用於檢測DPYD*2A遺傳多態性的引物、探針及檢測試劑盒的製作方法
2023-11-07 00:05:02
本發明涉及體外核酸檢測，尤其是涉及採用螢光定量pcr(fq-pcr)技術檢測dpyd*2a基因多態性的引物、探針及檢測試劑盒。
背景技術：
：二氫嘧啶脫氫酶(dihydropymidinedehydrogenase，dpd)是氟尿嘧啶(5-fu)藥物代謝途徑中的關鍵性酶之一，可催化5-fu在形成細胞毒作用的核酸之前代謝成無抗癌活性的代謝產物，是5-fu代謝失活的限速酶。dpd由二氫嘧啶脫氫酶基因(dpyd)編碼產生，dpyd基因定位於染色體lp22上，全長約950kb，包括23個外顯子。dpyd序列上鹼基的突變可能引起dpd結構及活性的改變，dpd活性缺乏與氟化嘧啶類化療藥物毒性反應密切相關，而dpyd突變則對dpd結構及活性起著重要的作用。氟尿嘧啶(5-fu)、卡培他濱和替加氟都為嘧啶類似物，屬抗代謝類抗腫瘤藥物。卡培他濱為5-fu的前體，在體內可活化代謝為5-fu，用於結腸癌和對紫杉醇及多柔比星等無效的晚期乳腺癌的治療。替加氟為5-fu的衍生物，在體內經肝臟活化轉變為5-fu而發揮抗腫瘤作用。85％的5-fu經二氫嘧啶脫氫酶(dpd)代謝滅活。dpd酶活性低下的結腸癌和胃癌患者應用5-fu、卡培他濱或替加氟後出現體內5-fu蓄積，引起嚴重黏膜炎、粒細胞減少症、神經系統症狀甚至死亡。dpyd基因14外顯子1986位a>g多態性(dpyd*2a)是最常見的引起酶活性下降的遺傳變異，等位基因攜帶率為3％。約40％低dpd酶活性的個體攜帶dpyd*2a等位基因，其中有60％的患者應用5-fu治療後出現4級嚴重的粒細胞減少；而在dpd酶活性正常患者中，5-fu所致嚴重毒副反應的發生率僅為10％。因此，對dpyd*2a多態性進行檢測可預測5-fu治療導致致命性毒性反應發生風險。fda已批准在5-fu說明書中增加在用藥前對dpyd多態性進行檢測的建議。cpic指南也建議在應用5-fu、卡培他濱和替加氟前對dpyd多態性進行檢測，攜帶dpyd*2a等位基因的患者慎用5-fu、卡培他濱和替加氟，或降低用藥劑量，以避免嚴重不良反應或毒性的發生。目前常用的基因分型方法大致可分為三類：一是基於凝膠電泳的技術，如pcr反應結合限制性酶切片段長度多態性分析(rflp)、多重pcr、等位基因特異性擴增等；二是基於螢光標記雜交反應的基因分型技術，包括寡核苷酸連接分析，焦磷酸法dna測序、直接雜合子測序以及等位基因特異性引物延伸等。以上二種方法都是在pcr擴增反應之後，再採取不同的方法檢測多態性位點。三是基因晶片技術，基因晶片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的dna片段(基因探針)，有規律地排列固定於矽片、玻片等支持物上，構成的一個二維dna探針陣列，利用這類晶片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。基因晶片技術由於高通量等優點在snp檢測中得到大量應用，但也存在檢測時條件難以控制、重複性差、準確性低、易出現假陽性、假陰性結果、靈敏度較低等缺點。此外，還有磁珠/pcr螢光探針法、怛溫擴增法、pcr溶解曲線法、pcr+導流雜交法等方法。上述各種方法都具有各自的優缺點及適用性。目前採用螢光定量pcr法對dpyd*2a基因多態性的檢測主要有染料法與探針法兩種方式。染料法即在反應體系中加入雙鏈dna嵌入染料如sybrgreeni以指示目標片段的擴增。然而由於染料不具序列物異性，因此只能進行單重pcr，這不僅使通量變低，而且必須依靠熔解曲線分析區分目標片段與二聚體。而目前探針法同樣為的單重pcr，通量低。技術實現要素：本發明的第一目的在於提供用於檢測基因dpyd*2a(rs3918290)多態性的引物。本發明的第二目的在於提供用於檢測基因dpyd*2a(rs3918290)多態性的探針。本發明的第三目的在於提供用於檢測基因dpyd*2a(rs3918290)多態性的檢測試劑盒。所述用於檢測基因dpyd*2a(rs3918290)多態性的引物如下：dpyd*2a-f:5』-cagtgagaaaacggctgcat-3』dpyd*2a-r:5』-catcagcaaagcaactggca-3』。所述用於檢測基因dpyd*2a(rs3918290)多態性的特異識別探針序列及標記的螢光染料如下：fam-5』-tgactttccagacaacgtaagtgtg-3』bhq1hex-5』-tgactttccagacaacataagtgtgat-3』-bhq1。所述用於檢測基因dpyd*2a(rs3918290)多態性的檢測試劑盒採用兩種不同螢光基團標記的探針在同一反應管內同時指示兩個目標片段(目標片段分別含rs3918290的g型基因、a型基因)的存在情況。所述檢測試劑盒包括反應體系(pcrmix)：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，(1.5～3.0)mmol/lmgcl2，2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/ldpyd*2a-f，1μmol/ldpyd*2a-r,1μmol/lfam標記探針，1μmol/lhex標記探針；陰性對照：滅菌超純水。本發明採用螢光定量pcr(fq-pcr)技術檢測dpyd*2a基因多態性，fq-pcr的工作原理是利用taq酶的5』→3』外切酶活性，在pcr反應系統中加入一個螢光標記的探針。該探針可與引物包含序列內的dna模板發生特異性雜交，探針的5』端標以螢光報告基團，靠近3』端標以螢光淬滅基團，兩者之間構成能量傳遞結構。當探針保持完整時，5』端螢光報告基團所激發出的螢光信號被3』端淬滅基因吸收或抑制，不出現螢光信號變化。當pcr反應體系中有目的基因存在，就會擴增出特異核酸片段，螢光探針即會根據鹼基配對的原理與之雜交。當pcr進入延伸(複製)期，tap酶從引物3』端開始,隨新鏈延伸沿dna模板移動，當移動到探針結合的位置時，其5』→3』端外切酶活性作用，將探針切斷(切口平移效應)。螢光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，淬滅基團的淬滅作用被解除，螢光報告基團的螢光信號釋放出來。不同的等位基因探針由於標記的螢光染料不同，因此所發螢光信號不同，可通過對螢光信號的檢測判斷樣本的基因型。本發明利用不同的螢光基團標記的探針可同時檢測樣品中dpyd*2a(rs3918290)多態性，實現單管封閉可同時檢測多個snp位點，克服傳統螢光法檢測通量不高的缺陷，減少了交叉汙染的機率；操作簡便，檢測快速，檢測結果直觀，根據不同的螢光信號產生的擴增曲線即可定性判斷待測樣本中各種基因型，無需繁瑣的分析過程。本發明提供的檢測試劑盒具有靈敏度高、分型準確、操作簡便快捷等優點，可對腫瘤患者進行有效的用藥指導，提高藥物的療效、降低藥物不良反應，為實現腫瘤患者個體化治療提供依據。附圖說明圖1為採用純水為陰性對照時，fam(465-510nm)檢測頻道無擴增曲線。圖2為採用純水為陰性對照時，hex(533-580nm)檢測頻道無擴增曲線。圖3為採用rs3918290的g型基因的陽性質粒作對照，fam檢測頻道有一條擴增曲線。圖4為採用rs3918290的g型基因的陽性質粒作對照，hex檢測通道無擴增曲線。圖5為採用rs3918290的a型基因的陽性質粒作對照，hex檢測頻道有一條擴增曲線。圖6為採用rs3918290的a型基因的陽性質粒作對照，fam檢測通道無擴增曲線。圖7為採用rs3918290分別為g、a型基因的兩種陽性質粒為模板的反應管內，fam檢測頻道有擴增曲線。圖8為採用rs3918290分別為g、a型基因的兩種陽性質粒為模板的反應管內，hex檢測頻道有擴增曲線。具體實施方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。一、材料1、儀器實時螢光pcr儀、移液器、離心機。2、引物、探針設計本發明設計了一對高效特異引物用於目標基因的檢測，一對標記的螢光染料的探針檢測相應的dpyd*2a多態性位點。引物、探針系列如下：引物：dpyd*2a-f:5』-cagtgagaaaacggctgcat-3』dpyd*2a-r:5』-catcagcaaagcaactggca-3』。探針：fam-5』-tgactttccagacaacgtaagtgtg-3』bq1hex-5』-tgactttccagacaacataagtgtgat-3』-bhq1。3、試劑10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2，2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶。二、方法1、樣本選擇醫院體檢人群樣本130例。2、基因組dna提取用常規分子生物學方法或市售試劑合從抗凝全血中提取人基因組。3、實時螢光pcr擴增與檢測實時螢光pcr反應體系：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及螢光探針，30ng人基因組dna。實時螢光pcr反應在rochelightcycler480ⅱ儀器上按以下條件進行擴增檢測：第一階段：95℃2min。第二階段：95℃20sec，62℃20sec(螢光採集)，72℃20sec(40cycles)2個螢光檢測頻道分別為fam、hex。三、結果分析陰性對照：以純水作模板的反應管內應無任何擴增曲線產生。陽性對照：陽性對照品為分別克隆到載體puc57上的二個dna片段(每個載體中dna片段分別含rs3918290的g型基因、a型基因)，同一反應管內加入二種陽性質粒為模板，fam、hex檢測頻道均應有擴增曲線產生。結果判定：樣本反應管中fam檢測頻道有擴增曲線產生則判定存在snp位點上rs3918290g型基因，hex檢測頻道有擴增曲線產生則存在snp位點上rs3918290a型基因，若fam、hex檢測頻道同時有擴增曲線產生則snp位點上rs3918290存在g、a兩種基因型。為驗證本發明的準確性，進行了130份基因組樣本的驗證實驗，與測序結果對比，符合率達100％。結果如下表：結果(基因型)本發明檢測結果(例)測序結果(例)符合率(％)g/g128128100g/a22100採用純水為陰性對照時，fam(465-510nm)檢測頻道無擴增曲線如圖1所示產生，採用純水為陰性對照時，hex(533-580nm)檢測頻道無擴增曲線如圖2所示產生。圖3和圖4的結果表明，在實驗條件下含螢光基團fam的探針只對snp位點上rs3918290的g型基因的目標片段有特異結合，螢光基團hex的探針不結合基因snp位點為g的目標片段，兩種探針不存在交叉反應。圖5和圖6的結果表明，在實驗條件下含螢光基團hex的探針只對rs3918290的a型基因的目標片段有特異結合，螢光基團fam的探針不結合snp位點為a的目標片段，兩種探針不存在交叉反應。圖7和圖8的結果表明，同一反應管同時存在二種基因型，反應體系不影響試劑盒的靈敏性、特異性。序列表莊江興，廈門市同普生物科技有限公司用於檢測dpyd*2a遺傳多態性的引物、探針及檢測試劑盒20174patentinversion3.3120dna人工序列1cagtgagaaaacggctgcat20220dna人工序列2catcagcaaagcaactggca20325dna人工序列3tgactttccagacaacgtaagtgtg25427dna人工序列4tgactttccagacaacataagtgtgat27當前第1頁12