用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的製作方法

2023-12-08 18:58:41 2

用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的製作方法
【專利摘要】本發明提供：用於肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM、AIM的部分肽、或含有編碼所述AIM或所述部分肽的核苷酸序列的核酸；用於篩選用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的方法，其使用通過用高脂肪膳食飼餵AIM表達不足的非人哺乳動物而產生的動物；等等。
【專利說明】用於肝臟疾病的預防劑或治療劑

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用於肝臟疾病等的預防劑或治療劑。

【背景技術】
[0002] 代謝症候群是近年來隨著生活環境的變化快速出現的現代疾病，並且像多米諾骨 牌的倒下一樣發展出各種難於控制的疾病組，諸如2型糖尿病、動脈硬化性疾病等。在該系 列疾病中，從早期階段起連同肥胖變得顯著的是脂肪肝。最近已經闡明，百分之幾十的患有 脂肪肝的患者進展至被稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的疾病。在NASH中，大範圍的肝 實質以不依賴於酒精的方式變得纖維化，並且肝硬化和肝癌經常進一步發生。儘管胰島素 敏化劑、抗氧化劑、護肝劑（liver supporting agent)、抗高脂血症劑、降壓藥等用於治療 NASH，但不存在確立的治療方法，並且已經期望開發有效的治療藥物。
[0003] NASH的準確發病機理仍不清楚。儘管已經提出炎症和胰島素耐抵抗與脂肪肝組 合從而發生NASH的兩次打擊理論，但是沒有任何結論性的實驗證據。作為NASH的動物模 型，可以提到用MCD(甲硫氨酸-膽鹼缺乏膳食）或四氯化碳飼餵（load)的小鼠；然而，由 於肝衰竭導致的肝壞死後的纖維化是具有降低的體重的主要部分，並且無法準確反映患有 代謝症候群的人患者中的肝纖維化，其是由於營養過剩而由肥胖和脂肪肝引起的。一旦可 以生成能夠再現人病理學的NASH的動物模型，則可以篩選或評估用於NASH的治療藥物。
[0004] 儘管代謝症候群基於獲取與肥胖相關的胰島素耐抵抗，但在最近幾年已經闡明， 脂肪組織的慢性炎症是重要的。由於肥胖導致的脂肪組織的持續炎症在整個機體中擴散以 誘導全身性胰島素耐抵抗。
[0005] 本發明人在最近幾年已經闡明，病理學的關鍵是如下所述（非專利文獻1-4)的 AM(巨噬細胞的凋亡抑制劑）。AM由巨噬細胞特異性產生且存在於血液中。由於肥胖， AIM的血液濃度增加，AIM經由⑶36通過胞吞作用被引入脂肪細胞，誘導累積的中性脂肪 的降解（脂解作用），並從脂肪細胞釋放游離脂肪酸（非專利文獻5)。釋放的脂肪酸經由 toll樣受體的刺激誘導並維持脂肪組織中的慢性炎症（非專利文獻6)。事實上，在AIM敲 除（KO)小鼠中，肥胖不會導致整個機體（包括脂肪組織和肝臟）中的慢性炎症，並且不產 生胰島素耐抵抗，這進而顯著抑制糖尿病和動脈硬化的發生（非專利文獻4、6)。然而，AIM 參與肝臟疾病（特別是NASH)的發病和進展迄今仍然未知。
[0006] [文獻列表]
[非專利文獻] 非專利文獻 I: J Exp Med 189: 413-422，1999 非專利文獻 2: J Biol Chem 276: 22910-22914，2001 非專利文獻 3: Am J Pathol 162: 837-847，2003 非專利文獻 4: Cell Metab 1: 201-213，2005 非專利文獻 5: Cell Metab 11: 479-492，2010 非專利文獻 6: PNAS 108: 12072-12077，2011。
[0007] 發明概述 本發明待解決的問題 本發明的目的是提供用於肝臟疾病的預防藥物或治療藥物。此外，本發明的目的是提 供用於評估或篩選用於肝臟疾病等的預防藥物或治療藥物的新方法。此外，本發明的另一 個目標提供肝臟疾病的診斷方法。
[0008] 解決問題的方法 本發明人研宄了通過飼餵高脂肪膳食而產生肥胖的AIM敲除小鼠的病理學，並且獲得 了非常有趣的發現，即在其中包括肝臟的全身慢性炎症和胰島素抵抗兩者受到抑制的狀態 中發生與（1)肥胖、（2)先前脂肪肝、（3)肝實質的纖維化、和（4)高度頻繁癌發生的人NASH 的病理學類似的病理學。由此認為，補充AIM變為一系列肝臟疾病諸如脂肪肝、NASH和肝 癌的預防或治療方案。
[0009] 本發明人已經基於這些發現進行進一步研宄，並且完成了本發明。
[0010] 因此，本發明提供
[1] 用於肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或 其部分肽的鹼基序列的核酸；
[2] 用於肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含誘導AIM的表達的藥物或穩定AIM的藥 物；
[3] [1]或[2]的藥劑，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或 肝癌；
[4] 篩選用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼餵 AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物；
[5] [4]的方法，其包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼餵條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用測試物質的步驟， (2) 觀察用測試物質施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的以下特性的任何一項或 多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌，和 (V)肝臟中的炎症應答，和 (3) 通過與未施用所述測試物質比較來選擇改善上述特性的測試物質的步驟；
[6] [4]或[5]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或 肝癌；
[7] 評估用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的預防或治療效果的方法，其包括使用通過 用高脂肪膳食飼餵AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物；
[8] [7]的方法，其包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼餵條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用用於肝臟疾病的 預防劑或治療劑的步驟， (2) 觀察用用於肝臟疾病的預防劑或治療劑施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的 以下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌， (V)肝臟中的炎症應答， (3)通過將上述特性與未施用用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的特性比較而評估用 於肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果的步驟；
[9] [7]或[8]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或 肝癌；
[10] 診斷肝臟疾病的方法，其包括以下步驟： (1) 測量試驗主體的樣品的AM濃度的步驟， (2) 將所述試驗主體的樣品的上述AM濃度與健康人的樣品的AM濃度比較的步驟， (3) 當所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度低於所述健康人的樣品的AIM濃度時，判 斷所述試驗主體具有肝臟疾病或具有發生肝臟疾病的高可能性的步驟；
[11] [10]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝 癌；
[12] 用於預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的AIM或其部分肽、 或含有編碼所述AIM或其部分肽的鹼基序列的核酸；
[13] 用於預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的誘導AIM表達的 藥物或穩定AIM的藥物；
[14] [12]或[13]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化 或肝癌；
[15] AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或其部分肽的鹼基序列的核酸，其用於預 防或治療肝臟疾病；
[16] [15]的AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或其部分肽的鹼基序列的核酸，其 中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[17] 誘導AIM表達的藥物或穩定AIM的藥物，其用於預防或治療肝臟疾病；和
[18] [17]的藥物，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
[0011] 發明效果 本發明可以提供用於肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM等作為活性成分。此外， 根據使用本發明的肝臟疾病模型小鼠的篩選方法，可以搜索對於肝臟疾病的預防或治療有 效的物質。此外，使用本發明的肝臟疾病模型小鼠，可以評估已知的用於肝臟疾病的預防劑 或治療劑的效果。此外，本發明可以提供通過測量試驗主體的樣品中的AIM濃度用於診斷 肝臟疾病的方法。
[0012] 附圖簡述 圖1顯示表示以下的圖：A :用高脂肪膳食飼餵的AM KO小鼠和WT小鼠的肝重量、肝重 量與體重的比率和肝中中性脂肪的重量。平均值土SEM，P〈0. 001。B :用高脂肪膳食 飼餵的AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片的蘇木精-伊紅（HE)染色的圖像。
[0013] 圖2 A:用高脂肪膳食飼餵之後第20周AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片的天 狼星紅染色的圖像。B:顯示用高脂肪膳食飼餵0、6、12、20、45、55周的AM KO小鼠和WT 小鼠的肝組織切片中纖維化比率的圖。C:顯示用高脂肪膳食飼餵的AM KO小鼠和WT小 鼠的肝臟中TGFI3 1和a SM的相對mRNA表達水平的圖。
[0014] 圖3顯示A :從用高脂肪膳食飼餵52周的AM KO小鼠（表示為AM-/-)和WT小 鼠（表示為AIM+/+)分離的肝臟的拍攝圖像。B:用高脂肪膳食飼餵52周的AIM KO小鼠 的肝組織切片的蘇木精-伊紅染色的圖像。C:顯示用高脂肪膳食飼餵0、6、12、20、45、52 周的AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片中良好分化的肝細胞癌（HCC)的開始頻率的圖。
[0015] 圖4顯示用高脂肪膳食飼餵的AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片的抗AFP抗體 染色的圖像，和顯示用高脂肪膳食飼餵的AM KO小鼠和WT小鼠的肝臟中AFP的相對表達 水平的圖。
[0016] 圖5提供顯示用高脂肪膳食飼餵的AM KO小鼠和WT小鼠的肝臟中F4/80 (巨噬細 胞）、TNFα、IL-6、IL-lβ的相對表達水平的圖。平均值±SEM，*;P〈0·05，** ;P〈0·01， ***; P〈0. OOl0
[0017] 圖6顯示A :AM KO小鼠、WT小鼠和RAG KO小鼠的血清中存在的AM的蛋白質印 跡圖像，和體外結合至單克隆或多克隆IgM的AIM的蛋白質印跡圖像，和B :用IgM靜脈內 注射的RAG KO小鼠的血清中存在的AM的蛋白質印跡圖像。
[0018] 圖7顯示在小鼠和人的血清中AM和IgM水平之間的相關性的圖。
[0019] 圖8顯示抗AM抗體染色的圖像和與AIM孵育的小鼠原代培養肝細胞的蛋白質印 跡圖像。
[0020] 圖9顯示在與油酸預培養之後與或不與AIM孵育的小鼠原代培養肝細胞的油紅0 染色的圖像，和顯示細胞中FSP27的相對表達水平的圖。
[0021] 圖10是3T3-L1前脂肪細胞中AIM或各SRCR結構域蛋白的脂肪細胞分化抑制效 果的圖。
[0022] 圖11是顯示NASH患者和非NASH患者中血清的AM濃度的圖。
[0023] 圖12提供A :用高脂肪膳食與rAM或PBS餵食的AM KO小鼠中體重的變化的圖， 和B :肝的目視圖像，肝組織切片（癌症部位，非癌症部位）的蘇木精-伊紅染色的圖像，顯 示癌症發病率的圖，和顯示用高脂肪膳食與rAIM或PBS餵食的AM KO小鼠中肝中性脂肪 的量的圖。
[0024] 實施方案的描述 本發明中的AIM是包含與SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列相同或實質上相同的氨基 酸序列的蛋白。
[0025] AM可以是，例如，從巨噬細胞分離和純化的蛋白，所述巨噬細胞是溫血動物（例 如，人、小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴、黑猩猩、雞等）的免疫細胞。它也可以是 化學合成的或在無細胞翻譯系統中生物化學合成的蛋白。或者，該蛋白可以是從摻入核酸 的轉化體產生的重組蛋白，所述核酸包含編碼上述胺基酸序列的鹼基序列。
[0026] 與SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列是指與SEQ ID NO: 2中顯示的胺基酸序列等具有約60 %或更高，優選約70 %或更高，進一步優選約80 %或 更高，特別優選約90%或更高，最優選約95%或更高的同源性的胺基酸序列。在這裡，"同 源性"是指在使用本【技術領域】中已知的數學算法比對兩條胺基酸序列時在最佳比對中相同 的胺基酸殘基和類似的胺基酸殘基與所有重疊的胺基酸殘基的比率（％)(優選地，該算法 考慮在序列的一側或兩側引入缺口，用於最佳比對）。"類似胺基酸"意指具有類似物理化學 特性的胺基酸；其實例包括在相同組下分類的胺基酸，諸如芳香族胺基酸（Phe、Trp、Tyr)， 脂肪族胺基酸仏]^、1^11、116、'\^11)，極性胺基酸（6111、4811)，鹼性胺基酸（1^8、4找、把8)， 酸性胺基酸（Glu、Asp)，具有羥基的胺基酸（Ser、Thr)，和具有小側鏈的胺基酸（Gly、Ala、 Ser、Thr、Met)。預期通過此類相似胺基酸的取代不會改變蛋白的表型（即，保守胺基酸取 代）。保守胺基酸取代的具體實例是【技術領域】中已知的，並且描述於各種文獻（參見，例如， Bowie 等人，Science, 247:1306-1310 (1990))〇
[0027] 本說明書中的胺基酸序列同源性可以在以下條件（期望值=10 ;允許缺口；矩 陣=BL0SUM62;過濾=OFF)下使用同源性計算算法 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)來計算。作為用於石角 定胺基酸序列同源性的其它算法的實例，可以提到Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)中描述的算法[該算法被併入NBLAST和XBLAST程序（版本 2.0) (Altschul 等人，Nucleic Acids Res·，25:3389-3402 (1997))]，Needleman 等人， J. Mol. Biol.，48:444-453 (1970)中描述的算法[該算法被併入GCG軟體包中的GAP 程序]，Myers和Miller, CABI0S，4:11-17 (1988)中描述的算法[該算法被併入ALIGN 程序（版本2. 0)，這是CGC序列比對軟體包的部分]，Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448 (1988)中描述的算法[該算法被併入GCG軟體包中的FASTA程 序]等，它們同樣可以優選使用。
[0028] 更優選地，與SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列是與SEQ ID NO:2中顯示的胺基酸序列具有約60%或更高，優選約70%或更高，進一步優選約80% 或更高，特別優選約90%或更高，且最優選約95%或更高的同一性的胺基酸序列。
[0029] 作為包含與SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列的蛋白， 例如，包含與上述SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列且具有與包 含SEQ ID N0:2等中顯示的胺基酸序列的蛋白的活性實質上相同質量的活性的蛋白是優選 的。在這裡，"活性"是指，例如，抑制動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的凋亡的活性，維持或促 進動脈硬化的活性，脂肪細胞分化抑制活性，熔化脂肪細胞的脂滴的活性，脂肪細胞降低活 性，CD36結合活性，胞吞至脂肪細胞的活性，FAS結合活性，FAS功能抑制活性，抗肥胖活性 等。"實質上相同的質量"意指其活性是定性地（例如，生理學上或藥理學上）相同的。因 此，優選的是，上述活性是相互等效的，但這些活性的定量係數，諸如活性的程度（例如，約 0. 1至約10倍，優選約0. 5至約2倍）和蛋白的分子量，可以是不同的。
[0030] 上述活性可以通過本身已知的方法進行測量。
[0031] 本發明中AM的實例還包括包含以下的蛋白：（1)從SEQ ID N0:2中顯示的氨基 酸序列缺失1或2個或更多個（優選約1至100,優選約1至50,進一步優選約1至10,特 別優選1至幾個（2、3、4或5))胺基酸的胺基酸序列，（2)向SEQ ID NO:2中顯示的胺基酸 序列添加1或2個或更多個（優選約1至100,優選約1至50,進一步優選約1至10,特別 優選1至幾個（2、3、4或5))胺基酸的胺基酸序列，（3)在SEQ ID NO: 2中顯示的胺基酸序 列中插入1或2個或更多個（優選約1至50,優選約1至10,進一步優選1至幾個（2、3、4 或5))胺基酸的胺基酸序列，（4)在SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列中被其它胺基酸取 代1或2個或更多個（優選約1至50,優選約1至10,進一步優選1至幾個（2、3、4或5)) 胺基酸的胺基酸序列，或（5)包含其組合的胺基酸序列。
[0032] 當已經如上所述插入、缺失或取代胺基酸序列時，插入、缺失或取代的位置沒有特 別限制，只要維持該蛋白的活性。
[0033] 本發明的AIM優選為具有SEQ ID NO:2中顯示的胺基酸序列的人AM蛋白 (GenBank登錄號：AAD01446)，或其在其它哺乳動物中的同源物[例如，在GenBank中作為 登錄號：AAD01445註冊的小鼠同源物等]。
[0034] 在本說明書中，根據肽命名的慣例描述蛋白和肽，其中左端表示N末端（氨基末 端），右端表不C末端（幾基末端）。在包括包含SEQ ID NO: 2中顯不的氣基酸序列的蛋白 的本發明的AIM中，C末端可以是羧基（-C00H)、羧酸鹽（_C00_)、醯胺（-CONH 2)和酯（-C00R) 中的任一種。
[0035] 在這裡，作為酯中的R，可以使用Cp6烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基和正 丁基，c 3_8環烷基，例如，環戊基和環己基，C 6_12芳基，例如苯基和α-萘基，苯基-Cp2烷基， 例如苄基和苯乙基，C 7_14芳烷基，例如，α-萘基-Cp2烷基，例如，α-萘基甲基、新戊醯氧基 甲基;等。
[0036] 當本發明的AIM在除了 C末端以外的位置具有羧基（或羧酸酯）時，其中羧基被 醯胺化或酯化的蛋白也包括在本發明的蛋白中。在此情況下，作為酯，使用例如上述在C末 端的醋等。
[0037] 此外，本發明的AM還包括：其中N末端胺基酸殘基的氨基被保護基團（例如，CV6 醯基，諸如CV6烷醯基（alkanoyl)諸如甲醯基和乙醯基等）保護的蛋白；其中可以在體內 在N末端裂解後產生的穀氨醯胺殘基已經被轉化為焦穀氨酸的蛋白，其中分子中胺基酸的 側鏈上的取代基（例如，-〇H、_SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等）被適當的保護基團（例 如，CV 6醯基，諸如C η烷醯基諸如甲醯基和乙醯基等）保護的蛋白，綴合的肽，諸如所謂具 有與之鍵合的糖鏈的糖肽等。
[0038] AIM的部分肽（下文有時簡稱為"本發明的部分肽"）可以是任意的，只要它是具 有上述AM的部分胺基酸序列且具有與AIM實質上相同質量的活性的肽。在這裡，"實質上 相同質量的活性"如上文所定義。此外，可以以與AIM的情況下相同的方式測量"實質上相 同質量的活性"。
[0039] 由於AM包含3個包含大量半胱氨酸的SRCR (富含半胱氨酸的清道夫受體）結構 域，所以各SRCR結構域都可以被用作本發明的部分肽。具體而言，例如，在SEQ ID N0:2中 顯示的胺基酸序列中，可以使用分別包含SRCRl結構域（SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列 的胺基酸編號24 - 125)、SRCR2結構域（SEQ ID N0:2中顯示的胺基酸序列的胺基酸編號 138 - 239)和SRCR3結構域（SEQ ID NO: 2中顯示的胺基酸序列的胺基酸編號244 - 346) 的部分胺基酸序列，包含SRCR結構域的任何組合的部分胺基酸序列等。本發明的部分肽的 大小沒有特別限制，只要它包含上述功能結構域。部分肽優選包含不小於50的部分胺基酸 序列，更優選不小於100的部分胺基酸序列，進一步優選不小於200的部分胺基酸序列。部 分胺基酸序列可以是單一連續的部分胺基酸序列，或者彼此連接的不連續的多個部分氨基 酸序列。
[0040] 此外，本發明的部分肽的C末端可以是羧基（-COOH)、羧酸鹽（_COO_)、醯胺 (-CONH 2)和酯（-COOR)中的任一種。在這裡，酯中的R的實例包括類似於AM的上述實例 的那些。當本發明的部分肽在除了C末端以外的位置具有羧基（或羧酸酯）時，羧基被醯 胺化或酯化，其也包括在本發明的部分肽中。作為這種情況下的酯，例如，使用與在C末端 的酯類似的那些等。
[0041] 此外，在本發明的部分肽中，以與上述AIM相同的方式，N末端胺基酸殘基的氨基 可以用保護基團保護，N末端的穀氨醯胺殘基可以被轉化為焦穀氨酸，分子中胺基酸的側鏈 上的取代基可以用合適的保護基團保護，或者部分肽可以是其中糖鏈被鍵合的合成肽（所 謂的糖狀等），等。
[0042] 本發明中待使用的AM或其部分肽可以是鹽的形式。例如，使用與生理學上可接 受的酸（例如，無機酸、有機酸）、鹼（例如，鹼金屬鹽）的鹽等，並且生理學上可接受的酸加 成鹽是優選的。有用的鹽包括，例如，與無機酸（例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸）的鹽或與 有機酸（例如，乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯 甲酸、甲磺酸、苯磺酸）的鹽等。
[0043] 可以通過本身已知的蛋白純化方法從上述哺乳動物的巨噬細胞產生AM。具體而 言，AIM或其鹽可以通過均質化哺乳動物巨噬細胞，通過低速離心去除細胞碎片，以高速離 心上清液以沉澱包含細胞膜的級分，並且使上清液進行層析諸如反相層析、離子交換層析、 親和層析等等來製備。
[0044] AIM或其部分肽也可以根據公眾已知的肽合成方法來製備（以下在其化學合成的 說明中，全長AIM和其部分肽被綜合簡稱為AIM，除非另有規定）。
[0045] 肽合成的方法可以是，例如，固相合成方法和液相合成方法中的任一種。期望的蛋 白可以通過將能夠構成AIM的部分肽或胺基酸與剩餘部分縮合，並且去除所得產物可具有 的任何保護基團來產生。
[0046] 在這裡，縮合和保護基團去除根據本身已知的方法，例如，下面（1)和（2)中所示 的方法來進行： (1) M. Bodanszky 和 M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) (2) Schroeder 和 Luebke: Academic Press, New York (1965)〇
[0047] 因此獲得的AM可以通過已知的純化方法進行純化或分離。在這裡，作為純化方 法的實例，可以提到溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相層析、重結晶、其組合等。
[0048] 當因此獲得的AIM是游離形式時，可以將所述游離形式通過已知方法或其類似方 法轉化為合適的鹽形式，並且在另一方面，當獲得鹽形式的AM時，它可以通過已知方法或 其類似方法轉化為游離形式或者不同的鹽的形式。
[0049] 此外，AM也可以通過培養包含編碼其的核酸的轉化體，以及從獲得的培養物中分 離和純化AM而產生。編碼AM或其部分肽的核酸可以是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合體， 優選DNA。此外，核酸可以是雙鏈或單鏈的。在雙鏈核酸的情況下，它可以是雙鏈DNA、雙鏈 RNA、或DNA = RNA雜合體。在單鏈的情況下，它可以是有義鏈（即編碼鏈）或反義鏈（即非 編碼鏈）。
[0050] 編碼AM或其部分肽的DNA的實例包括基因組DNA，源自溫血動物（例如人、牛、 猴、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、倉鼠、雞等）的巨噬細胞的cDNA，合成 的DNA等。編碼AM或其部分肽的基因組DNA可以通過聚合酶鏈式反應（在下文中簡稱 為"PCR方法"）直接擴增，其通過使用從以下製備的基因組DNA級分作為模板：人或其它 溫血動物（例如，猴、牛、馬、豬、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、雞等）的上述動物的 任何細胞[例如，肝細胞、脾細胞、神經細胞、神經膠質細胞、胰臟β細胞、骨髓細胞、腎小球 繫膜細胞、朗格漢斯細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯狀細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細 胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例如，巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、 肥大細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞）、巨核細胞、滑膜細胞、 軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質細胞、或其對應的祖細胞、 幹細胞或癌細胞等]，或其中存在此類細胞的任何組織[例如，腦或腦的任何部分（例如， 嗅球、杏仁核、基底神經節、海馬、丘腦、下丘腦、底丘腦核、大腦皮質、延髓、小腦）、脊髓、腦 垂體、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肺、胃腸道（例如大腸、小 腸）、血管、心臟、胸腺、脾臟、下頒下腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關節、月旨 肪組織（例如，棕色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨骼肌等]，且編碼AM或其部分肽的cDNA 也可以通過PCR方法和逆轉錄酶-PCR(在下文簡稱為"RT-PCR方法"）通過分別使用從巨 噬細胞製備的總RNA或mRNA級分作為模板直接擴增。或者，編碼AM或其部分肽的基因組 DNA和cDNA也可以通過菌落或噬菌斑雜交方法或PCR方法等從通過將上述基因組DNA和總 RNA或mRNA的片段插入合適的載體中而製備的基因組DNA文庫和cDNA文庫中克隆。用於 文庫的載體可以是任何噬菌體、質粒、粘粒、噬菌粒等。
[0051] 編碼AM的DNA的實例包括包含與SEQ ID NO: 1的鹼基編號64至1107顯示的鹼 基序列相同或實質上相同的喊基序列的DNA等。
[0052] 作為包含與SEQ ID NO: 1的鹼基編號64至1107顯示的鹼基序列相同或實質上相 同的鹼基序列的DNA，使用包含與SEQ ID N0:1的鹼基編號64至1107顯示的鹼基序列具有 不小於約60%、優選不小於約70%、更優選不小於約80%、特別優選不小於約90 %的同源 性的鹼基序列，且編碼具有與上述AM等的實質上相同質量的活性的蛋白的DNA。
[0053] 本說明書中的鹼基序列同源性可以在以下條件（期望值=10 ;允許缺口；過濾= ON;匹配得分=1;錯配得分=-3)下使用同源性計算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)來計算。作為用 於確定鹼基序列同源性的其它算法的優選實例，還可以提到上述胺基酸序列同源性計算算 法。
[0054] 編碼AM的DNA優選是包含SEQ ID NO: 1的鹼基編號64至1107顯示的鹼基序列 顯示的編碼人AM蛋白的鹼基序列的DNA (GenBank登錄號：AF011429)，或其在其它哺乳動 物中的同源物[例如，在GenBank中作為登錄號：AF011428註冊的小鼠同源物等]。
[0055] 編碼本發明的部分肽的DNA可以是任意的，只要它包含編碼包含與SEQ ID NO:2 中顯示的胺基酸序列的部分相同或實質上相同的胺基酸序列的肽的鹼基序列。具體而言， 作為編碼本發明的部分肽的DNA，使用（1)包含由SEQ ID NO: 1的鹼基編號64至1107顯 示的鹼基序列顯示的部分鹼基序列的DNA，或（2)包含與包含SEQ ID NO: 1的鹼基編號64 至1107顯示的部分鹼基序列的DNA具有不小於約60%、優選不小於約70%、更優選不小於 約80%、特別優選不小於約90%的同源性的鹼基序列，且編碼具有與上述AM等的實質上 相同質量的活性的蛋白的DNA。
[0056] 編碼AM或其部分肽的DNA可以通過PCR方法通過擴增具有編碼AM或其部分肽 的鹼基序列的部分的合成DNA，或將併入合適的表達載體的DNA與編碼AM的部分或完整區 域的標記的DNA片段或合成DNA雜交來克隆。雜交可以根據本身已知的方法或基於其上的 方法，例如，描述於Molecular Cloning,第2版（J. Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab. Press，1989)的方法等來進行。當使用商購文庫時，雜交可以根據所附說明書手冊中 描述的方法來進行。雜交可以優選在高嚴格條件下進行。
[0057] 作為高嚴格條件的實例，可以提到在45°C在6 XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉）中雜交 反應、隨後在65°C在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗滌一次或多次的條件等。本領域技術人員能 夠通過適當地改變雜交溶液的鹽濃度、雜交反應溫度、探針濃度、探針長度、錯配數、雜交反 應時間、洗滌溶液的鹽濃度、洗滌溫度等而容易地獲得期望的嚴格性。當使用商購文庫時， 雜交可以根據隨附所述文庫的說明書手冊中描述的方法來進行。
[0058] 包含編碼AM或其部分肽的DNA的表達載體可以通過以下產生，例如，從編碼AM 的DNA切出期望的DNA片段，並且將所述DNA片段接合在適當的表達載體中啟動子下遊。
[0059] 作為表達載體，使用源自大腸桿菌的質粒（例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13); 動物細胞表達質粒（例如，pAl_ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);動物病毒載體， 諸如逆轉錄病毒、牛痘病毒、腺病毒等等。
[0060] 該啟動子可以是任何啟動子，只要它適用於用於表達所述基因的宿主。
[0061] 例如，當宿主是動物細胞時，使用SRa啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨 細胞病毒）啟動子、RSV (勞斯肉瘤病毒）啟動子、MoMuLV (莫洛尼鼠白血病病毒）LTR、 HSV-TK(單純皰瘮病毒胸苷激酶）啟動子等。在這些中，CMV啟動子、SRa啟動子等是優選 的。
[0062] 當宿主是屬埃希氏菌屬的細菌時，trp啟動子、Iac啟動子、recA 啟動子、λ 動子、Ipp啟動子、T7啟動子等是優選的。
[0063] 除了上述以外，有用的表達載體包括，任選攜帶增強子、剪接信號、多聚腺苷酸附 加信號、選擇標記、SV40複製原點（以下也簡稱為SV40ori)等的那些。作為選擇標記的實 例，可以提到二氫葉酸還原酶（以下也簡稱為dhfr)基因[甲氨蝶呤（MTX)抗性]、氨苄青 黴素抗性基因（以下也簡稱為▲￥/)、新黴素抗性基因（以下也簡稱為AfeA G418抗性）等。 具體而言，當使用缺乏dhfr基因的中國倉鼠細胞以及作為選擇標記的dhfr基因時，也可使 用不含胸苷的培養基來選擇目標基因。
[0064] 必要時，可以將編碼適合用於宿主的信號序列的鹼基序列（信號密碼子）添加 (或用天然信號密碼子取代）至編碼AIM或其部分肽的DNA的5'-末端側。例如，當宿主是 屬埃希氏菌屬，使用PhoA信號序列、OmpA信號序列等；當宿主是動物細胞時，使用胰島素信 號序列、α-幹擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
[0065] AM或其部分肽可以通過用包含上述編碼AM或其部分肽的DNA的表達載體轉化 宿主並培養獲得的轉化體來產生。
[0066] 作為宿主，例如，使用屬埃希氏菌屬、動物細胞等。
[0067] 作為屬埃希氏菌屬，例如，使用大腸桿菌K12_DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 60，160(1968)]，大腸桿菌 JM103 [Nucleic Acids Research, vol. 9， 309 (1981)]，大腸桿菌 JA221 [Journal of Molecular Biology, vol. 120，517(1978)]， 大腸桿菌 HBlOl [Journal of Molecular Biology, vol. 41，459 (1969)]，大腸桿菌 C600 [Genetics, vol. 39，440 (1954)]等。
[0068] 作為動物細胞，例如，使用猴COS-7細胞、猴Vero細胞、中國倉鼠卵巢細胞（以下 簡稱為CHO細胞）、dhfr基因缺陷的CHO細胞（以下簡稱為CH0(dhfr_)細胞）、小鼠 L細 胞、小鼠 AtT-20細胞、小鼠骨髓瘤細胞、大鼠 GH3細胞、人FL細胞等。
[0069] 轉化可基於公眾已知的方法根據宿主種類進行。
[0070] 屬埃希氏菌屬可以，例如，根據描述於Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69， 2110 (1972)，Gene, vol. 17，107 (1982)中的方法等進行轉化。
[0071] 動物細胞可以，例如，根據描述於 Saibo Kogaku (Cell Engineering)，extra issue 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263-267 (1995) ,Shujunsha 出版，或 Virology, Vol. 52, 456 (1973)的方 法進行轉化。
[0072] 轉化體的培養可基於公眾已知的方法根據宿主種類進行。
[0073] 作為用於培養轉化體（其宿主是屬埃希氏菌屬的細菌）的培養基的實例，補充有 葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培養基[Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]是優選的。根據 需要，為了增強啟動子效率，可以將化學劑諸如3 β -吲哚丙烯酸添加至培養基中。
[0074] 轉化體（其宿主是屬埃希氏菌屬的細菌）的培養通常在約15°C至約43°C進行約 3至約24小時。如果必要，培養物可以進行通氣或攪拌。
[0075] 用於培養轉化體（其宿主是動物細胞）的有用的培養基包括，例如，包含約5 -約 20%胎牛血清的最低基礎培養基（MEM) [Science, vol. 122，501 (1952)]，Dulbecco 改良 的 Eagle 培養基（DMEM) [Virology, vol. 8，396 (1959)]，RPMI1640 培養基[The Journal of the American Medical Association, vol. 199，519 (1967)]，199 培養基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73，1(1950)]等。培養基的 pH 優 選為約6至約8。培養通常在約30°C至約40°C進行約15至約60小時。如果必要，培養物 可以進行通氣或攪拌。
[0076] 如上所述，AM可以在轉化體的細胞中或細胞外產生。
[0077] AIM或其部分肽可以根據本身已知的方法從通過培養上述轉化體獲得的培養物中 分離和純化。
[0078] 例如，當從培養的細菌或細胞的細胞質中提取AIM或其部分肽時，適當地使用以 下方法，其中通過已知方式收集細菌或細胞，將其懸浮在適當的緩衝溶液中，並藉助於超聲 處理、溶菌酶和/或凍融等破碎，其後，通過離心或過濾獲得可溶性蛋白的粗提取物。緩衝 溶液可包含蛋白變性劑諸如尿素或鹽酸胍，和表面活性劑，諸如Triton X-100?。此外，當 AIM或其部分肽被分泌在真菌（細胞）外時，使用通過離心、過濾等從培養物等中分離培養 上清液的方法。
[0079] 因此獲得的可溶性級分和培養上清液中含有的AIM或其部分肽的分離和純化可 以根據本身已知的方法來進行。有用的方法包括基於溶解度的方法，諸如鹽析和溶劑沉澱； 主要基於分子量差異的方法，諸如透析、超濾、凝膠過濾和SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳；基於 電荷差異的方法，諸如離子交換層析；基於特異性親和力的方法，諸如親和層析；基於疏水 性差異的方法，諸如反相高效液相層析；和基於等電點差異的方法，諸如等電聚焦。這些方 法可以適當地組合。
[0080] 因此獲得的AM或其部分肽的存在可以通過酶免疫測定法、蛋白質印跡法等使用 針對AM的抗體來證實。
[0081] 如上所述獲得的AIM或其部分肽或其鹽或包含編碼AM或其部分肽（有時在這裡 表示為AIMs)的鹼基序列的核酸可以作為用於預防肝臟疾病的發病或肝臟疾病的治療的 藥劑提供。
[0082] 在本發明中，誘導AM表達的藥物和穩定AM的藥物也可用於替代AMs。
[0083] 誘導AM表達的藥物的實例包括具有AM轉錄活性等的化合物，並且該化合物的 實例包括能夠結合AM基因的啟動子區域等的轉錄因子。本發明人還發現，AIM在巨噬細胞 中表達。因此，作為誘導AIM表達的藥物，可以提到巨噬細胞分化誘導劑。巨噬細胞分化誘 導劑沒有特別限制，只要其可以從祖細胞諸如粒細胞-巨噬細胞集落形成細胞（CFU-GM)、 巨噬細胞集落形成細胞（CFU-M)等誘導巨噬細胞的分化，並且可以使用粒細胞-巨噬細胞 集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)等。轉錄因子、GM-CSF、M-CSF可 以是通過上述已知方式從哺乳動物組織和細胞中分離和純化的蛋白，或者可以是化學合成 的或在無細胞翻譯系統中生物化學合成的蛋白。或者，它們可以是從用包含編碼上述蛋白 的鹼基序列的核酸導入的轉化體產生的重組蛋白。
[0084] 穩定AIM的藥物的實例包括抑制AIM的降解的化合物，抑制排洩到尿中的化合物 等。抑制降解的化合物的實例包括蛋白酶抑制劑，蛋白酶體抑制劑等。蛋白酶抑制劑的實 例包括絲氨酸蛋白酶抑制劑（4-(2-氨基乙基）苯磺醯氟鹽酸化物（AEBSGF)、抑肽酶、胰蛋 白酶抑制劑等），半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E-64,亮肽素等）等。蛋白酶體抑制劑的實例包 括乳胞素、MG-115、MG-132、蛋白酶體抑制劑I等。抑制排洩到尿中的化合物的實例包括 賦予AM防止通過腎小球基底膜的分子量的化合物。如下述實施例中所示，由於可以證實 IgM與AM的結合，所以IgM可作為抑制AM排洩到尿中的化合物提及。然而，由於擔心施 用IgM本身引起免疫系統中的副作用，優選使用通過融合IgM的Fc片段（這是與AIM的結 合位點）和具有防止腎小管的過濾和排洩到尿中的水平的分子量的蛋白而獲得的融合蛋 白。儘管待融合的蛋白沒有特別限制，但具有較少副作用擔心的蛋白是優選的，並且，例如， 可以使用白蛋白。結合可以是直接結合或經由鉸鏈區。鉸鏈區的實例包括串聯FLAG標籤。 此類分子可以通過常規方法通過連接編碼每個的基因且作為單一重組蛋白來產生。
[0085] 在本發明的下述實施例中，與野生型（WT)小鼠相比，AM敲除小鼠在高脂肪膳 食飼餵條件下顯示肝臟疾病的促進發病。具體地，肝臟疾病類似於非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)的病理學，且進展為肝硬化和肝細胞癌，這是該疾病的特徵，被證實為可重複的。從 上述內容中，表明AIMs、誘導AIM表達的藥物或穩定AM的藥物、或者可以通過下述篩選方 法進行搜索的能夠取代AIM的功能的化合物防止肝臟疾病的發病和進展並治療肝臟疾病。
[0086] 作為本發明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩定AM的藥物的藥物組合物的 應用目標的肝臟疾病是，例如，脂肪肝、NASH、肝硬化和肝癌。在另一個方面，作為本發明的 包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩定AM的藥物的藥物組合物的應用目標的肝臟疾病是， 例如，與肝星狀細胞的活化相關的肝臟疾病。肝星狀細胞活化的指標是，例如，a SMA(a -平 滑肌肌動蛋白）mRNA的表達。因此，肝臟疾病可能是其中與正常肝組織相比a SM mRNA 顯著高表達的肝臟疾病。在又另一個方面，肝臟疾病可能是其中與正常肝組織相比TGF0 1 或膠原4A1顯著高表達的肝臟疾病。
[0087] 本發明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩定AM的藥物的藥物組合物是低毒 性的，並且可以作為液體原樣，或作為藥物組合物的合適劑型，口服或胃腸外（例如，血管 內施用，皮下施用等）施用於人或其它溫血哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、 貓、狗、猴等）。
[0088] 作為用於胃腸外施用的組合物的實例，使用注射劑、栓劑等；所述注射劑可包括劑 型，諸如靜脈內注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌內注射劑和滴注注射劑。此類注射劑可 以根據公眾已知的方法來製備。注射劑可以通過以下製備，例如，將上述本發明的AMs、誘 導AM表達的藥物或穩定AIM的藥物溶解、懸浮或乳化在通常用於注射劑的無菌水溶液或 油性溶液中。作為用於注射的水溶液的實例，可以使用生理鹽水、包含葡萄糖或另一種輔助 藥物的等滲溶液等，其可以與適當的增溶劑組合使用，所述增溶劑，例如，醇（例如乙醇）， 多元醇（例如，丙二醇，聚乙二醇），非離子表面活性劑[例如，聚山梨酯80，HC0-50 (氫化 蓖麻油的聚氧乙烯（50 mol)加合物）]等。作為油性溶液的實例，可以使用芝麻油、大豆油 等，其可以與作為增溶劑的苯甲酸苄酯、苄醇等組合使用。將製備的注射溶液優選填充在適 當安瓿中。用於直腸施用的栓劑可以通過將上述本發明的AIMs、誘導AIM表達的藥物或穩 定AIM的藥物與普通栓劑基質混合來製備。
[0089] 作為用於口服施用的組合物，可以提到固體或液體劑型，特別是片劑（包括糖包 衣片劑和薄膜包衣片劑）、丸劑、顆粒劑、粉劑、膠囊（包括軟膠囊）、糖漿劑、乳劑、懸浮劑 等。此類組合物通過公眾已知的方法產生，並且可以包含在藥物製備領域中常用的載體、稀 釋劑或賦形劑。作為用於片劑的載體或賦形劑的實例，可以使用乳糖、澱粉、蔗糖、硬脂酸鎂 等。
[0090] 用於胃腸外或口服施用的上述藥物組合物被便利地製備在適用於活性成分的劑 量的藥物單位劑型中。作為此類藥物單位劑型的實例，可以提到片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑 (安瓿）和栓劑。優選的是，可以以例如，每個藥物單位劑型通常5至500 mg，特別是5至 100 mg用於注射劑，或10至250 mg用於其它劑型，來含有上述本發明的AMs、誘導AM表 達的藥物或穩定AIM的藥物。
[0091] 儘管本發明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩定AM的藥物的上述預防劑或 治療劑的劑量根據施用的主體、目標疾病、症狀、施用途徑等而變化；例如，當該藥劑用於治 療/預防成人中的肝臟疾病時，基於單一劑量，通過靜脈內注射，每天約1至5次，優選每天 約1至3次，通常以約0. 01至20 mg/kg體重，優選約0. 1至10 mg/kg體重，且更優選約 0.1至5 mg/kg體重方便地施用本發明的AIMs。在腸胃外施用和口服施用的其它模式的情 況下，可以施用相似的劑量。在症狀特別嚴重的情況下，可以根據症狀增加劑量。
[0092] 每種上述組合物都可以包含當與上述AMs、誘導AM表達的藥物或穩定AM的藥 物配製時不產生不想要的相互作用的任何其它活性成分。
[0093] 此外，本發明的AMs、誘導AM表達的藥物或穩定AM的藥物可以與可用於治療肝 髒疾病的其它藥物組合使用，所述可用於治療肝臟疾病的其它藥物諸如胰島素增敏劑（例 如，噻唑烷衍生物類，諸如羅格列酮、吡格列酮等等，雙胍類，諸如二甲雙胍、丁雙胍等）；抗 氧化劑類（例如，維生素 E、維生素 C、甜菜鹼、EPL(多烯磷脂醯膽鹼）等）；護肝劑（例如 熊去氧膽酸（UDCA)等）；抗高血脂症劑（例如，貝特類藥物、普羅布考、他汀類藥物等）； 降壓藥（例如，血管緊張素 II受體拮抗劑等）；甘草素製劑；中國草藥（例如，小柴胡湯 等）；抗癌劑等。本發明的AIMs、誘導AIM表達的藥物或穩定AIM的藥物和 上述藥物可以一次或不同次施用於患者。
[0094] 如上所述，證實了與野生型小鼠相比，AM敲除小鼠在高脂肪膳食飼餵條件下高頻 率發生類似於非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的病理學的肝臟疾病，並進一步進展為肝硬化 和肝細胞癌。這表明，高脂肪膳食飼餵條件下的AIM敲除小鼠可以作為肝臟疾病的新模型 小鼠提供。因此，本發明提供了針對用於預防或治療肝臟疾病的藥劑的篩選方法，其使用通 過用高脂肪膳食飼餵AM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。
[0095] AM表達缺陷的非人哺乳動物意指其中內源AM的表達失活的非人哺乳動物，包 括從其中AIM敲除（KO)的ES細胞製備的AM KO動物，以及其中AIM表達被反義或RNAi 技術失活的敲低（KD)動物等。在這裡，"敲除（KO) "意指通過破壞或去除內源基因而防止 完整mRNA的產生，而"敲低（KD) "意指抑制從mRNA翻譯為蛋白以失活內源基因的表達。在 下文中，本發明的AM K0/KD動物有時簡稱為"本發明的K0/KD動物"。本發明的AM KO動 物公開於 Miyazaki T.等人·（J. Exp. Med.，189，413-422，1999) 〇
[0096] 可以是本發明的主體的"非人哺乳動物"沒有特別限制，只要它是已經對其建立轉 基因系統的非人哺乳動物；實例包括小鼠、大鼠、牛、猴、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、豚鼠、倉 鼠、大鼠、小鼠等。兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠等是優選的；具體而言，從疾病模型動物製備的觀點 來看，具有相對短的個體發育時期和生命周期且易於繁殖的嚙齒類動物是更優選的；具體 地，小鼠（例如，作為純系的C57BL/6品系、BALB/c品系、DBA2品系等，作為雜交系的B6C3Fi 品系、BDF1S系、B6D2F i品系、ICR品系）和大鼠（例如，Wistar、SD等）是優選的。
[0097] 除了哺乳動物以外，鳥類諸如雞可用於與作為本發明的主體的"非人哺乳動物"的 目的相同的目的。
[0098] 用於敲除AIM的具體方法公開於上述Miyazaki T.等人（J. Exp. Med，189， 413-422，1999)。作為其它已知的一般方法，可以優選使用包括以下的方法：通過常規方 法分離源自主體非人哺乳動物的AM(基因組DNA)，並通過例如（1)通過將另一 DNA片段 (例如，藥物抗性基因，報導基因等）插入外顯子部分或啟動子區域而破壞外顯子或啟動子 的功能，或（2)使用Cre-IoxP系統或Flp-frt系統切出AM的整體或部分以缺失基因，或 (3)將終止密碼子插入蛋白編碼區以防止翻譯為完整蛋白，或（4)將終止基因轉錄的DNA序 列（例如，多聚腺苷酸附加信號等）插入轉錄區以防止合成完整的mRNA(以下簡稱為靶向 載體），通過同源重組等在主體非人哺乳動物的AIM基因座處整合具有構建以隨後失活基 因的DNA序列的DNA鏈。
[0099] 同源重組可以通過，例如，將上述靶向載體引入胚胎幹細胞（ES細胞）來獲得。
[0100] ES細胞是指在胚泡期源自受精卵的內細胞團（ICM)的細胞，並且可以培養和維 持，同時在體外保持未分化狀態。ICM細胞註定形成胚體，是所有組織包括生殖細胞都基於 其的幹細胞。所使用的ES細胞可以是建立的細胞系，或根據Evans和Kaufman (Nature, vol. 292，p. 154，1981)的方法新建立的細胞系。例如，在小鼠 ES細胞的情況下，目前通常 使用源自129小鼠品系的ES細胞，但其免疫學背景不清楚；出於獲得具有免疫學清楚的遺 傳背景的純系的ES細胞等來替代它的目的，也可以合適地使用從C57BL/6小鼠或從BDF/J、 鼠（C57BL/6和08八/2的？1)建立的ES細胞等，其中可從C57BL/6收集的少數卵子已經通過 與DBA/2雜交而進行改良。除了可收集的卵子數目高且卵子強健的優點以外，BDF 1小鼠具 有C57BL/6小鼠作為其背景；因此，可以有利地使用由其衍生的ES細胞，因為當製備疾病模 型小鼠時，遺傳背景可以通過與C57BL/6小鼠回交而用C57BL/6小鼠的遺傳背景來替代。ES 細胞可以在適當條件下通過單層培養（直至達到高密度），或懸浮培養（直至形成細胞聚 集物）被分化為許多種類型的細胞，包括體壁肌（parietal muscle)、內臟肌和心肌[M.J. Evans和M.H. Kaufman, Nature vol. 292, p. 154, 1981; G. R. Martin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ), vol. 78, p. 7634, 1981; T. C. Doetschman 等人，Journal of Embryology and Experimental Morphology，vol. 87，p. 27，1985];通過分化整合有靶向載體的ES細胞獲得的AM表達 缺陷的非人哺乳動物的細胞可用於AIM的體外細胞生物學研宄中。
[0101] 例如，如果靶向載體被設計成通過將另一 DNA片段插入AM基因的外顯子部分或 啟動子區域以破壞外顯子或啟動子的功能，則該載體可以假定，例如，下面所示的構造。
[0102] 首先，為了確保另一 DNA片段通過同源重組插入AM的外顯子或啟動子部分，靶向 載體需要包含與其它DNA片段中5'的上遊和3'的下遊的各目標位點（5'臂和3'臂）同 源的序列。
[0103] 儘管插入的其它DNA片段沒有特別限制，但可通過使用藥物抗性基因或報導基因 選擇在其染色體中整合具有藥物抗性或報導基因活性作為指標的靶向載體的ES細胞。在 這裡，藥物抗性基因的實例和報導基因的實例包括，但不限於，分別新黴素磷酸轉移酶II (nptll)基因、潮黴素磷酸轉移酶（HPT)基因等，和β-半乳糖苷酶（IacZ)基因、氯黴素乙 醯轉移酶（cat)基因等。
[0104] 藥物抗性或報導基因優選在任意選擇的能夠在哺乳動物細胞中發揮功能的啟動 子的控制下。例如，可以提到病毒啟動子，諸如SV40早期啟動子、巨細胞病毒（CMV)長末端 重複（LTR)、勞斯肉瘤病毒（RSV)LTR、小鼠白血病病毒（MoMuLV) LTR、和腺病毒（AdV)衍生 的早期啟動子、和用於哺乳動物組成型蛋白基因的啟動子，諸如肌動蛋白基因啟動子、 PGK基因啟動子和轉鐵蛋白基因啟動子等。然而，如果將藥物抗性或報導基因插入AIM中， 從而使得其被置於AIM的內源啟動子的控制之下，則控制該基因的轉錄的啟動子不需要存 在於革G向載體中。
[0105] 靶向載體優選具有終止從藥物抗性或報導基因下遊的基因（多腺苷酸化（polyA) 信號，也稱為終止子）轉錄mRNA的序列；例如，可以使用源自病毒基因或源自各種哺乳動物 或鳥類基因的終止子序列。優選地，使用SV40終止子等。
[0106] 通常，哺乳動物中的基因重組主要非同源地發生；引入的DNA被隨機地插入染色 體上任意選擇的位置。因此，不可能通過基於檢測藥物抗性或報導基因等的表達的選擇 (陽性選擇）有效地只選擇靶向至由同源重組靶向的內源AM的那些克隆；有必要對於所 有選擇的克隆通過DNA雜交或PCR證實整合位點。因此，如果，例如，賦予丙氧鳥苷敏感性 的單純皰瘮病毒衍生的胸苷激酶（HSV-tk)基因接合在與靶向載體的目標序列同源的區域 之外，則具有隨機插入其中的載體的細胞不能在包含丙氧鳥苷的培養基上生長，因為它們 具有HSV-tk基因，而通過同源重組靶向至內源AM基因座的細胞變得對丙氧鳥苷耐受，並 得到選擇，因為它們不具有HSV-tk基因（陰性選擇）。或者，如果將白喉毒素基因，例如，接 合以替代HSV-tk基因，則具有隨機插入其中的載體的細胞由於本身產生的毒素而死亡，從 而使得也可以在藥物不存在的情況下選擇同源重組體。
[0107] 儘管磷酸鈣共沉澱法、電穿孔法、脂質體轉染法、逆轉錄病毒感染法、凝集法、顯微 注射法、基因槍（粒子槍）法、DEAE-葡聚糖法等中的任一種都可用於靶向載體引入ES細 胞，但因為易於處理大量細胞等而通常選擇電穿孔法，因為哺乳動物中的基因重組主要非 同源地發生，從而使得如上所述獲得同源重組體的頻率低。對於電穿孔，可以原樣使用用於 轉染到動物細胞中的普通條件；例如，電穿孔可以這樣進行：通過在對數生長期胰蛋白酶 消化ES細胞以便將它們分散為單細胞，將細胞懸浮在培養基中以獲得IO 6至10 8個細胞/ ml的密度，將細胞轉移至小杯中，添加10至100 μ g的靶向載體，並施加200至600 V/cm 的電脈衝。
[0108] 其中整合靶向載體的ES細胞可以通過由DNA雜交或PCR篩選從通過在飼養細胞 上培養單細胞獲得的集落分離和提取的染色體DNA進行確定；如果藥物抗性基因或報導基 因被用作其它DNA片段，則可能在細胞階段用其表達作為指標來選擇轉化體。例如，如果使 用包含nptll基因作為用於陽性選擇的標記基因的載體，將轉染處理後的ES細胞在包含新 黴素系列抗生素諸如G418的培養基中培養，並且選擇所得抗性集落作為轉化體的候選者。 如果使用包含HSV-tk基因作為用於陰性選擇的標記基因的載體，將ES細胞在包含丙氧鳥 苷的培養基中培養，並且選擇所得抗性集落作為同源重組體的候選者。將獲得的集落轉移 至各自培養板，並重複胰蛋白酶消化和培養基交換，其後保留部分用於培養，並且使剩餘部 分進行PCR或DNA雜交來證實引入的DNA的存在。
[0109] 當將證實其中整合有引入的DNA的ES細胞返回至源自相同物種的非人哺乳動物 來源的胚胎時，ES細胞整合到宿主胚胎的ICM中，以形成嵌合胚胎。將其移植至受體母體 (雌性胚胎受體）中，並允許繼續發育，從而獲得嵌合的KO動物。如果ES細胞有助於在嵌 合動物中形成將分化為卵子或精子的原生殖細胞，則將獲得種系嵌合體；通過將其交配，可 以製備其中遺傳維持AIM的表達缺陷的KO動物。
[0110] 為了製備嵌合胚胎，存在其中將最多至桑椹胚期的早期胚胎粘附並聚集在一起的 方法（聚集嵌合體方法），和其中將細胞顯微注射至胚泡的胚泡腔的方法（注射嵌合體方 法）。儘管在使用ES細胞製備嵌合胚胎中已傳統上廣泛實施後者，但作為不需要顯微操作 器且可以容易操作的方法，近來已實施其中通過將ES細胞注射至8細胞期胚胎的透明帶中 而生成聚集嵌合體的方法，和其中通過將ES細胞團和去除透明帶的8細胞期胚胎共培養並 聚集而生成聚集嵌合體的方法。
[0111] 在所有情況下，宿主胚胎可以收集自如下以相同方式提到的可以用作轉染至受精 卵中的用於卵收集的雌性的非人哺乳動物；例如，在小鼠的情況下，為了使得可能通過毛色 確定ES細胞對形成嵌合體小鼠的百分比貢獻，優選的是，宿主胚胎收集自顯示與ES細胞 來源的品系的毛色不同的毛色的品系的小鼠。例如，在源自129小鼠品系（毛色：深淺環 紋（agouti))的ES細胞的情況下，C57BL/6小鼠（毛色：黑色）或ICR小鼠（毛色：白化） 用作用於收集卵的雌性；在源自C57BL/6或DBF 1小鼠（毛色：黑色）或源自TT2細胞（源 自C57BL/6和CBA的F1 (毛色：深淺環紋））的ES細胞的情況下，ICR小鼠或BALB/c小鼠 (毛色：白化）可用作用於收集卵的雌性。
[0112] 因為種系嵌合體形成能力主要取決於ES細胞和宿主胚胎的組合，所以更優選選 擇顯示高種系嵌合體形成能力的組合。例如，在小鼠的情況下，優選使用源自C57BL/6品系 的宿主胚胎等用於源自129品系的ES細胞，並使用源自BALB/c品系的宿主胚胎等用於源 自C57BL/6品系的ES細胞。
[0113] 優選的是，用於卵收集的雌性小鼠為約4至約6周齡，並且用於交配的雄性小鼠是 約2至約8個月齡的相同品系。儘管交配可以通過自然交配，但其優選在施用促性腺激素 (促卵泡激素，然後促黃體激素）以誘導過度排卵後進行。
[0114] 在胚泡注射方法的情況下，胚泡胚胎（例如，在小鼠的情況下，在交配後約3. 5天） 收集自用於卵收集的雌性的子宮（或桑椹胚期中或收集自輸卵管之前、之後的早期胚胎， 可以在用於胚胎培養的培養基（下述）中培養，直至胚泡期），且將具有引入其中的靶向載 體的ES細胞（約10至約15個細胞）用顯微操作器注射入胚泡的胚泡腔，其後將胚胎移植 到假孕胚胎受體雌性非人哺乳動物的子宮中。作為胚胎受體雌性非人哺乳動物，可以以相 同的方式使用可用作轉染到受精卵中的胚胎受體雌性的非人哺乳動物。
[0115] 在共培養方法的情況下，8-細胞期胚胎和桑椹胚（例如，在小鼠的情況下，在交配 後約2. 5天）收集自用於卵收集的雌性的輸卵管和子宮（或8細胞期中或收集自輸卵管之 前、之後的早期胚胎，可以在用於胚胎培養的培養基（下述）中培養，直至8-細胞期或桑椹 胚期），且將透明帶溶解在酸性臺氏溶液中，其後，將整合有靶向載體的ES細胞團（細胞數： 約10至約15個細胞）置於用礦物油覆蓋的用於胚胎培養的介質的微滴中，將上述8-細胞 期胚胎或桑椹胚（優選2個胚胎）進一步放置，並且將它們共同培養過夜。將獲得的桑椹 胚或胚泡移植到如上所述的胚胎受體雌性非人哺乳動物的子宮。
[0116] 如果移植的胚胎成功植入且胚胎受體雌性受孕，則嵌合非人哺乳動物幼崽將通過 自然分娩或剖腹產獲得。允許已經自然分娩的胚胎受體雌性繼續哺乳；如果幼崽通過剖 腹產分娩，則幼崽可以由分別提供的用於哺乳的雌性（通常交配和分娩的雌性非人哺乳動 物）進行哺乳。
[0117] 對於種系嵌合體的選擇，如果已經確定ES細胞的性別，則首先選擇與ES細胞性別 相同的嵌合體小鼠（通常，選擇雄性嵌合體小鼠，因為使用雄性ES細胞），然後基於表型諸 如毛色選擇顯示高ES細胞貢獻率（例如，50%或更高）的嵌合體小鼠被。例如，從D3細胞 (其是源自129小鼠品系的雄性ES細胞）和源自C57BL/6小鼠的宿主胚胎之間的嵌合體胚 胎獲得嵌合體小鼠的情況下，優選的是，選擇顯示高百分比的深淺環紋毛色的雄性小鼠。選 擇的嵌合體非人哺乳動物是否是種系嵌合體可以基於通過與相同動物物種的適當品系雜 交獲得的F 1動物的表型來確定。例如，在上述嵌合體小鼠的情況下，深淺環紋相對於黑色 是顯性的；因此，當雄性小鼠與雌性C57BL/6小鼠雜交時，如果選擇的雄性小鼠是種系嵌合 體，則獲得的匕的毛色是深淺環紋的。
[0118] 通常獲得因此獲得的整合有靶向載體的種系嵌合體非人哺乳動物（創建者）作為 AIM僅在同源染色體中任一者中敲除的雜合子。為了獲得AIM在兩條同源染色體中都敲除 的純合子，在如上所述獲得的F1動物中，可以雜交雜合子的同胞動物。雜合子的選擇可以通 過，例如，通過DNA雜交或PCR篩選從F 1動物的尾部分離和提取的染色體DNA來確定。獲 得的F2動物的1/4將是純合子。
[0119] 在使用病毒作為靶向載體的另一個優選實施方案中，可以提到以下方法，所述方 法包括用含有包含在5'和3'臂之間插入的用於陽性選擇的標記基因和所述臂外的用於陰 性選擇的標記基因的DNA的病毒感染非人哺乳動物的ES細胞（參見，例如，Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 99, No. 4，pp. 2140-2145，2002)。例如，當使用逆轉錄病毒或慢病毒時，將細胞接種到適當的 培養器諸如培養皿中，將病毒載體添加至培養液（如果需要，聚凝胺可以共存在），將細胞 培養1至2天，其後，如上所述繼續培養，並選擇其中整合載體的細胞。
[0120] 關於用於敲低AM的具體方法，可以提到以下方法，所述方法包括使用本身已知 的製備轉基因動物的技術引入編碼AM的反義RNA或siRNA (包括shRNA)的DNA，並允許其 在主體非人哺乳動物細胞等中。
[0121] 包含與期望多核苷酸的目標區域互補的鹼基序列的DNA，即與期望多核苷酸可雜 交的DNA可以被稱為針對期望多核苷酸是"反義"的。
[0122] 具有與編碼AM或其部分的多核苷酸的鹼基序列互補或實質上互補的鹼基序列 的反義DNA可以是任何反義DNA，只要它包含與編碼AM或其部分的多核苷酸的鹼基序列互 補或實質上互補且具有抑制多核苷酸表達的作用的鹼基序列。
[0123] 與編碼AM的多核苷酸實質上互補的鹼基序列是，例如，與重疊區域的多核苷酸 的互補鏈的鹼基序列具有約70%或更高，優選約80%或更高，更優選約90%或更高，最優 選約95%或更高的同源性的鹼基序列。本文中的鹼基序列同源性可以，例如，在以下條件 (期望值=10 ;允許缺口；過濾=ON ;匹配得分=1 ;錯配得分=-3)下使用同源性計算算法 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)來計算。
[0124] 具體地，在編碼AIM的多核苷酸的互補鏈的完整鹼基序列中，（a)在意在抑制翻譯 的反義DNA的情況下，與編碼AIM的N末端部分的部分的鹼基序列（例如，在起始密碼子 附近的鹼基序列等）的互補鏈具有約70%或更高，優選約80%或更高，更優選約90%或更 高，最優選約95%或更高的同源性的反義DNA是合適的，和（b)在意在用RNaseH降解RNA 的反義DNA的情況下，與編碼AM的包括內含子的多核苷酸的完整鹼基序列的互補鏈具有 約70%或更高，優選約80%或更高，更優選約90%或更高，最優選約95%或更高的同源性 的反義DNA是合適的。
[0125] 具體地，當主體非人哺乳動物是小鼠時，可以提到包含與以GenBank登錄號： AF011428註冊的鹼基序列或其部分互補或實質上互補的鹼基序列的反義DNA，優選地，包 含與所述鹼基序列或其部分互補的鹼基序列的反義DNA等。
[0126] 可以基於編碼克隆的或測定的AIM的DNA的鹼基序列信息設計併合成具有與編碼 AIM或其部分的多核苷酸的鹼基序列互補或實質上互補的鹼基序列的反義DNA(下文也稱 為"本發明的反義DNA")。此類反義DNA能夠抑制AM的複製和表達。具體地，本發明的反 義DNA能夠與從AM轉錄的RNA (mRNA或初始轉錄產物）雜交，並且能夠抑制mRNA的合成 (加工）或功能（翻譯成蛋白）。
[0127] 本發明的反義DNA的目標區域關於其長度沒有特別限制，只要翻譯成AIM由於反 義DNA的雜交而受到抑制；目標區域可以是編碼蛋白的mRNA的整個序列或部分序列，且長 度最短為約10個鹼基，並且最長為mRNA或初始轉錄產物的整個序列。具體地，可以選擇 AM的5'末端髮夾環、5'末端6鹼基對重複、5'末端非翻譯區、翻譯起始密碼子、蛋白編碼 區、ORF翻譯終止密碼子、3'末端非翻譯區、3'末端回文區、或3'末端髮夾環作為反義DNA 的優選目標區域，但也可以選擇AIM基因的任何其它區域作為目標。例如，該基因的內含子 部分也可以是目標區域。
[0128] 此外，本發明的反義DNA可以是以下反義DNA，所述反義DNA不僅與AM的mRNA或 初始轉錄產物雜交以抑制翻譯成蛋白，而且能夠結合至作為雙鏈DNA的AM以形成三重鏈 (三鏈體（triplex))，從而抑制轉錄為RNA。或者，本發明的反義DNA可以是形成的DNA: RNA 雜合體以誘導被RNaseH降解的反義DNA。
[0129] 編碼能夠特異性切割編碼AIM的mRNA或編碼區域內的初始轉錄產物（在初始轉 錄產物的情況下，包括內含子部分）的核酶的DNA也可以涵蓋在本發明的反義DNA中。最 通用核酶之一是感染性RNA諸如類病毒和擬病毒中發現的自我剪接RNA，並且錘頭型、髮夾 型等是已知的。錘頭型表現出酶活性，具有長度約40個鹼基，並且可能通過使側接錘頭結 構部分的兩端的幾個鹼基（總共約10個鹼基）變為與mRNA的期望切割位點互補的序列而 特異性切割目標mRNA。因為這種類型的核酶僅以RNA作為底物，所以它提供了不攻擊基因 組DNA的額外優點。如果AM mRNA本身假定雙鏈結構，則可以通過使用通過接合可以特異 性結合RNA解旋酶的源自病毒核酸的RNA基序而製備的雜合核酶而使得目標序列成為單鏈 的[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10):5572-5577 (2001)]。此外，核酶可以是通過 進一步接合從促進轉錄產物易位到細胞質的tRNA修飾的序列而製備的雜合核酶[Nucleic Acids Res·，29(13):2780-2788 (2001)]。
[0130] 在本文中，由與AIM的mRNA或初始轉錄產物的編碼區中的部分序列（在初始轉 錄產物的情況下，包括內含子部分）同源的寡-RNA (oligo-RNA)和與之互補的鏈（即 所謂的單鏈幹擾RNA(siRNA))組成的雙鏈RNA也可用於製備本發明的KD動物。已知所 謂的RNA幹擾（RNAi)(這是當siRNA被引入細胞中，與所述RNA同源的mRNA被降解的 現象）發生在線蟲、昆蟲、植物等中；因為這種現象被證實也發生在動物細胞中[Nature, 411 (6836) :494-498 (2001)]，所以siRNA已被廣泛地用作核酶的替代技術。siRNA可以使 用商購軟體（例如RNAi Designer; Invitrogen)基於作為目標的mRNA的鹼基序列信息來 適當地設計。
[0131] 本發明的反義寡-DNA和核酶可以通過基於AM的cDNA序列或基因組DNA序 列來確定mRNA或初始轉錄產物的目標序列，並使用商購的DNA/RNA合成儀（Applied Biosystems, Beckman等）合成與其互補的序列來製備。通過經由根據需要使用的適當接 頭（銜接分子）序列將合成的反義寡-DNA或核酶插入在表達載體中啟動子的下遊，可以制 備編碼反義寡-RNA或核酶的DNA表達載體。在這裡可以優選使用的表達載體的實例包括 用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母，菌體諸如λ 菌體，逆轉錄 病毒諸如莫洛尼白血病病毒，動物或昆蟲病毒諸如慢病毒、腺伴隨病毒、牛痘病毒和杆狀病 毒等擴增的質粒。尤其而言，質粒（優選來自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母的質粒，特別 是來自大腸桿菌的質粒）和動物病毒（優選逆轉錄病毒、慢病毒）是優選的。啟動子的實 例包括病毒啟動子，諸如SV40早期啟動子、巨細胞病毒（CMV)長末端重複（LTR)、勞斯肉瘤 病毒（RSV)LTR、小鼠白血病病毒（MoMuLV) LTR、和腺病毒（AdV)衍生的早期啟動子、和用於 哺乳動物組成型蛋白基因的啟動子，諸如肌動蛋白基因啟動子、PGK基因啟動子和轉鐵 蛋白基因啟動子等。
[0132] 編碼較長反義RNA (例如，AM mRNA的全長互補鏈等）的DNA表達載體可以通過經 由根據需要使用的適當接頭（銜接分子）序列以相反方向將通過常規方法克隆的AIM cDNA 插入在表達載體中啟動子的下遊來製備。
[0133] 同時，編碼siRNA的DNA可以通過分別合成編碼有義鏈的DNA和編碼反義鏈的 DNA，並將它們插入適當的表達載體中來製備。作為siRNA表達載體，可以使用具有Pol III 系統啟動子諸如U6或Hl的siRNA表達載體。在這種情況下，在整合有載體的動物細胞中， 將有義鏈和反義鏈轉錄並退火以形成siRNA。shRNA可以通過將包含通過長度鹼基（所述 長度鹼基允許形成適當的環結構（例如，約15至25個鹼基））分隔的有義鏈和反義鏈的單 元插入適當表達載體中來製備。作為shRNA表達載體，可以使用具有Pol III系統啟動子 諸如U6或Hl的shRNA表達載體。在這種情況下，在整合有表達載體的動物細胞中轉錄的 shRNA本身形成環，然後由內源酶Dicer酶等處理，以形成成熟的siRNA。或者，也可能通過 使用Pol II系統啟動子表達包含作為目標的siRNA序列的微小RNA(miRNA)而實現通過 RNAi的敲低。在這種情況下，通過顯示組織特異性表達的啟動子，組織特異性敲低也是可能 的。
[0134] 為了將包含編碼AM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA的表達載體引入細 胞，根據目標細胞適當地使用本身已知的方法。例如，為了引入早期胚胎諸如受精卵，使用 顯微注射法。為了引入ES細胞，可以使用磷酸鈣共沉澱法、電穿孔法、脂質體轉染法、逆轉 錄病毒感染法、凝集法、顯微注射法、粒子槍方法、DEAE-葡聚糖法等。或者，當逆轉錄病毒、 慢病毒等被用作載體時，有時可能通過將病毒添加至早期胚胎或ES細胞，並培養胚胎或細 胞1至2天以便用病毒感染細胞而便利地實現轉染。從ES細胞（建立創建者）再生個體、 傳代（製備純合子）等可以如上關於本發明的KO動物所述來進行。
[0135] 在一個優選的實施方案中，通過顯微注射將包含編碼AM的反義RNA、siRNA、 shRNA、或miRNA的DNA的表達載體引入作為主體的非人哺乳動物的早期胚胎（受精卵）。
[0136] DNA顯微注射至受精卵中可以通過常規方法使用通常已知的裝置諸如顯微操作器 來進行。簡而言之，使用固定移液器將置於用於胚胎培養的培養基的微滴中的受精卵抽吸 並固定，並且使用注射移液器將DNA溶液直接注射至雄性或雌性原核，優選為雄性原核。引 入的DNA優選在使用CsCl密度梯度超速離心或者陰離子交換樹脂柱等高度純化後使用。還 優選的是，將引入的DNA通過使用限制性內切酶切割載體部分預先進行線性化。
[0137] 引入DNA後，將受精卵通過微滴培養法等在5%氣態二氧化碳/ 95%大氣中在用 於胚胎培養的培養基中培養，直至1細胞期至胚泡期，其後將其移植到使得假孕的用於接 受胚胎的雌性非人哺乳動物的輸卵管或子宮。用於接受胚胎的雌性非人哺乳動物可以是任 一種與待移植的早期胚胎來源的動物相同的物種；例如，當移植小鼠早期胚胎時，優選使用 雌性ICR小鼠（優選約8至約10周齡）等。使得用於接受胚胎的雌性非人哺乳動物假孕 的已知方法是，例如，包括將雌性與切除輸精管（結紮輸精管）的相同物種的雄性非人哺乳 動物（例如，在小鼠的情況下，用雄性ICR小鼠（優選約2個月或更大齡））交配，並選擇證 實具有陰道塞的雌性的方法。
[0138] 使用的用於胚胎培養的雌性可以是已經自發排卵的雌性，或者在與切除輸精 管（結紮輸精管）的雄性交配之前接受施用的促黃體激素釋放激素（通常簡稱為LHRH) 或其類似物以誘導生育力的雌性。LHRH類似物的實例包括[3, 5-Di I-Tyr5] -LH-RH、
[01118]-1^-冊、〇)-六136]-1^-冊、[(168-6171。]-1^-冊、〇)-把8(821) 6]-1^-冊和其乙基醯胺類 (Ethylamides)等。施用的LHRH或其類似物的量和施用後與雄性非人哺乳動物的交配的 時間根據非人哺乳動物的種類而變化。例如，當非人哺乳動物是小鼠（優選ICR小鼠等） 時，通常優選的是，在施用LHRH或其類似物之後約4天將雌性小鼠與雄性小鼠交配；施用的 LHRH或其類似物的量通常為約10至60 μ g/個體，優選約40 μ g/個體。
[0139] 通常，如果待移植的早期胚胎是在桑椹胚期或之後，則將胚胎移植到用於接受胚 胎的雌性的子宮；如果早期胚胎是在桑椹胚期之前的階段（例如，1-細胞期至8細胞期胚 胎），則將胚胎移植到輸卵管。根據待移植的胚胎的發育階段，在變得假孕之後給定天數過 去之後，適當地使用用於接受胚胎的雌性。例如，在小鼠的情況下，變得假孕之後約0. 5天 的雌性小鼠優選用於移植2-細胞期胚胎，並且變得假孕之後約2. 5天的雌性小鼠優選用於 移植胚泡胚胎。將用於接受胚胎的雌性麻醉（優選地，使用阿佛丁、耐波他等）後，進行切 開，拉出卵巢，並且使用用於胚胎移植的移液器將在用於胚胎培養的培養基中懸浮的早期 胚胎（約5至約10個胚胎）注射入輸卵管的腹腔口（abdominal osteum)的附近或子宮角 的輸卵管接合部。
[0140] 當移植的胚胎成功植入且胚胎受體雌性受孕時，非人哺乳動物幼崽將通過自然分 娩或剖腹產獲得。允許已經自然分娩的胚胎受體雌性繼續哺乳；當幼崽通過剖腹產分娩時， 幼崽可以由分別提供的用於哺乳的雌性進行哺乳（例如，在小鼠的情況下，具有通常交配 和分娩的雌性小鼠（優選為雌性ICR小鼠等））。
[0141] 確保在受精卵細胞階段轉移編碼AM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA， 從而使得引入的DNA將存在於主體非人哺乳動物的所有種系細胞和體細胞中。引入的DNA 是否被整合在染色體DNA中可以通過，例如，通過DNA雜交或PCR篩選從幼崽的尾部分離和 提取的染色體DNA進行確定。如上所述獲得的後代非人哺乳動物（F tl)的種系細胞中表達載 體的存在意指該表達載體存在於隨後世代（F1)中所有動物的所有生殖系細胞和體細胞中。
[0142] 通常，Ftl動物作為在任一同源染色體中具有引入的DNA的雜合子獲得。不同F tl個 體具有在不同的染色體上隨機插入的引入的DNA，除非插入是通過同源重組。為了獲得在兩 條同源染色體中都具有表達載體的純合子，將F tl動物與非轉基因動物雜交以製備F i動物， 並且可以雜交在任一同源染色體中具有引入的DNA的其雜合的同胞動物。如果引入的DNA 只在一個基因座上整合，則1/4獲得的F2動物將是純合的。
[0143] 在使用病毒作為載體的另一個優選的實施方案中，與KO動物的上述情況的一樣， 可以提到包括用包含編碼AM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA的病毒感染非人哺 乳動物的早期胚胎或ES細胞的方法。當受精卵被用作細胞時，優選的是，在感染前去除透 明帶。病毒載體感染後培養1至2天後，在早期胚胎的情況下，將受精卵移植到如上所述使 得假孕的用於接受胚胎的雌性非人哺乳動物的輸卵管或子宮，或者在ES細胞的情況下，受 精卵繼續在添加如上所述的選擇藥物的情況下進行培養，並且選擇整合有載體的細胞。
[0144] 此外，如 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 98，pp. 13090-13095，2001 中所述，從雄性非人哺乳動物收 集的精原細胞在與STO飼養細胞共培養的過程中用病毒載體感染，其後將精原細胞注入雄 性不育的非人哺乳動物的輸精管，並且將雄性不育的非人哺乳動物與雌性非人哺乳動物交 配，由此可以有效獲得對於編碼AIM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA是雜合-Tg (+/-)的幼崽。
[0145] 描述於 Miyazaki Τ·等人（J. Exp. Med.，189，413-422，1999)或通過上述方 法獲得的本發明的AIM基因表達缺陷的非人哺乳動物在高脂肪膳食飼餵條件下具有以下 特徵： (1) 肝重量增加， (2) 脂肪肝得到促進， (3) 脂肪肝得到發生，和/或 (4) 肝臟中炎症應答受到抑制。
[0146] 此外，像野生型動物一樣，本發明的AM表達缺陷的非人哺乳動物在高脂肪膳食 飼餵條件下特徵性地顯示了促進的肝纖維化。這些表型至少在常規公眾已知的AM KO小 鼠中還沒有報導。具體地，從脂肪肝變為肝纖維化再變為肝癌類似於NASH的病理學，這是 新發現。
[0147] (1)肝重量增加意指，通過用高脂肪膳食飼喂，與野生型動物相比，本發明的AM 表達缺陷的非人哺乳動物中肝重量和/或肝重量/體重（％)變得顯著不同。在下述實施 例中，與野生型小鼠相比，從高脂肪膳食飼餵的第6周起在AIM敲除小鼠中發現顯著差異。
[0148] (2)脂肪肝得到促進意指，通過用高脂肪膳食飼喂，與野生型動物相比，本發明的 AIM表達缺陷的非人哺乳動物的肝臟中在早期階段觀察到脂肪積累。脂肪在肝臟中的積累 也可以通過，例如，用油紅0染色肝組織切片來證實。或者，它也可以通過測量肝組織中的 中性脂肪的量來證實。在下述實施例中，與野生型小鼠相比，從高脂肪膳食飼餵的第6周起 在AM敲除小鼠中發現顯著差異。
[0149] (3)肝癌得到發生意指，通過用高脂肪膳食飼喂，在本發明的AIM表達缺陷的非 人哺乳動物中觀察到肝癌的發病。肝癌可以，例如，通過用抗AFP(a -甲胎蛋白）染色肝組 織切片，測定肝組織中的AFP表達水平，或測量血液AFP濃度進行證實。在下述實施例中， 甚至從高脂肪膳食飼餵起一年後也幾乎無法在野生型小鼠中證實肝癌，但從高脂肪膳食飼 餵起一年在所有AIM敲除小鼠中都發現肝癌。
[0150] (4)肝臟中炎症應答受到抑制意指，與野生型動物相比，本發明的AM表達缺陷 的非人哺乳動物中炎症應答受到抑制，甚至當它們用高脂肪膳食飼餵時。炎症應答可以通 過例如，F4/80 (巨噬細胞標記物）、TNF a、IL-6或IL-I β的表達來證實。在下述實施例 中，與野生型小鼠相比，從高脂肪膳食飼餵的第12周起在AIM敲除小鼠中肝臟中的炎症受 到顯著抑制。
[0151] 肝纖維化得到促進意指，像野生型動物一樣，通過用高脂肪膳食飼喂，在本發明的 AM表達缺陷的非人哺乳動物中觀察到肝纖維化。肝纖維化可以通過，例如，用天狼星紅染 色肝組織切片來證實。儘管已知由於肝星狀細胞的膠原合成參與肝纖維化，但它也可以通 過a SMA(其是肝星狀細胞的標記物）的表達來證實。它也可以通過肝臟中TGFM、膠原 4Α1的表達來證實。在下述實施例中，從高脂肪膳食飼餵的第20周起在野生型小鼠和AM 敲除小鼠中觀察到肝纖維化。此外，從高脂肪膳食飼餵的第20周起在野生型小鼠和AIM敲 除小鼠中觀察到a SMA的高表達。TGFM趨向於顯示與高脂肪膳食飼餵時期的長度成比 例的表達水平的增加。然而，在野生型小鼠和AIM敲除小鼠之間沒有觀察到纖維化水平和 a SMA和TGF β 1的表達水平的顯著差異。
[0152] 這些發現表明，置於高脂肪膳食飼餵條件下的AIM表達缺陷的非人哺乳動物可用 作肝臟疾病的動物模型，並且可以進一步用於篩選肝臟疾病的預防藥物或治療藥物。具體 地，本發明的篩選方法包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼餵條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用測試物質的步驟， (2) 觀察用測試物質施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的以下特性的任何一項或 多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌，和 (V)肝臟中的炎症應答，和 (3) 通過與未施用所述測試物質比較來選擇改善上述特性的測試物質的步驟。
[0153] 用於本發明的篩選方法中飼餵AIM表達缺陷的非人哺乳動物的高脂肪膳食沒有 特別限制，只要脂質含量高。它通常具有不小於20 %，優選不小於30 %，更優選不小於40 % 的脂質含量。用高脂肪膳食飼餵AM表達缺陷的非人哺乳動物的時期是至少直到可以證實 上述特性。飼餵時期不小於6周，更優選不小於12周，進一步優選不小於20周。
[0154] 作為待施用於AIM表達缺陷的非人哺乳動物的測試物質，可以使用蛋白、肽、抗 體、非肽化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物、血漿 等。施用測試物質的時機可以是高脂肪膳食飼餵的開始前或與其開始同時，或者在AIM表 達缺陷的非人哺乳動物的高脂肪膳食飼餵後觀察上述特性之後。施用方法可以是口服或胃 腸外的。對於口服施用，其也可以通過與飼料或飲用水混合來施用。作為腸胃外施用，可以 提到腹膜內施用，通過靜脈內注射、皮下注射、皮內注射、肌內注射、滴注等施用，栓劑的直 腸施用等。施用可以包括單次施用或多次施用。
[0155] 用測試物質施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的特性在施用測試物質後，通常 約4周或更晚，優選6周或更晚進行觀察。至於肝重量，它可以通過測量從上述哺乳動物 分離的肝臟的重量和/或肝重量/體重（％)來觀察。至於肝臟脂肪，它可以通過用油紅 O染色上述分離的肝臟的肝組織切片，並且將其染色水平轉化為數值，或者測量肝組織中中 性脂肪的量來觀察。至於肝臟纖維，它可以通過用天狼星紅染色上述分離的肝臟的肝組織 切片，並且將其染色水平轉化為數值來觀察。或者，至於肝臟纖維，它也可以通過將上述分 離的肝臟中的a SMA( α -平滑肌肌動蛋白）、TGFf3 1或者膠原4A1的表達水平轉化為數值 來證實。至於肝癌，它可以通過用抗AFP(a-甲胎蛋白）染色上述分離的肝臟的肝組織切 片，並且將其染色水平轉化為數值，或者將上述分離的肝臟中AFP的表達水平轉化為數值， 或者測量血液AFP濃度來觀察。至於肝臟中的炎症應答，它可以通過將上述分離的肝臟中 F4/80、TNFa、IL-6或IL-Ιβ的表達水平轉化為數值來證實。
[0156] 將如上所述獲得的上述特性的觀察結果與在測試物質的未施用的情況下的結果 進行比較。或者，預先繪製肝臟疾病的存在與否和上述特性的相關性圖，並且可以將獲得的 上述特性的觀察結果與相關性圖進行比較。優選基於顯著差異的存在與否進行比較。
[0157] 當獲得的上述特性的觀察結果相比於測試物質的未施用得到改善時，可以選擇測 試物質作為用於肝臟疾病的預防或治療的藥劑。在這裡，得到改善意指（i)肝重量低於測 試物質的未施用，（ii )肝臟脂肪量（油紅O染色的水平，或中性脂肪的量）低於測試物質 的未施用，（iii)肝纖維化的水平（天狼星紅染色的水平，a SMA、TGFf3 1、膠原4A1的表達） 低於測試物質的未施用，（iv )AFP表達低於測試物質的未施用，（V ) F4/80、TNFa、IL-6、 IL-I β的表達高於測試物質的未施用。
[0158] 當上述中選擇的測試物質被用作用於預防或治療肝臟疾病的藥劑時，它可以以與 本發明的AIMs相同的方式進行配製，並且通過類似的施用途徑並以類似的劑量進行施用。 待作為預防劑或治療劑的目標的肝臟疾病可以類似於上述那些。
[0159] 此外，由於高脂肪膳食飼餵條件下的AIM表達缺陷的非人哺乳動物可用作肝臟疾 病的動物模型，所以所述哺乳動物可以用於肝臟疾病的預防藥物或治療藥物的評估方法。 因此，本發明還提供了評估用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的預防或治療效果的方法，其 包括使用通過用高脂肪膳食飼餵AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。具體地，本 發明的評估方法包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼餵條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用用於肝臟疾病的 預防劑或治療劑的步驟， (2) 觀察用用於肝臟疾病的預防劑或治療劑施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的 以下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌， (V)肝臟中的炎症應答， (3) 通過將上述特性與未施用用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的特性比較而評估用 於肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果的步驟。
[0160] 本發明的評價方法中待施用於AIM表達缺陷的非人哺乳動物的用於肝臟疾病的 預防劑或治療劑可以是已知的用於肝臟疾病的預防劑或治療劑。其實例包括，但不限於， 胰島素增敏劑（例如，噻唑烷衍生物類，諸如羅格列酮、吡格列酮等等，雙胍類，諸如二甲雙 胍、丁雙胍等）；抗氧化劑類（例如，維生素 E、維生素 C、甜菜鹼、EPL(多烯磷脂醯膽鹼） 等）；護肝劑（例如熊去氧膽酸（UDCA)等）；抗高血脂症劑（例如，貝特類藥物、普羅布考、 他汀類藥物等）；降壓劑（例如，血管緊張素 II受體拮抗劑等）；甘草素製劑；中國草藥（例 如，小柴胡湯等）；抗癌劑等。用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的施用時期、 施用方法、施用頻率等可以與上述篩選方法中的那些相同。
[0161] 待通過本發明的評價方法觀察的特性的觀察方法可以根據上述篩選方法的描述 來進行。當通過評價方法獲得的上述特性的觀察結果比未施用用於肝臟疾病的預防劑或治 療劑改善更大程度時，測試物質可以被評價為作為用於預防或治療肝臟疾病的藥劑具有較 高的預防或治療效果。如本文中所使用，得到改善意指與上述相同。
[0162] 在本發明的下述實施例中，NASH患者的血清AM濃度被證實為比非NASH患者更 低。具體地，進展至肝癌的NASH患者的血清AM濃度被證實為仍然低於沒有進展至肝癌的 NASH患者的血清AM濃度。從上述可見，表明肝臟疾病可以通過測量試驗主體的血液AM 濃度來診斷。具體地，本發明的診斷方法包括以下步驟： (1) 測量試驗主體的樣品的AIM濃度的步驟； (2) 將所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度與健康人的樣品的AIM濃度比較的步驟； (3) 當所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度低於所述健康人的樣品的AIM濃度時，判 斷所述試驗主體具有肝臟疾病或具有發生肝臟疾病的高可能性的步驟。
[0163] 儘管本發明的診斷方法可適用的試驗主體沒有特別限制，但例如，可以提到具有 發生肝臟疾病的風險或懷疑已經發生肝臟疾病的試驗主體。儘管此類試驗主體沒有限制， 但例如，可以提到具有肥胖、糖尿病、高血壓、動脈硬化、高血脂等的症狀的試驗主體。作為 健康人，可以提到還沒有被臨床診斷為具有肝臟疾病的那些，例如，沒有上述症狀的人。
[0164] 待用於本發明診斷方法的樣品沒有特別限制，只要它收集自上述試驗主體，並且 包含待作為測量目標的AIM基因產物（例如，RNA、蛋白、其裂解產物等）。其實例包括體液， 諸如血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、汗液、唾液、滑液等或其級分，和其中含有的細胞，特別 是巨噬細胞等。
[0165] 從試驗主體收集的樣品的AM濃度可以通過從巨噬細胞製備RNA (例如，總RNA， mRNA)級分，並測量級分中含有的AM基因的轉錄產物來測量。儘管RNA級分可以通過使 用已知方法，諸如胍-CsCl超速離心法、AGPC法等來製備，但可以通過使用商購的RNA提取 試劑盒（例如RNeasy Mini試劑盒；由QIAGEN等製造）從痕量巨噬細胞迅速且方便地制 備高純總RNA。用於檢測RNA級分中AM基因的轉錄產物的方法的實例包括使用雜交的方 法（RNA印跡、斑點印跡、DNA晶片分析等），使用PCR的方法（RT-PCR、競爭性PCR、實時PCR 等）等。定量PCR方法，諸如競爭性PCR、實時PCR等是優選的，因為AIM基因表達的變化可 以從痕量的巨噬細胞迅速、方便且高定量地檢測。
[0166] 當採用RNA印跡或斑點印跡雜交時，AM基因的轉錄產物可以通過使用能夠與基 因的轉錄產物雜交的核酸（探針）來測量。此類核酸的實例包括能夠在高嚴格條件下與包 含AIM基因的轉錄廣物顯不的喊基序列（例如，SEQ ID NO: 1中顯不的喊基序列）的核酸 雜交的核酸。高嚴格條件是上述條件等。
[0167] 待用作探針的核酸可以是雙鏈或單鏈的。在雙鏈核酸的情況下，它可以是雙鏈 DNA、雙鏈RNA、或DNA = RNA雜合體。在單鏈的情況下，可以使用反義鏈。儘管核酸的長度沒 有特別限制，只要它可以與目標核酸特異性雜交，但例如，它不小於約15個鹼基，優選不小 於約30個鹼基。核酸優選用能夠檢測且定量目標核酸的標記來標記。作為標記試劑，例如， 使用放射性同位素、酶、螢光物質、發光物質等。作為放射性同位素，例如，使用[ 32p]、[3h]、 [14C]等。作為上述酶，優選具有高比活性的穩定酶；例如，使用β-半乳糖苷酶、β-葡萄 糖苷酶、鹼性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。作為螢光物質，例如，使用螢光胺、異硫 氰酸螢光素等。作為發光物質，例如，使用魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。此外， 還可以使用生物素_(鏈黴）抗生物素蛋白用於結合探針和標記。
[0168] 當採用RNA雜交時，將上述製備的RNA級分通過凝膠電泳分離，轉移至硝酸纖維 素、尼龍、聚偏二氟乙烯等的膜，在上述高嚴格條件下在包含如上述製備的標記探針的雜交 緩衝液中雜交，且通過合適的方法對於各條帶測量與膜結合的標記的量，由此可以測量AM 基因的表達水平。此外，在斑點印跡的情況下，AM基因的表達水平可以通過使點有RNA級 分的膜以相同方式進行雜交反應並測量斑點的標記的量來測量。
[0169] 在另一個優選的實施方案中，定量PCR方法用作用於測量AIM濃度的方法。定量 PCR的實例包括競爭性PCR、實時PCR等。
[0170] 用作PCR中的引物的寡核苷酸組沒有特別限制，只要它們可以各自與AIM基因的 轉錄產物的有義鏈（編碼鏈）和反義鏈（非編碼鏈）特異性雜交，並且可以擴增它們夾心 的DNA片段。例如，可以提到各自具有約15-約100個鹼基、優選約15-約50個鹼基的長度 且設計以擴增約100 bp - I kbp DNA片段的寡DNA組。更具體地，作為用作引物的寡核 苷酸組，可以提到能夠在高嚴格條件下與包含與上述鹼基序列互補的鹼基序列的核酸（反 義鏈）雜交的核酸。如本文中所使用，高嚴格條件如上定義。
[0171] 在競爭性RT-PCR中，期望的DNA的量通過以下測定：允許已知量的可以由能夠擴 增期望的DNA的引物組擴增的另一種模板核酸作為競爭物在反應液中共存，以引起競爭性 擴增反應，並比較擴增產物的量。因此，當使用競爭性RT-PCR時，除了上述引物組以外，使 用已知量的可以用引物組擴增且在擴增後可以與目標核酸的擴增產物（即AIM基因的轉錄 產物）區分（例如，不同的擴增大小、限制性酶處理後的片段的不同迀移模式等）的競爭物 核酸。因為當目標核酸和競爭物核酸競爭引物時擴增競爭性地發生，所以擴增產物的定量 比例反映初始模板的定量比例。競爭物核酸可以是DNA或RNA。在DNA的情況下，cDNA通 過逆轉錄反應從如上所述製備的RNA級分合成，並且PCR可以在上述引物組和競爭物共同 存在的情況下進行。在RNA的情況下，將競爭物添加至RNA級分並進行逆轉錄反應，且添加 上述引物組並進行PCR。在後者的情況下，可以估計初始mRNA的絕對量，因為還考慮逆轉錄 反應效率。
[0172] 在實時PCR中，使用螢光試劑實時監測擴增量，並且整體地包含熱循環儀和螢光 分光光度計的裝置是必要的。此類裝置是商購的。根據待使用的螢光試劑，存在幾種方法， 並且，例如，可以提到嵌入劑法、TaqMan?探針法、分子信標法等。在任何情況下，cDNA通過 逆轉錄反應從如上所述製備的RNA級分合成，並將上述引物組和螢光試劑（探針）（例如， 通過結合雙鏈DNA而發射螢光的試劑（嵌入劑），諸如SYBR Green I、溴化乙錠等)、可用 作上述探針的核酸（所述核酸在擴增區域內與目標核酸的雜交）（其中兩個末端分別用熒 光物質（例如，FAM、HEX、TET、FITC等）和猝滅物質（例如TAMRA、DABCYL等）等修飾）（ TaqMan1^探針或分子信標探針）各自添加至PCR反應系統。由於嵌入劑結合合成的雙鏈 DNA且在照射激發光之後發射螢光，所以可以通過測量螢光的強度監測擴增產物的量，基於 其可以推定初始模板cDNA的量。TaqMan?探針是能夠雜交至目標核酸的擴增區域的寡核 苷酸，其兩個末端分別被螢光物質和猝滅物質修飾。它在退火過程中雜交至目標核酸，但由 猝滅物質的存在禁止其發射螢光，並且當在延伸過程中被DNA聚合酶的外切酶活性分解時 (其釋放螢光物質）發射螢光。因此，通過測量螢光強度，可以監測擴增產物的量，基於其可 以推定初始模板cDNA的量。分子信標探針是能夠雜交至目標核酸的擴增區域且具有髮夾 型二級結構的寡核苷酸，其兩個末端分別被螢光物質和猝滅物質修飾。當它具有髮夾結構 時，它由於猝滅物質的存在而不發射螢光，並且當螢光物質和猝滅物質之間的距離在退火 過程中雜交至目標核酸之後增加而發射螢光。因此，可以通過測量螢光強度監測擴增產物 的量，基於其可以推定初始模板cDNA的量。由於實時RT-PCR允許實時監測PCR的擴增量， 所以它不需要電泳且可以更快速地分析AM基因的表達。
[0173] 在另一個實施方案中，從試驗主體收集的樣品的AM濃度可以通過從樣品製備蛋 白級分並檢測級分中含有的AIM來測量。AIM的檢測可以使用針對AM的抗體通過免疫測 量方法（例如，ELISA、FIA、RIA、蛋白質印跡等）來進行。或者，A頂的檢測也可以通過質譜 法諸如MALDI-TOFMS等來進行。
[0174] 針對AM的抗體可以根據通常用於產生多克隆抗體或單克隆抗體的技術且使用 包含與SEQ ID NO:2中顯示的胺基酸序列相同或實質上相同的胺基酸序列或其部分胺基酸 序列的蛋白作為免疫抗原來獲得。
[0175] 在將這些個別免疫測量方法應用於本發明的診斷方法時，不必設置具體條件、程 序等。使本領域技術人員普通技術考慮各方法中的常規條件和程序，可以構建AIM的測 量系統。對於這些一般技術手段的詳情，可以參考彙編、書本等。例如，Hiroshi Irie， 編，"Radioimmunoassay"（Kodansha Ltd.，1974 年出版）、Hiroshi Irie，編，"Sequel to the Radioimmunoassay"（Kodansha Ltd·, 1979 年出版）、Eiji Ishikawa 等人，編， "Enzyme Immunoassay"（Igakushoin, 1978 年出版）、Eiji Ishikawa 等人，編，"Enzyme Immunoassay"（第 2版）（Igakushoin, I982年出版）、Eiji Ishikawa等人，編，"Enzyme Immunoassay"（第 3 版）（Igakushoin, 1987 年出版）、Methods in ENZYM0L0GY， 第 70 卷(Immunochemical Techniques (部分 A))、同上，第 73 卷(Immunochemical Techniques (部分 B))、同上，第 74 卷（Immunochemical Techniques (部分 C))、同 上，Vol. 84 (Immunochemical Techniques ( D: Selected Immunoassays))、同上， 第 92 卷（Immunochemical Techniques (部分 E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同上，第 121 卷（Immunochemical Techniques ( I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(均由 Academic Press Publishing 出版） 等。
[0176] 如上面所提到，本發明的AM的血液濃度在患有肝臟疾病的患者中降低。因此，當 如上所述測量AM濃度且結果顯示與健康人相比降低的濃度時，可以判斷試驗主體已經發 生肝臟疾病或具有發生肝臟疾病的高可能性。或者，預先繪製肝臟疾病的存在與否和AIM 濃度的相關性圖，並且可以將獲得的觀察結果與相關性圖進行比較。優選基於顯著差異的 存在與否進行比較。
[0177] 本文序列表中的序列標識號顯示以下序列。
[0178] [SEQ ID N0:1] 顯不人AIM的喊基序列。
[0179] [SEQ ID NO:2] 顯示人AM的胺基酸序列。
[0180] [SEQ ID NO:3] 顯不對於F4/80的有乂引物的喊基序列。
[0181] [SEQ ID NO:4] 顯示對於F4/80的反義引物的鹼基序列。
[0182] [SEQ ID NO:5] 顯不對於TNFa的有乂引物的喊基序列。
[0183] [SEQ ID NO:6] 顯示對於TNFa的反義引物的鹼基序列。
[0184] [SEQ ID NO:7] 顯示對於IL-6的有義引物的鹼基序列。
[0185] [SEQ ID NO:8] 顯示對於IL-6的反義引物的鹼基序列。
[0186] [SEQ ID NO:9] 顯示對於IL-I β的有義引物的鹼基序列。
[0187] [SEQ ID NO: 10] 顯示對於IL-I β的反義引物的鹼基序列。
[0188] [SEQ ID NO: 11] 顯不對於aSMA的有乂引物的喊基序列。
[0189] [SEQ ID NO: 12] 顯示對於a SMA的反義引物的鹼基序列。
[0190] [SEQ ID NO: 13] 顯示對於TGFβ 1的有義引物的鹼基序列。
[0191] [SEQ ID NO: 14] 顯示對於TGFβ 1的反義引物的鹼基序列。
[0192] [SEQ ID NO:15] 顯示對於AFP的有義引物的鹼基序列。
[0193] [SEQ ID NO: 16] 顯示對於AFP的反義引物的鹼基序列。
[0194] [SEQ ID NO: 17] 顯示對於GAPDH的有義引物的鹼基序列。
[0195] [SEQ ID NO: 18] 顯示對於GAPDH的反義引物的鹼基序列。 實施例
[0196] 本發明下面藉助以下實施例和參考例進行更具體地描述，本發明並不限於以下實 施例和參考例。
[0197] 實施例1 :通過用高脂肪膳食（HFD)飼餵AM敲除小鼠而促進脂肪肝 通過用高脂肪膳食（HFD)飼餵AIM敲除小鼠和WT小鼠而研宄肝重量、相對於體重的肝 重量、肝臟中中性脂肪的重量、和通過蘇木精-伊紅組織染色的肝脂肪的積累。作為結果， 用HFD飼餵WT小鼠直到第20周沒有導致肝重量/體重的明顯差異，但用HFD飼餵AM敲 除小鼠導致從第6周起相比於WT的肝重量/體重的顯著增加（圖1A)。此外，肝臟中中性 脂肪重量的結果顯示，用HFD飼餵AM敲除小鼠導致從第6周起肝臟中脂肪的積累，並且已 經闡明，與WT相比，脂肪肝得到促進（圖1B)。
[0198] 實施例2 :通過用高脂肪膳食（HFD)飼餵AIM敲除小鼠的肝纖維化（肝硬化）的 進展 用高脂肪膳食（HFD)飼餵野生型小鼠（雄性，10隻小鼠，12周齡）和AIM敲除小鼠（雄 性，10隻小鼠，12周齡），0、6、12、20、45、55周後，用福馬林固定肝臟，用天狼星紅染色片， 並且通過NIH-J圖像定量染色的纖維化區域（圖2A)。每隻小鼠用三個不連續的片分析， 並且顯示平均值（纖維化與整片的比率）（圖2B)。作為結果，纖維化面積隨著HFD飼餵時 期變長而增加，但在野生型小鼠和AIM敲除小鼠之間沒有發現顯著差異。此外，在固定前 從肝組織的部分提取RNA，並且通過定量RT-PCR分析a SMA和TGF β的mRNA表達水平，所 述a SM和TGF β是參與肝纖維化的代表性基因（圖2C)。由於高脂肪膳食（HFD)飼餵後 45、55周時在AIM敲除小鼠中頻繁發生癌症，並且正常肝臟區域的準確表達水平難以分析， 所以僅僅在飼餵〇、6、12、20周的小鼠中進行RNA分析。作為結果，儘管aSM和TGF β的 mRNA表達水平隨著HFD飼餵而增加，但在它們之間沒有發現顯著差異。
[0199] 實施例3 :通過用高脂肪膳食（HFD)飼餵AM敲除小鼠的肝細胞癌的發病 當用HFD飼餵WT小鼠52周時，觀察到脂肪肝，但大部分沒有發生肝細胞癌。然而，在 所有AIM敲除小鼠中觀察到肝細胞癌，並且幾乎所有觀察到的腫瘤都是高度分化型肝細胞 癌（HCC)(圖3A、B、C)。通過Hoechst/AFP染色在AM敲除小鼠的肝臟中證實肝細胞癌（圖 4)，並且還證實了肝臟中AFP的促進表達。
[0200] 實施例4 :通過高脂肪膳食（HFD)飼餵的AM敲除小鼠的炎症應答 用高脂肪膳食（HFD)飼餵AIM敲除小鼠抑制了肝臟中的炎症應答（圖5)。當用HFD 飼餵WT小鼠時，在第12-20周時觀察到肝臟中促進的炎症應答，諸如巨噬細胞的積累，以及 TNFa、IL-6、IL_lf3的促進表達。相反，與WT相比，這些炎症應答在AM敲除小鼠中被抑 制（圖5)。
[0201] 實施例5 :通過IgM穩定血液AM 通過蛋白質印跡分析由於不存在B淋巴細胞而在血液中缺乏IgM的RAG (重組激活基 因）KO小鼠的血清AM。與WT相比，RAG KO小鼠顯示出血清中極低水平的AM，並且沒有 檢測到AM-IgM複合物（圖6A)。因此，在體外檢查AM和IgM的結合，以證實AM和IgM 的結合（圖6A)。此外，向RAG KO小鼠靜脈內施用200 μ g IgM。作為結果，血液AM增加 (圖6B)。此外，通過ELISA方法測定小鼠和人血清的AM濃度與IgM濃度。作為結果，闡 明了血液AM濃度和IgM濃度在人中也是相關的，如在小鼠中一樣（圖7)。從上述可見，表 明AIM與IgM形成複合物，並且在血液中被穩定化。
[0202] 實施例6 :AM在體外的脂肪肝抑制作用 研宄AIM在體外對肝細胞的作用。將小鼠原代培養的肝細胞與AIM反應5小時，並且將 細胞用抗-AIM抗體染色，並進行蛋白質印跡。作為結果，證實了 AIM被細胞所攝取（圖8)。 此外，將800 μΜ油酸（OA)添加至小鼠原代培養的肝細胞，並且將細胞培養24小時以生成 脂肪肝，並且在添加或不添加 AM的情況下進一步培養24小時。從油紅0染色和FSP27 (脂 肪特異性蛋白27)的mRNA表達水平測量脂肪肝的程度。通過不添加 AIM (0A - DMEM)，油 紅0染色的水平和fsp27表達水平相比於不添加 OA增加，並且證實了脂肪肝的程度（圖 9)。另一方面，通過添加 AM (0A - AM)，油紅0染色的水平和fsp27表達水平沒有增加 (圖9)，並且證實了 AIM的脂肪肝改善作用。
[0203] 實施例7 :通過SRCR結構域抑制前脂肪細胞分化為脂肪細胞 通過在HEK293T細胞中表達添加 HA (血凝素）標籤的每種人SRCR結構域並且通過抗 HA抗體柱對其純化而獲得重組人SRCR結構域（SRCR1、SRCR2、SRCR3)蛋白。將3T3-L1前 脂肪細胞在lμg/mL胰島素、l μM地塞米松（DEX)、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤（IBMX)存 在的情況下培養48小時，以誘導分化為脂肪細胞，並且研宄SRCR結構域和AM的分化抑制 作用。添加的AM是人全長AM (hAM)，並且以20 μ g/ml使用上述3種SRCR結構域蛋 白。基於沒有添加的油紅O染色的水平作為100%定量向脂肪細胞的分化。在所有SRCR結 構域中都發現與AIM的脂肪細胞分化抑制作用相同的脂肪細胞分化抑制作用（圖10)。
[0204] 實施例8 :測量NASH患者的血清AM濃度 在3例NASH患者（2例進展為肝細胞癌）和3例非NASH患者中測量血清AM濃度。使 用抗-A頂抗體通過蛋白質印跡進行測量，並且定量信號的強度。與非NASH患者相比，NASH 患者顯示降低的血清AIM濃度（圖11)。此外，進展為肝細胞癌的NASH患者顯示更加降低 的血清AM濃度（圖11)。
[0205] 參考例：AIM施用對用高脂肪膳食（HFD)飼餵的AIM敲除小鼠的作用 繁殖8周齡AIM KO小鼠，同時用高脂肪膳食（HFD)飼喂。從HFD飼餵的第2 - 3周 起每天施用AIM或媒介物，然後觀察脂肪在肝臟的積累。當施用後4 - 6周時用油紅0染 色肝臟時，在媒介物施用組中觀察到脂肪積累，而在AM施用組沒有發現這一點。因此，已 知AIM可用於脂肪肝的預防。此外，繁殖8周齡AM KO小鼠，同時用高脂肪膳食（HFD)飼 喂。從HFD飼餵的第6 - 8周起每天施用AIM或媒介物，然後觀察脂肪在肝臟的積累。當 施用後4 - 8周時用油紅0染色肝臟時，在媒介物施用組中脂肪積累相比於施用前增加，而 在AM施用組脂肪積累相比於施用前降低。因此，已知AIM可用於脂肪肝的改善或治療。此 夕卜，通過使用能夠激動性地（agonistically)控制AIM的功能的藥物（包括具有AIM活性 的AIM的部分肽）或誘導AIM的表達藥物來替代AM也獲得了類似結果。類似地，通過在 當發生肝纖維化和肝癌的時間點施用AIM也證實了 AIM對肝硬化和肝癌的預防、改善或治 療作用。
[0206] 實施例9 :AIM施用對用高脂肪膳食（HFD)飼餵的AIM敲除小鼠的作用 用高脂肪膳食（HFD)飼餵AIM敲除小鼠（雄性，10隻小鼠，12周齡）43周，並且從第 30周至第43周每周一次通過腹膜內注射施用重組AM (rAM) (20 mg/Kg (體重）；5隻小 鼠）或PBS (5隻小鼠）。在HFD的第43周，將小鼠宰殺，用福馬林固定分離的肝臟，並且 製備肝組織片。用蘇木精-伊紅染色獲得的肝組織片，並且分析癌症的狀態和脂肪肝的狀 態。對於每隻小鼠以10個非連續片製備肝組織片，並且分析癌症的存在與否、大小和數目。 此外，在固定前部分去除肝（非癌部分），並且測量中性脂肪的含量。作為結果，rAIM施用 組的體重顯著降低。另一方面，PBS施用組的體重增加（圖12A)。在rAM施用組中沒有發 現清楚的癌部分。相反，所有小鼠在PBS施用組中都具有多個癌結節（cancer nodule)。此 夕卜，在組織學上發現多個肝癌。顯示目視照片和蘇木精-伊紅染色圖像（圖12B)。至於脂 肪肝，在rAM施用組中觀察到組織學上明顯的改善。此外，與PBS施用組的中性脂肪含量 相比，肝（非癌部分）的中性脂肪含量顯著降低（圖12B)。
[0207] 工業實用性 本發明可以為肝臟疾病提供預防劑或治療劑，其包含AIM作為活性成分。此外，本發明 的肝臟疾病模型小鼠有助於闡明肝臟疾病的發病機制，並且根據使用所述肝臟疾病模型小 鼠的篩選方法，可以搜索對於肝臟疾病的預防或治療有效的物質。此外，使用本發明的肝臟 疾病模型小鼠，可以評估已知的用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果。此外，本發明可提 供用於診斷肝臟疾病的方法。
[0208] 本申請基於在日本提交的專利申請號2012-103958(申請日：2012年4月27日）， 其內容完全併入本文。
【權利要求】
1. 用於肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其 部分膚的鹼基序列的核酸。
2. 用於肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含誘導AIM的表達的藥物或穩定AIM的藥物。
3. 根據權利要求1或2的藥劑，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝 硬化或肝癌。
4. 篩選用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼餵 AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。
5. 根據權利要求4的方法，其包括W下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼餵條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用測試物質的步驟， (2) 觀察用所述測試物質施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的W下特性的任何一 項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌，和 (V)肝臟中的炎症應答，和 (3) 通過與未施用所述測試物質比較來選擇改善上述特性的測試物質的步驟。
6. 根據權利要求4或5的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝 硬化或肝癌。
7. 評估用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的預防或治療效果的方法，其包括使用通過用 高脂肪膳食飼餵AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。
8. 根據權利要求7的方法，其包括W下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼餵條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用用於肝臟疾病的 預防劑或治療劑的步驟， (2) 觀察用所述用於肝臟疾病的預防劑或治療劑施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動 物的W下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌， (V)肝臟中的炎症應答， (3) 通過將上述特性與未施用所述用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的特性比較而評 估所述用於肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果的步驟。
9. 根據權利要求7或8的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝 硬化或肝癌。
10. 診斷肝臟疾病的方法，其包括W下步驟： (1) 測量試驗主體的樣品的AIM濃度的步驟， (2) 將所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度與健康人的樣品的AIM濃度比較的步驟， (3) 當所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度低於所述健康人的樣品的AIM濃度時，判 斷所述試驗主體具有肝臟疾病或具有發生肝臟疾病的高可能性的步驟。
11. 根據權利要求10的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬 化或肝癌。
12. 用於預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的AIM或其部分膚、或 含有編碼所述AIM或其部分膚的鹼基序列的核酸。
13. 用於預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的誘導AIM表達的藥 物或穩定AIM的藥物。
14. 根據權利要求12或13的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、 肝硬化或肝癌。 15. AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其部分膚的鹼基序列的核酸，其用於預防 或治療肝臟疾病。
16. 根據權利要求15的AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其部分膚的鹼基序列 的核酸，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
17. 誘導AIM表達的藥物或穩定AIM的藥物，其用於預防或治療肝臟疾病。
18. 根據權利要求17的藥物，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬 化或肝癌。
【文檔編號】G01N33/15GK104470531SQ201380022312
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年4月26日 優先權日:2012年4月27日
【發明者】宮崎徹 申請人:宮崎徹