人睪丸發育特異性蛋白－6基因編碼蛋白的製作方法

2023-11-06 07:01:02 2

專利名稱：人睪丸發育特異性蛋白－6基因編碼蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬於人類基因組技術領域。
本發明所述人睪丸發育特異性蛋白-6基因(testis developmentspecific protein gene,NYD-SP6)是發明人在南京醫科大學生殖醫學江蘇省重點實驗室用基因晶片方法篩選獲得，首先製備人睪丸功能基因表達晶片，通過比較胚胎和成年人睪丸功能基因的表達，獲得差異表達克隆，經序列測定證明為全長cDNA，為1859bp；其開放閱讀框架為1127bp，其編碼381個胺基酸。查閱基因庫，該基因為新基因。由於該基因是成人睪丸高表達，因此發現的人睪丸發育特異性蛋白-6基因可能與睪丸發育有關，用該基因克隆可製備成融合蛋白，用該蛋白免疫家兔，可獲得單克隆和多克隆抗體，該基因也可用於製備睪丸功能基因表達晶片。融合蛋白也可能成為相關疾病治療的基因藥物。
由於人睪丸發育特異性蛋白-6基因在Genbank資料庫中尚無人的同源基因，本發明人對於該基因的結構和功能研究成果全都是開創性的。美國國家生物技術情報中心(National Centerfor BiotechnologyInformation,NCBI)已正式接受該基因為Genbank的新成員，接受號為AY014283。1 gggggttgtg accacaccga cacgtatttt acagataaat cattcttgcg gcggcgggtc61 gaacacgttt atttattttt tattttctca acaagctttt acccagcacc tgtccagtga121 aacaacttga taatcgtttc gaggggcgtc cgccgggtta ggaagccact gcctggcagc181 ttgtggaagc ctcatttgca aagccacccc tcagatgttt tgaagatcgt gacgtcttgt241 aactagcagt gtgtgcacag aatcctactc aaggaacgtc ttggcccagc gatgcaaaga301 actgaagttt caagctggaa gagcctgtat tgtcctcaca atagtataga agaattcaag361 agaggagaga gagacagcac cgaatgaaga ctgtaaaaga aaagaaggaa tgccagagat421 tgagaaaatc tgccaagact aggagggtaa cccagaggaa accgtcttca gggcctgttt481 gctggctatg ccttcgagaa cctggggatc ccgaaaaatt aggggaattt cttcagaaag541 acaatatcag cgtgcattat ttctgtctta tcttatctag taagctgcct cagaggggcc601 agtccaacag aggtttccat ggatttctgc ctgaagacat caaaaaggag gcagcccggg661 cttctaggaa gatctgcttt gtgtgcaaga aaaagggagc tgctatcaac tgccagaagg721 atcagtgcct cagaaacttc catctgcctt gtggccaaga aaggggttgc ctttcacaat781 tttttggaga gtacaaatca ttttgtgaca aacatcgccc aacacagaac atccaacatg841 ggcatgtggg ggaggaaagc tgcatcttat gttgtgaaga cttatcccaa cagagtgttg901 agaacatcca gagcccgtgt tgtagtcaag ccatctacca ccgcaagtgc atacagaaat961 atgcccacac atcagcaaag catttcttca aatgtccaca gtgtaacaat cgaaaagagt1021 ttcctcaaga aatgctgaga atgggaattc atattccaga cagagatgct gcctgggaac1081 tcgagccagg ggctttctca gacttatatc agcgctatca gcactgtgat gcccccatct1141 gtctgtatga acaaggcaga gacagctttg aggatgaagg gaggtggtgc ctcattctgt
1201 gtgctacatg cggatcccac ggaacccaca gggactgctc ctctcttaga tctaacagta1261 agaaatggga gtgtgaggag tgttcacctg ctgcagccac agactacata cctgaaaact1321 caggggacat cccttgctgc agcagcacct tccaccctga ggaacatttc tgcagagaca1381 acaccttgga agagaatccg ggcctttctt ggactgattg gccagaacct tccttattag1441 aaaagccaga gtcctctcgt ggcaggagga gctactcctg gaggtccaag ggtgtcagaa1501 tcactaacag ctgcaaaaaa tccaagtaac accttctgag tagctgctgt cccacacaat1561 agggtatgaa gctgcgctcc tccatcgggt ttggggaggg agcactctgg gactgtgaga1621 caaggaagca gggccagcag tgagactatg agccaagcaa agagaagtct cagtggagca1681 tgaggaggga gcagtccaga tgccaacaag gaaatgcgtt tatggctaca aaaaggcctc1741 tggtttctcc tattctcctc ccaccaagga ttcttccacc ttaatcttgg tttcatatgc1801 ctttttttac ttcacccaat gtttgttgtt tttgcaaaat aaaaggaaaa aaaaaaaaa人睪丸發育特異性蛋白-6基因cDNA序列MKTVKEKKECQRLRKSAKTRRVTQRKPSSGPVCWLCLREPGDPEKLGEFLQKDNISVHYFCLILSSKLPQRGQSNRGFHGFLPEDIKKEAARASRKICFVCKKKGAAINCQKDQCLRNFHLPCGQERGCLSQFFGEYKSFCDKHRPTQNIQHGHVGEESCILCCEDLSQQSVENIQSPCCSQAIYHRKCIQKYAHTSAKHFFKCPQCNNRKEFPQEMLRMGIHIPDRDAAWELEPGAFSDLYQRYQHCDAPICLYEQGRDSFEDEGRWCLILCATCGSHGTHRDCSSLRSNSKKWECEECSPAAATDYIPENSGDIPCCSSTFHPEEHFCRDNTLEENPGLSWTDWPEPSLLEKPESSRGRRSYSWRSKGVRITNSCKKSK人睪丸發育特異性蛋白-6基因開放閱讀框架胺基酸序列本發明的目的是鑑於人睪丸發育特異性蛋白-6基因是本發明人發現的全新基因，目前人類對此基因的認識和了解僅限於本發明人所做的科學研究工作。由於該基因是與睪丸特異功能相關的基因，而且是胚胎低表達，成人高表達，因此該基因很可能與睪丸的發育有關，其異常表達可能影響男性的生殖功能，因此該基因的研究可用於①通過製備該基因的融合蛋白，用於研究該基因與睪丸功能的關係，還可能成為一種治療男性睪丸相關疾病的生物藥品。
②製備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結構和功能的不可缺少的重要工具，人睪丸發育特異性蛋白-6基因編碼蛋白的多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉澱等多種根據免疫學原理設計的檢測方法，可用於該基因編碼蛋白在組織細胞中的定位和定量研究，也可用於各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質-蛋白質相互作用研究等。因此，該抗體有可能用於製備與人睪丸發育特異性蛋白-6基因表達異常相關疾病診斷試劑盒，並有可能用於製備抗生育藥物。
③製備基因診斷晶片將功能基因用於製備基因診斷晶片是基因開發研究的一個重要方面，在疾病診斷(如男性不育、性功能低下)和藥物篩選等方面均具有重要意義。
本發明技術方案1．人睪丸發育特異性蛋白-6基因融合蛋白的製備以人睪丸發育特異性蛋白-6基因開放閱讀框的核苷酸序列與質粒pDESTTM15製備成GST-SP2-pDEST15表達質粒，在無NaCl的LB中30℃培養到0.5OD600，經0.3MNaCl誘導後，超聲粉碎後經GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。
2．人睪丸發育特異性蛋白-6基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結合，經透析後再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫紐西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發注射一次，共三次，於三個月後取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA，測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進一步用抗原作競爭抑制免疫試驗確定抗體的特異性。根據ELISA結果確定其用於免疫組織化學染色的稀釋倍增數為1∶200～500。
3．人睪丸發育特異性蛋白-6基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結合，經透析後再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內注射)，隔周一次，連續2-3次，融合前靜脈加強一次，用ELISA方法證實抗體的產生後，取脾臟分離脾細胞，然後與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞。陽性克隆經多次亞克隆，直至獲得分泌抗人睪丸發育特異性蛋白-6抗體的單克隆雜交瘤細胞株。
4．人睪丸發育特異性蛋白-6基因用於製備睪丸功能基因表達晶片(1)以獲取的人睪丸發育特異性蛋白-6基因的核苷酸序列設計引物，擴增全長的人睪丸發育特異性蛋白-6基因序列，用作點膜的樣品。
(2)用英國BioRobotics自動點膜儀將標本點在8×12cm尼龍膜上，每一標本點2個點，每點的DNA量約幾ng。；陽性對照8個housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxy Ⅰ-ferminal esterase LⅠ)。陰性對照加λ噬菌體DNA和P-blue質粒。
(3)將含有該基因的晶片用於人睪丸發育特異性蛋白-6基因缺失的診斷和藥物篩選33P標記抽提待檢標本mRNA或DNA，用Random Primer標記法標記待檢標本mRNA或DNA，作為雜交的探針。雜交將點制好的尼龍膜標記探針雜交後，雜交爐(68℃)內烘乾，用磷屏壓片。信號掃描和分析用記錄儀分析雜交信號。根據雜交信號的強弱分析影響人睪丸發育特異性蛋白-6基因蛋白表達水平或人睪丸發育特異性蛋白-6基因的缺失。
權利要求
1．人睪丸發育特異性蛋白-6(NYD-SP6)克隆製備的融合蛋白，其特徵是NYD-SP6基因全部開放閱讀框胺基酸，序列為MKTVKEKKECQRLRKSAKTRRVTQRKPSSGPVCWLCLREPGDPEKLGEFLQKDNISVHYFCLILSSKLPQRGQSNRGFHGFLPEDIKKEAARASRKICFVCKKKGAAINCQKDQCLRNFHLPC6QERGCLSQFFGEYKSFCDKHRPTQNIQHGHVGEESCILCCEDLSQQSVENIQSPCCSQAIYHRKCIQKYAHTSAKHFFKCPQCNNRKEFPQEMLRMGIHIPDRDAAWELEPGAFSDLYQRYQHCDAPICLYEQGRDSFEDEGRWCLILCATCGSHGTHRDCSSLRSNSKKWECEECSPAAATDYIPENSGDIPCCSSTFHPEEHFCRDNTLEENPGLSTDWPEPSLLEKPESSRGRRSYSWRSK6VRITNSCKKSK
2．根據權利要求1所述針對NYD-SP6基因開放閱讀框胺基酸序列製備的多克隆抗體，其特徵是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合後，免疫紐西蘭兔製備多克隆抗體。
3．根據權利要求1所述針對NYD-SP6基因開放讀框胺基酸序列製備的單克隆抗體，其特徵是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細胞並和骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，進一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，製備單克隆抗體。
4．根據權利要求1所述針對將NYD-SP6基因開放讀框胺基酸序列用於製備睪丸功能基因表達晶片，其特徵是PCR擴增NYD-SP6基因cDNA，點於晶片用於晶片製備。
5．根據權利要求1所述，針對NYD-SP6基因開放讀框胺基酸序列製備融合蛋白，其特徵是融合蛋白可作為製備治療相關疾病的藥物。
全文摘要
本發明屬於人類基因組技術領域,所述的人睪丸發育特異性蛋白－6(testis development specific protein gene,NYD－SP6)基因全長cDNA序列為1859bp,其開放閱讀框序列為1127bp,其編碼381個胺基酸,該基因在基因庫(Genbank)中的編號為AY014283。本發明利用NYD－SP6基因克隆製備融合蛋白,並可用該蛋白免疫動物製備單克隆和多克隆抗體,同時可將基因克隆用於睪丸特異功能基因表達晶片的製備,表達蛋白也可能成為治療相關疾病的基因藥物。
文檔編號C07K16/18GK1318563SQ0111351
公開日2001年10月24日 申請日期2001年4月11日 優先權日2001年4月11日
發明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請人:南京醫科大學