德欽野生紫花苜蓿組培繁殖方法
2023-12-08 19:43:06 2
專利名稱：德欽野生紫花苜蓿組培繁殖方法
德欽野生紫花苜蓿組培繁殖方法所屬領域本發明屬於生物技術領域，具體地，涉及一種德欽野生紫花苜蓿(Medicagaosativa L.)無菌苗組織培養及快速繁殖的方法。
背景技術：
德欽野生紫花苜猜(Medicago sativa L.)是一種多年生豆科牧草,分布雲南省迪慶藏族自治州德欽縣和金沙江流域的乾熱河谷地區，抗乾熱性十分突出。德欽野生紫花苜蓿蛋白質含量高，營養品質好，適於放牧和調製青乾草，牛、馬、豬和羊等牲畜均喜食，是一種優質的飼草資源。另外該苜蓿較耐貧瘠，在乾熱河谷地區種植可起到保土綠肥的作用。但由於當地的人們長期不合理地過度利用，野生紫花苜蓿已經到了瀕危的狀況。且野生紫花苜蓿的結實率很低，種子不易發芽，自然繁殖率較低。建立組培快繁體系可以從根本上解決這一問題。 迄今，紫花苜蓿組培快繁法大多都選用無菌種子為外植體，通過擬原球莖途徑培養，此類方法存在德欽野生紫花苜蓿種子產量較低，通過原球莖途徑培養造成的周期長的缺點。
發明內容
針對現有技術存在的上述不足，本發明旨在提供一種德欽野生紫花苜蓿的組織快繁方法，各階段採用不同的優化培養基配方，使之在野生種源缺乏及繁殖率低的情況下能夠快速繁衍，使該物種的優良性狀的保存能夠得到保障，同時避免了通過原球莖途徑造成的周期長的缺點，縮短離體培養時間及生產成本，提高生根率和幼苗移栽率，為德欽野生紫花苜蓿的可持續利用提供了組培種苗繁育基礎。本發明採用葉片為外植體產生原球莖組培方法顯得更有實際應用價值。本發明的上述目的是通過下述的技術方案加以實現的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，包括葉片消毒、愈傷組織誘導、分化、壯苗及生根培養以及試管苗移栽步驟，取野生紫花苜蓿的幼嫩葉片進行原球莖誘導、分化、壯苗、生根培養，培養的溫度為23-25°C，溼度為30-45%，光照強度為1000-3000LX，光照時間為16h/d ;所述的愈傷組織誘導培養基為MS + 2，4-D 2. O mg/1+ 6-BA I. O mg/1 + 3%蔗糖+ O. 8% 瓊脂，分化培養基為 MS + 6-BA O. 5 mg/1 + NAA O. 5 mg/1 + 3% 蔗糖 + O. 8% 瓊月旨，壯苗培養基為MS+IAA1.0 mg/1 +KTO. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂培養基，生根培養基為1/2MSmg/Ι + 3%蔗糖+ O. 8%瓊脂培養基。所述的組培繁殖方法中，葉片消毒先用用自來水衝洗3飛遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H202溶液浸泡15分鐘，無菌蒸餾水清洗5遍。所述的組培繁殖方法中，移栽是生根組培苗在培養瓶內培養20天以後煉苗5天，再移栽於溫室大棚，移栽基質為混有滅過菌的營養土(園土 腐殖土 砂土 =2 2 1)和適量珍珠巖，移栽最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋裝有基質的營養盤，遮陽保溼，使環境相對溼度保持在80%，並早晚通氣半小時，成活後去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。具體地，本發明的組培繁殖方法為選德欽野生紫花苜蓿的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水衝洗3飛遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15 min,無菌蒸餾水清洗5遍,然後每一小葉切成5 mmX5 mm的小塊。將切好的幼嫩葉片接種於愈傷組織誘導培養基MS + 2,4-D 2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，培養條件為溫度24°C，光照16h，光照強度1000LX，培養45 d左右。把經過篩選具有胚性的質地緻密或顆粒狀或具有綠色芽點，體積適中的愈傷組織塊進行分割，使愈傷組織塊大小均一，儘量將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉入同一分化培養基MS + 6-BA 0.5 mg/1+ NAA 0.5 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進行體細胞胚生長和發育的培養，培養條件為溫度24°C，光照強度3000LX，光照16h，培養45 d左右。將在分化培養基生成的叢生芽轉到壯苗培養基MS+IAA1.0 mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂進行壯苗培養基使其快速生長，形成大的叢生苗並伸長，培養10天左右。將生成的無根小苗(2 3cm高)在節間下部I mm處切下，移入生根培養基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂。培養條件為溫度24°C，光照強度 3000LX,光照16h。IOd左右即可生根，當試管苗出現3飛條粗根，長約2 3cm，苗高5cm以上時準備移栽。先打開封瓶膜，經:T5d鍛鍊，移入混有滅過菌的營養土(園土 腐殖土 砂土=2 2 1)和適量珍珠巖的培養盤內，最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋，遮陽保溼，使環境相對溼度保持在80%，並早晚通氣半小時，成活後去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。與現有技術相比，本發明的組培方法的優點在於本發明方法在培養不同階段採用了不同配方的培養基，以適應植物在不同時期對營養物質的需求，通過本發明的方法培養，野生紫花苜蓿的出愈率為97. 85%，分化率為79. 07%，生根率為98. 42%，移栽成活率為94. 55%，在一月內可增殖係數為10，極大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖係數，阻止了由於野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導致該物種瀕臨滅絕的危險，為該物種的保存和可持續利用提供了非常有效的繁殖方法。本發明建立了有效的工廠化野生紫花苜蓿組培快繁方法，解決了傳統野生種子繁殖困難，繁殖受阻的狀況。通過本發明組培快繁得到的幼苗，成苗一致性強，生長健壯，葉色濃綠，病蟲害較少，易於管理。不受季節限制，任何時候都可以進行組培。可以保持物種特性，使該品種能夠延續和可持續利用。節約了生產成本，且生產過程中分化率高，繁殖速度快。本發明通過不斷的探索實驗，形成了一套專門的野生紫花苜蓿組織培養繁殖技術體系，克服了之前專利培養基成分複雜，培養過程繁瑣，無實際工廠化繁殖經驗，為規模化人工種植德欽野生紫花苜蓿提供了保障，現階段已使用本發明工廠化生產德欽野生紫花苜蓿瓶苗3年之久，生產過程中問題少，分化率高，繁殖速度快，繼代代數多，營養成分與德欽野生紫花苜蓿相當，證明了該繁殖技術是目前為止適合工廠化生產的組培方法。
具體實施例方式以下實施例用來進一步說明本發明的實質性內容。根據本發明技術方案和實施例的描述，也許同領域技術人員在本發明的基礎上還可以對本發明技術方案進行一些修改和改進。因此，在不偏離本發明主要技術方案基礎上所做的修改和改進，均應屬於本發明所要求保護的範圍。實施例I :以德欽野生紫花苜猜(Medicagao sativa L.)的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水衝洗3遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15min，無菌蒸餾水清洗5次，然後每一小葉切成5 mmX5 mm的小塊。將切好的幼嫩葉片接種於愈傷組織誘導培養基MS +
2.4-D2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，培養條件為溫度24°C，光照16h，光照強度1000 LX，培養45天。把經過篩選具有胚性的質地緻密或顆粒狀或具有綠色芽點，體積適中的愈傷組織塊進行分割，使愈傷組織塊大小均一，儘量將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉入同一分化培養基MS + 6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/I + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進行體細胞胚生長和發育的培養，培養條件為溫 度24°C，光照強度3000LX，光照16h。45天左右，將在分化培養基生成的叢生芽轉到MS+IAA1. O mg/1+ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂壯苗培養基使其快速生長，形成大的叢生苗並伸長。將生成的無根小苗(2cm高)在節間下部Imm處切下，移入生根培養基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂，培養條件為溫度24°C，光照16h，光照強度3000LX。10天左右即可生根，當試管苗出現3條粗根，長2cm，苗高5cm以上時準備移栽。先打開封瓶膜，經3天鍛鍊，移入混有滅過菌的營養土(園土 腐殖土 砂土 =2:2:1)和適量珍珠巖的培養盤內，最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋，遮陽保溼，使環境相對溼度保持在80%，並早晚通氣半小時，成活後去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。實施例2:以德欽野生紫花苜猜(Medicagao sativa L.)的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水衝洗5遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15min，無菌蒸餾水清洗5次，然後每一小葉切成5 mmX5 mm的小塊。將切好的幼嫩葉片接種於愈傷組織誘導培養基MS +
2.4-D2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，培養條件為溫度24°C，光照16h，光照強度1000 LX，培養45天左右。把經過篩選具有胚性的質地緻密或顆粒狀或具有綠色芽點，體積適中的愈傷組織塊進行分割，使愈傷組織塊大小均一，儘量將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉入同一分化培養基MS + 6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/I + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進行體細胞胚生長和發育的培養，培養條件為溫度24°C，光照強度3000LX，光照16h。45天左右，將在分化培養基生成的叢生芽轉到MS+IAA1. O mg/1+ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂壯苗培養基使其快速生長，形成大的叢生苗並伸長。將生成的無根小苗(3cm高)在節間下部Imm處切下，移入生根培養基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂，培養條件為溫度24°C，光照16h，光照強度3000LX。10天左右即可生根，當試管苗出現:Γ5條粗根，長2 3cm，苗高5cm以上時準備移栽。先打開封瓶膜，經5天鍛鍊，移入混有滅過菌的營養土(園土 腐殖土 砂土 =2:2:1)和適量珍珠巖的培養盤內，最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋，遮陽保溼，使環境相對溼度保持在80%，並早晚通氣半小時，成活後去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。通過本發明上述方法的培養，野生紫花苜蓿的出愈率為97.85%，分化率為79. 07%，生根率為98. 42%，移栽成活率為94. 55%，在一月內可增殖係數為10，極大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖係數，阻止了由於野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導致該物種瀕臨滅絕的危險，為該物種的保存和可持續利用提供了非常有效的繁殖方法。解決了傳統野生 種子繁殖困難，繁殖受阻的狀況。通過本發明組培快繁得到的幼苗，成苗一致性強，生長健壯，葉色濃綠，病蟲害較少，易於管理。不受季節限制，任何時候都可以進行組培。可以保持物種特性，使該品種能夠延續和可持續利用。節約了生產成本，且生產過程中分化率高，繁殖速度快。
權利要求
1.德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩葉片消毒後，順序在愈傷組織誘導、分化、壯苗、生根培養基中進行原球莖愈傷組織誘導、分化、壯苗、生根培養，然後進行試管苗移栽，所述的愈傷組織誘導培養基為MS + 2,4-D 2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/I + 3% 蔗糖 + O. 8% 瓊脂，分化培養基為 MS + 6-BA O. 5 mg/1 + NAA O. 5 mg/1 + 3% 蔗糖+ 0.8%瓊脂，壯苗培養基為MS+IAA1.0 mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂培養基，生根培養基為1/2MS mg/Ι + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂培養基；誘導、分化、壯苗、生根培養的溫度為23-25°C，溼度為30-45%，光照強度為1000-3000LX，光照時間為16h/d。
2.如權利要求I所述的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，其特徵在於所述的葉片消毒先用自來水衝洗3飛遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H202溶液浸泡15分鐘，無菌蒸餾水清洗5遍。
3.如權利要求I所述的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，其特徵在於所述的試管苗移栽是生根組培苗在培養瓶內培養20天後，煉苗5天再移栽於溫室大棚，移栽基質為混有滅過菌的營養土即園土 腐殖土 砂土 =2:2:1和適量珍珠巖，移栽7天內用塑料薄膜覆蓋裝有基質的營養盤，遮陽保溼，使環境相對溼度保持在80%，早晚通氣半小時，成活後去除塑料薄膜，待組培苗長出健壯的莖葉時移入大田。
4.如權利要求I所述的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，其特徵在於選德欽野生紫花苜蓿的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水衝洗3飛遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15 min，無菌蒸餾水清洗5遍，然後每一小葉切成5 mm X 5 mm的小塊，將切好的幼嫩葉片接種於愈傷組織誘導培養基MS + 2，4-D 2. O mg/1+ 6-BA I. O mg/1 + 3%蔗糖+.O.8%瓊脂中，培養條件為溫度24°C，光照16h，光照強度1000LX，培養45 d，把經過篩選具有胚性的質地緻密或顆粒狀或具有綠色芽點，體積適中的愈傷組織塊進行分割，使愈傷組織塊大小均一，將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉入同一分化培養基MS +6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進行體細胞胚生長和發育的培養，培養條件為溫度24°C，光照強度3000LX，光照16h，培養45 d ;將在分化培養基生成的叢生芽轉到壯苗培養基MS+IM1. O mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + O. 8%瓊脂進行壯苗培養基使其快速生長，形成大的叢生苗並伸長，培養10天，將生成2 3cm高的無根小苗在節間下部Imm處切下，移入生根培養基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂，培養條件為溫度24°C，光照強度3000LX,光照16h，IOd後生根，當試管苗出現3飛條粗根，長2 3cm，苗高5cm以上時移栽，先打開封瓶膜，經:T5d鍛鍊，移入混有滅過菌的營養土即園土 腐殖土 砂土 =2:2:1和適量珍珠巖的培養盤內，最初7天用塑料薄膜覆蓋，遮陽保溼，使環境相對溼度保持在80%，並早晚通氣半小時，成活後去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。
全文摘要
德欽野生紫花苜蓿(Medicagao sativa L.)無菌苗組織培養及快速繁殖的方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩葉片進行原球莖誘導、分化、壯苗、生根培養。通過本發明方法，繁育的野生紫花苜蓿在一月內可增殖係數為10，平均生根率為98%，平均移栽成活率為95%，極大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖係數，阻止了由於野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導致該物種瀕臨滅絕的危險，為該物種的保存和可持續利用提供了非常有效的繁殖方法。
文檔編號A01H4/00GK102907326SQ20121044008
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月7日 優先權日2012年11月7日
發明者畢玉芬, 姜華, 何承剛, 馬向麗, 趙雁, 申亞楠 申請人:雲南農業大學