一種抗菌肽gw13及其製備方法和應用的製作方法
2023-12-09 03:58:01 2
專利名稱：一種抗菌肽gw13及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種抗菌肽，具體涉及ー種抗菌肽GW13及其製備方法和應用。
背景技術：
抗菌肽是生物體內廣泛存在ー種具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特異性防禦系統的免疫應答產物，具有廣譜抗菌和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性。抗菌肽的抑菌機理與抗生素不同，它是通過物理滲透作用於細菌細胞膜，破壞膜上磷脂雙分子層，從而使膜內物質外流，導致細菌死亡，因此，抗菌肽不產生耐藥性。抗菌肽本身是ー種多肽類物質，不存在殘留性問題，所以抗菌肽是抗生素最理想的替代物，具有極為廣闊的市場應用前景。目前，上千種抗菌肽已經從各種動植物 體中提取出來，但作為抗生素替代品用於醫療領域的抗菌肽卻很少。限制抗菌肽成為抗生素替代物的原因有以下兩個方面一方面是抗菌肽對於正常細胞，比如紅細胞等也造成溶血作用，也就是細胞選擇性低，那麼，尋找ー種提高抗菌肽細胞選擇性的方法勢在必行。細胞選擇性是抗菌肽對不同細胞的不同選擇性作用，也就是對有害微生物有抑制或殺傷作用，而對正常細胞沒有毒性作用。抗菌肽的治療指數是評價其細胞選擇性的關鍵性指標。抗菌肽的治療指數越大，抗菌肽的細胞選擇性就越高，說明該抗菌肽成為抗生素替代品的可行性越大。影響抗菌肽應用的第二個方面是，生產成本問題。目前對於抗菌肽的結構功能研究，主要通過化學合成的方法獲得抗菌肽，胺基酸數目越多，合成成本越高，所以，細胞選擇性高的抗菌小肽成為人們研究的熱點。抗菌肽的種類繁多，結構複雜，因此很難找到統一的模型來代表所有抗菌肽進行研究。另夕卜，人們盲目的使用基因工程的方法表達抗菌肽，而沒有對抗菌肽的結構和功能以及體外試驗進行全面的摸索，導致表達得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性和細胞毒性。目前為止，已經有很多種方法來研究抗菌肽的結構和功能之間的關係。比如通過構建抗菌肽庫的方法篩選抗菌肽，或利用最小化方法來得到僅含有幾種胺基酸的全新抗菌肽等方法。本發明通過截取自然存在的天然抗菌肽的一段胺基酸殘基片段，並將其羧基末端特徵性三殘基胺基酸複合物循環連接一次，設計得到全新抗菌肽。該三殘基胺基酸殘基包括，Arg (精氨酸；R)、Trp (色氨酸；W)、Leu (亮氨酸；L)。Arg是ー種鹼性胺基酸，提供的正電荷可與細菌表面的負電荷發生靜電吸引作用，而且這種吸引作用比其他兩種鹼性胺基酸(Lys和His)更強。Trp和Leu均是疏水性胺基酸，可與細菌表明的磷脂發生疏水性作用，破壞細菌的磷脂膜，從而產生生物學活性。研究發現富含Trp和Leu抗菌肽的抑菌潛カ強於其他疏水性胺基酸。國內外還未見到利用天然抗菌肽的羧基末端片段截取的小肽連接重複的(RWL)結構特徵單元來研究抗菌肽結構與功能關係的報導和研究。
發明內容
本發明是為了得到抗菌活性較高而細胞毒性相對較低的抗菌肽，從而設計了ー種高細胞選擇性的抗菌肽GW13及其製備方法。抗菌妝GW13 的胺基酸序列是=GlyLeuArgProLysTyrSer (ArgTrpLeu) 2_NH2
抗菌肽GW13的製備方法如下I)根據定點胺基酸片段截取方法，截取線性雞β -防禦素4羧基末端13個胺基酸片段，並去除ニ硫鍵，獲得GWlO抗菌肽，將典型片段ArgTrpLeu重複連接，獲得GW13抗菌肽。2)採用固相化學合成法通過多肽合成儀得到肽樹脂；將得到的肽樹脂經過TFA切割後，得到兩條多肽；然後經過反相高效液相色譜純化和質譜鑑定後，即完成多肽的製備；3)對抗菌肽的最小抑菌濃度和溶血活性進行了分析檢測，並對其治療指數進行計算，結果表明通過ArgTrpLeu疊加性連接，提高了肽的抗菌肽活性和治療指數；GW13具有較高的細胞選擇性，具有成為抗生素替代物的發展潛力。通過本方法製備的抗菌肽的實驗技術簡單，對得到的抗菌肽進行抗菌和溶血活性檢測，發現GW13不但對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門 氏菌、雞沙門氏菌，枯草芽孢桿菌、糞鏈球菌八種菌種有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，綜合來看，GW13是ー種具有較高應用價值的抗菌肽。
圖I為抗菌肽GWlO的質譜圖；圖2為抗菌肽GW13的質譜圖。
具體實施例方式實施例I : 線性雞β -防禦素4的胺基酸序列為Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro151015Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro；202530Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu_NH23538定點截取線性雞β -防禦素4羧基末端13個胺基酸片段，並去除ニ硫鍵，獲得GW10 (GlyLeuArgProLysTyrSerArgTrpLeu-NH2)片段。將典型片段ArgTrpLeu 重複連接，獲得 GW13 (GlyLeuArgProLysTyrSer (ArgTrpLeu)2-ΝΗ2)抗菌肽。GWlO和GW13為胺基酸數量為10和13的小肽。實施例2 將上述兩個抗菌肽使用多肽合成儀進行合成，方法為固相化學合成法，具體步驟為I)抗菌肽的製備從C端到N端逐一進行，通過多肽合成儀來完成。首先將Fmoc-X (X是每個抗菌肽的C端第一個胺基酸)接入到Wang樹脂，然後脫去Fmoc基團後得到X-Wang樹脂；再將Fmoc-Y-Trt-OH (9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y為每個抗菌肽C端第二個胺基酸)；按照這個程序依次從C端合成到N端，直至合成完畢，得到脫去Fmoc基團的側鏈保護的樹脂；
在上述得到的肽樹脂中，加入切割試劑，20°C避光下反應2小吋，過濾；沉澱TFA(三氟こ酸)洗滌，將洗液與上述濾液混合，旋轉蒸發儀濃縮，再加入10倍左右體積的預冷無水こ醚，_20°C沉澱3h，析出白色粉末物，以2500g離心lOmin，收集沉澱，再用無水こ醚洗滌沉澱，真空乾燥，得到多肽，其中切割試劑由TFA、水和TIS(三異丙基氯矽烷)按照質量比95 2. 5 2. 5混合而成； 使用O. 2mol/L硫酸鈉(磷酸調節至ρΗ7· 5)進行柱平衡30min,用90%こ腈水溶液溶解多肽，過濾，C18反相常壓柱，採用梯度洗脫(洗脫劑為甲醇和硫酸鈉水溶液按照體積比為30 70 70 30混合)，流速為lml/min，檢測波為220nm，收集主峰，凍幹；再利用反相C18柱進ー步純化，洗脫液A為O. I % TFA/水溶液；洗脫液B為O. I % TFA/こ腈溶液，洗脫濃度為25% B 40% B，洗脫時間為12min，流速為lml/min，再同上收集主峰，凍幹;抗菌肽的鑑定將上述得到的抗菌肽經過電噴霧質譜法分析，質譜圖中顯示的分子量(見附圖1、2)與表一中的理論分子量基本一致，抗菌肽的純度大於95%。表I抗菌肽的設計
權利要求
1.ー種抗菌肽GW13，其特徵在於，胺基酸序列為GlyLeuArgProLysTyrSer(ArgTrpLeu) 2-NH2。
2.一種製備如權利要求I所述抗菌肽GW13的製備方法，其特徵在於，方法如下1)根據定點胺基酸片段截取方法，截取線性雞β_防禦素4羧基末端13個胺基酸片段，並去除ニ硫鍵，獲得GWlO GlyLeuArgProLysTyrSerArgTrpLeu片段，將典型片段ArgTrpLeu 重複連接，獲得 GW13 GlyLeuArgProLysTyrSer (ArgTrpLeu) 2_NH2 :抗菌妝；2)採用固相化學合成法通過多肽合成儀得到肽樹脂；將得到的肽樹脂經過TFA切割後，得到兩條多肽；然後經過反相高效液相色譜純化和質譜鑑定後，即完成多肽的製備。
3.—種如權利要求I所述的ー種抗菌肽GW13的應用，其特徵在於治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的藥物中應用。
全文摘要
本發明涉及一種抗菌肽GW13及其製備方法和應用。其胺基酸序列為GlyLeuArgProLysTyrSer(ArgTrpLeu)2-NH2。其製備方法為1)根據定點胺基酸片段截取方法，截取線性雞β-防禦素4羧基末端13個胺基酸片段，並去除二硫鍵，獲得GW10(GlyLeuArgProLysTyrSerArgTrpLeu-NH2)片段，將特徵性的三殘基複合物ArgTrpLeu重複連接，獲得GW13抗菌肽；2)使用多肽合成儀進行固相合成法合成肽樹脂；經TFA切割後得到多肽，反相高效液相色譜純化。本發明所得到的抗菌肽GW13具有較強的抑菌活性和較弱的溶血活性，治療指數最高，具有很大的發展潛力。
文檔編號C07K1/06GK102827255SQ201210296758
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者單安山, 董娜, 馬清泉, 胡婉寧 申請人:東北農業大學