性 過程中採用的復性緩衝液配方為20mM Tris-HC1PH8. 0,50Mm NaCl，l%甘油。
5.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵在 於所述的SPA為為金黃色葡萄球菌重組A蛋白。
6.如權利要求1或5所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特 徵在於所述的SPA膠體金的製備包括採用檸檬酸三鈉還原法製備膠體金溶液，然後膠體金 溶液中逐滴加入金黃色葡萄球菌重組A蛋白；其中所採用的重懸緩衝液為含酪蛋白， 0. 05%聚乙二醇6000，0. 05%吐溫-20，0. 01mol/L pH7. 2的PBS緩衝液；所採用的膠體金稀 釋液為含含酪蛋白，0. 05%聚乙二醇6000，5%蔗糖，0. 05%吐溫-20，0. 01mol/L pH7. 2 的PBS緩衝液。
7.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵在於所述的反應試劑盒為塑料方形小盒，大小為4. 8cmX3cmX0. 7cm，分底和蓋兩部分，蓋 面有直徑0. 5cm圓孔，盒內有兩層，第一層為硝酸纖維素膜，NC膜下緊貼著第二層為吸水紙墊。
8.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵在 於所述的步驟d)為在反應試劑盒圓孔內的NC膜上點樣，一點為口蹄疫FMD 3AB抗原lul， 作為檢測點；另一點為已知口蹄疫FMD 3AB抗體陽性的豬血清IuL作為質控點；室溫乾燥 後加入IOOuL封閉液，滲入乾燥後加入待檢血清IOOuL ；滲入後加入IOOuL衝洗；滲入後加 入標記好的SPA膠體金SOuL ；待滲入後再加入洗滌液IOOuL,洗去未結合的SPA膠體金； 5min內若在膜上出現紅色斑點即為陽性，否則為陰性。
9.如權利要求8所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵在 於所述的封閉液為含酪蛋白和0. 05%吐溫-20的0. 01mol/L pH 7. 2的PBS緩衝液； 所述的洗滌液為含0. 05%吐溫-20的0. Olmol/LpH 7. 2的PBS緩衝液；PBS緩衝液配方為 NaH2PO4 · H2O 0. 276g，無水 Na2HPO4L 136g，NaCl 8. 76g，KC10. 187g，加適量蒸餾水溶解後 定容至1000mL。
10.如權利要求8所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的製備方法，其特徵 在於所述的口蹄疫FMD 3AB抗原蛋白點樣時濃度為0. 0875mg/mL。
全文摘要
本發明公開了一種利用斑點免疫金滲濾法檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體的檢測方法，具體包括如下步驟a)口蹄疫FMD 3AB非結構蛋白的合成；b)SPA膠體金的製備；c)反應試劑盒的製作；d)應用反應試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結構蛋白抗原點於NC膜上，封閉後加待測樣品，洗滌後用步驟b)中製備的SPA作為膠體金標記蛋白檢測口蹄疫非結構蛋白3AB抗體。本發明具有操作簡便快速，不需特殊儀器設備，斑點色澤鮮豔，特異性強，靈敏性高，結果易於判斷，且檢測樣本可以保存的特點。
文檔編號C12N15/70GK101819209SQ20101017706
公開日2010年9月1日 申請日期2010年5月15日 優先權日2010年5月15日
發明者吳紹強, 孔繁德, 徐淑菲, 朱文釧, 林祥梅, 梅琳, 陳信忠, 韓雪清, 龔豔清 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心