一種腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗及其製備方法

2023-12-09 04:00:36

專利名稱：：一種腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於疫苗領域，特別是涉及一種針對腎症候群出血熱的黏膜免疫疫苗及其製備方法。
背景技術：
：漢坦病毒(Hantavirus)是一種分節斷的負鏈RNA病毒，屬於布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬，齧齒動物是漢坦病毒的主要宿主。依血清型和基因型可以將漢坦病毒分為近30個病毒種(species)。漢坦病毒可以引起人類兩種疾病，即腎症候群出血熱(HemorrhagicFeverwithRenalSyndrome,HFRS)和漢坦病毒肺症候群(HantavirusPulmonarySyndrome,HPS)。腎症候群出血熱是以發熱、出血傾向及腎臟損害為主要臨床特徵的急性病毒性傳染病。按國際分型習慣，引起腎症候群出血熱的是漢坦病毒中的漢灘型(Hantaan)、漢城型(Seoul)、多布拉瓦型(Dobrava)、普馬拉型(Puumala)型和Saaremaa型病毒。在我國，將引起腎症候群出血熱的漢坦病毒分類為野鼠型和家鼠型等，分別和漢灘型(Hantaan)和漢城型(Seoul)等對應。我國是受漢坦病毒危害最嚴重的國家，世界上的腎症候群出血熱多發生在我國。目前我國使用的腎症候群出血熱疫苗都是通過肌肉注射的滅活疫苗，包括單價及雙價疫苗。與傳統注射疫苗相比，黏膜疫苗因其簡便、經濟、低痛及可避免不潔接種而導致疾病傳播等諸多優點而引起越來越多研究者的關注，但針對腎症候群出血熱的黏膜免疫疫苗尚未見報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種可經黏膜途徑免疫接種的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗。本發明的技術方案如下一種腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗，至少包含(a)—種或多種型別滅活漢坦病毒，和(b)殼聚糖，其中殼聚糖以微米顆粒的形式存在，滅活漢坦病毒被包裹於殼聚糖微米顆粒中。進一步的，本發明的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗還可以包含(c)大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)。上述滅活漢坦病毒可以來源於任何會引起腎症候群出血熱的型別，包括漢灘型(Hantaan)、漢城型(Seoul)、多布拉瓦型(Dobrava)、普馬拉型(Puumala)型和Saaremaa型等漢坦病毒。通常是用e—丙內酯或其他方法進行滅活處理。優選家鼠型或野鼠型單一型別的滅活漢坦病毒，或者是二者的混合物。目前廣泛應用於注射疫苗的滅活漢坦病毒都可以用於本發明。滅活漢坦病毒典型的製備過程包括VeroE6細胞或其他細胞培養漢坦病毒，收穫病毒，卩-丙內酯或福馬林等其他方法滅活，濃縮後過柱純化，然後添加一定量的人血清白蛋白作為保護劑。可以用雙抗體夾心酶連免疫吸附試驗檢測純化滅活病毒的抗原活性，紫外比色法(280nm)確定包含病毒的總蛋白含量[宋乾等，病毒學報，1985，1(1):25-29]。所製備的滅活漢坦病毒通常以溶液狀態保存，一般在分子篩純化病毒後，添加終濃度為0.5-1%g/ml的人血清白蛋白作為保護劑，然後再調整溶液體積使總蛋白含量為20—500Ug/mL加以儲存。上述殼聚糖形成微米顆粒，以膠體溶液形式存在，所用殼聚糖優選分子量為2100—2210，乙醯化度為80—90%,本發明黏膜免疫用疫苗中殼聚糖的含量為0.1%0.4%g/mL。在本發明中，事先配製殼聚糖膠體溶液，然後將其與滅活漢坦病毒儲存溶液按預定比例混合，二者混合後，滅活漢坦病毒被包裹於殼聚糖微米顆粒當中。上述殼聚糖膠體溶液可以採用如下方法製備得到先將醫用級別的殼聚糖溶解，濾膜過濾除菌後加入適量多聚磷酸鈉(終濃度為0.001-0.05%)得到殼聚糖膠體溶液，該殼聚糖膠體溶液中殼聚糖的濃度為0.2%-0.5%g/ml。溶解殼聚糖最常用的溶劑是低濃度的無機酸或某些有機酸，如0.1%甲酸、0.25%冰乙酸、10%檸檬酸等。上述方法製備得到的滅活漢坦病毒儲存液和殼聚糖膠體溶液通常可以按i:i一i:4的體積配伍，所得疫苗中殼聚糖的含量為0.1%0.4%g/mL，而包含病毒在內的總蛋白含量為5-250ug/mL。上述大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位是大腸桿菌不耐熱毒素(Heat-labileenterotoxin，LT)中的B亞單位，其具有無毒，但卻能有效協助遞呈外界抗原到黏膜淋巴相關組織中，具有較強的黏膜免疫佐劑活性。在本發明的疫苗中其用量範圍是為0.5-5wg/mL。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的獲得，可以首先通過基因工程的手段將其基因克隆到表達載體中，然後再轉化大腸桿菌進行表達，最後進行分離純化得到，這些方法均是本領域技術人員所熟知的，於此不再贅述。本發明腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗的製備方法是，分別製備滅活漢坦病毒儲存溶液、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位和殼聚糖膠體溶液，然後按比例將各組分混合即可。本發明的疫苗組合物中還可以包含一種或多種其他佐劑，可以在混合形成上述組合物之前和/或之後加入。所述佐劑例如CpGODNs(富含CG的寡核苷酸片斷)，比如說CpGm26:5'隱TCCATCACGTTCCTGACGTT隱3'(MichaelJ.McCluskie等，Vaccine2001，19:2657-2660)。本發明的疫苗組合物通常是以pH6.5-8.0的膠體溶液或懸浮液形式存在和包裝。本發明的疫苗是針對黏膜給藥而設計的，可選擇的給藥途徑包括口、鼻、生殖道、直腸等等，其中以鼻內和口服途徑最切實可行。因此，本發明的疫苗優選適合於鼻內給藥的包裝及相應口服包裝，如鼻噴霧劑、滴鼻劑、凝膠或口服膠囊。在本發明所提供的黏膜免疫用腎症候群出血熱疫苗中，殼聚糖、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位均為無毒生物製劑，殼聚糖微米顆粒具有緩釋、抗消化的作用，而LTB具有黏膜佐劑活性。動物實驗結果顯示，本發明的疫苗經鼻腔和口服接種均能有效激發機體產生抗漢坦病毒的特異黏膜免疫應答和體液免疫應答，與對照組相比具有統計學意義(p〈0.01)，較傳統出血熱注射疫苗具有安全、方便、經濟等優點，對於腎症候群出血熱的預防具有重要意義。圖la是通過SDS-PAGE電泳鑑定實施例1所表達純化的LTB的電泳結果圖；圖lb是通過westernblot鑑定實施例1所表達純化的LTB的結果圖。圖2a是200倍光學顯微鏡下觀察到的殼聚糖微米顆粒；圖2b是200倍光學顯微鏡下觀察到的實施例1製備的病毒性腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗。圖3a是實施例1所製備的配伍一疫苗滴鼻和口服黏膜免疫小鼠後誘導產生slgA效果的統計結果圖；圖3b是實施例1所製備的配伍一疫苗滴鼻和口服黏膜免疫小鼠後血清IgG免疫應答效果的統計結果圖。圖4a是實施例1所製備的配伍二疫苗滴鼻和口服黏膜免疫小鼠後誘導產生slgA效果的統計結果圖；圖4b是實施例1所製備的配伍二疫苗滴鼻和口服黏膜免疫小鼠後血清IgG免疫應答效果的統計結果圖。具體實施方式下面結合附圖，通過具體實施例對本發明作進一步說明，但不以任何方式限制本發明的範圍。實施例l、疫苗的製備一、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的表達純化1、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位基因的擴增1)PCR擴增引物上遊引物5，隱CATCCATGGCTCCCCAGTCTA-3，(含NcoI位點)下遊引物5，-TAACTCGAGGTTTTCCATACT-3,(含XhoI位點)2)PCR擴增條件PCR反應體系為lOOul，體系組成為IOX緩衝液10ul4XdNTP(各2.5mmol/L):5ul上遊引物(10pmol/L):2.5lU下遊引物(10pmol/L):2.5ul反應模板大腸桿菌(￡.co")菌株H1M7菌液2u1高保真DNA聚合酶(5U/ul):0.5雙蒸tK:77.5ulPCR反應條件為:95'C40s，52。C45s，72°C45s，共30個循環，PCR結束後1.5%瓊脂糖凝膠純化回收3)pET22b-LTB表達載體構建上述PCR產物和pET22b質粒(德國Novagen公司)用限制性內切酶NcoI和XhoI酶切後，1.5%瓊脂糖凝膠純化回收，用T4DNA連接酶連接轉化DH5a菌株，挑取陽性克隆，DNA測序驗證，得到含有LTB基因的重組質粒pET22b-LTB。2、LTB基因的誘導表達，純化與鑑定取pET22b質粒和上述獲得的pET22b-LTB質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，接種於2XYT培養基37°C振蕩培養至OD,達到0.8左右，加入終濃度為10g/L的乳糖進行室溫誘導培養6h。之後6500g離心15分鐘收穫菌體，常規方法提取目的蛋白，N嚴親和層析純化，1XPBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.4)緩衝液透析得到帶His-Tag的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)。Bradford法測定LTB含量，儲存液濃度調整為10—25ug/mL。通過SDS-PAGE電泳(圖la)禾卩westernblot(圖lb)鑑定，結果顯示LTB獲得成功表達和純化，圖中箭頭所示為目的蛋白。圖la中Ml為分子量標記物；l為含pET22b質粒的BL21菌體表達的總蛋白(對照)；2為含pET22b-LTB質粒的BL21菌經10g/L乳糖誘導後表達的總蛋白；3為表達並純化出的目的蛋白LTB。圖lb中M2為分子量標記物，1為含pET22b質粒的BL21菌體表達的總蛋白(對照)；2為表達並純化出的目的蛋白LTB。二、殼聚糖膠體溶液的製備量取0.25ml冰醋酸溶解於100ml雙蒸水中獲得0.25%醋酸溶液。稱取藥用級乙醯化殼聚糖(85%乙醯化)0.2—0.5g，溶解於0.25%醋酸溶液100ml中,即獲得0.2—0.5%g/ml殼聚糖溶液。之後加入終濃度為0.001-0.05%的多聚磷酸鈉，室溫混勻得到含殼聚糖微米顆粒的膠體溶液，光學顯微鏡下可見均勻分散的微米粒子，此即殼聚糖微米顆粒(如圖2a示)。三、滅活漢坦病毒的製備1、採用2.5升轉瓶加含500毫升10%胎牛血清的eagle's培養基(生長液)，接種VeroE6細胞傳代培養，培養條件為37'C，5%C02，轉速10rpm;2、待細胞貼壁並長滿後，棄掉培養基，按l:200接種漢坦病毒，吸附2小時後補加含2%胎牛血清的eagle's培養基(維持液)繼續培養7-9天；3、收集上清，4T:下P-丙內酯滅活24小時，37。C水解2小時；4、將上述滅活病毒原液採用濾板(300kpellicon，美國Millipore公司)濃縮大約50倍；5、分子篩(Sepharose4FFcolumn)過柱純化，其中平衡和洗脫液均為1XPBS，最終純化的滅活漢坦病毒為液體形式存在，溶劑為1XPBS。雙抗體夾心酶連免疫吸附試驗檢測純化滅活病毒的抗原活性；6、加入終濃度為0.5-1%g/ml人血清白蛋白作為穩定滅活病毒的保護劑，然後用紫外比色法(280nm)確定總蛋白含量，之後調整滅活漢坦病毒儲存液的體積，使總蛋白濃度為20—500ixg/mL。四、腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗的配伍配伍一量取漢坦病毒儲存液(含滅活的家鼠型或野鼠型單一型別的漢坦病毒，或是家鼠型和野鼠型等量混合物)2.5uL，量取LTB儲存液0.5iiL，量取2—7pL上述売聚糖微米顆粒膠體溶液中，室溫均勻混合後得5—10wL配伍腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗。取一滴疫苗在光學顯微鏡下(放大200倍)可見為均勻分散的微米小顆粒(如圖2b所示)，根據標尺可見比單純的殼聚糖微米顆粒(圖2a)大1倍左右。酶聯免疫實驗證實，在殼聚糖膠體溶液中加入滅活漢坦病毒後，滅活病毒被包裹到殼聚糖微米顆粒中。採用雙體夾心法檢測，取96孔板，每孔100ng抗漢坦病毒核蛋白單抗包被，4t:過夜，之後加入配伍一疫苗，陽性對照為滅活病毒原液，陰性對照為PBS緩衝液，各設4個復孔，37'C溫育2小時。然後洗板，加入辣根過氧化物酶標記的抗漢坦病毒核蛋白單抗，37。C溫育l小時。PBS-T洗板6次顯色，記錄450nm下吸光度值，結果見表1。表l:檢測殼聚糖包裹滅活病毒情況分組本發明陽性對照陰性對照吸光度0.1340.1090.1470.1270.7710.7010.7160.6940.1120,0990.0890.11均值0.1300.7200.102從表中可以看出本發明與陽性對照相比吸光度值明顯下降(0.720/0.130比值>2),由此可間接推斷滅活病毒己經包裹於殼聚糖膠體溶液中並仍以微米顆粒形式存在(圖2b)配伍二量取漢坦病毒儲存液2.5uL與2.5—7.5"L殼聚糖膠體溶液室溫均勻混合後得5—10uL配伍腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗。陰性對照組配伍即僅用滅活病毒進行免疫接種，量取漢坦病毒儲存液2.5uL與2.5一7.5ixLlXPBS室溫均勻混合。實施例2、疫苗的檢驗一、腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗安全性實驗因本發明疫苗中存在大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位，而大腸桿菌不耐熱腸毒素是導致腹瀉的主要毒素之一，雖然理論上B亞單位為無毒的，但基於以後本發明要應用於人群接種的安全性考慮，首先在細胞和實驗動物水平進行了毒性評估。細胞水平採用哺乳動物細胞系VeroE6進行，陽性對照組為商業霍亂毒素0.1ug/mL，樣本組分別加10ug/mL，20yg/mL，50ug/mL，100ug/mLLTB,細胞培養3天後陽性對照組開始出現細胞脫落、縮小等症狀，5天細胞明顯脫落死亡。而樣本組均生長良好。動物水平6-8周齡雌C57BL/6小鼠隨機分兩組，每組6隻。將上述腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗口服10倍劑量，同時設立口服PBS對照組。觀察各組小鼠的是否有腹瀉症狀。結果實驗組和對照組小鼠大便正常，均無腹瀉症狀。二、腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗免疫效果實驗結果1、實驗動物分組6~8周齡，雌C57BL/6小鼠隨機分8組，每組6隻，其中配伍一4組分別為滴鼻接種及對照組，口服接種及對照組；配伍二4組分別為滴鼻接種及對照組，口服接種及對照組。；2、腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗接種滴鼻免疫組和口服免疫組，取腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗(配伍一和配伍二)進行滴鼻和口服免疫接種，每次接種5-10微升，其相應的對照組為單獨用滅活漢坦病毒。免疫方式為0，14d，28d接種三次。3、黏膜免疫抗體應答黏膜免疫結束後，通過1XPBS衝洗小鼠陰道後收集衝洗液約50ul/只，通過斷尾採血，分離血清。ELISA方法檢測黏膜免疫後黏膜免疫分泌型IgA抗體(slgA)和體液免疫IgG應答。具體操作程序為(1)取表達並純化的漢坦病毒核蛋白(梁米芳等，中華實驗和臨床病毒學雜誌，1993;7(3):225)包被96孔酶標板，4"C過夜，5%脫脂奶封閉後備用。(2)黏膜免疫反應sIgA的檢測陰道衝洗液約按(l:2)稀釋加入上述96孔板，37°C2小時，之後PBS-T(含0.1%吐溫-100的磷酸鹽緩衝液)洗板三次，加入辣根過氧化物酶標羊抗鼠sIgA，37°C1.5小時；黏膜免疫血清IgG檢測取相應免疫血清按1:200，1:400，1:800，1:1600，l:3200倍比稀釋後加入96孔板，37°C2小時，之後PBS-T洗板三次，加入辣根過氧化物酶標羊抗鼠IgG，37°C1.5小時。(3)反應完畢後PBS-T洗板6次，DAB(鄰苯二胺)顯色，4NH2S04終止，記錄OD.450值。(4)數據處理血清IgG抗體免疫應答結果採用抗體稀釋倍數取對數後平均值士SD表示，黏膜免疫sIgA結果直接450nm吸光度均值土SD表示，免疫組與對照組間數據分析採用Student'st檢驗(p<0.05)。實驗結果顯示，本發明經滴鼻、口服與對照組相比均能有效(p<0.01)刺激機體產生特異黏膜免疫sIgA抗體(圖3a，4a)和體液免疫IgG抗體應答(圖3b，4b)。滴鼻、口服組特異黏膜免疫slgA抗體反應結果分別為0.340±0.041和0.308±0.057，特異血清IgG抗體反應結果分別為2.803±0.155和2.502±0.246。4、微量中和試驗測定中和抗體滴度VeroE6細胞消化後接種96孔板，培養過夜待貼壁即可用於實驗。取100TCID5o漢坦病毒與2倍稀釋C57BL/6小鼠免疫血清等體積混合，4'C中和過夜。將中和完畢的混合液接種於上述96孔板中，每個稀釋度4孔重複，37'C繼續培養7天後檢測細胞染毒情況。中和抗體滴度用50%或絕大部分(80%以上)細胞孔被中和抑制的血清最高稀釋度的倒數表示。微量中和實驗結果顯示腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗配伍一和二經滴鼻和口服可產生較強保護性中和抗體，抗體滴度分別為1:16和1:8左右(表2)。表2:滴鼻和口服免疫組鼠血清中抗漢坦病毒中和活性結果x^疫組別中和滴度\陽性對照承配伍一配伍二tableseeoriginaldocumentpage10*滅活漢坦病毒與鋁劑混合皮下注射，即用傳統疫苗進行免疫;**在不加佐劑的情況下，單用滅活漢坦病毒滴鼻；***在不加佐劑的情況下，單用滅活漢坦病毒口服。由上述實驗可以證明K本發明的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗製備方便、經濟，免疫簡便易行，低疼痛，易於接受。2、本發明的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗可以經鼻腔和口服兩種途徑免疫接種，這兩種途徑接種均可產生較強保護性中和抗體。3、動物實驗表明，本發明具有良好的生物安全性，能有效激發機體對漢坦病毒產生特異的局部和系統免疫應答，可以用於新型腎症候群出血熱疫苗的生產。權利要求1.一種黏膜免疫用腎症候群出血熱疫苗，其包含滅活漢坦病毒和殼聚糖，所述滅活漢坦病毒來源於一種或多種型別的會引起腎症候群出血熱的漢坦病毒，殼聚糖以微米顆粒的形式存在，滅活漢坦病毒被包裹於殼聚糖微米顆粒中。2.如權利要求1所述的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗，其特徵在於所述滅活漢坦病毒是家鼠型和/或野鼠型滅活漢坦病毒。3.如權利要求1所述的黏膜免疫用腎症候群出血熱疫苗，其特徵在於所述殼聚糖分子量為2100—2210，乙醯化度為80—90%。4.如權利要求1所述的黏膜免疫用腎症候群出血熱疫苗，其特徵在於該疫苗中殼聚糖的含量為0.1%0.4%g/mL。5.如權利要求1所述的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗，其特徵在於該疫苗還包含大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位，其含量為0.5-5ug/mL。6.如權利要求15中任一權利要求所述的腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗，其特徵在於所述疫苗以pH6.5-8.0的膠體溶液或懸浮液形式存在。7.權利要求1所述腎症候群出血熱黏膜免疫用疫苗的製備方法，先分別製備滅活漢坦病毒儲存液和殼聚糖膠體溶液，然後將二者混合。8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述殼聚糖膠體溶液的製備包括先將醫用級別的殼聚糖溶解，濾膜過濾除菌後加入多聚磷酸鈉得到殼聚糖膠體溶液，其中殼聚糖濃度為0.2%-0.5%g/mL，多聚磷酸鈉濃度為0.001-0.05%g/mL。9.如權利要求8所述的製備方法，其特徵在於所述殼聚糖分子量為2100—2210，乙醯化度為80—90%。10.如權利要求8或9所述的製備方法，其特徵在於首先，按照下列步驟l)4)製備滅活漢坦病毒儲存液1)細胞培養漢坦病毒後收穫病毒；2)用p-丙內酯或福馬林滅活病毒；3)濃縮後過柱純化病毒，之後添加終濃度為0.5-1%g/ml的人血清白蛋白作為保護劑；4)調整溶液體積，使總蛋白濃度為20—500Ug/mL;然後將該滅活漢坦病毒儲存液與殼聚糖膠體溶液按體積比1:l一l:4混合。全文摘要本發明公開了一種腎症候群出血熱黏膜免疫疫苗及其製備方法。該疫苗包含來源於一種或多種型別的能夠引起腎症候群出血熱的漢坦病毒的滅活病毒和殼聚糖，其中殼聚糖以微米顆粒的形式存在，滅活漢坦病毒被包裹於殼聚糖微米顆粒中，進一步的，該疫苗還可以包含具有黏膜佐劑活性的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。動物實驗結果顯示，本發明的疫苗經鼻腔和口服接種均能有效激發機體抗漢坦病毒的特異性黏膜免疫應答和體液免疫應答，與對照組相比具有統計學意義(p＜0.01)，相比於傳統出血熱注射疫苗具有安全、方便、經濟等優點。文檔編號A61P31/00GK101249261SQ200810102120公開日2008年8月27日申請日期2008年3月18日優先權日2008年3月18日發明者劉琴芝,張全福,曹守春,川李,李德新,梁米芳申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所