基因表達技術的製作方法

2023-11-06 13:41:52 1

專利名稱：：基因表達技術的製作方法基因表達技術
技術領域：
本申請涉及基因表達技術。技術背景不應該將本說明中的先前發表文獻的列舉或討論看作為承認對該文獻是技術狀況的一部分或者是普通常識。Hartl(1996，Atowe，381,571-580)將被稱為分子伴倡(chaperon)的蛋白質種類定義為能與另一種蛋白質的其它不穩定的構象異構體結合併使其穩定的蛋白質，而且通過有控制地結合與釋放，促進蛋白質在體內正確的結果(fate)，它進行摺疊、低聚物裝配(assembly),轉運到特定的亞細胞小室(subcellularcompartment),或通過降角爭而處理。BiP(也稱為GRP78,免疫球蛋白重鏈結合蛋白(Igheavychainbindingprotein)和酵母中的Kar2p)是hsp70家族的高豐度70kDa分子伴估，位於內質網(ER)中，其一種功能是用來輔助分泌系統中的運輸和摺疊蛋白質。蛋白質二硫鍵異構酶(disulphideisomerase)(PDI)是分子伴倡蛋白質，位於ER中，其在蛋白質的翻譯後加工的過程中參與催化二疏4建形成。對天然和外來蛋白質分泌的研究已顯示從ER到高爾基體的運輸是限速步驟。證據證明BiP與正常蛋白質短暫結合，並與蛋白質的突變體或者錯誤摺疊形式發生更穩定的相互作用。結果，BiP可在溶解摺疊前體和防止運輸未摺疊和未裝配的蛋白質中起雙重作用。Robinson和Wittrup,1995,所o&c/wo/./Vog.11，171-177，研究了外來蛋白質分泌對釀酒酵母中的BiP(Kar2p)和PDI蛋白水平的影響，並發現延長分泌的外來蛋白質的組成型(constitutive)表達可將溶解的BiP和PDI降低到用Western分析無法檢測的水平。由於異源蛋白分泌導致ER分子伴侶和摺疊酶(foldase)水平下降對改進酵母表達/分泌系統的嘗試具有重要的意義。通過一些機制，包括非摺疊蛋白質應答(UPR)來調控分子伴侶的表達。使用重組技術，已顯示多個PDI基因拷貝可增加宿主細胞中PDI蛋白水平(Farquhar等，1991，G匿,108，81-89)。1993年12月23日發表的W093/25676中首次提出將編碼PDI的基因和編碼異源二硫鍵蛋白的基因共表達，以此作為增加異源蛋白的產量的方法。WO93/25676報導，通過與PDI共表達可提高antistasin和蜱抗凝蛋白(tickanticoagulantprotein)的重組表達。已將這一策略用於增加其它類型蛋白質的重組表達。Robinson等，1994,歷0/rec/2"0/0gF,12,381-384報導，可用釀酒酵母中重組的額外PDI基因拷貝將人血小板衍生的生長因子(humanplateletderivedgrowthfactor,PDGF)B同型二聚體的重組表達提高十倍，並將粟酒裂殖酵母酸性磷酸酶的重組表達提高四倍。Hayano等，1995,7^55*Ze股ra,377,505-511描述了人溶菌酶(humanIysozyme)和PDI在酵母中共表達。觀察到功能性溶菌酶的生產和分泌增加了約30-60%。Shusta等，1998,A^wre所ofec/wo/ogy，16，773-777報導，通過在宿主細胞中過量表達PDI,釀酒酵母中單鏈抗體片段(single-chainantibodyfragments,scFv)的重組表達可以提高2到8倍。Bao&Fukuhara,2001,Ge"e,272,103-110報導，通過與酵母PDI基因的額外的重組拷貝(《/屍0//)共表達，乳酸克魯維斯酵母(《/wj^eram少cas/ac&)中的重糹且人血清白蛋白(recombinanthumanserumalbumin,rHSA)的表達與分;必可增加15倍或更多。為產生包含PDI基因和異源蛋白基因的共轉化的酵母，WO93/25676教導了可將兩個基因在染色體上整合；可將一個在染色體上整合，一個位於質粒上；可將每個基因引入不同的質粒上；或可將兩個基因引入相同的質粒上。WO93/25676舉出下述實例在染色體上整合有PDI基因的額外拷貝的酵母菌抹中表達來自質粒pKH4a2的antistasin(實施例16和17);表達來自載體K991的antistasin,所述載體具有存在於名為Yep24的多拷貝酵母穿衝復載體上的額外的PDI基因拷貝(Botstein等，1979,8,17-24)(實施例20);和分別在GAUO和GAL1啟動子的控制下表達來自酵母穿梭載體pC1/1的antistasin和PDI基因(Rosenberg等，1984,Ato^e,312，77-80)。實際上，前面引用的Robinson和Wittrup,1995也4吏用GAL1-GAL10基因間區i成(intergenicregion)來表達紅細胞生成素(erythropoietin)，並得出結論，應該使用緊密抑制型(tightlyr印ressible)的可誘導啟動子來構建用於分泌異源蛋白的酵母生產菌抹，否則在充填大規模發酵罐所需的多代細胞生長後，持續分泌的負面影響(即可檢測的BiP和PDI水平降低)會佔優勢。本領域的後續工作已將轉基因的染色體整合確認為使重組蛋白生產最大化的關鍵。前面引用的Robinson等，1994,使用額外的染色體整合的PDI基因拷貝使PDGF和粟酒裂殖酵母(51.pom&)酸性磷酸酶的表達獲得可觀察到的增加。Robinson等報導，使用多拷貝2pm表達載體來增加PDI蛋白水平的嘗試對異源蛋白分泌具有有害的作用。前面引用的Hayano等，1995，描述了將人溶菌酶的基因和PDI引入酵母宿主，每個基因在單獨的線性化整合載體上，從而實現了染色體整合。前面引用的Shusta等，1998報導在酵母系統中，將轉基因整合到宿主染色體還是使用游離的(episomal)表達載體之間的選擇會極大地影響分泌，參考Parekh&Wittrup,1997，說ofec/wo/.屍rag.，13，117-122，使用5整合載體將scFv基因穩定地整合到宿主染色體上優於使用基於2um的表達質粒。前面引用的Parekh&Wittrup曾經教導，使用5整合載體而不是基於2的表達質粒，牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)的表達增加了一個數量級。據說，基於2(xm的表達質粒對於異源分泌蛋白的生產無法達到預期目標(counter-productive)。前面引用的Bao&Fukuhara,2001報導"首次考慮可直接將《/屍D//基因弓1入攜帶rHSA表達盒(expressioncassette)的多拷貝載體中。然而，發現這樣的構建體嚴重影響酵母生長和質粒穩定性。這證實了我們先前關於多拷貝載體上的《/屍￡>//基因對乳酸克魯維酵母細胞有害的發現(Bao等，2000)，，。Bao等，2000,腸"，16,329-341，如上面引用的Bao和Fukuhara的文章段落中提到的，報導了將K/戶D//基因引入乳酸克魯維酵母的多拷貝質粒pKan707上，質粒的存在導致菌抹生長較差。Bao等得出結論，《/屍Z)/7基因的過量表達對乳酸克魯維酵母細胞有毒性。考慮到Bao等較早的發現，Bao和Fukuhara選擇將尺//10/7的一個副本引入到宿主染色體上。與此背景相反，我們以前曾經驚訝地證明，與先有技術的建議相反，當分子伴侶蛋白的基因和異源蛋白的基因在酵母中的2nm-家族多拷貝質粒上共表達時，異源蛋白的產量基本上提高。我們較早的申請已作為WO2005/061718發表，本申請要求該申請的優先權，其公開了產生異源蛋白的方法，其包括(a)提供包含2jim-家族質粒的宿主細胞，所述質粒包含編碼包含分子伴侶蛋白序列的蛋白的基因和編碼異源蛋白的基因；(b)在允許表達編碼分子伴侶蛋白的基因和編碼異源蛋白的基因的條件下，在培養基中培養宿主細胞。(c)從培養基中純化表達的異源蛋白；和(d)任選地，將純化的蛋白質凍幹。如上所討論，Bao等，2000，1^^,16，329-341報導，乳酸克魯維酵母的PDI基因AT/屍D//的過量表達對乳酸克魯維酵母細胞有毒性。與這一背景相反，我們驚訝地發現，不僅可能過量表達PDI和其它分子伴侶而不產生Bao等報導的有害影響，而且兩種不同的分子伴侶可在同一個細胞內重組過量表達，並能夠使蛋白(包括異源蛋白)的表達水平高於任何一個分子伴侶單獨表達所獲得的水平而沒有毒性。這是沒有預料到的。相反，根據Bao等的教導，人們會認為兩種分子伴侶蛋白的過量表達比一種的過量表達毒性更大。此外，根據也在本申請中下面報導的一些初步發現，可期望的是通過與單一的分子伴倡共表達所獲得的異源蛋白表達的增加，將達到對於使用的細胞系統可能的最大水平。因此，特別令人驚奇的是，發現通過將兩種不同的分子伴侶與蛋白質共表達能夠獲得蛋白質表達的進一步增加。
發明內容因此，作為本發明的第一方面，提供了生產期望的蛋白質如異源蛋白質的方法，其包括提供宿主細胞，所述宿主細胞包含第一重組基因、第二重組基因和第三基因，所述第一重組基因編碼包含第一分子伴侶蛋白的序列的蛋白，所述第二重組基因編碼包含第二分子伴侶蛋白的序列的蛋白，所述第三基因(任選地，第三基因是重組的)編碼期望的蛋白質(任選為異源蛋白質)，其中第一和第二分子伴侶不同；和在允許表達第一、第二和第三基因的條件下，在培養基中培養宿主細胞。任選地，可以，或者可以不將由此表達的期望的蛋白質從培養的宿主細胞或培養基中純化出來。任選地，可以，或者可以不將由此純化的期望的蛋白質凍幹。所述方法可以，或者可以不進一步包括用載體或稀釋劑將純化的期望的蛋白質進行配製的步驟，可任選地以單位劑型，以上文所討論的方式提供(present)由此配製的蛋白質。術語"重組基因，，包括作為"孤立(standalone)"可表達的序列獨立起作用以產生編碼的蛋白質的核酸序列，可替換的是在宿主內引入的與內源性序列組合起作用的核酸序列(如通過整合入內源性序列以產生與該內源性序列不同的核酸序列)以增加目標蛋白質的表達。"重組基因"通常是不天然存在於所用背景(context)中的基因。例如，在整合位點整合入宿主生物染色體的基因如果包含不天然存在於整合位點的序列，就可以稱為"重組基因"。因此，"重組基因"可以，或者可以不包含基因的編碼、調控或任何其它區域中的非天然序列，或者可以，或可以不包含天然存在的基因序列，但在該序列不天然存在的整合位點引入宿主生物染色體。相同的問題，已作必要修正，也適用於將"重組基因"插入到質粒中。術語"染色體整合"和"整合入宿主細胞的染色體"是本領域中熟知的術語。為避免疑問，這些術語包括將多核苷酸序列整合入宿主細胞中天然存在的任何可遺傳的核物質，天然存在的質粒除外。因此，"整合入宿主細胞染色體"的多核苷酸序列可以，或者可以不，被整合入原核(如細菌)細胞的染色體，或者整合入真核細胞基因組的任何部分，如整合入核遺傳物質，其包括染色體(或者染色體中的一條)、線粒體基因組或葉綠體基因組。第一和第二分子伴侶可以，或者可以不，每個單獨為如下討論的具體列出的分子伴侶之一，並且為在同一個宿主細胞中共表達時，能至少提供相加效應(additiveeffect)以增加期望的蛋白質的表達的分子伴倡的組合。我們用"相加效應"表示宿主細胞中，當第一和第二重組基因同時和第三基因共表達時，期望的蛋白質的表達水平高於同樣系統中下述情況的表達水平(i)第一重組基因與第三基因共表達而不表達第二重組基因和(ii)第二重組基因與第三基因共表達而不表達第一重組基因。此處使用術語"分子伴侶"表示結合另一種蛋白質的其它不穩定構象異構體並使其穩定的蛋白質，而且通過受控的結合與釋放，可促進蛋白質在體內的正確結果，其進行摺疊、低聚體裝配，並轉運到特定的亞細胞小室，或通過降解而處理。因此分子伴侶也是涉及蛋白質摺疊的，或具有分子伴侶活性的或涉及未摺疊蛋白應答的蛋白質。這類分子伴侶蛋白質在本領域眾所周知，例如在斯坦福基因組資料庫(StanfordGenomeDatabase)(SGD)、http:〃db.yeastgenome.org或者http:〃www.yeastgenome.org中的分子伴估蛋白質。優選的分子伴侶是真核分子伴侶，特別優選的分子伴侶是酵母分子伴侶，包括HCCT2、CCT3、CCT4、(XT5、CC715、CCT7、CdC觸、CPi丄C屍i6、五t/G7、FM07、HC//7、i/57370、HSP"、HS屍/似、/^屍26、//們0、//5P仏//群0、朋屍7S、瓜屍S2、^M/、MD刀、節72、MPD/、M屍D2、屍Z)T7、PFD7、J5C7、U7、爿7P仏爿7P仏醜r7V、CDC37、C屍i7、7f5CS2、i^72、Lf/57、7kfG"五/、7kffSA/、7V(95i、五CAf70、XSL4y、S&42、5"W丄515^4、5!SC7、6"5^入57ZJ、M57、OiM7、OiA/2、屍￡7/、PrC2、屍SE7、t/B/4和7i4C7,或者截短的無內含子(truncatedintronless)i^4C/(Valkonen等2003,々///^/￡"v/ra".M/cra"69,2065)，以及77MP、/MM/S(也稱作和rCP7(也稱作CC77)。本發明的實踐中有用的分子伴侶可以是，也可以不是*熱激蛋白質，如作為hsp70蛋白家族(包括Kar2p，SSA和SSB蛋白，如由6X4/、S5142、5"&43、5S44、615^/和S5T^編碼的蛋白)的成員的蛋白質、作為HSP卯-家族的成員的蛋白質，或者作為HSP40-家族的成員的蛋白質，或涉及它們的調節(modulation)的蛋白質(如Sillp),包括DNA-J和DNA-J-樣蛋白(如Jemlp和Mdj2p);*作為核周蛋白(karyopherin)/輸入蛋白(importin)家族的成員的蛋白，如核周蛋白/輸入蛋白的a或(3家族，例如核周卩蛋白PSE1;*作為Hjelmqvist等,2002,C7e"o膨所o/ogy,3(6),research0027.1-0027.16中描述的ORMDL家族的成員的蛋白質，如Orm2p。*天然位於內質網中或分泌途徑中其他位置如高爾基體中的蛋白。例如在內質網(ER)的腔室中，尤其是分泌細胞中天然起作用的蛋白，如PDI。*作為錨定在ER中的跨膜蛋白的蛋白質，如前述Hjelmqvist等，2002中描述的ORMDL家族的成員(例如Orm2p);在胞質溶膠(cytosol)中起作用的蛋白質，如hsp70蛋白，包括SSA和SSB蛋白，如蛋白質產品515^7、S&42、5X43、SS57和S5S2;*在細胞核、核被膜和/或細胞質中起作用的蛋白質，如Pselp;*對於細胞生存"必需的"蛋白，如PDI，或者由下述基因中的一個編碼的蛋白CCT2、CCr3、(XT4、CCT5、CCr6、CC7V、CCr<S、CiV5A￡70/、朋屍70、瓜細、屍D/7、CDC57、X^R2、M7￡/、Mi577、A/"C^/、SSC7、T7MP、E4^/7S和7Ui^，或作為必需的核周蛋白的蛋白質，如Pselp;*涉及巰基氧化或者二硫基形成、斷裂或異構化的蛋白質，或者催化，特別是在分泌蛋白和細胞表面蛋白的生物合成過程中催化蛋白質中硫醇:二硫化物交換反應的蛋白質，如蛋白質二硫鍵異構酶(如Pdilp和Mpdlp)、同源物(如Euglp)和/或相關蛋白質(如Mpd2p、Fmolp、Erolp);*涉及蛋白質合成、裝配或摺疊的蛋白質，如PDI和Ssalp;*優先或排他地與未摺疊蛋白，而不是成熟蛋白質結合的蛋白質，如hsp70蛋白質，包括SSA和SSB蛋白質，例如由S5^4八SW2、5"&43、5^力4、SSS7和5^B2編碼的蛋白質；*防止前體蛋白質在胞質溶膠中聚合的蛋白質，如hsp70蛋白質，包括SSA和SSB蛋白質，例如由5"W八S&42、5"W3、S5L4麼和編碼的蛋白質；*與受損蛋白質結合併使其穩定的蛋白質，如Ssalp;*涉及非摺疊蛋白質應答或提供對引起未摺疊蛋白質應答的試劑(如衣黴素和二硫蘇糖醇)的抗性增加的蛋白質，如前述Hjelmqvist等，2002中描述的ORMDL家族的成員(例如Orm2p)或涉及應激反應(stressresponse)的蛋白質(i口Ubi4p);*作為共分子伴侶的蛋白質和/或間接涉及蛋白質摺疊和/或未摺疊蛋白質應答的蛋白質(如hspl04p和Mdjlp);參與大分子核質轉運的蛋白質，如Pselp;*通過識別核位置序列和核輸出序列、並與核孔複合物相互作用來介導大分子跨核膜轉運的蛋白質，如PSE1;如EP0746611和Hillson等，1984，MeAoA￡，膨/.,107,281-292中描述的能夠對亂序的(scrambled)核糖核酸梅RNA恢復核糖核酸酶活性的蛋白質，如PDI;*具有酸性pl(如4.0-4.5)的蛋白質，如PDI;*作為Hsp70家族的成員的蛋白質，和任選具有N末端ATP結合域和C末端肽結合域的蛋白質，如Ssalp。*作為肽醯-脯氨醯順反異構酶的蛋白質(如Cpr3p和Cpr6p);*作為已知分子伴侶的同源物的蛋白質(如Hsp10p);*作為線粒體分子伴侶的蛋白質(如Cpr3p);*作為細胞質或核分子伴侶的蛋白質(如Cnslp);作為結合膜的分子伴侶的蛋白質(如Orm2p和Fmolp);*具有分子伴侶激活劑活性或者分子伴侶調控活性的蛋白質(如Ahalp、Haclp和Hchlp);*與不成熟形式的多肽短暫結合，以造成正確的摺疊運輸和/或分泌的蛋白質，包括有效易位到內質網所需的蛋白質(如Lhslp)或有效易位到它們在細胞內的作用位點所需的蛋白質(如Pselp);*參與蛋白質複合體裝配和/或核糖體裝配的蛋白質(如Atpllp、Pselp和Noblp);伴侶素T複合物的蛋白質(如Cct2p);*前摺疊體(prefoldin)複合物的蛋白質(如Pfdlp);*線粒體膜間隙蛋白質，如Tim9p;*能在體內與Mrsllp/TimlOp形成複合體的蛋白質，如Tim9p;*參與介導多處內膜蛋白(polytopicinnermembraneproteins)的輸入與插入的蛋白質，如Tim9p;*防止進入的(incoming)蛋白質聚合的蛋白質，如Tim9p;*能作為與前序歹'j易位酶(presequencetranslocase，連同Ssclp、Tim44p、Mgelp和Paml6p—起)有關的線粒體輸入驅動物(motor)中的功能性組成部分的蛋白質，如Paml8p;*能刺激Sscqp的ATP酶活性，如驅動線粒體輸入的蛋白質，如Paml8p;*包含J域的蛋白質，如Paml8p;*能作為介導胞質溶膠中蛋白質摺疊的包含伴侶素的T複合體的a亞基起作用的蛋白質，如Tcplp;*能在保持肌動蛋白細胞骨架中起作用的蛋白質，如Tcplp，或*作為黑月復果蟲黽(Drasop/zz7ame/a"ogaster)或無尾鼠(mousetailless)複合多肽或其同源物的蛋白質，如Tcplp。優選的分子伴侶使蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)或其具有在內質網(ER)腔室中催化形成二碌l/建的相同能力的片段或變體。我們使用"PDI"包括了具有對亂序的(scrambled)核糖核酸梅RNA恢復核糖核酸酶活性的能力的蛋白質，如EP0746611和Hillson等，1984,謝/zo^107，281-292中所述。PDI是通常催化硫醇:二硫化物交換反應的酶，並且是分泌細胞中ER腔室的主要常駐蛋白質組分。大量證據表明PDI在分泌蛋白質的生物合成中起作用(Freedman，1984,7>e"A9,438-41),而這得到了原位直4秦交聯(directcross-linking)研究的支才寺(Roth和Pierce,1987,Bz'oc/zem&^y,26,4179-82)。研究發現，微粒體膜缺少PDI顯示共翻譯的蛋白質二硫化物中有特定的缺陷(BuIleid和Freedman,1988，Mm^，335,649-51),這暗示了在分泌蛋白質和細胞表面蛋白質的生物合成過程中，酶作為天然二硫鍵形成的催化劑起作用。這種作用與酶已知的在體外的催化性質一致；PDI可催化硫醇:二硫化物交換反應，導致淨蛋白質二硫鍵形成、斷裂或者異構化，並可通常在很多種被還原、未摺疊蛋白質底物中催化蛋白質摺疊和天然二硫鍵的形成(Freedman等，1989,A'oc/ze肌S》w/.,55,167-192)。PDI還可作為分子伴侶起作用，因為缺少異構酶活性的突變PDI可以加速蛋白質摺疊(Hayano等，1995,F五^Si:e故ry,377,505-51)。最近，報導了巰基氧化而不是二硫化物異構是釀酒酵母中蛋白質二硫鍵異構酶的主要功能(Solovyov等，2004,J.Biol.Chem.，279(33)34095-34100)。所述酶的DNA和胺基酸序列對於幾個物種是已知的(Scherens等，1991，1fea^，7，185-193;Farquhar等，1991，Ge"e，108,81-89;EP074661;EP0293793;EP0509841),而且關於純化的酶對哺乳動物肝臟均質性的作用機制的信息正在增加(Creighton等，1980,乂Mo/.所o/.,142，43-62;Freedman等，1988,5z.oc/7ew.5bc.Jh3w&,16,96-9;Gilbert,1989,5z'oc/7em/W/^，28，7298-7305;Lundst誦和Holmgren,19卯，/編.C7z綴，265,9114-9120;Hawkins和Freedman,1990,所oc/zew./，275,335-339)。在當前暗示作為細胞中蛋白質摺疊、裝配和易位的介導物的很多蛋白質因子中(Rothman,1989，Ce//，59,591-601),PDI具有明確的催化活性。宿主中缺失內源的PDI基因或使其失活導致產生不能生存的宿主。換句話說，內源的PDI基因是"必需"基因。從哺乳動物組織中容易地分離PDI,且均質酶是同型二聚體(2x57kD)，具有特徵性的酸性pl(4.0-4.5)(前面引用的Hillson等，1984)。還從小麥和藻類C77/畫j^/。mcw似^/7/7ar必(Kaska等,1990,j8/cc/zew.268,63-68)、大鼠(Edman等，1985,Atowre,317,267-270)、牛(Yamauchi等51987，Aoc/zem.歷0;/2w.Com附.，146,1485-1492)、人(Pihlajaniemi等，1987，￡MBO6,643-9)、酵母(前述Scherens等和前面引用的Farquhar等)和雞(chick)(Parkkonen等，1988,歷0c/2em.,,256,1005-101l)中純化了該酶。從這些脊推動物物種中得到的蛋白質顯示從頭到尾的高度的序列保守性，而且所有都顯示了在大鼠PDI序列中首次發現的幾個整體特性(前面引用的Edman等，1985)。優選的PDI序列包括來自人和來自酵母物種，如釀酒酵母的PDI序列。酵母蛋白質二硫鍵異構酶前體PDIl可作為Genbank登錄號(accessionno.)CAA42373或者BAA00723找到，並具有522個胺基酸的序列，如WO2005/061718中所述，其內容通過引用併入本文。另一種酵母蛋白質二硫鍵異構酶序列可作為Genbank登錄號CAA38402找到，其如WO2005/061718所述具有530個胺基酸的序列，該文獻的內容通過引用併入本文。WO2005/061718(其內容通過引用併入本文)中這些序列(第一個序列是Genbank登錄號CAA42373或BAA00723的序列，第二個序列是Genbank登錄號CAA38402的序歹'j)的比對(alignment),顯示這兩個序列之間的區別是在114位置(力口粗突出表示)的單個胺基酸差異，而且Genbank登錄號CAA38402所述序列在位置506-513包含額外的胺基酸EADAEAEA。本發明也包括上述PDI序列的變體和片段，和其它天然存在的PDI序列的變體。在PDI的上下文中，"變體，，指其中在一個或多個位置存在胺基酸插入、缺失或者保守或非保守取代的蛋白質，只要這樣的變化產生的蛋白質的基本性質，例如酶活(典型活性和比活性(typeofandspecificactivity)),熱穩定性、在一定pH範圍內的活性(pH穩定性)沒有明顯變化。此上下文中的"明顯"指本領域的技術人員能夠判定變體的性質仍然可以是，或者可以不是不同的，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。"保守取代，，是預定的組合，如Val、Ile、Leu、Ala、Met;Asp、Glu;Asn、Gin;Ser、Thr、Gly、Ala;Lys、Arg、His;和Phe、Tyr、Trp。優選的保守取代包括Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gin;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。"變體，，通常與衍生得到該變體的多肽具有至少25%、至少50%、至少60%或至少70%,優選至少80%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%,還更優選至少99%，最優選至少99.5%的序列同一性。可以使用合適的電腦程式確定兩個多肽之間的百分比序列同一性，如下所述。這樣的變體可以是，或者可以不是天然的或者使用本領域所熟知的蛋白質工程和定點誘變方法製備的。在PDI的上下文中，"片段"指其中在一個或多個位置具有缺失的蛋白質。因此片段可以包括，或者可以不包括完全成熟的PDI蛋白質的完整序列的最多5、10、20、30、40或者50%,通常多達60%,更通常多達70%，優選多達80%,更優選多達90%，甚至更優選多達95%,還更優選多達99%。PDI蛋白質的特別優選片段包括期望的蛋白質的一個或多個完整域。PDI的變體或者片段可以是，或者可以不是這樣的蛋白質，當其在宿主細胞中重組表達時能夠補充宿主細胞，如釀酒酵母中內源編碼的PDI基因中缺失；也可以是，或者可以不是，例如天然存在的PDI同源物，如由其它生物編碼的同源物，所述生物如其它酵母或其它真菌，或其它真核生物，如人或其它脊推動物，或動物或植物。當第一分子伴侶是PDI，尤其是哺乳動物或酵母PDI時，在一個實施方案中，第二分子伴侶不是hsp70分子伴侶蛋白質(如酵母KAR2、HSP70、BiP、SSAl-4、SSB1、SSC1、SSD1或真核的hsp70蛋白質，如HSP68、HSP72、HSP73、HSC70、網格蛋白去包被ATP酶(clathrinuncoatingATPase)、IgG重鏈結合蛋白(BiP)、葡萄糖調節蛋白質75、78和80(GRP75、GRP78和GRP80)等)。具體地在一個實施方案中，第一分子伴侶不是酵母PDI，此時第二分子伴侶是酵母KAR2。特別地在另一個實施方案中，第一分子伴侶不是哺乳動物PDI，此時第二分子伴侶是哺乳動物BiP。或者，當第一和第二分子伴侶分別是，例如PDI，特別是哺乳動物或酵母PDI，和如上所述的hsp70分子伴侶蛋白質時，期望的蛋白質可為異源蛋白質，其可以是或可以不是選自下組的蛋白質-*哺乳動物基因產品，如酶、細胞因子(cytokine)、生長因子、激素、疫苗、抗體等；紅細胞生成素(erythropoietin)、胰島素、生長激素(somatotropin)、生長激素釋放因子、血小板衍生的生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子a、轉化生長因子p、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經生長因子、胰島素-樣生長因子I、胰島素-樣生長因子II、凝固因子VIII、超氧化物歧化酶、a-幹擾素、Y-幹擾素、白細胞介素-1、白細胞介素-2、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細月包介素-5、白細胞介素-6、粒細胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor)、多語系集落刺激因子(multi-lineagecolonystimulatingactivity)、鬥立糹田月包-巨嗟糹田刀包刺；敫因子(granulocyte-macrophagestimulatingfactor)、巨p藍糹田月包集落刺5敫因子(macrophagecolonystimulatingfactor)、T糹田月包生長因子、'淋巴毒素(lymphotoxin)等；或者人基因產品；*可以用作疫苗的任何基因產品，包括哺乳動物病原體的任何結構的、膜關聯的、膜結合的或分泌的基因產品，其包括能夠感染或者侵襲哺乳動物的病毒、細菌、單細胞或多細胞寄生蟲，特別是病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、立氏立克次氏體(義Wcfete//)、牛痘、志賀氏菌屬(幼z'ge〃a)、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、腺病毒、流行性感冒病毒、曱型肝炎(hepatitisA)、B型肝炎(hepatitisB)、登革熱病毒(denguevirus)、日本乙型腦炎(JapaneseBencephalitis)、水痘-帶狀皰滲(&n'ce〃azoWe。、細月包巨化病毒(cytomegalovirus)、曱型肝炎、輪狀病毒(rotavirus),以及4元病毒病的疫苗，所述病毒病i口萊姆病(Lymedisease)、麻滲(measles)、黃熱病(yellowfever)、月思^^炎(mumps)、狂犬病(rabies)、皰滲(herpes)、流行性感冒(influenza)、副流行性感冒(parainfluenza)等；或者糹田菌，如霍亂孓瓜菌(W6n'oc/zo/erae)、傷寒沙門菌(Sa/mo"e〃a0^^)、百曰咳博德特氏菌(Bonie&〃a/eWz^s&)、月申炎鏈球菌(浙一ococciwp"g應。"/"e)、流感嗜血菌(i7ewo/Mw51/w/7we"za)、石皮傷風4麥菌(C7tw/WcZ/ww/etom')、白葉矣4奉4幹菌(Corywe6acter/wm<iz)/^/zen'ae)、麻風分才支4幹菌(AfycoZ"cfe廠z'ww/eprae)、A^&sen'a《o"o/r/7oefle、月3月莫炎奈瑟氏王求菌(A^z'5^en'a附ew'"g/"cfc)、4且3求孑包菌(Cocc/c&)/cfeyz'mm"/"等。另一個優選的分子伴侶是包含由基因S5L4/編碼的蛋白質序列的蛋白質，或其具有等同的分子伴侶—樣活性的片段或變體。SSJ/,也叫做YG100，位於釀酒酵母基因組的染色體I上，大小為1.93kbp。WO2005/061718中描述了由基因515^/編碼的蛋白質的一個已發表的蛋白質序列，此文獻的內容通過引用併入本文。WO2005/061718中還描述了的已發表的編碼序列，此文獻內容通過引用併入本文，但是可理解的是，該序列可以通過簡併取代進行修飾，以獲得編碼同樣蛋白質產品的可選的核苷酸序列。蛋白質Ssalp屬於Hsp70家族的蛋白質，位於胞質溶膠中。Hsp70蛋白質族具有表現許多分子伴侶活性的能力；幫助蛋白質合成、裝配和摺疊；調節多肽向各種胞內位置易位和分解蛋白質聚集體(Becker&Craig,1994,￡w/歷oc/zew.219，11-23)。Hsp70基因是高度保守的，具有N末端ATP結合域和C末端肽結合域。Hsp70蛋白質族與蛋白質(主要是未摺疊的蛋白質)的肽骨架反應。通過hsp70蛋白質族來結合併釋放肽是ATP依賴性的過程，並伴有hsp70中的構象變化(前述Becker&Craig，1994)。胞質溶膠hsp70蛋白質族特別涉及蛋白質的合成、摺疊和分泌(前述Becker&Craig,1994)。在釀酒酵母中，將胞質溶膠hsp70蛋白質族分為兩組SSA(SSA1畫4)和SSB(SSB1和SSB2)蛋白質,它們在功能上彼此不同。SSA家族是"必需的"，來自該組的至少一個蛋白質必須是活性的以維持細胞生存力(前述Becker&Craig,1994)。胞質溶膠hsp70蛋白質族優選與未摺疊和不成熟的蛋白質結合。這表明它們可以通過在胞質溶膠中裝配成多分子複合體之前使蛋白質維持在未摺疊狀態和/或促進它們向各種細胞器易位，從而防止前體蛋白質的聚集(前述Becker&Craig，1994)。SSA蛋白質特別涉及翻譯後的生物發生(biogenesis)和維持易位到內質網和線粒體的前體(Kim等，1998，屍rac.A^/.爿cat/,Scf.95，12860-12865;Ngosuwan等，2003，所o/.Oze肌278(9),7034-7042)。已顯示Ssalp可結合受損蛋白質，使它們以部分未摺疊的形式穩定，並使再摺疊或降解發生(前述Becker&Craig，1994;Glover&Lindquist,1998，Ce仏94,73-82)。Demolder等，1994，所她c/wo/"32，179-189報導，S&4/在酵母中的過量表達使在染色體上重組整合的編碼人幹擾素-(3的基因的表達增加。未說明如果SX47和人幹擾素-(3由同一質粒上的重組基因編碼，異源基因表達是否得到提高。實際上，根據在酵母中過量表達分子伴侶的領域近來的發展(如前面引用的Robinson等，1994;Hayano等，1995;Shusta等，1998;Parekh&Wittrup,1997;Bao&Fukuhara,2001;和Bao等，2000)，技術人員根本不願由2pm-家族質粒表達5S4/，更不願由2fim-家族質粒表達S^SW和異源蛋白質來增加異源蛋白質的表達水平。本發明也包括了蛋白的變體和片段，所述蛋白包含由基因編碼的蛋白質的序列。在由基因S&^編碼的蛋白質的上下文中，"變體，，指具有天然Ssalp序列的蛋白質，除了其中在一個或多個位點具有胺基酸插入、缺失或保守或者不保守取代，只要這樣的變化產生的蛋白質的基本性質，如酶活(典型活性和比活性)、熱穩定性、在一定pH範圍內的活性(pH穩定性)沒有顯著的變化。此上下文中的"顯著，，是指本領域的技術人員可判定變體的性質可仍然不同，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。"保守取代"是預定的組合如Val、Ile、Leu、Ala、Met;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr、Gly、Ala;Lys、Arg、His;和Phe、Tyr、Trp。優選的保守取^包才舌Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。Ssalp的"變體"通常與天然的Ssalp的序列具有至少25%、至少50°/。、至少60°/。或至少70%，優選至少80%，更優選至少90%,甚至更優選至少95%,還更優選至少99%，最優選至少99.5%的序列同一性。可以用合適的電腦程式確定兩個多肽之間的百分比序列同一性，如下面討論的。這樣的變體可以是，或者可以不是天然的或者用本領域所熟知的蛋白質工程和定點誘變方法製備的。在Ssalp的上下文中，"片段"指具有天然Ssalp序列的蛋白質，除了其中在一個或多個位點具有缺失。因此片段可以包括，或者可以不包括完全成熟的Ssalp蛋白質的完整序列的最多5、10、20、30、40或者50%,通常多達60%，更通常多達70%，優選多達80%，更優選多達90%,甚至更優選多達95%，還更優選多達99%。Ssalp蛋白質的特別優選的片段包括期望的蛋白質的一個或多個完整域。Ssalp的變體或者片段可以是，或者可以不是這樣的蛋白質，當其在宿主細胞如釀酒酵母中重組表達時能夠補充宿主細胞中內源編碼的5S/^基因(或其同源物)的缺失；而且可以是，或者可以不是，例如天然存在的Ssalp同源物，如由其它生物編碼的同源物，所述其它生物如其它酵母或其它真菌，或其它真核生物，如人或其它脊推動物，或動物或植物。另一種優選的分子伴侶是包含由屍5^7基因編碼的蛋白質序列的蛋白質，或其具有等同的分子伴侶-樣活性的片段或變體。i^￡/，也稱為iC4屍7W,是必需基因，位於染色體XIII上。WO2005/061718中描述了蛋白質Pselp的已發表的蛋白序列，此文獻的內容通過引用併入本文。WO2005/061718中還描述了屍5S7的已發表的核苦酸編碼序列，此文獻的內容通過引用併入本文，但可理解的是，該序列可以通過筒並取代進行修飾以獲得編碼同樣的蛋白質產品的可選的核苷酸序列。屍S五7基因長3.25kbp。Pselp參與大分子的核質轉運(Seedorf&Silver,1997,屍rac.Ato/.^cad5W.94,8590-8595)。這個過程通過嵌入核包#1中並由核孔蛋白組成的核孔複合體(NPC)進行(Ryan&Wente,2000,CwrC^/".Ce〃歷o/.12,361-371)。蛋白質具有特殊序列，其包含核輸入、核定位序列(NLS)與輸出、核輸出序列(NES)所需的信息(Pemberton等，1998，CwrQp/".Ce〃說o/.10,392-399)。Pselp是核周蛋白(karyopherin)/輸入蛋白(importin),是分為a家族和P家族的一組蛋白質。核周蛋白是通過識別NLS和NES來介導大分子跨核膜轉運的可溶的轉運因子，並與NPC相互作用(前述Seedorf&Silver,1997;Pemberton等，1998;Ryan&Wente，2000)。通過核孔的易位由GTP水解驅動，由小GTP結合蛋白Ran催化進行(前述Seedorf&Silver,1997)。已將Pselp鑑定為核周蛋白P。已在釀酒酵母中鑑定了14個核周蛋白p蛋白質，其中只有4個是"必需"蛋白質。這可能是因為多個核周蛋白可以介導單個大分子的轉運(Isoyama等，2001，《/說o/.O/ew.276(24),21863-21869)。Pselp位於細胞核，處於核包被，距離細胞質有一定距離。這表明蛋白可以移入和移出核，作為其轉運功能的一部分(前述866(10辻&Silver,1997)。Pselp涉及轉錄因子的核輸入(前述Isoyama等，2001,swpra;Ueta等，2003，/所o/.C/zem.278(50)，50120-50127)、組蛋白的核輸入(Mosammaparast等，2002，編.CZew.277(1),862-868)和核糖體蛋白質在裝配成核糖體之前的核輸入(前述Pemberton等，1998)。它還介導mRNA從核輸出。核周蛋白識別RNA結合蛋白上發現的不同的NES並與其結合，所述RNA結合蛋白質在從核輸出之前包被(coat)RNA(前述Seedorf&Silver,1997，Pemberton等，1998)。因為大分子的核質轉運對於通過細胞循環的適當進程是必需的，所以核轉運因子，如Pselp是用於生長控制的新候選目標(前述Seedorf&Silver,1997)。也顯示在釀酒酵母中過量表達Pselp(蛋白質分泌增強子)可增加生物活性蛋白譜(repertoire)的內源蛋白質分泌水平(Chow等，1992;/Ce//.5W.101(3),709-719)。未說明如果Pselp和異源蛋白兩者都通過同一質粒上的重組基因編碼，異源基因表達是否得到提高。實際上，根據酵母中過量表達分子伴侶方面近來的發展(如前面引用的Robinson等，1994;Hayano等，1995;Shusta等,1998;Parekh&Wittrup,1997;Bao&Fukuhara,2001，'和Bao等，2000)，技術人員根本不會嘗試從2pm-家族質粒過量表達屍S五7基因，更不會從2pm-家族質粒表達Pse1p和異源蛋白質來增加異源蛋白質的表達水平。本發明也包括了包含Pselp的變體和片段。在Pselp的上下文中，"變體"指具有天然Ssalp序列的蛋白質，除了其中在一個或多個位點具有胺基酸插入、缺失或保守或者不保守取代，只要這樣的變化產生的蛋白質的基本性質，如酶活(典型活性和比活性)、熱穩定性、在一定pH範圍內的活性(pH穩定性)沒有顯著的變化。這裡的"顯著，，表示本領域的技術人員可判定該變體的性質可仍然不同，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。"保守取代"是預定的組合如Val、Ile、Leu、Ala、Met;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr、Gly、Ala;Lys、Arg、His;和Phe、Tyr、Trp。優選的保守取代包4舌Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。Pselp的"變體"通常與天然的Pselp的序列具有至少25%、至少50%、至少60%或至少70%,優選至少80%，更優選至少卯％，甚至更優選至少95%,還更優選至少99%，最優選至少99.5%的序列同一性。可以使用合適的電腦程式確定兩個多肽之間的百分比序列同一性，如下面討論的。這樣的變體可以是，或者可以不是天然的或者用本領域所熟知的蛋白質工程和定點誘變方法製備的。在Pselp的上下文中，"片段"指具有天然Pselp序列的蛋白質，除了其中在一個或多個位置具有缺失。因此片段可以包括，或者可以不包括完全成熟的Pselp蛋白質的完整序列的最多5、10、20、30、40或者50%,通常多達60%,更通常多達70%,優選多達80%,更優選多達90%，甚至更優選多達95%,還更優選多達99%。Pselp蛋白質的特別優選的片段包括期望的蛋白質的一個或多個完整域。Pselp的變體或者片段可以是，或者可以不是這樣的蛋白質，當其在宿主細胞如釀酒酵母中重組表達時能夠補充宿主細胞中內源屍S五7基因的缺失；而且可以是，或者可以不是例如天然存在的Pselp同源物，如由其它生物編碼的同源物，所述其它生物如其它酵母或其它真菌，或其它真核生物，如人或其它脊推動物，或動物或植物。另一種優選的分子伴倡是包含由<97M2基因編碼的蛋白質序列的蛋白質，或其具有等同的分子伴侶-樣活性的片段或變體。C^M2，也稱為YLR350W，位於釀酒酵母基因組的染色體XII(828729到829379位)上，並編碼與酵母蛋白Ormlp相似的進化上保守的蛋白。Hjelmqvist等，2002，歷o/。^,3(6)，research0027.1-0027,16報導，OiM2屬於包含三個人基因(0/Mi兀7、(97MD丄2和C^MDZ3)和微孢子、植物、果蠅、尾索動物(urochordates)和脊推動物中的同源物的基因家族。據報導0TMZ)L基因族編碼錨定於蛋白內質網(ER)中的跨膜蛋白質。蛋白質Orm2p是對於引起未摺疊蛋白質應答的試劑的抗性所需要的。Hjelmqvist等，2002(前述)報導了兩種釀酒酵母OiMD丄同源物(OAM/和C^M2)的雙敲除導致生長速率降低和對衣黴素和二硫蘇糖醇的敏感性增大。Orm2p的一種已發表的序列如WO2005/061718中所述，此文獻的內容通過引用併入本文。也如WO2005/061718中所述，上述蛋白質在釀酒酵母中由編碼核苦酸序列編碼，此文獻的內容通過引用併入本文，但可理解的是，該序列可以通過簡併取代來修飾以獲得編碼同樣的蛋白質產品的可選的核苷酸序列。本發明也包括了Orm2p的變體和片段。在Orm2p的上下文中，"變體，，指具有天然Orm2p序列的蛋白質，除了其中在一個或多個位點存在胺基酸插入、缺失或保守或者不保守取代，只要這樣的變化產生的蛋白質的基本性質，如酶活(典型活性和比活性)、熱穩定性、在一定pH範圍內的活性(pH穩定性)沒有顯著的變化。這裡的"顯著，，是指本領域的一名技術人員可判定該變體的性質可仍然不同，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。"保守取代，，是預定的組合，如Val、IIe、Leu、Ala、Met;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr、Gly、Ala;Lys、Arg、His;和Phe、Tyr、Trp。優選的保守取4戈包4舌Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。Orm2p的"變體，，通常與天然的Orm2p的序列具有至少25%、至少50%、至少60%或至少70%，優選至少80%,更優選至少90%，甚至更優選至少95%，還更優選至少99%,最優選至少99.5%的序列同一性。可以用合適的電腦程式確定兩個多肽之間的百分比序列同一性，如下面討論的。這樣的變體可以是，或者可以不是天然的或者用本領域所熟知的蛋白質工程和定點-漆變方法製備的。在Orm2p的上下文中，"片段"指具有天然Orm2p序列的蛋白質，除了其中在一個或多個位置具有缺失。因此片段可以包括，或者可以不包括完全成熟的Orm2p蛋白質的完整序列的最多5、10、20、30、40或者50%,通常多達60%，更通常多達70%,優選多達80%，更優選多達90%，甚至更優選多達95%,還更優選多達99%。Orm2p蛋白質的特別優選的片段包括期望的蛋白質的一個或多個完整域。Orm2p的變體或者片段可以是，或者可以不是這樣的蛋白質，當其在宿主細胞如釀酒酵母中重組表達時能夠補充宿主細胞中內源OTA^基因的缺失；而且可以是，或者可以不是，例如天然存在的Orm2p同源物，如由其它生物編碼的同源物，所述其它生物如其它酵母或其它真菌，或其它真核生物，如人或其它脊推動物，或動物或植物。編碼包含分子伴侶序列的蛋白質的基因可以，或者可以不以類似於下面討論的用於編碼異源蛋白的基因的形式形成，特別強調ORF和調控區的組合。因此，一種優選的分子伴侶是蛋白質二石克^:異構酶；另一種優選的分子伴侶是Orni2p或其片段或變體。在具體的優選實施方案中，第一和第二分子伴侶是蛋白質二硫鍵異構酶和Orm2p或其片段或變體。此外，第一和第二分子伴侶的優選組合可以，或者可以不，分別由下述基因編碼J/W/和CC72;和(XT3;爿/LO和CCW;ja4/和(XT5;」/￡4/和CCr6;和CC77;^^47和CXT&爿//^和CiV57;和C屍/3;^TW7和C屍i6;J/W7和五/0;^/W7和五f/G7;^Lffi^和FMO/;和//C/f/;J///^和//5"屍/0;j/^7和//S屍/2;j///^和//5P7W;^i47和/^SP26;」/W/和和//S/M2;^//^和//5P(50;^7^(7和//57VS;和//S屍S2;/1tt47和J五M六，和MDJ7;j/^/和MA/2;爿/W/和M戶D7;^T/y^和M屍D2;y^X4/和屍DZ/;」7/」/和屍屍Z)/;^/7」7和^iC7;爿/i4/和^屍J7;^W/和爿7P/7;^/^和^7P";yltt47和B777;J/W7和^T^/和A/GE/;^4/^/和〃7^//;J/^/和7W^/;J/^/和五CMM;和5*^/;A/7^/和SS/O;^Lft47和S&43;和S&4(，爿7i4/和MC7;和5*5^2;yitt4/和/1tt4/和5ZW;AK4/和OiAW;j//^7和<97M2;2^tt4/和和戶rC2;^i^/和屍S&;爿i/y^和C/5";和7^4。或截短的無內含子7i4C7;CC72和COT;(XT2和CCr4;CC72和CCT5;CC77和CCr6;CC72和CC77;CC72和CCrS;CCT2和C7V57;和C屍W3;CCr2和C屍A6;CC77和五707;CC72和五I7G7;CC72和FMO/;0^72和//0//;CC77和7i/5屍70;和//5P72;和//5P/(W;(XT2和//5752《CC72和//5P30;和//S屍42;(XT2和T/5"屍M;CC72和和朋，；CC72和/五M7;CC77和M肌(XT2和MA/2;CC72和M屍D/;CC72和M屍D2;CC72和屍Di7;CXT2和屍FZ^;CC72和」5C7;CC77和^V/;CC72和^r屍A/;CC72和爿7P";CC77和5777;CC72和CZ)C57;CC77和0^7;(XT2和T/iSCS2;CC72和^472;CC72和丄/ZW;CCT2和MG^7;(XT2和M7577;CC72和7V6^7;CC72和五CV1^0;CC72和SW/;CC77和5"W2;CC72和S5L43;CC72和5*5^4;CCJ2和MC7;(XT2和5"5^2;CCT2和S/丄7;CCZ2和5X57;(XT2和C^M7;CC72和(9/M2;CC72和CC77和PrC2;(XT2和屍5S7;CC72和t/S";CC72和7WC7或截短的無內含子//JC7;(XT3和CC7^;CC73和CC!T5;CCT5和CCT6;(XT3和CC77;CCT3和CCTS;CC73和C環；CC73和C潛；(XT5和C屍i6;CCT3和五i07;CCr3和五W^;CCT3和FMO;0^73和//01/7;CCT3和/^屍70;CC73和//5P/2;(XT3和T/57^似；CC73和//5P26;和//57^0;CCH和//57M2;CCT3和//5P60;CC7^和/^iS7VS;CC73和//S屍S2;(XT3和/五M7;CCr3和MA/7;(XT和MA/2;CCr3和M屍D7;(XT3和Af屍D2;CCT3禾口屍D/7;CC73牙口屍FD7;CC73和爿5C7;CC73禾口APJ/;CC713和J7P";CC73和爿3T";CCT3和B777;(XT5和CZX737;(XT5和CP77;CC:n和/^CS2;(XT3和^4/2;CC73和CCT3和A/G五7;(XT5和M/S";(XT3和A^OB/;CC73和五CMM;CCT3和S5^47;CC73和S5L42;CCT3和5"&43;(XT3和S&44;(XT3和MC7;CC"和5*5^2;(XT3和(XT3和SLS7;(XT5和OiM/;CC73和OTM2;(XT3和i^i7;CC73和P7T2;CC73和PS五7;CXT5和UB/4;CC73和//」C7或截短的無內含子//」C7;CC7V和CC";CCW和CCT6;CCW和CCT7;CCW和CCr&CCW和C7V57;CCr4和Ci^3;CCT^和C屍i6;CC7￥和￡^(97;(XT4和5C/G7;CCT4和FMO;0^7^和//0/7;CC!T4和//5P川；CCT4和T^屍"；(XT4和CC7W和i75P26;CCW和7/57^6*;CCW和7T57M2;CCW和CCT4禾口7l/iX^;CCT4牙口iWPZ)7;CC7￥禾口il/屍Z)2;CC7W禾口屍D/7;CCr4-口屍FD/;CC7^和J"C7;CCT^和JiV/;CCW和^TP//;CCW和」7P/2;(XT4和5r77;CCr4和CDC37;CCW和C屍/7;CCW和/^G52;CCW矛口DA2;CCr4禾口ZJ/57;CC7^禾口A^7五/;CCr4禾口7W/57/;CCT4禾口A^C^/;CC7W和￡CM/0;(X7V和SM/;CCW和SW2;CCW和5"5L43;CCr4和牙口Oi^f/;CC7^禾口OiyW2;CC7V牙口屍五A/;CC7V禾口屍7U2;CCr4和i^五/;CC7V和t/B/4;(XT4和ft4C7或截短的無內含子//JC7;CC715和(XT6;CCT5和CC77;CC"和(XTS;CCT5和C7V57;(XT5和C漸；CCT5和C屍W6;CCT5和五7C)/;CCT5和五t/G7;CCr5和FAf(9/;CCT5和/ZO^;CC73和//5P70;CCT5和/75P";CCr5和7/S屍7似；(XT5和//5P2<5;CC"和//S屍M;CCT5和//S屍42;CC"和//5P66/;CXT5和CCT5和//S屍52;CCT5和JEikr7;CCr5和MD刀；CCT5和MDJ2;CXT5和M屍D7;CCT5和M屍D2;CCT5和屍Z)/7;(XT5和屍屍Z)/;CC715和」5C7;CC"和^iV/;CC73和爿r屍"；CC73和v47PW;(XT5和B777;CXT5和CDC37;CCr5和C屍A7;CXT5禾口//SCS2;CCT5牙口^472;CC73和L/ZS/;CC!T5牙口AfGE/;CCT5和M^S7/;CCr5和7VOB/;CCT5和五CM/0;CCT5和5S47;CCr5和S5^2;CC73和M^O;(XT5和然JACC"和MC/;CC!T5和S5E2;和《S7";CCT5和5Z57;CC715和0/M7;(XT5和OAM2;和屍五i/;(XT5和屍7T2;(XT5和屍5^;CCD和C/5";CCr5和/i4C/或截短的無內含子/^C7;CCT6和CC77;(XT6和CCr&(XT6和C順；CCT6和C潔；CC715和C屍/6;CCr6和五707;CCr6和五C/G7;CCr6和FMO/;CC715和i/CH/;CCr6和/^屍川；(XT6和/757^2;CCT6和7/5P7似；CCT6和/Z57^6;CXT6和//5P鄧；(XT6和i/5P42;(XT6和/f5屍6化CCr6和i/5P7S;(XT6和H5PS2;(XT(5和J房7;CCT6和MDJ7;(XT(5和Mn/2;CCr"口M屍Z)7;(XT"口Af屍D2;CCr6和屍D/7;CCr6和屍FD7;CCr6和JBC7;CC!T6和^屍J7;(XT6和v47P/7;CXT6和爿r屍"；CCr6和B777;(XT6和CDC57;CCT(5和C屍i7;CCT"口朋CS2;CCr6和J^2;CCr"口丄節；CXT6和MGE/;CCT6和M/57/;CCr6和iVOS7;CCr6和五C^f70;CCT6和S5^/;CCr6和S5^2;CCr6和6X43;CXT6和S&44;CC7^和S5"C7;CCT6和CCT(5和57ZJ;CC『6和5XW;CCT6和(9i爐；CCr<5和OiM2;CCT(5和屍脂；CCr<5和屍rC2;CCr6和/^五7;CXT(5和U5/4;CCr6和/^C7或截短的無內含子/WC7;CCT7和(XTS;CC77和CiVW;CC77和C屍i3;CC77和C屍76;CCT7和五i07;CCT7和五t/G7;CCT7和FMO;CCT7;^//C//7;CCr7和HSPM;CCT7和i75P72;CCT7和//5P7W;CCT7和HSP26;CCT7和/75P30;CC77和^ttSPW;CC77和7ZS屍60;CC77和(XT7和CCT7和J￡M/;CC77和Mn/7;CC77和MDJ2;CCT7和M屍D7;CC77和M屍D2;CCT7和潛/;CC77和屍FD7;CC77和^&C7;CCT7和j屍刀；CC77和」7P7/;(XT7和爿r屍"；CC77和5777;CCT7和OX37;CCT7和C屍/7;CCT7和/^CS2;(XT7和iL4i2;(XT7和丄7/57;CCT7和MG五7;CC77和M肌/;CCT7和iV05/;CC77和ECM70;CCT7和5S47;CCT7和S5^2;CCT7和CC77和S&^;CC77和5^C7;CC77和5^五2;CCT7和67";CCT7和^SLS7;CCT7和(9iM/;CC77和C^7W2;CCT7和屍五i^;CCr7和P7U2;CC77和屍S五/;CC77和t/5/4;CCT7和//JC7或截短的無內含子//力C7;CCTS和C7ViS7;(XTS和C屍/^;CCrS和C屍i6;CXTS和五i07;(XTS和5t/G7;CCTO和FM9/;CCrS和/ZC^7;CCr<§和7/57)70;CCrS和/^屍/2;(XTS和i75P/似；CCrS和//S屍26;CCrS和//5P30;CCrS和CCTS和/^屍M;CCW和HS7VS;CCTS和//5PS2;CXTS和JE^f/;(XTS和ikfn/7;CCr<§和AfZX/2;CCrS和il/屍D/;CCTS牙口7WPD2;CCrS禾口屍D/7;CCrS和屍FD7;CCTS禾口爿5C/;CCrS和^7V/;CCTO和^7P";(XTS和^TP/2;(XTS和B777;CCTS和CDC37;CCTS和C屍i7;CCr<和//SCS2;(XTS和^/2;(XTS和丄/757;CCTS和MG五/;CCTS和MW57/;(XT<和WC必7;(XTS和五CM70;CCTS和5"&4/;CCTS和SW2;CCrS和SW3;<XTS和SW4;(XTS和MC7;(XTS和(XTS和CCrS和5L57;CXTS和CXTS和OTM2;(XTS和屍五i/;(XTS和P7T2;CCr<5和屍SW;CCrS和t/B/4;CCrS和/WC7或截短的無內含子/WC7;和CPi^;C7V57和C屍i^;和五7(97;C7V^和五t/G7;CiV57和FMC^;6^57和//0//;C7ViS7和i75P^;CWW和//5"屍/2;C7V57和MSP7似；CA/57和/75屍26;CAW和7757^50;和//S/M2;CMS7和7f5P仰；CAW/和//S屍7S;CA^;和//5PS2;和J五M/;CMS7和M/V/;和MD";CMS7和M屍D7;CA/57和MPZ)2;CW^S7和和J7P";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Syl4;M7577和SSC7;M^S7/和S5S2;ikff^"和<S7￡/;MK57/和SLS7;Mi^/7和(9/M/;M77/和OTM2;M/W/和屍五A7;M/5V7和屍7T2;Mi57/和M/iS7/和L^";M/577和//^C7或截短的無內含子//^C/;iVOB/和五CM川；M9B/和5S4/;A^W/和5"&42;iVCW/和SW3;iVC^/和5S44;iV05/和MC7;iVOW和S5五2;A^(9W和iVOW和5X57;7VOB7和OWM7;iV(9B7和OTM2;iVOB7和和P7T2;7VCW7和屍S五7;A^5;和t/及W;A^9W和/"C/或截短的無內含子/i4C/;￡CM70和6S^7;五CM70和5X42;五C7kf70和5^A5;￡CM/0和SW4;五C7l^0和5"SC/;五C71^0和S5^2;五CM/0和S/L/;五C7W6)和5X57;￡CM/C>和OiM/;￡CM70和OTM2;五CM70和五CM/0和PrC7;五CA/M和RS五7;￡CMM和t/AW;五CM川和/^C7或截短的無內含子/"C7;5!S^/和6^J2;和S5L43;S6M7和5"S^/;和MC/;和SS五2;和5ZL/;51^/和見S7;SS1^和OTM7;S&4/和(9TM2;M」y和屍5i^;5"6L47和/TC2;5"W7和屍5S/;5X47和t/醜"；和H^C7或截短的無內含子/WC7;和55^2和S5^4;5*^42和MC7;和5S^和SZL7;和5Z57;和OiM7;5X42和(9iM2;和屍五i7;和P7T2;和屍S五7;S5^2和f/5";55^2和//JC/或截短的無內含子Zi4C7;S&43和S&44;5S/L和S5U7;和S5E2;6X43和67丄/;5X43和5LS7;和OWM7;S&4J和6VM2;S&43和戶五/7;5"W3和P2T2;和屍S57;SS/O和f/及W;5"W3和f"C7或截短的無內含子/WC7;S5/^和6*5^7;S5L^和5S/44和57ZJ;5^4和S丄S/;5*5^4和OWM7;5151/^和OiM2;和屍五A7;5"&44和屍rC2;SS/H和屍5^/;5"W4和C/AW;5"5L^和/WC7或截短的無內含子7WC/;SSC7和5S五2;WC7和57丄六，MC7和SLS7;MC7和OiM7;幼C7和(9TM2;SSC7和屍五i7;5*SC7和P7T2;MC7和屍5S7;MC7和t/B/4;MC7和或截短的無內含子/i4C7;和57丄六，5"5S2和SLS7;SS五2和(9iM7;5*SE2和0/M2;和屍5i7;和P7T2;和屍5S7;S&E2和t/B";和//力C7或截短的無內含子/^4C7;SiL7和5XW;和07M7;S/"和0/M2;57丄/和屍E/^;57丄/和7TC7;和和f/S";和f"C7或截短的無內含子7MC7;SLS/和OWM7;5X57和OiM2;SLS7和屍五i/;和戶rC2;SLS7和屍5"五7;5LS7和L^/4;SLS7和/WC7或截短的無內含子//」C7;(9TM/和0/M2;(9AM/和OAM/和PrC2;OZM7和屍iSE/;OTM/和L^/4;OiM7和C7或截短的無內含子//JC7;(9/M2和;OiM2和屍7T2;(9TM2和P5^/;OiM2和L/RW;ORM2和/WC7或截4豆的無內含子/^C/;屍五77和/TC2;和戶5S/;屍五77和i7i";戶五77和Z^4C7或截短的無內含子7i4C7;戶7U2和屍6S7;屍7U2和t/B";P7T2和7i4C/或截短的無內含子T/yiC7;屍5"五7和C/B";和Z^fC7或截短的無內含子//」C7;M/4和//JC7或截短的無內含子//v4C7/77M9和/4//J7/77MP和CCD;r腳和CC73;T層和(XT*77M9和CCT5;和(XT6;7YM9和CCT7;77M9和CCr<S;77M9和C7V57;和C7W3;和C7W6;和五707;T7M9和五C/G7;7YM9和FMO/;7YM9和//Ci/7;77MP和凡SW0;和//S屍/2;77M9和HSP/M;7YM9和//5P26;7YM9和//S屍30;和/ZS屍"；77MP和//5P66);77M9和//57VS;7YAf9和//SPS2;2YMP和屍D/7;7YM9和屍FD7;77MP和」5C7;77A^和爿/V7;7771^和^TP77;77M9和J7/2;77M9和5777;HM9和C7)C37;77MP和C屍W7;和7YM9和Xy!R2;7TM9和丄/i57;77M9和MG五7;和MR"/;77MP和M9S/;7YA^和五QW0;T/M9和5"&4/;和5X42;和6X4J;7Y71W和5S^;7YMP和5^C7;77M9和7YMP和57ZJ;7Y7l必和5ZS7;77MP和(9TM/;77M9和OiM2;和屍五7^;77M9和PrC2;77M9和77MP和t/AW;77MP和/MC/或截短的無內含子7￡4C7;MM/S和v4/W//B4M7S和CC72;化M/S和CC7T，MM7S和CCW;"M/S和CC73;屍力M/S和CCT6;7MM7S和CC77;屍」M7S和(XT&屍JMM和OVW;屍v4M7S和C屍;3;/MM/S和C屍7(5;i^4M7S和五/0/;/MM7S和五t/G7;屍JM7S和FM9/;/MM/S和//C7//;屍JM/S和//57^化MM/S和/^屍"；和//S屍7似；屍JM/S和/75P26;7MM7S和/75P30;iMM7S和i^屍W;/MM7S和州M7S和7MM/S和//S屍S2;/MM/S和JEM7;E4M7S和MA//;/^A//S和MD刀；MM7S和M屍D/;化M/S和M屍D2;MM/S和屍￡>//;和」r屍W;MM7S和"777;和CZ)C37;7MM/S和C屍77;MM7S和fiiSCS2;/MM/S和7C472;屍JM7S和Zi/57;i^M7S和AfGE7;E4tVWS和A漢"7;iMM7S和WaB7;屍」M/S和五CM/0;和S^S^7;/MM/S和S5^2;iMM/S和SSA5;iMM7S和S5^4;化MM和SSC7;7MA/7S和S5S2;/MM/S和<S7ZJ;/^M7S和5XW;/MM7S和OTM7;7MM7S和C^M2;/MM7S和屍五i7;WM化和P7U2;7MM/S和屍S五7;WM/S和t/B";屍JM/S和ii4C7或截短的無內含子/WC7;7T屍7和A^4/，'rC戶/和CC72;和CC73;TCi3/和CCT4;和(XT5;7T屍7和CCT6;7T屍/和CC77;TC7V和CCr&7CP/和CA/5/;7T屍/和C屍/G;7T屍/和C屍/6;7T屍/和￡7^7;TC屍7和五t/G7;TO5;和FM(97;7Tf7和7T屍y和//57V0;rC屍7和//5"屍y2;rC屍/和//5P/似；7T屍/和/75"屍26;rc屍7和f75P鄧；7T/^和^SP42;7T屍/和HSPM;rc屍7和7U屍/和朋，；to3/和7U屍/和節j7;7T屍/和雄J2;rC屍7和M屍D7;rC屍/和7kf屍D2;7T屍/和屍D77;7T屍/和屍FD/;7T屍/和/1BC7;rC屍/和爿iV7;rOV和爿r屍"；TC屍7和^r屍/2;7T屍7和B777;7T屍/和CZ)C7;7T屍7和C7^7;和/^G^;TC屍/和X^72;7U屍/和LIIS1;TCP1和MGE1和;TCP1和MRS11;ICP1和MOB1;TCP1和ECM10;TCP1和SSA1;TCP1和SSA2;TCP1和SSA3;TCP1和SSA4;TCP1和SSC1;TCP1和SSE2;TCP1和SIL1;TCP1和SLS1;TCP1和ORM1;TCP1和ORM2;TCP1和PER1;TCP1和PRC2;TCP1和PSE1;TCP1和UPI4;TCP1和HAC1或階短的無內含子HAC1;TIM9和PAM18;TIM9和TCP1;或者PAM18和TCP1.第一、第二和第三重組基因可以，或者可以不，每個單獨存在於宿主細胞內的質粒(其可以是，或者可以不是2jim-家族質粒，如上所述)上，或者整合到宿主細胞基因組的染色體上。可以理解的是可使用質粒整合和在染色體上整合的第一、第二和第三重組基因的任何組合。例如，第一、第二和第三重組基因可以，或者可以不，每個單獨存在於質粒上，而該質粒可以是，或者可以不是相同的或者不同的質粒。或者，第一重組基因可以，或者可以不存在於質粒上，而第二和第三重組基因可以，或者可以不整合入宿主細胞基因組的染色體上。或者，第一和第二重組基因可以，或者可以不存在於質粒上，而第三重組基因可以，或者可以不整合入宿主細胞基因組的染色體上。或者，第一和第三重組基因可以，或者可以不存在於質粒上，而第二重組基因可以，或者可以不整合入宿主細胞基因組的染色體上。或者，第一和第二重組基因可以，或者可以不整合入宿主細胞基因組的染色體上，而第三重組基因可以，或者可以不存在於質粒上。或者，第一、第二和第三重組基因可以，或者可以不，每個單獨整合入宿主細胞基因組的染色體上。用於此目的的質粒可以是，或者可以不是如下限定的質粒，如2pm-家族質粒。因此，在一個實施方案中，根據本發明第一方面的方法不涉及其中第一、第二和第三重組基因都存在於2pm-家族質粒上的宿主細胞。因此，作為第二方面，本發明也提供質粒，其中所述質粒包含編碼不同分子伴侶的兩種不同基因(第一和第二重組基因)。在一個優選的實施方案中，質粒可以，或者可以不，進一步包含編碼異源蛋白的基因(第三重組基因)，如上面描述的異源蛋白。根據本發明的第二方面的質粒可以是，或者可以不是2(im-家族質粒。本發明的第三方面提供了使用本發明的第二方面的質粒作為表達載體以增加期望的蛋白質，包括異源蛋白質，如真菌(或者酵母)或脊推動物蛋白質的產量。期望的蛋白質可以，或者可以不由重組基因編碼，所述重組基因作為質粒的一部分存在，或者存在於宿主細胞中的不同質粒上，或者作為整合到宿主細胞的染色體中的轉基因存在於宿主細胞中。本發明的第四部分提供包含如上所述的質粒的宿主細胞。宿主細胞可以，或者可以不，另外包含編碼期望的異源蛋白質的重組基因。此處編碼期望的異源蛋白質的重組基因(所述的"第三重組基因'，)不作為編碼第一和第二分子伴估的同一質粒的部分而存在，宿主細胞可以包含，或者可以不包含不同質粒上的第三重組基因，或者作為整合入宿主細胞染色體的轉基因。作為第五方面，本發明提供包含第一、第二和第三重組基因的宿主細胞。第一、第二和第三重組基因可以，或者可以不，每個單獨存在於宿主細胞中的質粒(可以是，或者可以不是2pm-家族質粒，如上所述)上，或者整合入宿主細胞基因組的染色體上。可以理解的是，可以使用質粒和整合到染色體上的第一、第二和第三重組基因的任何組合，如上所述。因此，宿主細胞可以包含，或者可以不包含每個單獨位於質粒上的第一、第二和第三重組基因，而且質粒可以是，或者可以不是同一質粒或者不同的質粒。或者，宿主細胞可以包含，或者可以不包含質粒上的第一重組基因，和整合入宿主細胞染色體的第二和第三重組基因。或者，宿主細胞可以包含，或者可以不包含質粒上的第一和第二重組基因，和整合入宿主細胞染色體的第三重組基因。或者，宿主細胞可以包含，或者可以不包含質粒上的第一和第三重組基因，和整合入宿主細胞染色體的第二重組基因。或者，宿主細胞可以包含，或者可以不包含整合入宿主細胞染色體的第一和第二重組基因，和質粒上的第三重組基因。或者，宿主細胞可以包含，或者可以不包含每個單獨整合入宿主細胞基因組的染色體的第一、第二和第三重組基因。2um-家力美質粒就本發明而言，質粒可以是，或者可以不是2iLim-家族質粒。已顯示某些緊密相關的芽殖酵母的菌種包含天然存在的環狀雙鏈DNA質粒。這些質粒，統稱為2jim-家族質粒，包括來自魯氏接合酵母(Z;^wacc/2arow;;c以前^皮命名為雙孑包4妄合酵母>Zygosacc/^raw^yca6/s/on^)的pSRl、pSB3和pSB4，來自拜列氏接合酵母(Z少gwacc/zaram;;c"6m7")的質粒pSBl和pSB2、來自發酵才妻合酵母(Zygaracc/7ara7wyces/erwewto")的質鬥立pSMl、來自果蟲黽克魯維酵母(幻Mj;veram;;c^Jra^/w7aram)的質粒pKD1、來自膜醭畢赤酵母(屍/c/z/amem6rawae/ac/era)的未命名質粒(後文稱為"pPMl")和來自釀酒酵母的2,質粒(如圖1所示)和變體(如Scpl、Scp2和Scp3)(Volkert,等，1989，Af/cro&o/og/ca/i^vz.evw,53,299;Murray等，1988,/Afo/,5/o/.200,601;Painting,等，1984,J!力，/zW^ac/m'o/c^，56，331)。作為一族質粒，這些分子具有一系列共有的特性，它們通常在質粒的相對側(oppositeside)具有兩個反向重複序列，大小相似，大約6kbp(從4乃7到6615-bp),三個開放閱讀框，其中一個編碼位點特異性的整合酶CF丄屍)和自主複製的序列(ARS),也稱為複製起點(oh)，位置接近於一個反向重複序列的末端(Futcher,1988,reaW,4，27;前面引用的Murray等和Toh-e等，1986，5m/cIz/e^d.40,425)。儘管它們缺少可識別的DNA序列同源性，它們共享的分子結構和三個開放閱讀框的保守功能證明家族成員之間有共同的祖先聯繫。上述天然存在的2pm-家族質粒可以，或者可以不用於本發明中，但是本發明不限於使用天然存在的2(im-家族質粒。就本發明而言，2(mi-家族質粒可以，或者可以不，如下所述。2pm-家族質粒是環狀、雙鏈的DNA質粒。它通常很小，如3000到10000bp之間，任選地4500到7000bp之間，不包括重組插入的序列。2(im-家族質粒通常包含至少三個開放閱讀框("ORFs")，每個編碼蛋白，所述蛋白在將2pm-家族質粒穩定維持為多拷貝質粒方面發揮功能。由這三個ORFs編碼的蛋白質可以被定名為F_LP、itE屍7和/^屍2。2pm-家族質粒不包含所有三個編碼FL屍、7五屍/和/E屍2的ORFs時，那麼應該在另一個質粒上或者通過染色體重組來反向(/"fram)提供編碼缺失蛋白質的ORFs。"F丄屍"蛋白是能夠催化在由F丄屍識別的反向重複序列之間的位點特異性重組的蛋白。反向重複序列被稱為FLP重組目標(FRT)位點，且每個序列通常作為更大的反向重複序列的部分而存在(見下文)。優選的F丄屍蛋白包含由質粒pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl和2)im質4立之一編碼的F丄屍蛋白的序列，例如前面引用的Volkert等，Murray等和Painting等所描述的。本發明也包括這些F丄屍蛋白的變體和片段。"片段"和"變體"是那些保持了天然蛋白質催化相同FRT序列之間的位點特異性重組的能力的片段和變體。這樣的變體和片段通常和由質粒pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl和2pm質粒之一編碼的F丄屍蛋白具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%，或者更多的同源性。不同的FLP蛋白可以有不同的FRT序列特異性。通常的FRT位點可以包含，或者可以不包含反向重複序列側翼的核心核苷酸序列。在2(im質粒中，FRT核心序列長8個核苷酸，側翼的反向重複序列長13個核苷酸(前面引用的Volkert等)。但是由任何給定的F丄屍蛋白識別的FRT位點可以，或者可以不，與2(im質粒FRT位點不同。和i^屍2是涉及細胞分裂過程中質粒拷貝分配的蛋白質，並可以，或者可以不，也在KL屍表達的調控中具有作用。在來自不同的2pm-家族質粒的；五戶7蛋白質之間已經觀察到了相當大的序列分散性，但是在由不同的2(im-家族質粒得到的t^屍2蛋白質之間不可能進行序列比對。優選的兄E屍7和T^屍2蛋白質包含由質粒pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl和2pm質粒之一編碼的處:屍/和t^:屍2蛋白質序列，例如前面引用的Volkert等，Murray等，和Painting等所描述的。本發明也包括這些A五屍/和M屍2蛋白質的變體和片段。i^屍7和i^戶2的"片段"和"變體"是那些由質粒代替天然ORF編碼時不顯著破壞質粒在合適的酵母群體中的多拷貝穩定維持的片段和變體。這樣的i5屍7和iE屍2的變體和片段通常分別與由質粒pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl和2jim質粒之一編碼的和蛋白質具有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%,或者更多的同源性。由質粒上的ORFs編碼的7^屍7和7^i^蛋白質必須相容。優選的是i^屍/和/te屍2蛋白質具有由同一個天然存在的2iim-家族質粒，如pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl和2ium質粒編碼的i^屍7和i^屍2蛋白質的序列，或者其變體或片段。21im-家族質粒通常包含兩個反向重複序歹'h反向重複序列可以是任何大小，只要它們每個包含FRT位點(見上文)。反向重複序列通常是高度同源的。它們可以，或者可以不，分享高於50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或者更高的序列同一性。在優選實施方案中，它們是相同的。通常反向重複序列每個長度為200到1000bp。優選的反向重複序列每個長度可以是，或者可以不是200到300bp、300到400bp、400到500bp、500到600bp、600到700bp、700到800bp、800到900bp,或者900到1000bp。特別優選的反向重複序列是質粒pSRl(959bp)、pSBl(675bp)、pSB2(477bp)、pSB3(391bp)、pSMl(352bp)、pKDl(346bp)、2萍質粒(599bp)、pSB4或者pPMl上的反向重複序列。反向重複序列可以是，或者可以不是變化的。然而，每個反向重複序列中FRT位點的序列應該與由質粒編碼的屍￡戶蛋白的特異性相容，從而使編碼的F丄屍蛋白能夠起到催化質粒的反向重複序列之間的位點特異性重組的作用。反向重複序列之間的重組(和由此F丄屍蛋白識別質粒上FRT位點的能力)可以通過本領域公知的方法確定。例如，在利於F丄P表達的條件下，可以通過檢驗質粒中限制性譜(restrictionprofile)的變化來檢驗酵母細胞中的質粒，所制性語的變化說明F丄屍蛋白能夠識別質粒中的FRT位點，因此每個反向重複序列中的FRT位點都與由質粒編碼的FLP蛋白的特異性相容。在特別優選的實施方案中，反向重複序列，包括FRT位點源自與編碼fX屍蛋白的ORF相同的2pm-家族質粒，所述ORF如pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl或者2pm質粒。反向重複序列通常定位於2pm-家族質粒以使反向重複序列之間確定的兩個區域(如2pm質粒中稱為UL和US的區域)具有大致類似的大小，不包括外源引入的序列，如轉基因。例如，兩個區域中的一個可以具有，或者可以不具有相當於另一個區域長度的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者更多，高達100°/。的長度。2um-家族質粒通常包含編碼FLP的ORF和一個反向重複序列(可任意命名為"IR1",以與下段提到的其它反向重複序列相區別)，它們以這樣的方式並置，以使IR1出現在F丄PORF的遠端(distalend),而無任何插入的編碼序列，如2(im質粒中所見到的。此上下文中，我們用"遠端"表示FLPORP與啟動子啟動其轉錄的末端相對的末端。在優選的實施方案中，FLPORP的遠端與IR1重疊。2um-家族質粒通常包含編碼FLP的ORF和其它反向重複序列(可任意命名為"IR2",以與前一段提到的IR1相區別)，它們以這樣的方式並置，以使IR2出現在FLPORF的遠端，而無任何插入的編碼序列，如2pm質粒中所見到的。此上下文中，我們用"遠端"表示i五P2ORF與啟動子啟動其轉錄的末端相對的末端。在一個實施方案中，編碼REP2和FLP的ORF可以，或者可以不，與2家族質粒的反向重複序列之間確定的兩個區域位於同樣的區域上，所述的48同樣區域可為那兩個區域中較大的或者較小的(如果兩個區域之間的大小有任何差異)。在一個實施方案中，編碼朋屍2和F丄屍的ORF可以，或者可以不，由不同的啟動子轉錄。通常，2pm-家族質粒的反向重複序列之間確定的區域(如2(im質粒中稱為UL和US的區域)可以包含，或者可以不包含不多於兩個編碼蛋白質的內源基因，所述蛋白質在將2ym-家族質粒穩定維持為多拷貝質粒中起作用。因此在優選的實施方案中，質粒的反向重複序列之間確定的一個區域可以包含，或者可以不包含不多於編碼F丄屍和i^屍2、FZJ3和兄E:屍/、或者兄EP7和iE屍2的ORF作為內源編碼序列。2iim-家族質粒通常包含複製起點(也稱作"自主複製序列"-"ARS，，)，其通常是雙向的。任何合適的ARS序列都可以存在。酵母染色體複製起點的通常的共有序列可以是，或者可以不是適合的(Broach等，1982，CoW7foAor^w/.gw。"/.歷o/.，47，1165-1174;Williamson,7ms/,1985，1,1-14)。優選的ARS包括那些從pSRl、pSBl、pSB2、pSB3、pSB4、pSMl、pKDl、pPMl和2pm質粒中分離的ARS。因此，優選的2pm-家族質粒可以包含，或者可以不包含編碼F丄屍、7E屍7和7^屍2的ORF，兩個反向重複序列，每個反向重複序列都包含ARS序列和與編碼的FLP蛋白相容的FRT位點。優選地，FRT位點源自與編碼的F丄屍蛋白的序列相同的2pm-家族質粒。更優選地，編碼的7^屍/和i^屍2蛋白質的序列源自彼此相同的2pm-家族質粒。甚至更優選地，FRT位點源自與編碼的F丄屍、7五屍7和處:屍2蛋白質的序列相同的2(^m-家族質粒。還更優選地，編碼/1屍、和i^屍2的ORF序列，和反向重複序列(包括FRT位點)源自相同的2nm-家族質粒。此外，ARS位點可以，或者可以不，源自與屍丄J0、和T^:屍2的一個或多個ORF相同的2家族質粒，和反向重複序列(包括FRT位點)。術語"源自"包括與來源的序列具有相同序列的序列。然而，其變體和片段，如上文所述，也包括在內。例如，與天然存在的基因相比，具有源自2pm質粒的F丄P基因的序列的F丄屍基因可以具有，或者可以不具有修飾的啟動子或其它調控序列。另外或可替換地，具有源自2pm質粒的F丄屍基因的序列的FL屍基因可以，或者可以不，在開放閱讀框中具有修飾的核苷酸序列，所述核苦酸序列可以編碼，或者可以不編碼與天然存在的基因相同的蛋白質，或可以編碼，或者可以不編碼修飾的F丄屍蛋白質。同樣的考慮適用於具有源自特殊來源的序列的2jim-家族質粒上的其它序列。任選地，2jim-家族質粒可以包含，或者可以不包含源自2nm質粒的SZS區域的區域(也稱作REP3),如前面引用的Volkert等中所限定的。本發明的2lim-家族質粒中的5TS區域可以包含，或者可以不包含兩個或者更多個串聯重複序列(tandemrepeatsequence),如三個、四個、五個或者更多。或者，不存在串聯重複序列。串聯重複的長度可為任意大小，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100bp或者更長。2pm質粒的區域中的串聯重複長為62bp。串聯重複序列不一定相同。可以容許有微小的序列變化。可以，或者可以不，優選地選擇來自與i^屍7和i^屍2ORF之一或兩者相同的質粒的STB區域。5T5區域被認為是順式作用元件(c/s-actingelement),優選地不被轉錄。任選地，2(im-家族質粒可以包含，或者可以不包含額外的編碼蛋白質的ORF，所述蛋白質在將2nm-家族質粒穩定維持為多拷貝質粒中起作用。可以將額外的蛋白質命名為RAF或者D。編碼RAF或D基因的ORF可見於例如2pm質粒和pSMl上。因此RAF或DORP可以包含適合編碼由2pm質粒或pSMl編碼的RAF或D基因ORFs的蛋白質產品，或其變體和片段的序列。因此2pm質粒或pSMl的RAF或D基因的ORPs蛋白質產品的變體和片段也包括在本發明中。2(im質粒或pSMl的RAF或D基因的蛋白質產品的"變體，，和"片段"是那些由2pm質粒或pSMl代替天然ORF編碼時不會破壞合適的酵母群體中質粒的穩定多拷貝維持的變體和片段。這樣的變體和片段通常與由2pm質粒或pSMl編碼的RAF或D基因ORFs的蛋白質產品具有至少5%、10%、20%、30°/。、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或者更高的同源性。天然存在的2pm-家族質粒可以是，或者可以不是優選的。天然存在的2(im-家族質粒是具有上述特點的任何質粒，這些質粒在酵母中天然存在，即未進行重組修飾以包括異源序列。任意地，天然存在的2jim-家族質粒選自從魯氏接合酵母得到的pSRl(登錄號X02398)、pSB3(登錄號X02608)或者pSB4，均從拜列氏接合酵母得到的pSBl或pSB2(登錄號NC—002055或M18274)，從發酵接合酵母得到的pSMl(登錄號NC一002054)，從果蠅克魯維酵母得到的pKDl(登錄號X03961)，從膜醭畢赤酵母得到的pPMl,或者優選從釀酒酵母得到的2ium質粒(登錄號NC—001398或者J01347)。本段的登錄號指NCBI保藏物。2質粒(圖l)是6,318-bp的雙鏈DNA質粒，以每個單倍體基因組60-100個拷貝內生於大多數釀酒酵母菌抹中。2質粒包含小獨特(smallunique,US)區和大獨特(largeunique,UL)區，通過兩個599-bp的反向重複序列分隔。反向重複序列的位點特異性重組導致體內質粒在A形式和B形式之間轉變(Volkert&Broach,1986,Ce〃，46,541)。2的這兩種形式僅在它們的獨特區的相對方向上有差異。雖然從釀酒酵母克隆的2|im質粒(也稱作Scpl)的DNA測序給出6,318-bp的大小(Hartley和Donelson,1980，iVamre，286，860)，已知2pm、Scp2和Scp3的其它略小的變體，分別作為在稱為6TS的區域中125-bp和220-bp小缺失的結果而存在(Cameron等，1977，7Vwc/.爿c/Ai^s.,4,1429:Kikuchi,1983,CW/，35,487和Livingston&Hahne,1979,屍rac.A/"a"爿cad<SW.76，3727)。在一項研究中，世界上大約80。/。的天然酵母菌抹包含與2jim同源的DNA(通過Southern印跡分析)(Hollenberg,1982,CWe"f7b//(^Mcra6/o/ogya/W//www"o&o/ogy,96,119)。此外，釀酒酵母和卡爾酵母中發現的2|im質粒的天然群體中存在變異(遺傳多態性)，NCBI序列(登錄號NC—001398)為一個實例。2pm質粒具有核定位(nuclearlocalisation)並表現出高水平的有絲分裂穩定性(Mead等，1986,Mo/ecw/w&Ge"era/Ge"e"cs,205,417)。2|im質粒的內在穩定性由質粒編碼的拷貝數擴增和分配機制產生，這些機制在嵌合載體的發展過程中可為有害的(compromised)(Futcher&Cox，1984,丄5acfen'o/.，157，283;Bachmair&Ruis,1984,M0w她/2e/te，C77濯'e,115,1229)。包含2jim質粒的酵母菌抹被稱為[cir+]，而不包含2^im質粒的酵母菌抹被稱為[cir勺。2iim質粒的US區包含/^P2和F丄P基因，而UL區包含凡e:屍7和Z)(也稱作WF)基因、5TB-基因座和複製起點(Broach&Hicks,1980,Ce〃，21,501;Sutton&Broach,1985，Mo/.Ce//.AW.，5,2770)。Flp重組酶與反向重複序列中的FRT-位點(Flp識別目標)結合以介導位點特異性重組，這是體內天然質粒擴增和質粒拷貝數控制所必需的(Senecoff等，1985，屍rac.Ato/.Jcfld5W."5*./!,82,7270;Jayaram,1985,Prac.A^/.^cadt/.S.A，82,5875)。2(am-家族質粒的拷貝數可以受到Flp重組酶活性變化的顯著影響(Sle印等，2001,;TeaW，18,403;Rose&Broach,1990,Afe/zoA五"2^,"o/.,185，234)。Repl和Rep2蛋白質介導質粒聚集，儘管它們的作用模式是不清楚的(Sengupta等，2001,5acfe〃'o/.,183,2306)。它們也抑制FLP基因的轉錄(Reynolds等，1987,Mo/.Ce〃.腸/"7,3566)。2|im質粒的FLP和i^屍2基因從不同的啟動子轉錄，它們之間顯然沒有確定的插入序列。FZ屍和i^屍2轉錄物都在反向重複序列中相同的序列基序(motif)，分別在它們的翻譯終止密碼子之後的24-bp和178-bp處終止(Sutton&Broach,1985，Mo/.CW/.5zb/.，5，2770)。在^X屍的情況下，C末端編碼序列也位於反向重複序列中。此外，兩個反向重複序列在599bp內高度保守，這一特性被認為對於在體內有效地複製和擴增質粒是有利的，儘管只有FRT-位點(小於65-bp)對體外的位點特異性重組是必需的(Senecoff等，1985,屍rac.A^/.力cadSc/.C/S.A,82,7270;Jayaram，1985,A^/.^4cad".&A，82,5875;Meyer-Leon等，1984，CoW5^n'"gf/a^w^附/osz'a(9"g^3""to"ve所o/ogv，49，797)。Flp的關鍵催化殘基是具有由組氨酸-309和組氨酸345促進的鏈剪切的精氨酸-308和酪氨酸-343(其為必需的)(Pmsad等,1987,屍rac.脂/.^c。c/.SC."J.A,84，2189;Chen等，1992，Ce〃,69，647;Grainge等，2001，乂M/.腺"314,717)。描述了Rep2中的兩個功能域。殘基15-58形成了Repl-結合域，殘基50-296包含自結合和STB-結合區(Sengupta等，2001，乂Bacfen'o/.，183,2306)。缺少2|im質粒的許多必需功能區，但保留了功能順式元件爿A61和5T5的2pm的嵌合或大缺失突變衍生.物，在細胞分裂時不能有效地在母細胞和子細胞之間分配。如果這些功能以反式提供，如通過提供宿主，如[cir+]宿主中的功能性2|im質粒，這樣的質粒能產生上述作用(candoso)。先前已將目標基因插入2(im質粒的UL-區中。例如，參見EP0286424中的質粒pSAC3Ul和WO2005/061718的圖2中顯示的質粒，其中包括卩-內醯胺酶基因(氨千青黴素抗性)、i:五f/2選擇性標記和寡核苷酸接頭(linker)，將後兩個插入2pm-樣分解載體pSAC3(參見EP0286424)的UL-區中唯一的5VwBI位點中。位點之間包含氨千青黴素抗性基因的大腸桿菌DNA在轉化入酵母后從WO2005/061718中圖2所示的質粒上丟失。這在Chinery&Hinchliffe,1989,CWr.16,21和EP0286424中都有描述，其中這些類型的載體被命名為"分解載體(disintegrationvector)"。在接頭中的Mrt-位點可以插入其它的多核苷酸(Sleep等，1991,所ofec/2"o/ogy(7Vi9，9,183)。2(im質粒中的其它插入位點在本領域中是公知的，包括Rose&Broach(1990,MeAoA五"zymo/.，185,234-279)中描述的那些，如質粒pCV19、pCV20、CVne。，其利用F丄屍中￡coRI的插入；質粒pCV21、pGT41和pYE，其利用D中的五coRI作為插入位點；質粒pHKB52,其利用￡>中的戶Wl作為插入位點；質粒pJDB248，其利用D中的屍M和D中的五coRI的插入；質粒pJDB219,其使用其中Z)中的屍wl和F丄屍中的五coRI作為插入位點；質粒G18、質粒pAB18，其利用屍丄屍中的C/al的插入；質粒pGT39和pA3、質粒pYTll、pYTM和pYTll-LEU,其使用￡>中的屍M作為插入位點；和質粒PTY39，其使用F丄P中的EcoRI作為插入位點。其它2(im質粒包括pSAC3、pSAC3Ul、pSAC3U2、pSAC300、pSAC310、pSAC3Cl、pSAC3PLl、pSAC3SL4和pSAC3SCl，在EP0286424和Chinery&Hinchliffe(1989,C匿G麼f.，16,21-25)中描述，其也描述了屍WI、或S"aBI作為適當的2(im插入位點。更多的2pm質粒包括pAYE255、pAYE316、pAYE443、pAYE522(Kerry-Williams等，1998,腸W，14,161-169)、pDB2244(WO00/44772)和pAYE329(Sleep等'2001,}^^，18,403-421)。在一個優選實施方案中，將一個或者多個基因插入2nm-家族質粒上ARS序列附近的未轉錄區中。例如，在從釀酒酵母中獲得的2pm質粒中，ARS序列附近的未轉錄區從D基因末端延伸至ARS序列的開始。Chinery&Hinchliffe，1989,Q#r.Ge"a.，16,21-25中描述了在5VwBI(複製序列ARS起點附近)的插入。技術人員將理解的是，基因插入也可以在Chinery&Hinchliffe中描述的未轉錄區中在6WflBI位點的相鄰位置進行。在另一個優選實施方案中，2pm-家族質粒中的i^屍2和FZJ0基因每個都有鄰近它們的反向重複序列，並將一個或多個基因插入2pm-家族質粒中基因或FLP基因最後的功能密碼子之後的第一個鹼基和鄰近所述基因的反向重複序列中FRT位點之前的最後一個鹼基之間的區域。i^屍2基因或凡P基因最後的功能密碼子是基因開放閱讀框中的密碼子，所述基因在基因啟動子下遊最遠處，所述基因啟動子被終止密碼子代替將導致質粒的多拷貝穩定性的不可接受的損失，如此處所述。因此，通過多核苷酸序列的插入、缺失或取代在i^屍2或F丄屍任一基因中最後的功能密碼子下遊的任一點破壞或F丄戶基因，將不會導致質粒的多拷貝穩定性的不可接受的損失。例如，可以在密碼子59之後破壞2lam質粒的i^屍2基因，而且可以在密碼子344之後破壞2pm質粒的FLP基因，每個都不會帶來質粒的多拷貝穩定性的損失。可以通過製備F丄P或i^P2基因的質粒突變體，然後進行此處提出的下述測試來常規地確定其它2iim-家族質粒的同義基因(equivalentgene)中最後的功能密碼子，從而確定質粒是否保持多拷貝穩定性。因此，WO2005/061719中所述的質粒插入位點可以，或者可以不，用於攜帶根據本發明的任何方面的一個或多個重組基因。可以用如Chinery&Hinchliffe(1989,Cwr.Ge"et，16,21-25)所述的測試確定質粒是否保留了多拷貝穩定性。對於在Chinery&Hinchliffe(1989，CwrGw".，16,21-25)中描述的非選擇性培養基(YPD,也叫YEPD)中不生長的酵母，可以使用其它合適的非選擇性培養基。質粒穩定性可以定義為在確定的傳代數目後，對選擇性標記保持原養型的細胞的百分比。傳代數目將優選地足以顯示對照質粒，如pSAC35或pSAC310之間的差異，或者顯示與這樣的對照質粒的可比較的穩定性。傳代數目可以是l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多。優選較高的數目。可接受的質粒穩定性可以是1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或基本上100%。優選較高的百分比。技術人員將理解的是，儘管質粒在非選擇性培養基上生長時的穩定性小於100%,但是質粒在選擇性培養基中培養時仍然有用。例如，當按照WO2005/061719的實施例2的測試確定實施例中描述的質粒pDB2711穩定性時，其為僅僅10%穩定的，但是在選擇性生長條件下的搖瓶培養中，在重組轉鐵蛋白生產能力上提供了15倍增加。因此一個或多個基因插入可以，或者可以不，出現在i^屍2基因最後的功能密碼子之後的第一個鹼基和鄰近所述基因的反向重複序列中FRT位點之前的最後一個鹼基之間，優選出現在反向重複序列的第一個鹼基和FRT位點之前的最後一個鹼基之間，更優選出現在兄e:屍2基因的翻譯終止密碼子之後和FRT位點前的最後一個鹼基之前的位置。另外或可替換地，一個或多個基因插入可以，或者可以不，出現在FLP基因最後的功能密碼子之後的第一個鹼基和鄰近所述基因的反向重複序列中FRT位點之前的最後一個鹼基之間，優選出現在反向重複序列的第一個鹼基和FRT位點之前的最後一個鹼基之間，更優選出現在FLP編碼序列末端之後的第一個鹼基和FRT位點前的最後一個鹼基之間，如出現在FLP編碼序列末端之後的第一個鹼基。在一個優選實施方案中，其中2pm-家族質粒基於釀酒酵母的2fim質粒，是本領域所知的分解載體(例如，參見EP286424，其內容通過引用併入本文)。分解載體可以是，或者可以不是2^im質粒載體，其包含意欲通過重組丟失的DNA序列、三個2jamFRT位點，其中一對FRT位點處於正向(indirectorientation),其它兩對處於反向(inindirectorientation),以及目標DNA序列(如大腸桿菌複製起點和細菌選擇性標記)，待丟失的所述序列位於處於反向的所述4立點之間。因此，待丟失的序列可以包含，或者可以不包含選擇性標記DNA序列。優選的分解載體可以包含，或者可以不包含另外攜帶下述序列的完整的21im質粒(i)載體在細菌宿主中繁殖所必需的細菌質粒DNA序列；(ii)另外的2pmFRT位點；和酵母轉化的選擇性標記DNA序列；所述細菌質粒DNA序列存在於和另外的FRT位點產生於在2Mm質粒的兩個反向重複序列之一中的限制性位點，如lal，所述另外的FRT位點相對於所述的一個重複序列的內源FRT位點處於正向，且細菌質粒DNA序列夾心在另外的FRT位點和所述的一個重複序列的內源FRT位點之間。在優選的分解載體中，所有細菌質粒DNA序列可以，或者可以不，如所述^C夾在中間。特別優選的2nm質粒載體基本上具有如EP286424中所示的pSAC3的構型。此處使用的術語"分解載體，，也包括US6,451,559中描述的質粒，該文獻的內容通過引用併入本文。因此分解載體可以是，或者可以不是2pm載體，其除了編碼非酵母多肽的DNA序列外不含有細菌(特別是大腸桿菌)複製起點，或者更優選不包含細菌(特別是大腸桿菌)序列，優選地，所述載體中的所有DNA除了編碼非酵母多肽的DNA序列外，是酵母衍生的DNA。^發效摩迷的歡f的蛋4I和其如本文使用的術語"蛋白質，，和"期望的蛋白質，，包括所有天然和非天然的蛋白質、多肽和肽。就本發明而言，"異源蛋白質"是由如上所迷的"重組基因"編碼的蛋白質。"異源蛋白質"可以，或者可以不，與所用表達系統(我們使用"表達系統"包括了宿主細胞的基因組(通常是染色體)或質粒的含義，在所述宿主細胞的基因組中"重組基因，，整合到染色體上，而在所述質粒中"重組基因"由質粒編碼)中天然存在的一個或多個其它基因編碼的蛋白質在序列上相同。例如，在由2!im-家族質粒上攜帶的"重組基因"編碼的"異源蛋白質"的上下文中，"異源蛋白質"可以是，或者可以不是這樣的蛋白質，其不由2^m-家族質粒天然地編碼，也可以描述為"非2(im-家族質粒蛋白質"。為了方便起見，術語"異源蛋白質"和"非2[im-家族質粒蛋白質，，在本申請中同義地使用。任選地因此，當由2[im-家族編碼時，異源蛋白質不是F丄屍、i^屍/、7^屍2，或者由從魯氏接合酵母中獲得的pSRl、pSB3或者pSB4、均從拜列氏接合酵母中獲得的pSBl或pSB2、從發酵接合酵母中獲得的pSMl、從果蠅克魯維酵母中獲得的pKDl、從膜醭畢赤酵母中獲得的pPMl或從釀酒酵母中獲得的2pm質粒中的任何一個編碼的RAF/D蛋白質。編碼期望的異源或其它蛋白質的基因包括編碼異源蛋白質的多核苷酸序列(通常根據任何給定生物的標準密碼子使用方法)，指定的開放閱讀框(ORF)。基因可以，或者可以不，另外包含一些不編碼開放閱讀框的多核苷酸序列(稱為"非編碼區")。基因中的非編碼區可以包含，或者可以不包含一個或多個與ORF4喿作相連的調控序列，其允許開放閱讀框的轉錄和/或生成的轉錄物的翻譯。術語"調控序列，，指調節(即，促進或減少)與其可操作連接的ORF的表達(即，轉錄和/或翻譯)的序列。調控區通常包括啟動子、終止子、核糖體結合位點等。技術人員將理解的是，調控區的選擇取決於所用的表達系統。例如，啟動子可以是，或者可以不是組成型或誘導型的，而且可以是，或者可以不是細胞-或組織-類型特異性的或非特異性的。合適的調控區的長度可以是，或者可以不是5bp、10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、60bp、70bp、80bp、卯bp、訓bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、260bp、280bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp或者更長。本領域的那些技術人員將識別編碼分子伴倡，例如PDI的基因，可以或者可以不，另外包含非編碼區和/或調控區。這樣的非編碼區和調控區不限於與分子伴估ORP正常關聯的天然的非編碼區和/或調控區。當表達系統是酵母，如釀酒酵母時，對於釀酒酵母合適的啟動子包括那些與如下基因有關的啟動子戶G尺7基因、d4丄7或04丄川基因、7ZF7、r￡F2、戶r^、屍M47、CFC7、屍//05、7T屍7、JD/^、爿Z)//2、如下酶的基因3-磷酸甘油醛脫氬酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、葡萄糖激酶、a-交配因子信息素、a-交配因子信息素、屍iB/啟動子、屍iM7啟動子、G屍D/啟動子和包括部分5'調控區與其它啟動子的部分5'調控區或與上遊活化位點的雜合體的雜合啟動子(如EP-A-258067的啟動子)。合適的轉錄終止信號是本領域中熟知的。當宿主細胞是真核細胞時，轉錄終止信號任選地源自真核細胞基因的3'側翼序列(flankingsequence),其包含用於轉錄終止和聚腺苷酸化的適當信號。合適的3，側翼序列可以，或者可以不，例如，是與所用的表達控制序列天然相連的基因的那些序列，即可以，或者可以不，與啟動子相對應。或者，它們可以不同。在那種情況下，而且其中宿主是酵母，任選為釀酒酵母時，釀酒酵母v!D/i7、」D//2、CTC1或PG^/基因的終止信號是優選的。基因，如編碼分子伴侶(如屍D/7)或期望的蛋白質(如異源的期望的蛋白質)的基因，其啟動子和開放閱讀框側翼連接轉錄終止序列，以使轉錄終止序列位於啟動子和開放閱讀框的上遊和下遊，以防止轉錄通讀進入鄰近的基因，如2jim基因中，反之亦然，這可以是，或者可以不是有益的。在一個實施方案中，酵母如釀酒酵母中有利的調控序列包括酵母啟動子(如釀酒酵母屍ii7啟動子)，如EP431880中教導的；和轉錄終止子，任選為來自酵母JD//7的終止子，如EP60057中教導的。任選地，載體併入了至少兩個翻譯終止密碼子。非編碼區併入一個以上編碼翻;奪終止密碼子，如UAA、UAG或者UGA的DNA序列，以使翻譯通讀(read-through)最小化，並由此避免產生延長的非天然融合蛋白，這可以是，或者可以不是有益的。翻譯終止密碼子UAA是優選的。術語"可操作連接，，其含義中包括調控序列位於基因中的任何非編碼區內，以使其與ORF形成聯繫，允許調控區以它預期的方式對ORF產生作用。因此與"可操作連接"於ORP的調控區以這樣的方式定位，以使調控區能夠以預期的方式，在與調控序列相容的條件下影響ORF的轉錄和/或翻譯。在一個優選實施方案中，分泌期望的蛋白質(如異源的期望的蛋白質)。在此情況下，編碼分泌前導序列的序列，其如WO90/01063中教導包含大多悽丈天然HSA分泌前導序列，加上小部分釀酒酵母a-交配因子分泌前導序列，可以，或者可以不，包括在開放閱讀框中。或者，期望的蛋白質(如異源的期望的蛋白質)可以是，或者可以不是胞內的。期望的蛋白質(如異源的期望的蛋白質)可以包含，或者可以不包含真核蛋白質的序列，或者其片段或變體。合適的真核生物包括真菌、植物和動物。在一個實施方案中，異源蛋白質可以是，或者可以不是真菌蛋白質，如酵母蛋白質。在另一個優選實施方案中，期望的蛋白質(如異源的期望的蛋白質)可以是，或者可以不是動物蛋白質。代表性的動物包括脊推動物和無脊推動物。代表性的脊推動物包括哺乳動物，如人和非人哺乳動物。因此期望的蛋白質(如異源的期望的蛋白質)可以包含，或者可以不包含酵母蛋白質的序列。例如，它可以包含，或者可以不包含來自與得到2lam-家族質粒的宿主相同的宿主中的酵母蛋白質序列，特別是如果將編碼異源蛋白質的基因整合入所述2jim-家族質粒時。本領域的那些技術人員將識別本發明的方法、用途或者質粒可以包含，或者可以不包含編碼一種以上異源蛋白質、一種以上分子伴侶，或者一種以上異源蛋白質和一種以上分子伴侶的DNA序列。在另一個實施方案中，期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以包含，或者可以不包含下述蛋白質的序列白蛋白、單克隆抗體、依託泊苷(etoposide)、血清蛋白(如凝血因子)、antistasin、蜱抗凝肽、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、內皮他丁、血管他丁、膠原、免疫球蛋白或基於免疫球蛋白的分子或每一種的片段(如SmallModularImmunoPharmaceuticalTM("SMIP，，)或dAb,Fab，片段，F(ab，)2,scAb，scFv或scFv片段)、Kunkz域蛋白(如WO03/066824中描述的那些，帶有或者沒有白蛋白融合)、幹擾素、白介素、ILIO、ILll、IL12、幹擾素a種類和亞種、幹擾素(3種類和亞種、幹擾素Y種類和亞種、瘦素(leptin)、CNTF、CNTFAxl5、IL1受體拮抗劑、紅細胞生成素(EPO)和EPO衝莫擬物、血小板生成素(TPO)和TPO模擬物、prosaptide、cya,irin-N、5-螺旋、T20肽、T1249肽、HlVgp41、HlVgpl20、尿激酶、尿激酶原、tPA、水蛭素、血小板衍生的生長因子、曱狀旁腺素、胰島素原、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、胰島素樣生長因子、降鈣素、生長激素、轉化生長因子P、腫瘤壞死因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF、以活化前和活化形式存在的凝結因子，包括但不限於血纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白原、凝血酶、前凝血酶、凝血酶原、血管性血友病因子、a,-抗胰蛋白酶、血纖維蛋白溶酶原活化劑、因子VII、因子vin、因子ix、因子x和因子xm、神經生長因子、laci、血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、葡萄糖氧化酶、血清膽鹼酯酶、抑肽酶、澱粉樣前體蛋白、間-a胰蛋白酶抑制劑、抗凝血酶m、載脂蛋白類、蛋白質C、蛋白質S、代謝物、抗生素或者任何上面的變體或片段。在上述列出的蛋白質的上下文中，"變體"指其中一個或多個位置具有胺基酸插入、缺失或者保守或者不保守取代的蛋白質，只要這樣的變化得到的蛋白質的基本性質，如酶活性或受體結合(典型活性和比活性)、熱穩定性、在一定pH範圍內的活性(pH穩定性)沒有顯著的變化。此上下文中的"顯著"指本領域一名技術人員能夠判定變體的性質可仍然不同，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。"保守取代"是預定的組合,如Val、Ile、Leu、Ala、Met;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr、Gly、Ala;Lys、Arg、His;和Phe、Tyr、Trp。優選的保守取代包括Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。"變體，，通常與得到它的多肽具有至少25%、至少50°/。、至少60%或至少70%,優選至少80%,更優選至少90%,甚至更優選至少95%，還更優選至少99%,最優選至少99.5%的序列同一性。可以用合適的電腦程式，例如威斯康辛大學遺傳計算組的GAP程序，來確定兩個多肽之間的百分比序列同一性，而且可理解的是，相對於已將其序列進行了最佳比對的多肽來計算百分比同一性。可替換地，可以使用ClustalW程序(Thompson等，(1994)7Vwc/e/c」c/A22(22),4673-80)進行序列比對。所用參數可以，或者可以不，如下所述快速配對比對參數K-tuple(字)大小；1，窗口大小；5，空隙罰分(gappenalty);3,頂部對角線(topdiagonal)悽t;5。評分方法x百分比。多重比對參數缺口開放罰分(gapopenpenalty);10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty);0.05。評分矩陣BLOSUM。這樣的變體可以是，或者可以不是天然的或者使用本領域所熟知的蛋白質工程和定點誘變方法製備的。在上述列出的蛋白質的上下文中，"片段"指其中在一個或多個位點具有缺失的蛋白質。因此片段可以包含，或者可以不包含完全成熟的多肽的完整序列的最多5、10、20、30、40或者50%,通常地，片段包含完全成熟的多肽的完整序列的多達60%,更通常多達70%,優選多達80%，更優選多達90%，甚至更優選多達95%，還更優選多達99。/。。蛋白質的特別優選的片段包括蛋白質的一個或多個完整域。在一個特別優選的實施方案中，期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)包含白蛋白或其變體或片段的序列。我們使用的"白蛋白，，包括了包含由任何來源獲得的白蛋白序列的蛋白質。通常來源是哺乳動物。在一個優選實施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白("HSA，，)。術語"人血清白蛋白，，包括具有人體中天然存在的氨基Stf列的血清白蛋白及其變體的含義。任選地，白蛋白具有WO90/13653中公開的氨基,列或其變體。可通過用於分離對應於人類基因的cDNA的已知方法來獲得HSA編碼序列，並且該序列也公開於，例如EP73646和EP286424中。在另一個優選實施方案中，"白蛋白，，包括牛血清白蛋白的序列。術語"牛血清白蛋白"包括具有牛中天然存在的氨基i^f列，例如Swissprot登錄號P02769的血清白蛋白及其如下所述的變體的含義。術語"牛血清白蛋白，，也包括全長牛血清白蛋白的片段或其變體的含義，如下所述。在另一個優選實施方案中，白蛋白包括源自來自下述動物的一種血清白蛋白的白蛋白序列狗(例如參見Swissprot登錄號P49822)、豬(例如參見Swissprot登錄號P08835)、山羊(例如可由Sigma得到，產品號A2514或A4164)、火雞(例如參見Swissprot登錄號073860)、狒狒(例如可由Sigma得到，產品號A1516)、貓(例如參見Swissprot登錄號P49064)、雞(例如參見Swissprot登錄號P19121)、卵清蛋白(雞卵清蛋白)(例如參見Swissprot登錄號P01012)、驢(例如參見Swissprot登錄號P39090)、蓋亞那豬(例如可由Sigma得到，產品號A3060、A2639、05483或A6539)、倉鼠(例如可由Sigma得到，產品號A5409)、馬(例如參見Swissprot登錄號P35747)、獼猴(例如參見Swissprot登錄號Q28522)、小鼠(例如參見Swissprot登錄號089020)、鴿子(例如Khan等，2002,/"f.Macrawo/.,30(3-4)，171-8所述)、兔(例如參見Swissprot登錄號P49065)、大鼠(例如參見Swissprot登錄號P36953)和綿羊(例如參見Swissprot登錄號P14639),並且包括如下所述的其變體和片段。已知白蛋白的很多天然存在的突變形式。Peters(1996,」〃v^ow/v4/Z)w/w>7.'說'oc/2em/幼3^Ge"e"csa"<iAfWca/y^pp/fca/Zom1,AcademicPress,Inc.,SanDiego,California,p.l70-181)中描述了很多。如上所述的變體可以是，或者可以不是這些天然存在的突變體之一。"變體白蛋白"指其中在一個或多個位置具有胺基酸插入、缺失或者保守或者不保守取代的白蛋白，只要這樣的變化得到的白蛋白的至少一種基本性質，例如結合活性(典型活性和比活性，例如與膽紅素(bilirubin)結合)、滲量(osmolality)(月彭月長壓(oncoticpressure)、股體滲透壓(colloidosmoticpressure))、在一定pH範圍內的行為(pH穩定性)沒有顯著的變化。此上下文中的"顯著"指本領域一名技術人員會判定變體的性質可仍然不同，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。"保守取代"是預定的組合，如Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gin;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。這樣的變體可以是，或者可以不是通過本領域所熟知的技術製備的，如通過1981年11月24日頒布給(issuedto)Stevens的美國專利4,302,386中公開的定點誘變製備的，該文獻通過引用併入本文。通常地，白蛋白變體與天然存在的白蛋白具有高於40%，通常至少50%、更通常至少60%,優選至少70%,更優選至少80%,還更優選至少90%,甚至更優選至少95%,最優選至少98%或更高的序列同一性。可以用合適的電腦程式，例如威斯康辛大學遺傳計算組的GAP程序來確定兩個多肽之間的百分比序列同一性，而且可理解的是，相對於已將其序列進行了最佳比對的多肽計算百分比同一性。可替換地，可以使用ClustalW程序(Thompson等，1994)進行序列比對。所用參數可以，或者可以不，如下所述快速配對比對參數K-tuple(字)大小;1，窗口大小；5,空隙罰分(gappenalty);3，頂部對角線(topdiagonal)數；5。評分方法x百分比。多重比對參悽史在丸口開方文罰分(gapopenpenalty);10，在夾口延伸罰分(gapextensionpenalty);0.05。評分矩陣BLOSUM。上文所用的術語"片段"包括全長白蛋白或其變體的任何片段，只要至少一種基本性質，例如結合活性(典型活性和比活性，如與膽紅素結合)、滲量(膨脹壓、膠體滲透壓)、在一定pH範圍內的行為(pH穩定性)沒有顯著的變化。此處的"顯著，，指本領域一名技術人員會判定變體的性質可仍然不同，但與初始蛋白質的性質相比將是明顯的。片段通常為至少50個胺基酸長。片段可以包含，或者可以不包含白蛋白的至少一個完整子域。已將HSA域表達為重組蛋白質(Dockal,M.等，1999,/歷o/.C/ze肌，274,29303-29310),其中域I定義為由胺基酸1-197組成，域II定義為由胺基酸189-385組成，域III定義為由胺基酸381-585組成。存在域的部分重疊，因為延伸的a-螺旋結構(hlO-hl)存在於域I和域II之間以及域II和域III之間(前面引用的Peters,1996,表2-4)。HSA也包括6個子域(子域IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB)。子域IA包括胺基酸6-105，子域IB包括胺基酸120-177，子域IIA包括胺基酸200-291，子域IIB包括316-369,子域IIIA包括胺基酸392-491，子域IIIB包括胺基酸512-583。片段可以包含，或者可以不包含如上所述的一個或多個域或子域的部分或全部，或者這些域和/或子域的任何組合。在另一個特別優選的實施方案中，期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)包括轉鐵蛋白或其變體或片段的序列。本文使用的術語"轉鐵蛋白"包括轉鐵蛋白家族的所有成員(Testa,屍rato7w/rawme/"6ofcw,CRCPress,2002;Harris&Aisen,/rawcorWe/^awe/zVo"/ra^>w,Vol.5,PhysicalBioinorganicChemistry,VCH,1991)和它們的衍生物，如轉鐵蛋白、突變轉鐵蛋白(Mason等，1993,歷oc/^w^/7,32，5472;Mason等，1998，A0c/2e附.丄，330(1),35)、截短的轉鐵蛋白、轉鐵蛋白裂片(lobe)(Mason等，1996,屍rate/"8,119;Mason等，1991,Prafe/w屍wny:,2,214)、乳鐵蛋白、突變乳鐵蛋白、截短的乳鐵蛋白、乳鐵蛋白裂片或上述任何一種與其它肽、多肽或蛋白質的融合體(Shin等，1995,屍rac.A^/.爿cad5W.OS^，92,2820;Ali等，1999,J".Ao/.C7ze肌，274,24066;Mason等，2002，說oc/ze/w'^y,41，9448)。轉鐵蛋白可以是，或者可以不是人轉鐵蛋白。術語"人轉鐵蛋白，，在本文中用來表示與來自人的轉鐵蛋白無法區分的物質或者作為其變體或片段的物質。"變體"包括插入、缺失和保守或者不保守取代，其中這樣的變化基本上不改變轉鐵蛋白的有用的配體結合或免疫性質。本發明也包括了轉鐵蛋白的突變體。這樣的突變體可以，或者可以不，具有改變的免疫原性。例如，轉鐵蛋白突變體可以，或者可以不，顯示改變的(如減少的)^f唐基化。轉鐵蛋白分子的N端連接(N-linked)的糖基化形式可以通過在N、X或S/T位置的任何一個或全部加入/去除胺基酸糖基化共有序列，如N-X-S/T來進行修飾。轉鐵蛋白突變體可以，或者可以不，改變它們與金屬離子和/或其它蛋白質，如轉鐵蛋白受體的天然結合。以這種方式修飾的轉鐵蛋白突變體的例子在下面說明。我們也包括了人轉鐵蛋白或人轉鐵蛋白類似物的天然存在的多態的變體。通常，人轉鐵蛋白的變體或片段將具有至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%(優選至少80%、90%或95%)的人轉鐵蛋白的配體結合活性(例如鐵結合)，按照重量百分比計算(weightforweight)。轉鐵蛋白或者測試樣品的鐵結合活性可以通過蛋白質在無鐵狀態和完全負載鐵的狀態下470nm:280nm的吸光度比值由分光光度法測定。除非另外說明，試劑應是不含鐵的。可以通過對於0.1M梓檬酸鹽、0.1M醋酸鹽、10mMEDTA,pH4.5透析/人轉鐵蛋白或者測試樣品中除去鐵。蛋白質應以大約20mg/mL溶於100mMHEPES、10mMNaHC03、pH8.0中。測定在水中稀釋的脫輔基轉鐵蛋白(apo-transferrin)的470nm:280nm吸光度的比4直(Calbiochem，CNBiosciences,Nottingham,UK)，從而可以由分光光度法準確地測定280nm處的吸光度(0%鐵結合)。通過將191mg硝基三乙酸溶解於2mL的1MNaOH中來製備20mM的鐵-硝基三乙酸鹽(FeNTA)溶液，然後加入2mL0.5M三氯化鐵。用去離子水稀釋到50mL。通過加入足夠過量的新鮮製備的20mMFeNTA來用鐵完全負載脫輔基轉鐵蛋白(100%鐵結合)，然後將全-轉鐵蛋白製備物對於100mMHEPES、10mMNaHCO3、pH8.0完全透析，以在測定470nm:280nm處的吸光度比值之前去除殘留的FeNTA。使用測試樣品重複所述步驟，該測試樣品最初應該不含鐵，然後將最終的比值與對照相比較。此外，可以，或者可以不，使用包含上述任何一種的單個或多個異源融合體，或者與白蛋白、轉鐵蛋白或免疫球蛋白或這些蛋白質中任何一個的變體或片段形成的單個或多個異源融合體。這樣的融合體包括白蛋白N末端融合體、白蛋白C末端融合體和N末端及C末端白蛋白共融合體，如通過WO01/79271例示的，和轉鐵蛋白N末端融合體、轉鐵蛋白C末端融合體和N末端及C末端轉鐵蛋白共融合體。美國專利申請US2003/0221201和US2003/0226155、Shin,等，1995，/VocAto/Jcad<SW"&4，92,2820，Ali,等，1999,/A'o/C/zem，274,24066,Mason,等，2002,歷oc/ze脂'^"乂41,9448中給出了轉鐵蛋白融合體的例子，這些文獻的內容通過引用併入本文。技術人員還可理解的是，可以採用任何其它基因或變體的開放閱讀框，或部分或其中之一作為開放閱讀框用於本發明。例如，開放閱讀框可以，或者可以不，編碼包含任何序列的蛋白質，其為天然蛋白質(包括酶原)或天然蛋白質的變體或片段(例如，其可以是，或者可以不是域)，或者是完全合成的蛋白質，或者是不同蛋白質(天然或合成的)的單融合體或多融合體。這樣的蛋白質可以，但並不唯一，來自WO01〃9258、WO01/79271、WO01/79442、WO01/79443、WO01/79444和WO01/79480中提供的列表，或其變體或片段；所述文獻的公開通過引用併入本文。儘管這些專利申請提供了在白蛋白融合配偶體(fUsionpartner)的上下文中的蛋白質列表，但是就本發明而言，本發明不限於此，在其中列出的任何蛋白質可以，或者可以不，單獨提供或作為白蛋白、免疫球蛋白的Fc區、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白或其它任何蛋白質或上述任一種的片段或變體的融合配偶體提供，作為期望的多肽。期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以是，或者可以不是有治療活性的蛋白質。換言之，它可以，或者可以不，對個體如人，具有公認的醫療作用。很多不同類型的治療活性蛋白質是本領域中熟知的。期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以是，或者可以不是在診斷技術上有用的蛋白質。很多不同類型的在診斷上有作用的蛋白質是本領域中熟知的。期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以是，或者可以不是與保健(healthcare)無關的蛋白質。例如，它可以是，或者可以不是，作為工業、民用或營養(如作為食品或添加劑)劑有效用的蛋白。4艮多不同類型的具有工業、民用和/或營養效用的蛋白質也是本領域中熟知的。期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以包含，或者可以不包含有效引起在宿主細胞，如酵母細胞中分泌的前導序列。已使用或開發很多天然或人造的多肽信號序列(也稱作分泌前區)用於從宿主細胞的分泌蛋白質。信號序列將初生蛋白(nascentprotein)導向細胞機器(machineryofcell),該細胞機器將蛋白質從細胞輸出到周圍的培養基或者，在某些情況下，輸出到周質空間中。信號序列通常，儘管並不必需，位於初級翻譯產物的N-末端，而且通常，儘管並不必需，在分泌過程中將蛋白質切割以得到"成熟"蛋白質。在一些蛋白質的情況下，初始分泌的實體在去除信號序列後，在其N末端包括額外的胺基酸，稱為"原"序列，中間物實體稱為"原蛋白"。這些原序列可以，或者可以不，幫助最終蛋白質摺疊並成為有功能的，而且通常之後被切割。在其它例子中，原區域僅僅提供酶的切割位點，以切掉前-原區域(pre-proregion),且不知道具有其它功能。可以在蛋白質從細胞分泌的過程中或在從細胞輸出到周圍培養基或周質空間之後將原序列去除。指導蛋白質分泌的多肽序列，無論它們是否類似信號序列(即前序列)或前-原分泌序列，都稱為前導序列。蛋白質的分泌是涉及翻譯、易位和翻譯後加工的動態過程，在另一個步驟啟動或者完成之前，這些步驟中的一個或多個不必需完成。對於真核生物種類，如酵母，釀酒酵母、接合酵母屬的菌種、乳酸克魯維酵母和巴斯德畢赤酵母中生產蛋白質，已知的前導序列包括那些來自釀酒酵母酸性磷酸酶蛋白質(PhoSp)(參見EP400)、轉化酶蛋白(Sudp)(參見Smith等(1985)5We"ce,229,1219-1224)和熱激蛋白-150(Hspl50p)(參見WO95/33833)的前導序列。另外，已使用了來自釀酒酵母交配因子ct-l蛋白(MFa-l)和來自人溶菌酶與人血清白蛋白(HSA)蛋白質的前導序列，已將後者特別地，儘管不是專門地，用於分泌人白蛋白。WO90/01063公開了MFa-l和HSA前導序列的融合體，與#_用MFa-l前導序列相比，它有利地減少了人白蛋白中雜質片段的產生。WO2004/009819和本申請的實施例中還公開了修飾的前導序列；讀者將理解的是，那些前導序列可以與除轉鐵蛋白之外的蛋白質一起使用。此外，天然轉鐵蛋白前導序列可以，或者可以不，用於指導轉鐵蛋白和其它異源蛋白質的分泌。當根據本發明進行重組表達的分子伴侶是蛋白質二石克鍵異構酶時，那麼任選地期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以，或者可以不，在其成熟形式中包含二硫鍵。任何二硫鍵可以是，或者可以不是分子內的和/或分子間的。期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以是，或者可以不是商業上有用的蛋白質，如有醫藥上、診斷上、工業上、家庭中或者營養上有用的蛋白質。一些蛋白質，如異源表達的蛋白質，意欲與它們在其中表達的細胞相互作用以對細胞的活性產生有益作用。這些蛋白質以其本身來說並不是商業上有用的。商業上有用的蛋白質是對於它們在其中表達的細胞具有離體(exv/w)作用的蛋白質。然而，技術人員將理解的是，商業上有用的蛋白質可以，或者可以不，還對表達它(如異源蛋白質)的宿主細胞具有生物效應，但是該效應不是在其中表達蛋白質的主要或唯一原因。商業上有用的蛋白質可以包括用作代謝物或抗生素等的蛋白質。在一個實施方案中，優選期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)不是P-內醯胺酶。在另一個實施方案中，優選期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)不是antistasin。然而，讀者可理解的是，上述這些條件都沒從本發明的宿主細胞中或質粒上排除編碼(3-內醯胺酶或antistasin的基因，只不過編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的基因編碼除(3-內醯胺酶和/或antistasin之外的蛋白質。在本發明的實施中有用的質粒可以，除非另外說明，是任何類型的質粒。就本發明而言，"質粒，，還可以，或者可以不，包括其它類型的載體。基於將在其中使用質粒的宿主細胞系統來選擇合適的質粒是適當的。已知很多質粒和其它載體用於各種表達系統的轉化，包括使用下述物質的系統用例如重組噬菌體、質粒或者粘粒DNA表達載體轉化的細菌(如枯草芽孢桿菌或大腸桿菌)；用例如酵母表達載體轉化的酵母(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；用例如病毒表達載體(如杆狀病毒)轉化的昆蟲細胞系統；用例如病毒或細菌表達載體轉染的植物細胞系統；在細胞培養、轉基因或者作為基因治療中，用諸如腺病毒表達載體轉染的動物細胞系統。通常的原核細胞載體質粒為可由BioradLaboratories(Richmond,CA,USA)得到的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329;可由Pharmacia(Piscataway,NJ，USA)得到的p7c99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5;可由StratageneCloningSystems(LaJolla,CA92037,USA)得到的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、p麗8A、pNH16A、pNH18A和pNH46A。通常的哺乳動物細胞載體質粒是可由Pharmacia(Piscataway，NJ,USA)得到的pSVL。這一載體使用SV40後期啟動子(latepromoter)以驅動克隆基因的表達，在產生T抗原的細胞如COS-l細胞中發現了最高水平的表達。誘導型哺乳動物表達載體的例子是pMSG,也由Pharmacia(Piscataway,NJ，USA)得到，這一載體使用糖皮質激素(glucocorticoid)誘導的小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複的啟動子以驅動克隆基因的表達。有用的酵母質粒載體包括2]im-家族質粒(如上所述)，以及通常可由StratageneCloningSystems(LaJolla,CA92037,USA)得到的pRS403-406和pRS413-416。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合質粒(YIps),且併入了酵母選擇性標記//ZS3、7TP八LEU2和W^3。質粒pRS413-416是酵母著絲粒質粒(YCps)。也可以使用其它Yips和YCps質粒。可通過如下方法製備本發明任何方面所使用的質粒通過使用本領域所熟^、口的4支術，^口Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2001，3rdedition所描述的(其內容通過引入併入本文)，插入所需的序列(例如，一個或多個編碼分子伴侶的基因和/或一個或多個編碼異源蛋白的基因)來修飾本領域已知的質粒如2pm-家族質粒。例如，一種這樣的方法涉及通過粘性末端連接。通過合適的限制性酶的作用可以在質粒和待插入的DNA片段上產生相容的粘性末端。這些末端可以通過互補的鹼基對迅速退火，而剩餘的缺口可以通過DNA連接酶的作用封閉。另外的方法使用了合成的雙鏈寡核芬酸接頭(linker)和連接物(adaptor)。通過可以去除突出的3，端和補平凹陷的3，端的噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I產生具有平端的DNA片段。可以通過T4DNA連接酶將包含確定的限制性酶的識別序列的合成接頭和平端雙鏈DNA部分連接到平端化的DNA片段上。然後將它們用適當的限制性酶消化以產生粘性末端並連接到具有相容的末端的表達載體上。連接物也是化學合成的DNA片段，其包含用於連接的一個平末端，但也具有一個預形成的粘性末端。可替換地，可以通過DNA連接酶的作用在存在或者不存在一個或多個任選含有粘性末端的合成的雙鏈寡核苷酸的情況下將一個或多個DNA片段連接在一起。包含各種限制性內切酶位點的合成的接頭商業上可由很多來源得到，包括Sigma-GenosysLtd,LondonRoad，Pampisford，Cambridge,UnitedKingdom。質粒(如2^im-家族質粒)中適當的插入位點包括，但不限於，上述討論的那些位點。本發明還提供根據本發明的任何方面包含重組基因和/或質粒的宿主細胞。宿主細胞可以是任何類型的細胞。已知很多合適的宿主細胞表達系統，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(例如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和乳酸克魯維酵母)、絲狀真菌(例如麴黴屬)、植物細胞、全植物(wholeplant)、動物細胞和昆蟲細胞。細菌和酵母宿主細胞可以是，或者可以不是優選的。細菌宿主細胞可以用於克隆目的。酵母宿主細胞可以用於表達質粒中存在的基因。在一個實施方案中，宿主細胞可以是，或者可以不是酵母細胞，如下列菌屬的成員酵母屬GSbcc/zaramyce力、克魯維酵母屬、^m/a、亞羅酵母屬(KwTcw/a)、假絲酵母屬(Ca"t/油)、裂殖酵母屬(5"c/z/zoflcc/zarawycas)、德巴利酵母屬(Z)eZm70wyces)、Xaw^20//7少〃om^yc&s、地黴屬(GeoWc/wm)、阿舒嚢黴屬(JAG)、何德菌屬(7/wYaea)、許旺酵母屬OSbMva"w'om少ces)、絲孢酵母屬(7Hc/2c^/ora")、X朋Aop/^〃om少cw或畢赤酵母屬。酵母如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、魯氏接合酵母、拜列氏接合酵母、發酵接合酵母、果蠅克魯維酵母、曱醇畢赤酵母、多形漢遜酵母(//a/weww/a/w/jwzor/j/za)(也牙爾4乍屍/c/z/aawgwW")、Jn:w/afl(iew'm'vorafm1、解月旨亞羅酵母(KmWa、博伊丁假絲酵母(Ca"&WaWwY)、產朊假絲酵母(CawW(iaW/fc)、粟酒裂殖酵母(Sc/z/z(wacc/zaraw3;cespow6e)可以是,或者可以不是優選的。其它合適的酵母可以，或者可以不，包括漢遜德巴利酵母(DeZ)flT3;0，c&s/z朋sem'z〕、Xa/^/zop/^〃，;A:as(iew<iror/zoi、白地黴(GeofWc/zwwca"W(iwm)、才帛阿舒嚢黴(y4s/z6;/agos矽/")、F。Waeawer"ech7、i午旺酵母(^Sc/2waw"/om3;cesocc/dfew/a/k)、7Hc/zosporo"c/o/w&st/cw附和/或使用例如通過破壞基因編碼序列，在涉及蛋白質的O-糖基化的一個或多個蛋白質甘露糖基轉移酶中有缺陷的酵母，如WO2004/083245中所討論的(其內容通過引用併入本文)可以是，或者可以不是特別有利的。在另一個實施方案中，宿主細胞可以是，或者可以不是動物細胞。例如，動物細胞可以是，或者可以不是哺乳動物細胞，如人細胞類型。可以，或者可以不選擇宿主細胞類型與所用質粒類型的相容性。從一種酵母類型獲得的質粒可以在其它酵母類型中維持(Irie等，1991，Gene,108(1)，139-144;Irie等，1991,M/.G飢225(2),257-265)。例如，來自魯氏接合酵母的pSRl可以在釀酒酵母中維持。任選地，宿主細胞與2(im-家族質粒相容(參見對下述質粒的詳細說明)。例如，當質粒基於pSRl、pSB3或者pSB4日於，則合適的酵母細胞是魯氏接合酵母；當質粒基於pSBl或者pSB2時，則合適的酵母細胞是拜列氏接合酵母；當質粒基於pSMl時，則合適的酵母細胞是發酵接合酵母；當質粒基於pKDl時，則合適的酵母細胞是果蠅克魯維酵母；當質粒基於pPMl時，則合適的酵母細胞是膜醭畢赤酵母；當質粒基於2pm質粒時，則合適的酵母細胞是釀酒酵母或卡爾酵母。特別優選的是質粒基於2nm質粒，且酵母細胞是釀酒酵母。本發明的2jim-家族質粒如果包含具有源自天然存在的質粒的序列的F丄屍、i^屍7和i^屍2基因中的一個、兩個或優選三個，就可將其稱為"基於，，該天然存在的質粒。使用例如通過破壞基因編碼序列，在涉及蛋白質的O-糖基化的一個或多個蛋白質甘露糖基轉移酶中有缺陷的酵母，可以是，或者可以不是特別有利的。重組表達蛋白可以由生產宿主細胞進行不期望的翻譯後修飾。例如，白蛋白的蛋白質序列不包含N-連接糖基化的任何位點，並且未有通過O-連接糖基化實際上被修飾的報導。然而，已發現很多酵母種類中產生的重組人白蛋白("rHA，，)可以通過通常涉及甘露糖的O-連接糖基化來修飾。甘露糖基化的白蛋白能夠與血凝素伴刀豆球蛋白A結合。酵母產生的甘露糖基化的白蛋白的量可以通過使用在一個或多個屍MT基因中有缺陷的酵母菌抹來降低(WO94/04687)。實現其最方便的方法是產生基因組中有缺陷以使產生的一種Pmt蛋白質水平降低的酵母。例如，可以，或者可以不，在編碼序列或調控區(或者在調控一種屍MT基因表達的其它基因)中存在缺失、插入或轉座，以產生很少或者不產生Pmt蛋白質。或者，可以轉化酵母以產生抗-Pmt物質，如抗-Pmt抗體。如果使用除釀酒酵母之外的酵母，破壞一個或多個等同於釀酒酵母的屍MT基因的基因也是有利的，例如在巴斯德畢赤酵母或乳酸克魯維酵母中。從釀酒酵母中分離的屍M77(或任何其它屍MT基因)的序列可以，或者可以不，用於鑑定或破壞其它真菌種類中編碼相似酶活性的基因。WO94/04687中描述了乳酸克魯維酵母的屍M77同源物的克隆。酵母可以，或者可以不，如分別在WO95/33833和WO95/23857中教導的，缺失和/或E4屍3。可以，或者可以不，通過標準技術將上述質粒引入宿主中。關於原核宿主細胞的轉化，參見例如Cohen等(1972)屍rac.Ato/.Jcck/.69,2110andSambrook等(2001)Afo/ecw/arC7owVzg,j丄aZorato^yMam/a/，3rdEd.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。Sherman等(1986)她^zocfe/"Ifeos/GWzeft.cs,爿丄a6orato^y7kfa"wa/,ColdSpringHarbor,NY中4苗述了酵母細胞的轉化。Beggs(1978)Atoww275,104-109中的方法也是有用的。EP251744、EP258067和WO90/01063中一般地教導了轉化釀酒酵母的方法，所有這些文獻通過引用併入本文。關於脊推動物細胞，用於轉染這樣的細胞的試劑，例如磷酸4丐和DEAE-葡聚糖或脂質體製劑，可由StratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.,Gaithersburg，MD20877，USA得到。電穿孔也用於轉化細胞，而且是在本領域中熟知的用於轉化酵母細胞、細菌細胞和脊推動物細胞。Becker&Guarente(1990)MeAoA￡"^ywo/.194,182中公開了通過電穿孔轉化酵母的方法。通常，在使用質粒時，它並不轉化所有宿主，因此必需選擇用於轉化的宿主細胞。由此，質粒可以包含，或者可以不包含選擇性標記，其包括^旦不限於細菌選擇性標記和/或酵母選擇性標記。儘管本領域中已知有很多其它選擇性標記，但通常的細菌選擇性標記是p-內醯胺酶基因。酵母選擇性標記包括丄五t/2、7T屍7、//ZS3、//ZS^、t/ZL4丄t/iM5、5*^4/、爿D五2、M￡775、i:KS5、丄rW、7LK2、F^47、屍5"W、屍D/7和屍GiG。本領域的那些技術人員可理解的是，基因的染色體缺失或失活導致宿主不能生存的任何基因，所謂的"必需，，基因，當功能基因在質粒上提供時可以用作選擇性標記，如在；^t/酵母菌鬥朱中的屍(7尺/所顯示的(PiperandCurran,1990，CwwGe"e亡17，119)。可以在StanfordGenomeDatabase(SGD，http:Wdb.yeastgenome.org)中發現合適的"必需"基因。任何"必需"基因產品(如屍/0)/J、屍5S/、屍G^/或i^47基因之一的產品，和本申請中其它部分描述的其它產品)，當其缺失或失活時，不會產生營養缺陷(生物合成)需要，可以用作宿主細胞中質粒上的選擇性標記，當缺少所述質粒時，宿主細胞不能產生該基因產品，從而獲得增加的質粒穩定性而沒有需要在特定的選擇性條件下培養細胞的缺點。我們使用"營養缺陷(生物合成)需要，，，包括可以通過營養或對生長培養基進行其它添加或對改變來補足的缺陷。然而，不能表達功能性Pgklp或Fbalp的細胞可以通過向生長培養基中適當添加物質而得到補足，而且這樣的基因產品可以不是根據本發明的優選的"必需蛋白質"。因此，本發明的上下文中優選的"必需標記基因，，是那些基因，當其在宿主細胞中缺失或失活時導致不能通過對生長培養基進行任何添加或改變來補足的缺陷，其中這些添加或改變預期是例如能恢復宿主細胞表達"必需，，標記基因產品的能力的多核苷酸或者"必需，，標記基因本身的產品。因此，本發明提供的質粒，本發明的方法中使用的質粒或本發明的宿主細胞中包含的質粒可以包含，或者可以不包含一個以上選擇性標記。何必需的控制元件併入表達載體。這些標記包括用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶、G418或者新黴素抗性，和用於在大腸桿菌和其它細菌中培養的四環素、卡那黴素或者氨千青黴素(即p-內醯胺酶)抗性基因。或者，這些選擇特性的基因可在另一個載體上，該載體用於共轉化期望的宿主細胞。鑑定轉化成功的細胞的另一個方法涉及培養引入質粒得到的細胞，任選地以使重組多肽(即由質粒上的多核苷酸序列編碼且不是由宿主天然產生的多肽)表達。可富集和裂解細胞，並使用如Southern(1975)JMo/.歷o/.98,503或Berent等(1985)B/o/ec/z中描述的方法或者本領域中常用的DNA和RNA分析的其它方法，檢驗它們的DNA或RNA內容物(content)中是否存在重組序列。或者，可以使用抗體檢測轉化後細胞的培養物上清中是否存在多肽。除了直接測定重組DNA的存在之外，當重組DNA能夠指導蛋白質表達時，可以通過熟知的免疫方法來確定成功的轉化。例如，用表達載體成功轉化的細胞可以產生顯示適當抗原性的蛋白質。收穫懷疑被轉化的細胞樣品，並用適當的抗體檢驗蛋白質。因此，除了轉化後的宿主細胞本身，本發明還考慮到那些細胞的培養物，任選為營養培養基中的單克隆(同種細胞均一的(clonallyhomogeneous))培養物，或者是由單克隆培養物衍生的培養物。或者，轉化後的細胞可以，或者可以不，作為工業上/商業上或製藥上有用的產品，並可以使用而在不進行進一步純化或從培養基中純化，和任選地以適於它們預期的工業/商業或製藥用途的方式用載體或稀釋劑配製，和任選地以適合於這些用途的方式包裝和提供。例如，可將全細胞固定化；或者用於將細胞培養物直接噴到應用過程(process)、作物(crop)或其它期望的靶物上/中。類似地，可使用全細胞，如酵母細胞，作為膠嚢用於很多不同的應用，如香料、調味料和藥物。轉化後的宿主細胞可以，或者可以不，在本領域技術人員公知的適當的條件下培養足夠的時間，並考慮到本文公開的教導，以允許表達一個或多個重組分子伴侶和期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)。培養基可以是，或者可以不是非選擇性的，或者可以，或可以不，施加選擇壓力來維持質粒。如此產生的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以，或者可以不，存在於胞內，或者，如果分泌，則存在於培養基中和/或宿主細胞的周質空間。蛋^^回僅和應賴從培養的宿主細胞或者培養基中純化表達的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的步驟任選地包括細胞固定化、細胞分離和/或細胞破碎，但是總是包含至少一種不同於細胞固定化、分離和/或破碎步驟的其它純化步驟。細胞固定化技術，如用海藻酸4丐珠包被(encase)細胞，是本領域中熟知的。類似地，細胞分離技術，如離心、過濾(例如錯流過濾、膨脹床層析等)是本領域中熟知的。同樣地，細胞破碎方法，包括珠磨、聲處理、酶處理等是本領域中熟知的。至少一種其它純化步驟可以是本領域中已知的適於蛋白質純化的任何其它步驟。例如下述文獻中公開的用於回收重組表達的白蛋白的純化技術WO92/04367,去除源自基質的染料；EP464590，去除源自酵母的著色劑；EP319067,鹼沉澱和之後將白蛋白施用於親脂相；和WO96/37515、US5728553和WO00/44772，描述了完整的純化過程；上述所有文獻通過引用併入本文。可以通過已發現用於純化除白蛋白之外的蛋白質的任何技術從培養基中純化這些蛋白質。合適的方法包括^克酸銨或乙醇沉澱、酸或者溶劑萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、凝集素層析、濃縮、稀釋、pH調節、滲濾(diafiltration)、超濾、高效液相色譜("HPLC")、反相HPLC、電導率調節等。在一個實施方案中，可以，或者可以不，將上述技術中的任何一種或多種用於進一步將分離的蛋白質純化到商業或者工業上可以接受的純度水平。所謂商業或者工業上可以接受的純度，我們包括提供以下濃度的蛋白質至少0.01g丄、0.02g丄人0.03g丄人0.04g丄-，，0.05g丄"，0.06g丄-1，0.07g丄-1,0.08g丄人0.09g丄-,0.1g丄"，0.2g丄人0.3g.L人0.4g丄人0.5g丄人0.6g丄人0.7g丄—'，0.8g丄-1，0.9g.L-'，1g.L-1,2g丄-1，3g丄-1，4g丄-',5g丄人6g丄-1,7g丄"，8g丄懇1,9g丄",10g丄-',15g丄"，20g丄-',25g丄-',30g丄"，40g丄"，50g丄—'，60g丄人70g丄"，70g丄人90g.L",100g丄人150g丄"，200g丄"，250g丄"，300g丄-1350g丄人400g丄"，500g.L",600g丄"，700g丄-1，800g丄"，900g丄-1,1000g丄人或者更高。優選純化期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)以獲得藥學上可以接受的純度水平。如果蛋白質基本上無熱原，並可以以藥學上的有效量施用而不引起與蛋白活性無關的醫療作用，那麼蛋白質就具有藥學上可接受的純度水平。得到的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可以，或者可以不，用於其任何已知的應用，在白蛋白的情況下，所述應用包括對病人靜脈注射(i.v.)施用以治療嚴重的燒傷、休克和失血，補充培養基和在其它蛋白質的配製物中作為賦型劑。儘管通過本發明的方法獲得的在醫療上、診斷上、工業上、家庭中或者營養上有用的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)可能單獨提供或施用，但是優選將其作為配製物(如藥物配製物，特別是在醫療上和/或診斷上有用的蛋白質的情況中)，連同一種或者多種可接受的載體或稀釋劑一起提供。在與期望的蛋白質相容的意義上，載體或稀釋劑必須是"可接受的"，其中意欲將配製物施用於受體時，則對其受體是無害的。通常，載體或稀釋劑是無菌而且無熱原的水或鹽水(saline)。任選地，將以單位劑型(unitdosageform),如片劑、膠嚢、注射液等形式提供配製的蛋白質。在本發明的第六方面中提供了生產期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，如本發明較早方面所述的期望的蛋白質的方法，其包括提供包含第一重組基因和第二基因的宿主細胞，所述第一重組基因編碼包含Orm2p或其變體的序列的蛋白質，所述第二基因，任選為第二重組基因，其編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，任選地條件是第一和第二基因不都存在於宿主細胞中相同的2(im-家族質粒上；和在允許表達第一和第二基因的條件下，在培養基中培養宿主細胞。所述方法可以，或者可以不，另外包含從培養的宿主細胞或培養基中純化表達的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的步驟；和任選地，將純化的蛋白質凍幹；和任選地，用載體或稀釋劑配製純化的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)；和任選地，以單位劑型提供配製的蛋白質。在上面討論的方式中，宿主細胞可以，或者可以不，另外包含其它重組基因，所述其它重組基因編碼包含Orm2p的替代分子伴侶或其變體的序列的蛋白質。本發明的第六部分中的第一和第二基因中的任何一個或者兩者可以是，或者可以不是從質粒，任選從相同的質粒表達的重組基因，只要當兩個基因從相同的質粒表達時，所述質粒不是2pm-家族質粒。編碼包含Orm2p的替代分子伴侶或其變體的序列的蛋白質的其它重組基因也可以，或者可以不，從質粒表達，任選從與第一和第二重組基因中的一個或兩者相同的質粒表達。除了當第一和第二基因兩者都是從相同的質粒共表達的重組基因之外，其中一種可以，或者可以不，從2pm-家族質粒，如2pm質粒單獨表達。或者，本發明的第六方面中的第一和第二基因的一種或兩者可以，或者可以不，整合入宿主細胞的染色體中。編碼包含Orm2p的替代分子伴侶或其變體的序列的蛋白質的其它重組基因可以，或者可以不，整合入宿主細胞的染色體中，無論第一和第二基因是否從質粒表達或者是否整合到染色體上。本發明在第七方面中還提供如上面第六方面所述的宿主細胞，該宿主細胞包含第一重組基因和第二基因，所述第一重組基因編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質，所述第二基因，如重組基因，編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，任選地條件是第一和第二基因不存在於宿主細胞中相同的2家族質粒上。本發明還在第八方面提供了編碼蛋白質Orm2p或其變體的核S殳序列的用途，通過將所述核酸序列和宿主細胞內的基因共表達(但任選地不包括來自相同的2pm-家族質粒的這些基因的共表達)來增加宿主細胞(如上述宿主細胞)中所述由宿主中的基因，如重組基因編碼的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的生產。核酸序列和編碼期望的蛋白質的基因中的一種或兩者可以，或者可以不，從宿主細胞中的質粒表達，和任選從相同的質粒表達。在上述討論的方式中，宿主細胞可以，或者可以不，另外包括編碼Orm2p的替代分子伴侶或其變體的重組基因，其可以，或者可以不，位於宿主細胞中的質粒上，任選地位於與所述核酸序列和編碼期望的蛋白質的基因中的一種或者兩者相同的質粒上。合適的質粒包括2家族質粒，如2(im質粒，如上面所討i侖的。加異源蛋白質生產的用途在同樣的質粒上提供編碼異源蛋白質的重組基因和編碼Orm2p或其變體的基因，任選地條件是該質粒不是2pm-家族質粒。所述質粒還可以，或者可以不，在上述討論的方式中包含編碼Orm2p的替代分子伴侶或其變體的基因。因此，在第十方面中，本發明還提供質粒，任選地是表達質粒，其包含第一基因和第二基因，所述第一基因編碼蛋白質Orm2p或其變體或片段，所述第二基因編碼異源蛋白質，如上所討論的，任選地條件是該質粒不是2(im-家族質粒。所述質粒可以，或者可以不，另外包括編碼Orm2p的替代分子伴侶或其變體的第三基因。在優選實施方案中，第三基因編碼包含蛋白質二硫鍵異構酶的序列的蛋白質。我們還說明了，可將編碼包含"必需"蛋白質序列的蛋白質的含質粒基因(plasmid-bornegene)用於在宿主細胞中穩定地維持質粒，所述宿主細胞在缺少所述質粒的情況下不產生所述"必需"蛋白質。這具有確保微生物在選擇的培養條件下的遺傳穩定性的優勢，並由此改進個體培養物的重現性和可靠性，此外還可以進行長期的培養，而不會因為質粒丟失而降低產量。優選的"必需"蛋白質是分子伴侶，其可以或可以不^是供其它優勢，如作為選擇性標記起作用以提高質粒穩定性，其表達同時增加一個或多個期望的蛋白質，如宿主細胞中由重組基因編碼的異源蛋白質的表達。這一系統是有優勢的，因為它允許使用者將質粒需要攜帶的重組基因的數目最小化。例如，通常的現有技術的質粒攜帶使質粒在宿主細胞培養過程中穩定維持的標記基因(如上所述的那些標記基因)。除了實現期望效果所需的任何其它基因之外，這樣的標記基因也需要保留在質粒上。然而，質粒併入外源DNA序列的能力是有限的，因此將實現期望效果所需的序列插入的數目最小化是有利的。此外，一些標記基因(如營養缺陷型標記基因)需要培養過程在特定的條件下進行，以獲得標記基因的效果。這樣的特定條件對於細胞生長或者蛋白質生產可不是最優的，或者可需要使用低效的或者過度昂貴的生長系統。因此，可能使用編碼包含"必需"蛋白質序列的蛋白質的基因作為含質粒基因以增加質粒穩定性，其中質粒存在於細胞中，所述細胞在缺少該質粒的情況下，不能產生所述"必需"蛋白質。可理解的是，蛋白質是否"必需，，的問題將取決於所使用的系統；在一個宿主生物中不"必需"的蛋白質，當在相同的宿主中缺失、破壞、失活、修飾或影響一個或多個其它基因時，可能會成為"必需"的，從而用作"必需，，的含質粒基因，如上所述；同樣地，蛋白質是否"必需"可取決於確定的物理條件，如培養宿主細胞的pH、溫度和/或氧水平。優選地，"必需蛋白質，，是當它的編碼基因在宿主細胞中缺失或失活時，不會導致宿主細胞形成(develop)營養缺陷(生物合成)需要的蛋白質。使用"營養缺陷(生物合成)需要"，我們包括可以通過對生長培養基進行添加或改變，特別是對生長培養基的營養物組成進行添加或改變而補足的缺陷。因此，"必需蛋白質"可為營養缺陷型標記蛋白質，如果它的編碼基因在宿主細胞中失活，會導致營養缺陷型突變體的產生，即為了生長和存活，突變體生物需要正常(未突變的菌抹)所不需要的特定的附加營養物——優選的是，"必需蛋白質"不是營養缺陷型標記蛋白質。因此，在本發明的上下文中，編碼"必需蛋白質，，的"必需標記基因"是這樣的基因，當其在宿主細胞中缺失或失活時會導致通過對生長培養基的進行添加或改變，通常是營養物添加或改變，無法補足的缺陷，除了其中這些添加或改變例如為多核苷酸，其能恢復宿主細胞表達"必需"標記基因的產品或"必需，，標記本身的產品的能力。換言之，可以，或者可以不優選，"必需蛋白質"不是事實上涉及宿主細胞的營養物的代謝轉化的蛋白質。這種系統的優點在於可將"必需標記基因"用作宿主細胞中質粒上的選擇標記，當所述宿主細胞缺少該質粒時，不能夠產生該基因產物，以獲得增加的質粒穩定性而無需要在特定的選擇性(如選擇性營養物)條件下培養細胞的缺點。因此，可以在不需適合於任何特定的標記基因的條件下培養宿主細胞，而不損失質粒穩定性。例如，可將用此系統產生的宿主細胞在非選擇性培養基，如複合或豐富培養基中並在非選擇性生長條件(如pH、溫度和/或氧水平)下培養，這可為比通常用來使營養缺陷和其它標記基因產生作用的基本培養基和/或特別適合的生長條件更經濟，和/或更有支持力的(moresupportive)生長培養基/條件。例如，細胞可以具有，或者可以不具有編碼缺失或以其它方式失活的"必需"蛋白質的基因的內源拷貝。特別優選的是，如果"必需蛋白質"是"必需，，分子伴侶，因為這可以提供雙重優勢，提高質粒穩定性而不需要選擇性生長條件，和在宿主細胞中增加期望的蛋白質，如內源編碼的或異源蛋白質的產量。如杲選擇使用"必需"分子伴估的過量表達來增加宿主細胞中蛋白質的產量，則此系統也具有將質粒需要攜帶的重組基因數目最小化的優點。用於本發明此方面中的優選的"必需蛋白質"包括由基因屍D//和屍S五/編碼的"必需"分子伴倡，當編碼這些蛋白質的內源基因在宿主細胞中缺失或失活時，不會導致宿主細胞形成營養缺陷(生物合成)需要。優選的"必需"分子伴侶是真核分子伴侶，特別優選的"必需"分子伴侶是酵母分子伴侶，包括含有蛋白質序列的分子伴侶，所述蛋白質由選自下組的基因編碼ccr2,ccr3,ccr《cc",cere,cc7，ccrs，ctvs7，五t07(在缺少二醯胺(diamide)的情況下)，//S屍M，屍D/7,Wi2，7wg五7，^fA57/,7VC^7,屍5E7，7YM9，i^M/S和7U屍/。要指出的是，突變失活五i(9/的宿主細胞可以通過在氧化劑二醯胺存在的情況下的生長來補足(Frand&Kaiser,1998，Mo/ec"/wCe〃，1，161-170)，但是二醯胺不是上述營養缺陷型突變討論的"營養物，，添加的類型。二醯胺不是生長培養基通常使用的成分，用包含五7(9/基因的質粒轉化後的￡7(97突變體可以在豐富培養基中生長而不損失質粒穩定性。因此，在第十一方面，本發明還提供了包含質粒(如本發明前面任意部分所述質粒)的宿主細胞，所述質粒包含編碼"必需"蛋白質，如分子伴侶的基因，其中，在缺少所述質粒的情況下，宿主細胞不能夠產生"必需"蛋白質。優選地，在缺少所述質粒時，宿主細胞不能生存。通常，已將宿主細胞進行遺傳修飾，以使其不能從染色體編碼的(或者其它內源的)基因產生"必需"蛋白質的功能拷貝。宿主細胞可以，或者可以不，另外包含編碼異源蛋白質，如本發明前面部分所述的那些異源蛋白質的重組基因。本發明還在第十二方面提供包含作為唯一的酵母選擇標記，任選地作為唯一的選擇標記的，編碼"必需，，蛋白質如"必需"分子伴侶的基因的質粒。質粒可以，或者可以不，另外包含編碼異源蛋白質的基因。質粒可以是，或者可以不是2iim-家族質粒。在第十三方面，本發明還提供產生期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括如下步驟提供包含質粒的宿主細胞，質粒包含編碼"必需，，蛋白質如分子伴侶的基因，其中，在缺少質粒的情況下，宿主細胞不能產生"必需，，蛋白質，而且其中的宿主細胞還包含編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的基因，如重組基因；在允許表達"必需"蛋白質和期望的蛋白質的條件下，在培養基中培養宿主細胞；和任選地，從培養的宿主細胞或培養基中純化表達的期望的蛋白質；和另外任選地，將純化的蛋白質凍幹。因此，本方法使用的宿主細胞可以是，或者可以不是根據本發明的第十一方面的宿主細胞和/或宿主細胞可以用，或者可以不用根據本發明的第十二方面的質粒轉化。方法可以，或者可以不，另外包括如下步驟用載體或稀釋劑配製純化的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的步驟，和任選地以單位劑型，用上述方式提供配製的蛋白質。在一個優選實施方案中，"在允許表達'必需，蛋白質和期望的蛋白質的條件下，在培養基中培養宿主細胞，，的步驟涉及在培養基中培養宿主細胞，所述培養基不特定地適於對質粒上的任何基因的存在有選擇性，除了對編碼"必需，，蛋白質的基因的存在有選擇性。因此，在一個實施方案中，培養宿主細胞的步驟可以，或者可以不，在非選擇性培養基，如複合或豐富培養基中和/或在不特定地適於選擇存在"必需，，蛋白質的條件(如pH、溫度和/或氧水平)下進行。如果培養基不特定地適於使產品，通常是營養物產物的宿主細胞喪失(deprive)的，可以將培養基描述為適於本情況目的的非選擇性培養基，通常提供所述營養物產物以使未進行修飾的宿主細胞的生長最大化，或者以其它方式允許其生長，以防止"必需，，蛋白質的表達。例如，就本發明而言如果，將在"測試培養基"中生長的第一宿主細胞類型中的質粒穩定性與在"測試培養基，，中生長的第二細胞類型中的質粒穩定性進行比較時，當在"測試培養基，，中每種細胞類型生長5、10、15、20、25或者30代時，培養基("測試培養基")可以是非選擇性培養基，其中一(1)第一宿主細胞類型是根據本發明第十一方面的宿主細胞；(2)第二宿主細胞類型是根據本發明第十一方面的宿主細胞，除了已將它修飾以恢復宿主細胞在缺少質粒的情況下產生"必需"蛋白質的能力(不是說第二宿主細胞類型不包括編碼"必需"蛋白質的質粒，而是指它可以產生"必需，，蛋白質，即使當質粒不存在時)；在第二細胞類型中觀察到的質粒穩定性為在第一細胞類型中觀察到的質粒穩定性的少於99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%或者更少。因此，在這個實施方案中，儘管在非選擇性條件下生長，優選本發明的第十三方面的方法產生宿主細胞，其在5、10、15、20、25或者30代之後顯示基本上100%的質粒穩定性。本發明的第十四方面還提供了編碼"必需，，蛋白質(如上所述)的多核苷酸通過如下方法提高宿主細胞中質粒的穩定性的用途特別是在非選擇性條件下，將多核苷酸整合入質粒中以產生修飾的質粒，其中宿主細胞不能在缺少修飾的質粒的條件下產生"必需"蛋白質。穩定性的增加可以，或者可以不，在非選擇性條件下生長至少5代時，比經修飾以產生"必需"蛋白質的相同宿主細胞中未修飾的質粒的穩定性水平高至少1%(即1.01倍)、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%(即2倍)、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、IO倍或更高。在本發明第十四方面的一個實施方案中，質粒可以，或者可以不，另外包含基因，其編碼其它期望的異源蛋白質，如前面本發明較早方面所述的異源蛋白質。在那種情況下，所述用途可以，或者可以不，改進期望的異源蛋白質的產量，如當包含質粒的宿主細胞在非選4奪性條件下生長時。在一個優選實施方案中，"必需，，蛋白質是分子伴侶，而且可以，或者可以不，用於同時增加宿主細胞中質粒的穩定性，並提高宿主細胞生產期望的蛋白質產物的能力。期望的蛋白質產物可以是，或者可以不是內源編碼的蛋白質，或者可以是，或可以不是如本發明較早方面所述的異源蛋白質。當蛋白質產品是異源蛋白質時，它可以，或者可以不，由已整合入宿主細胞染色體的重組基因編碼，或由宿主細胞中存在於質粒上的基因編碼，所述質粒如修飾的質粒，其包含編碼如上所述的"必需"蛋白質的多核芬酸。我們還發現根據本發明的其它實施方案，可以通過修飾控制分子伴侶表達水平的啟動子來調節重組-提供的分子伴侶的作用。我們意外地發現，在某些情況下，較短的啟動子導致期望的蛋白質表達增加。不受理論的限制，我們認為這是因為在已經以高水平表達期望的蛋白質的宿主細胞中表達重組分子伴侶可以使細胞自身超負荷承載(overload)期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，從而使期望的蛋白質產量的總體增加很小或者沒有總體增加。在那些情況下，提供帶有截短的啟動子的重組分子伴侶基因可以是，或者可以不是有益的。因此，在本發明的第十五方面中，提供了包含啟動子序列的多核苷酸(如上所述的質粒)，所述啟動子與編碼分子伴侶(如上所述的那些分子伴侶)的編碼序列可操作連接，用於通過在宿主細胞中表達多核苷酸序列來增加宿主細胞(如上所述的宿主細胞)中期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，如上所述的那些蛋白質的表達，其中啟動子的特徵在於它能得到改變的分子伴侶表達水平，如比編碼序列與其天然存在的啟動子可操作連接時所得到的分子伴侶表達水平更高或更低的分子伴侶表達水平。本發明還在第十六方面提供產生期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括如下步驟提供包含重組基因的宿主細胞，所述重組基因包含與編碼分子伴侶的編碼序列可操作連接的啟動子序列，所述啟動子的特徵在於它能得到比編碼序列與其天然存在的啟動子可搡作連接時所得到的分子伴侶表達水平更低的分子伴侶表達水平，而且宿主細胞還包含編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的基因，如重組基因；在允許表達分子伴侶和期望的蛋白質的條件下培養宿主細胞；和任選地從培養的宿主細胞或培養基中純化表達的期望的蛋白質；和另外任選地將純化的蛋白質凍幹；和任選地用載體或稀釋劑進一步配製純化的期望的蛋白質；和任選地以單位劑型，以上述所討論的方式提供配製的蛋白質。從本申請的實施例中明顯看出，重組表達的PDI和基於轉鐵蛋白的蛋白質的組合提供了令人驚訝的轉鐵蛋白表達的高水平。例如，包括染色體編碼的重組PDI基因的系統中轉鐵蛋白的表達提供了2倍的增長(與其中沒有染色體編碼的重組PDI基因的對照相比)。這種增長比包含編碼人白蛋白的重組基因代替重組轉鐵蛋白基因的等效系統高5倍。宿主可以是任何細胞類型，如原核細胞(例如細菌細胞，如大腸桿菌)或者真核細胞。優選的真核細胞包括真菌細胞，如酵母細胞，和哺乳動物細胞。上面討論了代表性的酵母細胞。代表性的哺乳動物細胞包括人細胞。可以培養如上所述的宿主細胞以產生基於轉鐵蛋白的重組蛋白質。可將產生的基於轉鐵蛋白的蛋白質從培養物中分離並純化，任選地純化到製藥上可以接受的純度水平，例如用本領域已知的和/或如上面所列出的技術。純化的基於轉鐵蛋白的蛋白質可以，或者可以不，用製藥上可以接受的載體或稀釋劑進行配製，並可以，或者可以不，以單位劑型提供。現在將參考下述非限制性實施例和附圖舉例說明本發明。附圖簡述圖l顯示通常的2ixm質粒的圖語。圖2顯示具有屍￡)/7過表達的增加的重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌的火箭免疫電泳(RIE)測定結果。將冷凍保存的酵母儲備物(Cryopreservedyeaststock)在10mLBMMD搖瓶培養物中培育4天，每孔加載5|iL上清。每次火箭免疫電泳凝膠(50mL)使用40|iL山羊多克隆抗轉鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。A=對照菌抹[pSAC35],兩隻重複搖瓶(duplicateflasks);B=對照菌抹[pDB2536],兩隻重複搖瓶；C=對照菌抹[pDB2711],從純的(neat)到40倍水稀釋物；D-對照菌抹[pDB2931]，兩隻重複搖瓶；E-對照菌株[pDB2929]，從純的到40倍水稀釋物。圖3顯示具有和不具有屍D/i過量表達的重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌的RIE分析結果。將冷凍保存的酵母儲備物在10mL的BMMD搖瓶培養物中培育4天，每孔加載5iiL上清。重複的加載物由來自每個菌抹的兩份獨立的培養物中的上清組成。每次火箭免疫電泳凝膠(50mL)使用40山羊多克隆抗轉鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。A=對照菌抹[pSAC3習；B=對照菌抹[pDB2536];C=對照菌抹[pDB2711];D=對照菌抹[pDB2931];E-對照菌抹[pDB2929]。圖4顯示具有和不具有屍D/過量表達的重組轉鐵蛋白分泌的SDS-PAGE分析結果。將BMMD搖瓶培養物培育4天，用GelCodeBlue試劑(Pierce)在非還原性SDS-PAGE(4-12%NuPAGE,MOPS緩沖液，InVitrogen)上分析10jiL上清。1=SeeBluePlus2標記(InVitrogen)。2=pDB2536;3=pDB2536;4=pDB2711;5=pDB2711;6=pDB2931;7=pDB2931;8=pDB2929;9=pDB2929;10=pSAC35對照。圖5顯示從具有額外整合的屍D/7拷貝的釀酒酵母菌抹中重組轉鐵蛋白分泌的RIE分析。每孔加載5mL5天的BMMD搖瓶培養物上清。包含的菌抹1)pSAC35(陰性對照)；2)pDB2536(重組的非糖基化轉鐵蛋白(N413Q、N611Q))或者3)pDB2506(與質粒pDB2536相同，但是轉鐵蛋白ORF編碼在位置413和611沒有N—Q的突變的轉鐵蛋白，即重組糖基化轉鐵蛋白)。每孔包含源自單獨的轉化體的樣本。標準物是IOO、50、20、10、5和2mg丄"的人血漿全-轉4失蛋白(holo-transferrin)(Calbiochem)。圖6顯示來自搖瓶培養物中生長的菌抹A[pDB2536]和菌抹A[pDB2506]中重組轉鐵蛋白分泌的RIE分析。每孔5mL重複加載5天的BMMD或YEPD搖^f瓦培養物上清。圖7顯示從在搖瓶培養物中生長的菌抹A[pDB2536]和菌抹A[pDB2506]中分泌的重組轉鐵蛋白的SDS-PAGE分析。將培養物在BMMD中培育5天，並在以GelCode,BlueReagent(Pierce)染色的SDS-PAGE(4-12%NuPAGE,MOPSBuffer,InVitrogen)上分析30mL上清。l)菌抹A[pDB2536]轉化體1;2)菌抹A[pDB2536]轉化體2;3)菌抹A[pSAC35]對照；4)菌抹A[pDB2506]轉化體l;5)SeeBlue,Plus2蛋白質標準(只是近似的分子量)。圖8顯示從具有不同的屍￡)/7拷貝數的釀酒酵母菌抹中分泌的重組轉鐵蛋白的RIE。每孔加載5mL3天的BMMD搖瓶培養物上清。每次火箭免疫電泳凝膠(50mL)使用30mL山羊多克隆抗轉鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。(A)來自釀酒酵母對照菌抹[pDB2711]或[pDB2712]的上清；(B)來自菌株A[pDB2536]的上清；(C)來自對照菌抹[pDB2536]的上清。圖9顯示從具有不同的屍D/J拷貝數的釀酒酵母菌抹分泌的重組轉鐵蛋白的SDS-PAGE分析。在每條泳道加載30mL3天的BMMD搖瓶培養物上清後，在4-12%NuPAGE還原性凝膠上用MOPS緩衝液(InVitrogen)電泳；(泳道1)來自對照菌抹[pDB2536]的上清；(泳道2)來自菌抹A[pDB2536]的上清；(泳道3-6)來自對照菌抹[pDB2711]或[pDB2712]的上清；(泳道7)分子量標記(SeeBluePlus2，InVitrogen)。圖10顯示從具有和不具有額外的屍Z)//基因共表達的不同釀酒酵母菌抹中分泌的重組轉鐵蛋白的RIE。用酵母接種10mLYEPD搖瓶，並在3(TC培育4天。火箭免疫電泳凝膠的每孔加載5pL培養物上清。血漿Tf標準濃度以嗎/mL表示。20jiL山羊抗-Tf/50mL瓊脂糖(agragose)。Precipin用考馬斯藍(Coomassieblue)染色。圖11顯示當與具有不同長度的啟動子的屍Z)/7基因共表達時，不同的釀酒酵母菌抹中rHA表達的RIE分析。用酵母接種10mLYEPD搖瓶，並在30'C培育4天。火箭免疫電泳凝膠的每孔加載4pL培養物上清。rHA標準濃度以嗎/mL表示。400山羊抗-HA(Sigma產品A-l151在5mL水中重懸)/50mL瓊脂糖。Precipin用考馬斯藍染色。圖12顯示當與具有不同長度的啟動子的屍D/7基因共表達時，不同的釀酒酵母菌抹中rHA表達的RIE分析。用酵母接種10mLYEPD搖瓶，並在30°C培育4天。火箭免疫電泳凝膠的每孔加載4nL培養物上清。rHA標準濃度以ug/mL表示。400山羊抗-HA(Sigma產品A-l151在5mL水中重懸)/50mL瓊脂糖。Precipin用考馬斯藍染色。圖13顯示在具有和不具有共表達的重組PDI1的rHA融合蛋白的RIE分析。用以白蛋白融合表達質粒轉化的YBX7接種10mLBMMD搖瓶，並在30。C培育4天。火箭免疫電泳凝膠的每孔加載4nL培養物上清。rHA標準濃度以嗎/mL表示。200pL山羊抗-HA(Sigma產品A-l151在5mL水中重懸)/50mL瓊脂糖。Precipin用考馬斯藍染色。圖14顯示表達質粒上存在和不存在屍D//的重組白蛋白融合分泌的SDS-PAGE分析。用酵母接種10mLBMMD搖瓶，並在30。C、200rpm培育4天。用GelCodeBlue試劑(Pierce)在非還原性SDS-PAGE(4-12%NuPAGE,MESbuffer,InVitrogen)上分析30|aL上清。1=SeeBluePlus2標記(InVitrogen);2=l|igrHA;3=血管他丁(angiostatin)-rHA;4=血管他丁-rHA+屍D/7;5=內皮他丁-rHA;6=內皮他丁-rHA+屍Z)/7;7=DX-890-(GGS)4GG-rHA;8=DX-890-(GGS)4GG-rHA+戶i^7;9=DPI-14-(GGS)4GG-rHA;10=DPI-14-(GGS)4GG-rHA+澄/;11=Axokine(CNTF^5)-(GGS)4GG-rHA(Lambert等，2001，屍rac.A^/.爿c^/.5W.C/SA98,4652-4657);12=Axokine(CNTFAxl5)-(GGS)4GG-rHA+。圖15顯示RIE分析，其顯示具有來自基於2nm質粒的(9/M2共表達的釀酒酵母中的轉鐵蛋白分泌增加。每孔加載54天的搖瓶培養物上清。標準物是25、20、15、10、5|ig/mL的人血漿全-轉鐵蛋白(Calbiochem),每孔加載5fiL。每次火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用20^山羊多克隆抗-轉鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。圖16顯示R正分析，其顯示具有來自基於2nm質粒的屍5^/共表達的釀酒酵母中的轉鐵蛋白分泌增加。每孔加載5inL4天的搖瓶培養物上清。標準物是25、20、15、10、5嗎/mL的人血漿全-轉鐵蛋白(Calbiochem),每孔加載5!iL。每次火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用20(il山羊多克隆抗-轉鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。圖17顯示RIE分析，其顯示具有來自基於2(im質粒的SSJ/共表達的釀酒酵母中的轉鐵蛋白分泌增加。每孔加載5(iL4天的搖瓶培養物上清。標準物是25、20、15、10、5嗎/mL的人血漿全-轉鐵蛋白(Calbiochem),每孔加載5^L。每次火箭免疫電泳凝膠(50ml)使用20|il山羊多克隆抗-轉鐵蛋白(人)抗血清(Calbiochem)。圖18顯示R1E的結果。用如下菌抹接種10mLYEPD搖瓶用從pDB3078分離的1.41kbA^/I/屍Wl;力7::n屍7破壞的DNA片段轉化為色氨酸原養型的DXY1印7z/[pDB2976〗、DXY1印7J[pDB2977]、DXY1印/z/[pDB2978]、DXY1[pDB2979]、DXY1^;M[pDB2980]或DXY1f^7zl[pDB2981]。將轉化體在30°C、200rpm培育4天。火箭免疫電泳凝膠的每孔加載4pL培養物上清。rHA標準物的濃度用昭/mL表示。700山羊抗-HA(Sigma產品A-1151重懸於5mL水中)/50mL瓊脂糖。Precipin用考馬斯藍染色。標明了選擇用於進一步分析的分離物(*)。圖19顯示RIE的結果。用如下菌株接種10mLYEPD搖瓶DXY1[pDB2244]、DXYl[pDB2976]、DXY1印M盧,.T諮[pDB2976]、DXY1[pDB2978]、DXY1^7J/^7,:77戶7[pDB2978]、DXY1[pDB2980]、DXY1印M—7:..，/[pDB2980]、DXY1[pDB2977]、DXY1印"—7.vr譜[pDB2977]、DXY1[pDB2979]DXY1印"—7:.T蹈[pDB2979]、DXY1[pDB2981]和DXY1pA7.:77屍7[pDB2981],並在30°C、200rpm培育4天。火箭免疫電泳凝膠的每孔加載4pL培養物上清。rHA標準物的濃度用嗎/mL表示。800山羊抗-HA(Sigma產品A-1151重懸於5mL水中)/50mL瓊脂糖。Precipin用考馬斯藍染色。標明了選擇用於進一步分析的分離物(*)。圖20顯示具有長啟動子的SKQ2n和S288c基因序列的序列比對，如實施例6中所描述。圖21到圖33顯示各種質粒圖譜。圖34顯示來自包含pDB3175到pDB3178的DXY1和DXY1z^p7/^〃::77屍7的YEPD搖瓶培養物上清的火箭免疫電泳。用如下菌林接種10mLYEPD搖弁瓦DXY1[pAYE316]、DXY1[pDB3175]、DXY1[pDB3176]、DXY1[pDB3177]、DXY1[pDB3178]、DXY1zl印7—7:.T蹈[pDB3175]、DXY1闢7盧,:77屍/[pDB3176]、DXY1~/[pDB3177]和DXY1/^7.,77^/[pDB3178]，在30°C、200rpm培育4天。50mL火箭免疫電泳凝膠每孔5—式三份(intriplicate)加載培養物上清。rHA標準物濃度為300、200、150、100和50ng/mL。每50mL瓊脂糖凝月交600(iL山羊抗-HSA(Sigma產品A-1151重懸於5mL水中)。沉澱素(Precipitin)用考馬斯藍染色。圖35顯示來自包含pDB3179到pDB3182的DXY1和DXY1」^7;^,7.v77屍7的YEPD搖瓶培養物上清的火箭免疫電泳。用如下菌抹接種10mLYEPD搖瓶DXY1[pDB2931]、DXY1[pDB3179]、DXY1[pDB3180]、DXY1[pDB3181]、DXY1[pDB3182]、DXY1」印/—7.:，/[pDB3179]、DXY1p^7::77i^[pDB3180]、DXY1A/t7/c/z7::77i^[pDB3181]和DXY1zl^p/;^7.v77屍7[pDB3182],在30°C、200rpm培育4天。50mL火箭免疫電泳凝膠每孔5pL—式三份加載培養物上清。血漿轉鐵蛋白標準物濃度為100、50、20、10和5昭/mL。每50mL瓊脂糖凝膠使用40pL山羊多克隆抗人轉鐵蛋白抗血清(Calbiochem)。沉澱素用考馬斯藍染色。實施例已使用兩類表達盒(expressioncassette)來舉例說明重組人轉鐵蛋白突變體(N413Q、N611Q)從釀酒酵母的分泌。一種類型使用修飾的HSA(前)/MFal(原)前導序列(稱為"修飾的融合前導物"序列)。第二類表達盒只使用修飾的HSA(前)前導序列。"修飾的融合前導物"的24個胺基酸的序列是MKWVFIVSILFLFSSAYSRSLDKR。修飾的HSA(前)前導序列的18個胺基酸的序列是MKWVFIVSILFLFSSAYS。已經使用具有和不具有釀酒酵母PDI基因的附加拷貝的2)Lim表達載體在釀酒酵母中研究了使用這兩種盒的轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)表達。實施例1構建表達質粒如WO2005/061718的實施例1中所述，構建質粒pDB2515,pDB2529,pDB2536，pDB2688，pDB2690,pDB2711,pDB2921,pDB2928，pDB2929，pDB2930，pDB2931,pDB2932和pDB26卯，該文獻的內容通過引用併入本文。實施例2表達轉鐵蛋白用所有的轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)表達質粒轉化釀酒酵母對照菌抹以成為亮氨酸原養型，並製備凍存的儲備物。將菌株在以200rpm搖動的50mL錐形瓶中的10mLBMMD培養物中、在3(TC培育4天。通過火箭免疫電泳(RIE如Weeke,B.，1976,"Rocketimmunoelectrophoresis，，/"N.H.Azelsen,J.Kroll，和B.Weeke[eds.]，Amanualofquantitativeimmunoelectrophoresis.Methodsandapplications.Universitetsforlaget,Oslo,Norway中所述)、反相高效液相色譜(RP-HPLC)(表l)和用膠體考馬斯藍染色劑染色的非還原性SDS聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)來比較分泌到培養物上清中的重組轉鐵蛋白的效價(titres)。當釀酒酵母屍Z)//過量表達時，估計分泌的重組轉鐵蛋白的增加多於10倍。通過RP-HPLC分析(使用WO2005/061718實施例2中所述的方法，該文獻的內容通過引用併入本文)，確定對於修飾的融合前導序列，轉鐵蛋白分泌增加18倍，對於修飾的HSA-前前導序列，轉鐵蛋白分泌增加15倍(表1)。圖4顯示具有和不具有額外的屍0//表達的釀酒酵母菌抹分泌的重組轉鐵蛋白的SDS-PAGE比較。表1:tableseeoriginaldocumentpage86RIE分析表明，在存在額外的屍D/7拷貝的情況下，增加的轉鐵蛋白分泌為大約15倍(圖2)。通過RIE分析，對於修飾的HSA-前前導序列的增加量比對於修飾的融合前導序列的增加量看起來略高(圖3)。實施例3PDI的染色體過量表達選擇釀酒酵母菌抹A研究來自質粒pDB2506的重組糖基化轉鐵蛋白表達和來自質粒pDB2536的重組非糖基化轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)的分泌。菌抹A具有下述特徵額外的整合在染色體上的屍D//基因整合在宿主屍D//染色體的位置。.也將URA3基因和包含氨,青黴素抗性基因的細菌DNA序列在上述基因的插入位點整合入釀酒酵母基因組。對照菌林沒有上述任何一種插入。用pDB2506(重組轉鐵蛋白)、pDB2536(重組非糖基化轉鐵蛋白(N413Q、N611Q))或pSAC35(對照)轉化對照菌抹[ci,]和菌抹A[cirG]以成為亮氨酸原養型。在BMMD-瓊脂上選擇轉化體。通過火箭免疫電泳(RIE)對於每種菌林/質粒組合測定BMMD搖瓶培養物中轉鐵蛋白分泌的相對水平。圖5顯示兩抹菌都將糖基化和非糖基化的重組轉鐵蛋白分泌到培養物上清中。分別從菌抹A[pDB2506]和菌抹A[pDB2536]分泌的糖基化和非糖基化轉鐵蛋白的水平顯示高於從對照菌抹分泌的水平。因此，至少在搖瓶培養物中，在菌抹A的屍D/7基因座整合入宿主基因組的屍Z)L增強了轉鐵蛋白分泌。此外，在對照菌抹[pDB2536]和菌抹A[pDB2536]之間觀察到的轉鐵蛋白分泌的增加通過RIE顯示為至少100%的增加。相比之下，在對照菌抹[pDB2305]和菌抹A[pDB2305]之間rHA單體分泌的增加為大約20%(數據未顯示)。考慮到轉鐵蛋白有19個二硫鍵，因此，與17個二硫鍵的rHA相比，由於菌抹A中額外的屍Z)i7拷貝而引起的轉鐵蛋白分泌的增加大得令人吃驚。額外的PD"基因的拷貝可對於從釀酒酵母分泌來自轉鐵蛋白家族的蛋白質和它們的衍生物是特別有益的。通過RIE比較生長在BMMD和YEPD的轉化體從菌抹A[pDB2536]和菌抹A[pDB2506]分泌的鐵傳遞的水平(圖6)。結果表明，與BMMD(2-5mg丄"血清轉鐵蛋白當量)相比，通過在YEPD中生長得到的非糖基化的重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)和糖基化的重組轉鐵蛋白的效價(10-20mg丄"血清轉鐵蛋白當量)增加大於2倍。在YEPD中觀察到的糖基化和非糖基化轉鐵蛋白效價的增加，說明兩種轉鐵蛋白表達質粒在非選擇性生長條件下足夠穩定，以使期望的生物質(biomass)的增力口(通常由在YEPD中生長所致)得以轉化為糖基化和非糖基化轉鐵蛋白的生產率的增加。圖7顯示了從生長在BMMD搖瓶培養物中的菌株A[pDB2536]分泌的非糖基化轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)和從生長在BMMD搖瓶培養物中的菌抹A[pDB2506]分泌的糖基化轉鐵蛋白的SDS-PAGE分析。與菌抹A[pSAC35〗對照相比，菌抹A[pDB2536]樣品清晰地顯示一條額外的蛋白質條帶。這條額外的條帶遷移到從對照菌抹[pDB2536]分泌的重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)的預期位置。菌抹A[pDB2506]培養物上清顯示在轉鐵蛋白的預期位置包含一條擴散的蛋白質條帶。這說明分泌的重組轉鐵蛋白是不均一的，可能是因為Asp413和/或Asp611處的超-甘露糖基化(hyper-mannosylation)導致的。實施例4比較從包含pDB2711的釀酒酵母對照菌抹的轉鐵蛋白分泌和從釀酒酵母菌抹A的轉鐵蛋白分泌質粒pDB2711如上所述。還製備了具有與pDB2711相反的方向的A^/盒的質粒pDB2712(WO2005/061718的圖22)。用pDB2711和pDB2712轉化對照菌抹釀酒酵母[ci,]以成為亮氨酸原養型。在BMMD-瓊脂上選擇轉化體，並製備對照菌抹[pDB2711]的凍存的海藻糖儲備物。在BMMD和YEPD搖瓶培養物中比較了對照菌抹[pDB2711]、對照菌抹[pDB2712]、菌抹A[pDB2536]、對照菌抹[pDB2536]和可選的對照菌抹[pDB2536]的重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)的分泌。RIE顯示，與具有屍D/7的兩個染色體拷貝的菌抹A[pDB2536]和具有屍D/7基因的單個染色體拷貝的對照菌抹[pDB2536]相比，從具有多個游離的屍Z)/7拷貝的對照菌抹[pDB2711]得到的重組轉鐵蛋白分泌明顯增加(圖8)。對照菌抹[pDB2711]和對照菌林[pDB2712]似乎將相似水平的rTf(N413Q、N611Q)分泌到培養基中。在BMMD和YEPD培養基中，對照菌抹[pDB2711]和對照菌抹[pDB2712]轉化體之間分泌的水平相對一致，這說明即使在非選擇性條件下，質粒穩定性對於高水平轉鐵蛋白分泌也是足夠的。這與先前發表的有關重組PDGF-BB和HSA的數據形成對比，在先前發表的數據中顯示將屍Z)//引入多拷貝2pm質粒對宿主有害。表2:高細胞密度發酵的重組轉鐵蛋白效價tableseeoriginaldocumentpage88formulaseeoriginaldocumentpage89圖9顯示在BMMD搖瓶培養物中從對照菌抹[pDB2711]、對照菌抹[pDB2712]、菌抹A[pDB2536]、對照菌抹[pDB2536]和可選的對照菌抹[pDB2536]中分泌的轉鐵蛋白的還原性SDS-PAGE分析。來自對照菌抹[pDB2711]和對照菌抹[pDB2712]的所有樣品在轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)預期的位置顯示豐富的蛋白質條帶。來自不同菌抹的轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)條帶的相對染色強度顯示，菌抹A[pDB2536]比對照菌株[pDB2536]和可選的對照菌抹[pDB2536]產生更多的轉鐵蛋白，但是從對照菌抹[pDB2711]和對照菌抹[pDB2712]的分泌有更顯著的增長。觀察到的增加的重組轉鐵蛋白分泌伴隨著這些菌抹中增加的屍D/7拷貝數。這表明Pdilp水平在對照菌抹、菌抹A和可選擇的對照菌抹中限制轉鐵蛋白分泌，而增加的屍D//拷貝數是轉鐵蛋白分泌增加的原因。增加的屍Di7拷貝數會增加屍D/7的穩態表達水平，因此增加Pdilp活性的量。這可以通過使用很多替代方法，在不增加PDI1基因拷貝數的情況下實現，例如可以通過增加轉錄速率(transcriptionrate),如使用更高效的啟動子，或通過降低PDi7mRNA的清除速率(clearancerate)來增加穩態屍D/7mRNA水平。或者，可以使用蛋白質工程來增強Pdilp蛋白質的比活性或者轉換數(turnovernumber)。在高細胞密度發酵中，通過GP-HPLC分析和SDS-PAGE分析測得對照菌抹[pDB2711]重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)產量為大約3g丄"(表2)。此生產水平比對照菌抹、可選的對照菌抹或包含pDB2536的菌抹A高數倍。此外，對於生產用於人的治療用途的蛋白質，表達系統如對照菌抹[pDB2711]比使用菌抹A的那些系統有優勢，因為它們不包含細菌DNA序列。結論在包含整合入酵母基因組的屍D/7基因額外拷貝的釀酒酵母菌抹中研究了從多拷貝表達質粒(pDB2536)分泌重組轉鐵蛋白。也在用多拷貝表達質粒轉化的釀酒酵母中研究了轉鐵蛋白分泌，其中已將屍DJ7基因插入多拷貝游離的轉鐵蛋白表達質粒(pDB2711)中。與含有屍D/7單拷貝的菌抹相比，具有在內源的屍D/7基因座整合入基因組的額外的屍D/7基因拷貝的釀酒酵母菌抹以更高的水平分泌重組轉鐵蛋白和非糖基化重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)。通過使用pDB2711可實現屍DL/拷貝數的進一步增加。如通過SDS-PAGE和GP-HPLC分析測定的，在用pDB2711轉化的菌抹的高細胞密度發酵中，以大約3g丄"分泌重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)。因此，增加的基因拷貝數可使從釀酒酵母分泌的重組轉鐵蛋白的數量大幅增加。得出下述結論-1.在從pDB2536的重組轉鐵蛋白表達(非糖基化轉鐵蛋白(N413Q、N611Q))和pDB2506的重組轉鐵蛋白表達(糖基化轉鐵蛋白)的搖瓶分析中，釀酒酵母菌抹A將比對照菌抹更高水平的兩種重組轉鐵蛋白分泌到培養物上清中。這歸因於整合在屍2)/7基因座的屍Z)/7的額外拷貝。2.與菌抹A[pDB2536]相比，在多拷貝表達質粒上包含屍Z)i7基因的對照菌抹[pDB2711]在搖瓶培養和高細胞密度發酵中重組轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌都得到幾倍的增加。3.酵母如釀酒酵母中增加的屍D/7拷貝數在產生期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，如來自轉鐵蛋白家族的那些蛋白質的過程中有優勢。4.包含額外的屍D//基因拷貝的基於pSAC35的質粒有利於生產來自轉鐵蛋白家族的蛋白質，及它們的衍生物，如融合體、突變體、域和截短形式。實施例5將屍Di7基因插入2pm-樣質粒中可增加從各種不同釀酒酵母菌抹中重組轉鐵蛋白的分泌釀酒酵母菌才朱JRY188cir+(NationalCollectionofYeastCultures)和MT302/28Bcir+(Finnis等，1993，/肌oc&m.,212,201-210)通過半乳糖誘導FZP從Yep351-(24丄-屍丄屍7中過量表達，消除(cureof)天然的2pm質粒，如Rose和Broach所述(1990，MeA.五"2^mo/.，185,234-279),以分別產生釀酒酵母菌抹JRY188ci戶和MT302/28Bcir0。用pDB2931(WO2005/061718的圖14)和pDB2929(WO2005/061718的圖12)全部轉化釀酒酵母菌抹JRY188cir0,MT302/28Bcir0，S150-2Bcir0(Cashmore等，1986,Mol.Gen.Genet.,203,154-162)，CB11-63cir0(Zealey等,1988，Mol.Gen.Genet.，211，155-159)以成為亮氨酸原養型。在適當補充的缺少亮氨酸的基本培養基上選擇轉化體。將每個菌抹的轉化體接種到50mL搖瓶中的10mLYEPD中，在定軌搖床(orbitalshaker)上於30°C、200rpm培育4天。收穫培養物上清，通過火箭免疫電泳比較重組轉鐵蛋白效價(圖10)。結果表明當屍D/7存在於2(im質粒上時(pDB2929)，所有酵母菌抹上清中的轉鐵蛋白效價都高於其不存在於2Mm質粒上時(pDB293l)的情況。實施例6構建在同一2pm-樣質粒上包含各種屍D/7基因和各種異源蛋白質的表達盒的表達載體PCR擴增和將基因克隆進Ylplac211通過PCR擴增來自釀酒酵母S288c和釀酒酵母SKQ2n的屍D//基因，以產生具有包含啟動子序列的不同長度的5'非翻譯區的DNA片段。設計PCR引物以將PCR產物克隆入YIplac211的&0111和^^附111位點中(&612&Sugino，1988,(7e"e,74,527-534)。也將其它限制性內切酶位點併入PCR引物中以4足進隨後的克隆。表3描述了構建的質粒，表4給出了用於擴增基因的PCR引物序列。表3描述了在這些基於Ylplac211的質粒中屍D/7啟動子長度的差異。通過如下方法產生pDB2939(WO2005/061718的圖27):用寡核苦酸引物DS248和DS250(表5)從釀酒酵母S288c基因組DNA中PCR擴增屍￡>//基因，然後用五coRI和SflmHI消化PCR產物並將大約1.98-kb片段克隆入已用五coRI和BamHI切割的Ylplac211(Gietz&Sugino，1988,74,527-534)。pDB2939的DNA測序鑑定了DS248序列中缺少的'G，，其在表4中用粗體標記。用於屍Di7基因測序的寡核苷酸引物列於表5中，並由公布的S288c的屍Z)/基因序歹'J(染色體III上的PDI1/YCL043C從坐標(coordinate)50221到48653，加上上遊序列的1000個鹼基對和下遊序列的IOOO個鹼基對。http:〃www.yeastgenome.org/,Genebank登錄號NC001135)設計。表3:包含屍D//基因的基於Ylplac211的質粒tableseeoriginaldocumentpage91表4:用於PCR擴增釀酒酵母屍Z)i7基因的寡核苷酸引物引物序列DS248CTCTTTTTCCAATTTGCCACCGTGTAGCATTTTGTTGT-3'DS249TGTGTG-3'DS250AGCG-3'DS251ATGGACATACATATATATATATATATATATATATAT丁TTGT丁ACGCG-3'DS252CAAGCAGCATGTCTAATTGGTAATTTTAAAGCTGCC-3'DS267TGGACATACATATATATATATATATATATATATATATATTTTGTTACGCG-3，表5:用於釀酒酵母屍D/7基因DNA測序的寡核苷酸引物引物序列DS2535'-CCTCCCTGCTGCTCGCC-3'DS2545，-CTGTAAGAACATGGCTCC-3'DS2555'-CTCGATCGATTACGAGGG-3'DS2565'-AAGAAAGCCGATATCGC-3'DS2575，-CAACTCTCTGAAGAGGCG-3'DS2585'-CAACGCCACATCCGACG-3'DS2595'-GTAATTCTGATCACTTTGG-3，DS2605'-GCACTTATTATTACTACGTGG-3'DS2615，-GTTTTCCTTGATGAAGTCG-3'DS2625，-GTGACCACACCATGGGGC-3'DS2635，-GTTGCCGGCGTGTCTGCC-3，DS2645，-TTGAAATCATCGTCTGCG-3'DS2655'-CGGCAGTTCTAGGTCCC-3'DS2665，-CCACAGCCTCTTGTTGGG-3'MB/pUC引物(-40)5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'使用表3和表4中描述的PCR引物，並通過分別將大約l.卯-kb和1.85-kb的五coRI-5awHI片段克隆入Ylplac211,相似地構建質粒pDB2941(WO2005/061718圖28)和pDB2942(WO2005/061718圖29)。驗證pDB2941和pDB2942中屍Z)T7基因的DNA序列正確。從包含來自pMA3a:C7(US6,291，205)的基因的質粒DNAPCR擴增釀酒酵母SKQ2n屍D//基因序列，所述pMA3a:C7也稱作CloneC7(前文中的Crouzet&Tuite，1987;前文中的Farquhar等，1991)。使用寡核苷酸引物DS248和DS250(表3和表4)擴增SKQ2n屍Z)i7基因。用五coRI和萬awHI消化大約2.01-kbPCR產物並連接入已用五coRI和BawHI切割的Ylplac211(Gietz&Sugino,1988,G置，74,527-534)以產生質粒pDB2943(WO2005/061718的圖30)。SKQ2n屍DJ7序列的5'端類似於延長以包括五coRI、5WI、5VwBI、屍acl、屍化I、胡l和Sm"I位點的平端化的S/3el位點，3'端延長至類似於平端&"361位點的位點，其延伸以包括5"m"I、S"aBI和i"mHI位點。屍Z)//啟動子長度為約210bp。使用表5中給出的寡核苷酸引物確定屍D/7片段的完整DNA序列。這證實了存在釀酒酵母菌抹SKQ2n的PDI蛋白質的編碼序列(NCBI登錄號CAA38402)，但是在位置114有絲氨酸殘基(而不是如先前發表的精氨酸殘基)。類似地，以與pDB2939中的釀酒酵母S288c序列中相同的方式，pDB2943在DS248序列中也缺少"G"，其在表4中以粗體標記。使用表3和表4中描述的PCR引物，並通過分別將大約1.94-kb和1.87-kb的五coRJk^/"HI片段克隆入Ylplac211，相似地構建質粒pDB2963(WO2005/061718的圖31)和pDB2945(WO2005/061718的圖32)。在pDB2963和pDB2945中確認屍D/7基因的預期的DNA序列，其在胺基酸114的位置為絲氨酸密碼子。構建在T^P2之後的Zcml位點插入不同的屍DT7基因的基於pSAC35的rHA表達質粒構建基於pSAC35的質粒用於rHA與不同的戶D//基因的共表達(表6)。表6:用於rHA與不同的屍D/7基因共表達的基於pSAC35的質粒tableseeoriginaldocumentpage94pDB2978和pDB2980缺失用於rHA表達的Notl表達盒。這產生質粒pDB3081(WO2005/061718的圖47)、pDB3083(WO2005/061718的圖48)和pDB3084(WO2005/061718的圖49),如表8所述。表8:帶有不同屍D/7基因的基於pSAC35的質粒tableseeoriginaldocumentpage95將來自pDB2928(WO2005/061718的圖ll)的3256-bp麵片段克隆入pDB3081、pDB3083和pDB3084的iVod位點，使得從轉鐵蛋白基因的轉錄與LEU2同向。這產生了如表7所示的質粒pDB3085(WO2005/061718的圖50)、pDB3086(WO2005/061718的圖51)和pDB3087(WO2005/061718的圖52)。實施例7在2^im-樣質粒中插入並優化屍D/7基因增加了由各種不同的釀酒酵母菌抹分泌重組人血清白蛋白使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-l,規程2;(Ito等，1983,J^c/m'o/"153,163;Elble，1992,腺ec—腦,13,18)),用pDB2244(WO00/44772)、pDB2976(WO2005/061718的圖35)、pDB2978(WO2005/061718的圖37)或者pDB2980(WO2005/061718的圖39)轉化釀酒酵母菌抹JRY188cir0、MT302/28Bcir。、S150-2Bcir0、CB11-63cir。(均在前文描述)、AH22cir0(Mead等，1986,Mo/.Gew.205,417-421)和DS569cir0(Sleep等，l"l，所o/Tec/7"o/ogy，9,183_187)以成為亮氨酸原養型。在具有適當補充物的BMMD-瓊脂平板上選擇轉化體，然後點種(patchout)到具有適當補充物的BMMD-瓊脂平糹反上。將每個菌抹的轉化體接種到50mL搖瓶中的10mLYEPD中，在定軌搖床上於30。C、200rpm培育4天。收穫培養物上清，用火箭免疫電泳比較重組白蛋白效價(圖11和12)。結果表明，當屍D/7存在於2pm質粒上時，來自所有酵母菌抹的培養物上清中的白蛋白效價都高於屍Z)//基因不存在時的情況(pDB2244)。當質粒上缺少屍D//時培養物上清中的白蛋白效價取決於將哪個酵母菌抹選作表達宿主，然而，當具有長啟動子(210-bp)的屍Di7存在於2pm質粒(pDB2976)中時，觀察到在大多數實例中測試到表達的最大增長。通過縮短，例如缺失調控位點，來修飾PD/7啟動子具有控制該改進的作用。對於一抹酵母菌抹，已知為高產rHA的菌抹(DS569),優選較短的啟動子用於最佳的表達。實施例8基於2(im的質粒上的屍Di7增強重組白蛋白融合體的分泌研究了釀酒酵母SKQ2n屍Z)/7基因與長啟動子(210-bp)的共表達對於重組白蛋白融合體表達的影響。如WO2005/061718的實施例9所述產生下面表9中所述質粒，所述文獻的內容通過引用併入本文。表9:編碼白蛋白融合蛋白質的質粒的總結tableseeoriginaldocumentpage96使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-1，規程2;(Ito等，1983,/B。勿/。/"153，163;Elble，1992，腸&c/z一es，13，18))轉化與前面實施例中所用的相同的對照酵母菌抹以成為亮氨酸原養型。在BMMD-瓊脂平板上選擇轉化體，隨後點種到BMMD-瓊脂平板上。從10mLBMMD搖瓶培養物(24小時，30°C、200rpm)製備凍存的海藻糖儲備物。將每個菌抹的轉化體接種到50mL搖瓶中的10mLBMMD，並在定軌搖床上於30'C、200rpm培育4天。收穫培養物上清並通過火箭免疫電泳比專交重組白蛋白效價(圖13)。結果表明，當屍D/7存在於2iim質粒中時，來自所有酵母菌抹的培養物上清中的白蛋白效價都高於不存在時的情況。用SDS-PAGE分析進一步研究通過火箭免疫電泳檢測到的白蛋白融合體表達的增加。將表達各種白蛋白融合體的YBX7的BMMD搖瓶培養物在定軌搖床上於30°C、200rpm培育4天。通過SDS-PAGE分析培養物上清的樣品(圖14)。觀察到所研究的白蛋白融合體期望大小的蛋白質條帶的豐度(abundaijce)增力口。實施例9釀酒酵母ORM2和重組轉鐵蛋白在基於2pm質粒上的共表達選擇釀酒酵母對照菌抹和菌抹A(如實施例3所述)以研究轉鐵蛋白和(9AM2基因從基於2nm質粒共表達時對轉鐵蛋白分泌的影響。通過質粒pDB3090、pDB3092和pDB3093(其包含rTf(N413Q、N611Q)和(97tW2的表達盒)以及對照質粒pDB2931(其包含rTf(N413Q、N611Q)表達盒而無OAM2)將對照菌抹和菌抹A轉化為亮氨酸原養型。這些質粒的構建在WO2005/061718的實施例10中描述，該文獻的內容通過引用併入本文。在BMMD瓊脂上選擇轉化體，並點種到BMMD瓊脂上用於後續分析。為了研究OiM2共表達對轉鐵蛋白分泌的作用，用包含ORM2/轉鐵蛋白共表達質粒的菌抹接種10mL選擇性(BMMD)和非選擇性(YEPD)液體培養基。然後將搖瓶培養物在3(TC振蕩(200rpm)下培育4天。通過火箭凝膠免疫電泳(RIE)確定轉鐵蛋白分泌的相對水平(圖15)。在BMMD和YEPS培養基中，由對照菌抹[pDB3090]和對照菌株[pDB3092]分泌的轉鐵蛋白的水平均高於由對照菌株[pDB293l]分泌的水平。相似地，在BMMD和YEPS培養基中，由菌抹A[pDB3090]和菌抹A[pDB3093]分泌的轉鐵蛋白的水平均高於由菌抹A[pDB2931]分泌的水平。來自所有菌抹A轉化體的轉鐵蛋白分泌均高於同樣培養基中生長的對照菌抹轉化體。菌抹A在基因組上包含屍D/7的額外拷貝，其增強了轉鐵蛋白分泌。因此在菌抹A中，OiM2和戶D/7表達的增加對轉鐵蛋白分泌具有累積效應。實施例10釀酒酵母PSE1和重組轉鐵蛋白在基於2iim質粒上的共表達通過質粒pDB3097和pDB3098(其包含rTf(N413Q、N611Q)和屍S五7的表達盒)，以及對照質粒pDB2931(其包含rTf(N413Q、N611Q)的表達盒而無/^五7)將釀酒酵母對照菌抹轉化為亮氨酸原養型。WO2005/061718的實施例11中描述了這些質粒的構建，該文獻的內容通過引用併入本文。在BMMD瓊脂上選擇轉化體並點種到BMMD瓊脂上用於後續分析。為了研究表達對轉鐵蛋白分泌的作用，用包含屍5^//轉鐵蛋白共表達質粒的菌糹朱接種含有10mL選擇性(BMMD)液體培養基的搖瓶。然後將搖瓶培養物在3(TC振蕩(200rpm)下培育4天。通過火箭凝膠免疫電泳(RIE)確定轉鐵蛋白分泌的相對水平(圖16)。在BMMD培養基中，由對照菌抹[pDB3097]和對照菌抹[pDB3098]分泌的轉鐵蛋白的水平高於由對照菌抹[pDB2931]分泌的水平。因此，從基於2jim質粒表達屍5S7增強了釀酒酵母的轉鐵蛋白分泌。在pDB3097和pDB3098中以相對於T^屍2基因的任一方向轉錄的屍S五7基因改進了轉鐵蛋白分泌。實施例11釀酒酵母SSA1和重組轉鐵蛋白在基於2(im質粒上的共表達用質粒pDB3094和pDB3095(其包含rTf(N413Q、N611Q)和的表達盒)，以及對照質粒pDB2931(其包含rTf(N413Q、N611Q)的表達盒而無5S/i/)將釀酒酵母對照菌抹轉化為亮氨酸原養型。WO2005/061718的實施例12中描述了這些質粒的構建，該文獻的內容通過引用併入本文。在BMMD瓊脂上選擇轉化體並點種到BMMD瓊脂上用於後續分析。為了研究5^v4/表達對轉鐵蛋白分泌的作用，用包含S5W7/轉鐵蛋白共表達質粒的菌抹接種含有10mL選擇性(BMMD)液體培養基的搖瓶。然後將搖瓶培養物在30。C振蕩(200rpm)下培育4天。通過火箭凝膠免疫電泳(RIE)確定轉鐵蛋白分泌的相對水平(圖17)。在BMMD培養基中，由對照菌抹[pDB3095]分泌的轉鐵蛋白的水平高於由對照菌抹[pDB2931]和對照菌抹[pDB3094]分泌的水平。因此，從基於2)im質粒表達增強了釀酒酵母的轉鐵蛋白分泌。在pDB3094中以相對於基因相反方向轉錄的SS/(7基因改進了轉鐵蛋白分泌。實施例12屍D//基因的破壞結合基於2pm質粒上的PDI1基因，增強了重組白蛋白的分泌和質粒穩定性設計表11中列出的單鏈寡核苦酸DNA引物以擴增酵母屍D/7編碼區上遊的區域和酵母屍D/7編碼區下遊的另一個區域。表ll:寡核芬酸引物引物描述序列DS2995'屍D/7引物，38個鹼基5'-CGTAGCGGCCGCCTGAAAGGGGTTGACCGTCCGTCGGC-3'DS3005'屍D/7引物，40個鹼基5,-CGTAAAGCTTCGCCGCCCGACAGGGTAACATATTATCAC-3'DS3013'屍D/7引物，38個;威基5，-CGTAAAGCTTGACCACGTAGTAATAATAAGTGCATGGC-3'DS3023'屍D/7引物，41個鹼基5'-CGTACTGCAGATTGGATAGTGATTAGAGTGTATAGTCCCGG-3'DS30318個鹼基5，-GGAGCGACAAACCTTTCG-3'DS30420個鹼基5，-ACCGTAATAAAAGATGGCTG-3，DS30524個鹼基5，-CATCTTGTGTGTGAGTATGGTCGG-3'DS30614個鹼基5，陽CCCAGGATAATTTTCAGG-3'使用源自S288c基因組DNA作為模板，DNA引物DS299和DS300通過PCR擴增屍D/7的5，區，而引物DS301和DS302擴增i^D/7的3，區。PCR條件如下1^LS288c模板DNA(0.01ng/^L、0.1ng/^L、1ng/jiL、10ng/^L和100ng/|JL)、5jiL10xBuffer(FastStartTaq+Mg,(Roche))、1|iL10mMdNTP，s、5每種引物(2^M)、0.4pLFastStartTaq,用水加至50pL。使用Perkin-ElmerThermalCycler9700進行PCR。條件為95°C變性4分鐘[HOLD],然後[CYCLE]95。C變性30秒，45。C退火30秒，72。C延伸45秒的20個循環，然後[HOLD]72°C10分鐘，之後[H0LD]4。C。用iVort和州'"dIII切割0.22kbp的屍D/75，PCR產物，而用///"dill和屍WI切割0.34kbp的屍Z)//3'PCR產物。用歷'"dlII將質粒pMCS5(Hoheisel,1994，所0/ec/2m々w&s17，456-460)(WO2005/061718的圖85)消化至完全，用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，並再連接以產生pDB2964(WO2005/061718的圖86)。用州'ndni消化質粒pDB2964,用小牛小腸磷酸酶處理，並與用和///"dill消化的0.22kbp的屍D/75，PCR產物和用歷"dIII和屍M消化的0.34kbp和反向的通用引物和DNA測序引物DS303、DS304、DS305和DS306(表11)測定其序列。用引物DS234和DS235(表12)從Ylplac204(Gietz&Sugino,1988，G認，74,527-534)擴增修飾的7T屍7標記基因，其在PCR產物的任意一端併入M'"dm限制位點。PCR條件如下1模板Ylplac204(0.01ngL、0.1ng/pL、1ng/pL、10ng/^L和100ng/|iL)、5jiL10xBuffer(FastStartTaq+Mg,(Roche))、1nL10mMdNTP，s、5pL每種引物(2pM)、0.4pLFastStartTaq,用水加至50j^L。使用Perkin-ElmerThermalCycler9600進行PCR。條件為95。C變性4分鐘[HOLD]，然後[CYCLE]95。C變性30秒，45。C退火45秒，72。C延伸90秒的20個循環，然後[HOLD]72。CIO分鐘，之後[HOLD]4。C。用///"dill消化0.86kbp的PCR產物，並克隆進pMCS5的///"dill位點以產生pDB2778(WO2005/061718的圖88)。限制酶消化和用通用的正向與反向引物以及DS236、DS237、DS238和DS239(表12)測序確認修飾的7T^P/基因的序列是正確的。表12:寡核普酸引物tableseeoriginaldocumentpage100通過用///"dill消化從pDB2778分離0.86kbp的7T^P/基因，並克隆進pDB3069的///"dill位點以產生pDB3078(WO2005/061718的圖89)和pDB3079(WO2005/061718的圖90)。通過用A^I/屍"I消化，/人pDB3078或pDB3079分離1.41kb的p&7::27屍/破壞的DNA片段。併入ri/^缺失的酵母菌抹Op7zl)以這樣的方式構建，使得一旦生成^pLd,基因組中就不應保留與7T戶7標記基因(pDB2778)的同源性，以防止將來包含77屍/的構建體和7T戶7基因座之間的同源重組。為了實現從選4奪的宿主菌抹的基因組中完全去除天然的7T/V序列，設計寡核苷酸以擴增存在於整合載體Ylplac204(Gietz&Sugino,1988，Ge"e,74,527-534)上的7TP/標記基因之外的77戶/基因的5'UTR和3'UTR。Ylplac204的7T屍7標記基因與天然/染色體的77屍/基因不同之處在於通過定點誘變將內部的///^1111、iVI和位點去除(Gietz&Sugino，1988，Ge"e，74,527-534)。從1.453kbp平端化的基因組片段五coRI片段構建Ylplac204修飾的7T屍7標記基因，所述五coRl片段包含7T戶7基因和7T屍7啟動子的僅僅102bp(Gietz&Sugino,1988,74,527-534)。儘管這是相對短的啟動子序列，但是顯然足夠補足^p7營養缺陷型突變(Gietz&Sugino,1988,74，527-534)。只使用距離7T屍7ORF起始位置5'方向102bp處的五coRI位點上遊的DNA序列產生5，77戶7UTR。3，UTR的選擇是較不重要的，只要它在功能性修飾的7TP7標記3'端之外，將其選擇在翻譯終止密碼子下遊的85bp。設計並構建單鏈寡核苷酸DNA引物以擴增77屍/基因的5，UTR和3，UTR區，使得在PCR擴增過程中可在後面克隆步驟要使用的PCR產物的末端增加限制酶位點。使用S288c基因組DNA作為模板，引物DS230和DS231(表12)通過PCR擴增77屍/的5，區，而引物DS232和DS233(表12)擴增77屍/的3'區。PCR條件如下:1(iL模板S288c基因組DNA(0.01ng/pL、0.1ng/pL、1ng/pL、10ng/jiiL和100ng/|iL)，5pL10xBuffer(FastStartTaq+Mg，(Roche))、110mMdNTP，s、5|iL每種引物(2^M)、0.4(iLFastStartTaq，用水加至50jiL。使用Perkin-ElmerThermalCycler9600進行PCR。條件為95°C變性4分鐘[HOLD]，然後[CYCLE]95。C變性30秒，45。C退火45秒，72。C延伸90秒的20個循環，然後[HOLD]72°C10分鐘，之後[HOLD]4°C。用五coRI和///"dill切割0.19kbp的7TP/5，UTRPCR產物，而用SflmHI和歷打dIII切割0.2kbp的TTW3，UTRPCR產物，並連接入用BamHI/￡coRI線性化的pAYE505以產生質粒pDB2777(WO2005/061718的圖91)。WO95/33833中描述了pAYE505的構建。用正向和反向引物測定DNA序列，設計所述引物以從質粒骨架和克隆的插入物序列引發，通過測序確認了在兩種情況下克隆的77^P7基因的5，和3，UTR序列具有期望的DNA序列。質粒pDB2777包含T7i57破壞的片段，所述片段含有源自7T屍7的5，和3'UTR的序列的融合體。通過用五coRI的完全消化將此0.383kbp的7T屍7^^壞的片段從pDB2777切除。使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST1,規程2;(Ito等，1983,JBactenW.，153,163;Elble，1992,肌otec/z"/wM，13,18》，用白蛋白表達質粒pDB2244轉化酵母菌抹DXYl(Kerry-Williams等，1998，1feaW,14，161-169)以成為亮氨酸原養型，從而產生酵母菌抹DXY1[pDB2244]。WO00/44772中描述了白蛋白表達質粒pDB2244的構建。在BMMD-瓊脂平板上選捧轉化體，隨後點種到BMMD-瓊脂平板上。從10mLBMMD搖瓶培養物(24小時，30°C，200rpm)製備凍存的海藻糖儲備物。使用摻入如Toyn等，(200016，553-560)所述的反選擇性色氨酸類似物，5-氟鄰氨基苯曱酸(5-FAA)的營養瓊脂，用來自pDB2777的0.383kbp五coRI7T屍/破壞的DNA片段轉化DXY1[pDB2244]以成為色氨酸營養缺陷型(autotrophy)。挑取對5-FAA的毒性作用有抗性的菌落並在第二輪SFAA平板上劃線以確認它們真的對5-FAA有抗性，並篩除任何背景生長(backgroundgrowth)。然後將這些生長的菌落重新點種到BMMD和加色氨酸的BMMD，以鑑定哪些是色氨酸營養缺陷型。隨後選擇已顯示為色氨酸營養缺陷型的菌落，通過用YCplac22(Gietz&Sugino,1988,Ge"e，74，527-534)轉化來進一步分析，以確認哪個分離物是印7。使用跨越7T屍7基因座的PCR擴增來確認trp-表型是由於此區域中的缺失造成的。從確認為對於5-FAA有抗性且在不添加色氨酸的情況下不能在基本培養基上生長的分離物製備基因組DNA。用引物CED005和CED006(表12)如下進行基因組77屍/基因座PCR擴增1模板基因組DNA，510xBuffer(FastStartTaq+Mg,(Roche))，1|iL10mMdNTP，s,5|iL每種虧1物(2jiM)、0.4(iLFastStartTaq，用水加至50(aL。用Perkin-ElmerThermalCycler9600進行PCR。條件是94°C變性10分鐘[HOLD],然後[CYCLE]94。C變性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸120秒的40個循環，然後[HOLD]72°C10分鐘，然後[H0LD]4。C。野生型7T屍/基因座的PCR擴增得到大小為1.34kbp的PCR產物，而跨越缺失的77_P7區的擴增得到少0.50kbp的0.84kbpPCR產物。PCR分析將源自一抹DXY1的trp-菌抹(DXYl[pDB2244])鑑定為經歷了期望的缺失事件。如Sleep等，(1991,說o/rec/z"o/ogy,9，183-187)所述，將酵母菌抹DXY1^;/Zl[pDB2244]消除表達質粒pDB2244。使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-1,規程2;(Ito等，1983，>/Bflcteho/.,153，163;Elble,1992,跑ec—廳，13，18》，用pDB2244、pDB2976、pDB2977、pDB2978、pDB2979、pDB2980或pDB2981重新轉化DXY1cirD以成為亮氨酸原養型。在補充色氨酸的BMMD-瓊脂平板上選擇轉化體，並隨後點種到補充色氨酸的BMMD-瓊脂平板上。從補充色氨酸的10mLBMMD搖瓶培養物(24小時，30°C,200rpm)製備凍存的海藻糖儲備物。使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-1，規程2;(Ito等，1983，■/5她Wo/"153，163;Elble，1992,胸ec—腦,13,18))，用通過Md/屍WI消化從pDB3078分離的1.41kb;&7.v77P/破壞的DNA片段轉化酵母菌抹DXY1[pDB2976]、DXY1^//zl[pDB2977]、DXY1[pDB2978]、DXY1[pDB2979]、DXY1[pDB2980]或DXY1^p/zl[pDB2981]以成為色氨酸原養型。在BMMD-瓊脂平板上選擇轉化體，並隨後點種到BMMD-瓊脂平板上。將每抹菌的6個轉化體接種到50mL搖瓶中的10mLYEPD,並在定軌搖床上於30。C、200rpm培育4天。收穫培養物上清和細胞生物量。從色氨酸原養型和DXY1[pDB2244]製備基因組DNA(Lee,1992,所ofec/z"z々w",12，677)。用引物DS236和DS303(表11和12)通過如下PCR擴增基因組屍Z)//基因座1模板基因組DNA,5(aL10xBuffer(FastStartTaq+Mg，(Roche)),1(iL10mMdNTP，s,5|iL每種引物(2|iM)、0.4pLFastStartTaq,用水加至50^L。用Perkin-ElmerThermalCycler9700進4亍PCR。條件為94°C變性4分鐘[HOLD],然後[CYCLE]94。C變性30秒，50。C退火30秒，72。C延伸60秒的30個循環，然後[HOLD]72。CIO分鐘，然後[HOLD]4。C。野生型屍D/7基因座的PCR擴增未得到PCR產物，而跨越缺失的屍D/7區的擴增得到0.65kbp的PCR產物。PCR分析鑑定測試的所有36個可能的/^7.v77屍7菌抹都具有期望的.Ti屍7缺失。通過火箭免疫電泳比較重組白蛋白效價(圖18)。在每組中，DXYl化p7」[pDB2976]、DXY1印7」[pDB2978]、DXY1吵7」[pDB29闊、DXY1印/zl[pDB2977]和DXY1[pDB2979]的所有六個；^7::n屍/破壞抹具有非常200580048615.0說明書第93/98頁相似的rHA生產能力。只有DXY1^p/zl[pDB2981]的六個pA7,:77屍7破壞抹顯示rHA表達效價的變化。將圖18中所示的六個j^〃::77^/破壞抹塗布到YEPD瓊脂上以分離單菌落，然後重新點種到BMMD瓊脂上。將formulaseeoriginaldocumentpage104的三個單細胞的分離物接種到50mL搖瓶中的10mLYEPD中並在定軌搖床上於30。C、200rpm培養4天。收穫培養物上清，並通過火箭免疫電泳比較重組白蛋白效價(圖19)。將圖19中所示的13個野生型屍D/J和p^7.v77屍7破壞抹塗布到YEPD瓊脂上以分離單菌落。然後將每個菌抹的IOO個單細胞的菌落重新點樣到包含山羊抗HAS抗體的BMMD瓊脂或者YEPD瓊脂上以檢測重組白蛋白的表達(Sleep等，1991,歷0/rec/2"0/0gv，9，183-187)並對每個菌落的Leu+ZrHA+、Leu+/rHA-、LeuVrHA+或Leu-ZrHA-表型進行評分(表13)。表13:tableseeoriginaldocumentpage104這些數據說明當將屍D//基因用作無染色體編碼的PDI的宿主菌抹中質粒上的選擇標記時，甚至在非選擇性培養基如示例的豐富培養基中，質粒保留得到增加。實施例13構建基於pSAC35的表達載體pDB3175-pDB3182用於屍Z)/7與來自2UL-區中5V7aBI/Mrt-位點的重組人白蛋白或轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)的共表達將來自設計用於分泌重組人白蛋白的基於pSAC35的表達載體pAYE316(Sleep等，1991，歷otec/2"o/ow9,183-187)的MI表達盒克隆入大腸桿菌克隆載體pBST(+)(Sleep等，2001，reaW，18,403-421)的唯一的Mfl-位點，以產生質粒pQC262e。隨後用寡核芬酸LRE49(表14)通過定點誘變(Kunkel等，1987，MeAo^y五"z"w/.,154，367-382)，修飾pQC262e以在表達盒的」D//7終止子區Md位點緊鄰上遊導入唯一的」w718I-位點。表14:突變的寡核苷酸引物描述序列LRE49突變的45個;成基的AD/7/終止子區5，-GCTAGCGTCGACAAGCTTGCGGCGCGGTACCGTGTGGAAGAACG-3'這產生質粒pAYE560(圖21)。將具有長(210-bp)啟動子的釀酒酵母SKQ2n屍Z)/7基因/人pDB2952(WO2005/061719的圖46,該文獻的內容通過引用併入本文)分離到1.96-kbSmal片段上。在用爿w7181消化，用T4DNA聚合酶填充3，-凹入端，並用小牛小腸鹼性磷酸酶處理平端化的產物後，將pDB2952戶Z)//片4殳克隆入pAYE560的唯一的A/7718I-位點。這產生質粒pDB3171(圖22)，其具有以與rHA相同的方向轉錄的屍Di7基因，和pDB3172(圖23)，其具有屍Z)i7和基因的會聚轉錄(convergingtranscription)。通過將來自pDB3171的5.1kbrHA—屍Z)/7—iVort表達盒克隆入已用//o/I和小牛小腸鹼性磷酸酶消化的pSAC35以產生pDB3175和pDB3176(圖24和25)。通過類似地將來自pDB3172的~5.1kbrHA"X"屍Z)/7表達盒克隆入已用和小牛小腸鹼性磷酸酶消化的pSAC35以產生pDB3177和pDB3178(圖26和27)。為了構建表達盒用於重組未糖基化的人轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)與具有長(210-bp)啟動子的釀酒酵母SKQ2n屍D/7基因的共表達，將來自pDB3171的6.1-kb4/HI-5^I片段與來自pDB2928(WO2005/061718的圖11，該文獻的內容通過引用併入本文)的2.4-kb4/ni-5^/zI片段相連接，從而將rHA編碼和鄰近序列替換為用於轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)分泌的那些序列。這產生質粒pDB3n3(圖28)，其具有以與rTf(NW13Q、N611Q)相同的方向轉錄的屍D//基因，和pDB3174(圖29)，其具有PDI1和rTf(N413Q、N611Q)基因的會聚轉錄。通過將來自pDB3173的5.2kbrTf—屍D/7—Md表達盒克隆入已用和牛小腸鹼性磷酸酶消化的pSAC35以產生pDB3179和pDB3180(圖30和31)。通過將來自pDB3174的~5.2kbrTf—仨屍Di7表達盒克隆入已用Wort和牛小腸i威性磷酸酶消化的pSAC35以產生pDB3181和pDB3182(圖32和33)。實施例14在基於pSAC35的表達載體UL區域中的5VaBI/Mrt-位點的釀酒酵母屍D//作為釀酒酵母菌抹ZIYJ7J^f^;^7.':77屍/中的選擇標記使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST1,規程2;(Ito等，1983,/5ac/w/o/"153，163;Elble，1992，腺ec—固，13,18))，用基於pSAC35的質粒pAYE316、pDB3175、pDB3176、pDB3177、pDB3178、pDB2931、pDB3179、pDB3180、pDB3181和pDB3182轉化酵母菌4朱DXY1(Kerry-Williams等，1998，}^a^，14,161-169)和DXY1」^p7(參見WO2005/061718的實施例13,該文獻的內容通過引用併入本文)以成為亮氨酸原養型。在具有適當補充物的BMMD-瓊脂平板上選擇轉化體，並隨後點種到具有適當補充物的BMMD瓊脂平板上。使用修正的醋酸鋰方法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-1，規程2;(Ito等，1983,Ba"eWo/"153,163;Elble,1992,跑ec—腿，13，18》，用通過A^I/屍WI消化從pDB3078分離的1.41kb;^z7.'.'77屍/破壞的DNA片段轉化DXYl」印/[pDB3175]、DXYl7[pDB3176]、DXY1zl印7[pDB3177]、DXY1闢7[pDB3178]、DXY1Zl印/[pDB3179]、DXY1闢7[pDB3180〗、DXYlzl^/[pDB3181]和DXYlzl^/[pDB3182]以成為色氨酸原養型(參見WO2005/061718的實施例13)。在BMMD-瓊脂平板上選擇轉化體，並隨後點種到BMMD-瓊脂平板上。使用寡核芬酸引物CF247和DS236(表15)通過診斷PCR擴增大約810-bp的產物來證實用77《屍7標記破壞屍Z)1/基因。CF247結合在破壞位點上遊的屍D/7啟動子區，而DS236結合在7TP/基因中。表15:寡核苦酸測序引物引物描述序列CF247屍Di7啟動子區，20個;鹹基5'-GCGCGTTTTCATTAGTGCCC-3'tableseeoriginaldocumentpage107將DXY1zl^p7、包含pDB3175-pDB3182的DXY1zkr;7和推定的p&7::77P7破壞抹接種到50mL搖瓶中的10mLYEPD,在定軌搖床中於30°C、200rpm培育4天。從生物質製備基因組DNA(Lee,1992,祝o^c/zm々was,12,677)以隨後用作診斷PCR中的模板DNA。將0.5(iL模板基因組DNA，2.5(iL10xBuffer(FastStartTaq+Mg,(Roche)),0.5|iL10mMdNTP，s,2.5每種引物(2pM)，0.2FastStartTaq混合併加水至25pL。使用DyadDNAEnginePeltierthermalcycler(GRI)進行如下PCR:在95。C變性4分鐘，然後95°C30秒、55°C30秒和72°C1分鐘的25個循環，然後在72。C延伸10分鐘。只有從包含整合在；7&7基因座的77屍7基因的DNA中擴增了810-bp的PCR產物。成功地鑑定了包含pDB3175-pDB3182的DXYlZl^/;^7::77屍7。如所期望的，對照DXY1」^p7或者包含pDB3175-pDB3182的DXY1」^p7沒有產生PCR產物。比較包含pDB3175-pDB3182的DXY1和包含pDB3175-pDB3182的DXY1A/p/;^〃.v77屍7的質粒穩定性和在YEPD搖瓶培養物中重組人白蛋白或轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)的分泌。用上述菌抹接種10mL搖瓶並在30°C、200rpm生長4天。將樣品塗布到YEPD-瓊脂平板上並長成單菌落。將50個隨機選擇的菌落影印點種到BMMD和YEPD平板上並於3CTC培育。將在兩種培養基上都能生長的菌落百分比作為質粒穩定性的評分。表16和17中所示的結果說明所有質粒pDB3175-pDB3182在DXY1中的穩定性都小於100%,不管克隆在5VwBIM^1位點的屍Z)/7和rTf/rHA基因的相對方向如何。然而，在包含pDB3175-pDB3182的DXY1zl^^;^7.v77/^的所有情況中都測定出100%的質粒穩定性。因此，使用屍￡>/7作為基於pSAC35的載體的6VzaBI/A^I位點的唯一選擇性標記在豐富培養基中得到100%的質粒穩定性。表16:在UL區域中的S"aBIM^I位點包含重組白蛋白基因和釀酒酵母屍Z)//基因的基於pSAC35的載體在菌抹DXY1和DXY1Zl/r;7;^7.v77戶7中的質粒穩定性。用DXY1[pDB3175]、DXY1[pDB3176]、DXY1[pDB3177]、DXY1[pDB3178]、DXY1J印7—7:,mP7[pDB3175]、DXY1Zl吵7—7:.T譜[pDB3176]、DXY1」吵/—7::，/[pDB3177]和DXY1Zl印/;%/;7:,77屍7[pDB3178]接種10mLYEPD搖瓶，並於30。C、200rpm生長4天。將樣品塗布到YEPD-瓊脂平板上並生長成單菌落。將50個隨機選擇的菌落影印點種到BMMD和YEPD平板上並於30。C培育。將在兩種培養基上都能生長的菌落百分比作為質粒穩定性的評分。tableseeoriginaldocumentpage108*箭頭表示相對於LEU2基因的轉錄方向。表17:在UL區域中的5V7aBI/M/1位點包含重組轉鐵蛋白基因和釀酒酵母戶￡>/7基因的基於pSAC35的載體在菌抹DXY1和DXY1J/;t^;^7.:77P/中的質粒穩定性。用DXY1[pDB3179]、DXY1[pDB3180]、DXY1[pDB3181]、DXY1[pDB3182]、DXY1Zl印/mP/[pDB3179]、DXY1」印/—7:.T譜[pDB3賜]、DXY1zl吵7—7..T刑[pDB3181]和DXY1」印7/3^7::77屍/[pDB3182]接種10mLYEPD搖瓶，並於30°C、200rpm生長4天。將樣品塗布到YEPD-瓊脂平板上並生長成單菌落。將50個隨機選擇的菌落影印點種到BMMD和YEPD平板上並於3(TC培育。將在兩種培養基上都能生長的菌落百分比作為質粒穩定性的評分。tableseeoriginaldocumentpage108*箭頭表示相對於LEU2基因的轉錄方向。比較包含pDB3175-pDB3182的DXY1和包含pDB3175-pDB3182的DXY1Z^p7/^7:.Tii^的重組人白蛋白和轉鐵蛋白(N413Q、N611Q)的分泌。圖34顯示在用7TP7破壞基因組PD//基因將質粒穩定性提高到100%之後(表16)，對於插入&aBI位點的屍D/7，重組人白蛋白效價有所降低。然而，這一點完全通過基因組中破壞屍Z)/7之後基因穩定性的增加得到了補償，基因穩定性的增加可增加異源蛋白質分泌的可重複性和可靠性，從而產生在穩定的蛋白質生產，特別是在長時間培養，如間歇式(fillanddraw)發酵或連續培養發酵周期(campaign)中更有用的工業生物體。此外，當屍D/7位於pSAC35的之後的Xcml位點時(實施例12)，用7T屍7破壞基因組屍D//基因以增強質粒穩定性後rHA效價沒有明顯下降(表13)。這表明對於在表達rHA的基於2jmi質粒上的屍D/7來說，Zcml位點相比5V^BI位點是優選的(但不是必需的)。然而，可例如通過改變屍D//啟動子的長度(實施例7)來調節屍D//的表達，從而觀察到重組蛋白質分泌的增加。在上述實驗中使用的是長屍D/7啟動子，這不是緊密相關的rHA高產菌抹DS569中最佳rHA分泌的優選啟動子長度該菌抹中短啟動子導致了rHA分泌增加。在pSAC35的之後的XcmI位點的屍D//中包含長屍D//啟動子的DXY1[pDB2977]中破壞基因組屍Z)//的情況中(圖19)，分析包括了三個單獨分離物(不是圖34所示的一個分離物的三次重複)，並顯示rHA效價沒有降低。此外，破壞基因組戶Z)/7基因後，這些培養物清楚地顯示一致性(consistency)和可重複性增加。圖35中，在基於pSAC35的載體(其自身不是100%穩定的)上不含屍￡>//的DXY1[pDB2931]和包含質粒pDB3179-pDB3182、在5""aBI/A^1位點含有屍D/7的菌林之間觀察到重組轉鐵蛋白分泌有大的增加。在包含質粒pDB3179-pDB3182的DXY1^r;7;^7.v77i^中，質粒上的屍Z)//充當唯一的選擇性標記並導致遺傳穩定性的改善(參見表17)，其中觀察到100%的質粒穩定性而沒有減少重組轉鐵蛋白分泌。因此，通過將屍D7/置於轉鐵蛋白表達質粒上並破壞基因組中的屍/)//，總體作用是增強重組蛋白質的分泌，也可改善生產生物體的遺傳穩定性。權利要求1.生產期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括(a)提供包含第一重組基因、第二重組基因和第三基因的宿主細胞，所述第一重組基因編碼包含第一分子伴侶蛋白序列的蛋白質，所述第二重組基因編碼包含第二分子伴侶蛋白序列的蛋白質，所述第三基因，如第三重組基因，編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，其中第一和第二分子伴侶不同；和(b)在培養基中培養宿主細胞以獲得第一、第二和第三基因的表達。2.權利要求l的方法，其還包括從培養的宿主細胞或培養基純化表達的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的步驟。3.權利要求2的方法，其還包括將純化的蛋白質凍幹的步驟。4.權利要求2或3的方法，其還包括將純化的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)與栽體或稀釋劑進行配製和任選地以單位劑型提供配製的蛋白質的步驟。5.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第一或第二分子伴侶蛋白質中的一個或兩者具有真菌分子伴侶(任選為酵母分子伴侶)或哺乳動物分子伴倡(任選為人分子伴侶)的序列。6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第一或第二分子伴侶蛋白質中的一個或兩者分別獨立地包含由v4/^47、CC72、CCT3、(XT麼CCT3、(XT(5、CCT7、(XTS、C7V57、C屍/3、C屍i6、￡屍57、五/(9A五C/GAFMOh朋屍仏//5P肌Z/iS"屍l朋，、朋屍仏朋層、朋屍7S、//，2、J五MhMZXT/、MHZ2、M屍Dh雄D2、mT/、屍m、爿濃、」7P/A」7P72、5777、CZ)C37、C屍/7、T^C2、X/1/^、Zi/57、MA577、7V簡、五CM70、，7、5^2、S認、^S^、5SC7、鵬2、肌7、6*LS/、C/肌、(97M/、(9WM2、屍五7/、/TC7、屍SW、/WC7或截短的無內含子7WC7、77M9、/mm/s或rc屍/中的任何一個或它們中任何一種的變體或片段編碼的蛋白質的序列。7.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第一分子伴侶是蛋白質二硫鍵異構酶。8.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第二分子伴侶是Orm2p或其變體或片段。9.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第一或第二分子伴侶中至少一個，優選兩者，由染色體整合的重組基因編碼。10.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述第一或第二分子伴估中至少一個，優選兩者，由質粒上的基因編碼。11.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的第三基因整合入宿主細胞的染色體中，或在宿主細胞內的質粒上提供。12.根據權利要求10或11的方法，其中所述質粒是，或者不是，2|xm-家族質粒。13.根據權利要求12的方法，其中所述質粒包含基因，其編碼包含第一分子伴侶蛋白質的序列的蛋白質，和/或基因，其編碼包含第二分子伴4呂蛋白質的序列的蛋白質，和編碼期望的異源蛋白質的基因。14.根據權利要求12或13的方法，其中所述質粒是分解載體。15.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)包含可有效導致從宿主細胞如酵母中分泌的前導序列。16.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)是真核蛋白質或其片段或變體，任選為脊推動物或真菌(如酵母)蛋白質。17.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)是有商業上有用的蛋白質，如在治療上、診斷上、工業上、家庭中或在營養上有用的蛋白質。18.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)包含選自下組的序列白蛋白、單克隆抗體、依託泊苷、血清蛋白質(如凝血因子，例如因子vn、因子vm、因子ix、因子x和因子xm)、antistasin、蜱抗凝肽、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、內皮他丁、血管他丁、膠原、免疫球蛋白或基於免疫球蛋白的分子或二者之一的片段(如dAb,Fab，片段，F(ab，)2,scAb,scFv或scFv片段)、Kunitz域蛋白、幹擾素、白介素、ILIO、ILll、IL12、幹擾素a種類和亞種、幹擾素卩種類和亞種、幹擾素Y種類和亞種、瘦素、CNTF、CNTFAxl5(Axokine)、ILl-受體拮抗劑、紅細胞生成素(EPO)和EPO才莫擬物、血小板生成素(TPO)和TPO模擬物、prosaptide、cyanovirin-N、5-螺旋、T20肽、T1249肽、fflVgp41、HlVgpl20、尿激酶、尿激酶原、tPA、水蛭素、血小板衍生的生長因子、甲狀旁腺素、胰島素原、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、胰島素樣生長因子、降鈣素、生長激素、轉化生長因子(3、腫瘤壞死因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF、以活化前和活化形式存在的凝結因子，包括但不限於血纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白原、凝血酶、前凝血酶、凝血酶原、血管性血友病因子、ar抗胰蛋白酶、血纖維蛋白溶酶原活化劑、神經生長因子、LACI、血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、葡萄糖氧化酶、血清膽鹼酯酶、抑肽酶、澱粉樣前體蛋白、間-a胰蛋白酶抑制劑、抗凝血酶III、載脂蛋白類、蛋白質C、蛋白質S、代謝物、抗生素或者上述任一項的變體或片段。19.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)包含白蛋白或其變體或片段的序列。20.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)包含轉鐵蛋白家族成員，任選為轉鐵蛋白或乳鐵蛋白，或其變體或片段的序列。21.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述期望的蛋白質是期望的異源蛋白質，其包含融合蛋白，如白蛋白或轉鐵蛋白家族成員或二者之一的變體或片段直接或間接地與另一種蛋白質的序列融合的融合蛋白。22.—種質粒，其包含第一重組基因和第二重組基因，所述第一重組基因編碼包括第一分子伴侶蛋白質序列的蛋白質，所述第二重組基因編碼包括第二分子伴侶蛋白質序列的蛋白質。23.根據權利要求22的質粒，其中所述第一和第二分子伴侶中的至少一種，任選兩者，是權利要求5到8中任一項所限定的分子伴侶。24.根據權利要求22或23的質粒，其還包括第三重組基因，所述第三重組基因編碼期望的異源蛋白質，任選為如權利要求15-21中任一項所述的期望的異源蛋白質。25.根據權利要求22到24中任一項的質粒，其中所述質粒是如權利要求12到14中任一項所限定的質粒。26.宿主細胞，其包含第一重組基因、第二重組基因和第三基因，所述第一重組基因編碼包含第一分子伴侶蛋白質序列的蛋白質，所述第二重組基因編碼第二分子伴估蛋白質序列的蛋白質，所述第三基因，如第三重組基因，編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，其中所述第一和第二分子伴侶是不同的。27.根據權利要求26的宿主細胞，所述宿主細胞是如權利要求5到21中任一項所限定的宿主細胞。28.包含如權利要求22-25中任一項所限定的質粒的宿主細胞。29.根據權利要求1到21的任一項的方法，或者根據權利要求26到28的任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌或酵母宿主細胞。30.根據權利要求29的方法或宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母細胞，任選為以下菌屬的成員酵母屬、克魯維酵母屬、^"jra/fl、亞羅酵母屬、假絲酵母屬、裂殖酵母屬、德巴利酵母屬、Xfl"Aop/2;;//omycM、地黴屬、阿舒嚢黴屬、何德菌屬、許旺酵母屬、絲孢酵母屬、Xa"Ao//^//om;/c&s或畢赤酵母屬，如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、魯氏接合酵母、拜列氏接合酵母、發酵接合酵母、果蠅克魯維酵母、曱醇畢赤酵母、多形漢遜酵母(也稱為屍,c/z/aawgwWa)、爿ncw/aa<iem.m.voram\解月旨亞羅酵母、伯伊丁^i絲酵母、產朊假絲酵母或粟酒裂殖酵母。31.根據權利要求27或由權利要求10或11所限定的宿主細胞，其中所述質粒是2pm-家族質粒而且其中(a)所述質粒基於pSRl、pSB3或pSB4而宿主細胞是魯氏接合酵母；(b)所述質粒基於pSBl或pSB2而宿主細胞是拜列氏接合酵母；(c)所述質粒基於pSMl而宿主細胞是發酵接合酵母；(d)所述質粒基於pKDl而宿主細胞是果蠅克魯維酵母；(e)所述質粒基於pPMl而宿主細胞是膜醭畢赤酵母；或(f)所述質粒基於2pm質粒而宿主細胞是釀酒酵母或卡爾酵母；32.根據權利要求31的宿主細胞，其中所述質粒基於2nm質粒而宿主細胞是釀酒酵母或卡爾酵母。33.生產期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括(a)提供宿主細胞，其包含第一重組基因和第二基因，所述第一重組基因編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質，所述第二基因，如第二重組基因，編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，條件是所述第一和第二基因不存在於宿主細胞中同樣的2^m-家族質粒上；和(b)在培養基中培養宿主細胞以獲得所述第一和第二基因的表達。34.根據權利要求33的方法，其中所述第一和第二基因之一或兩者從質粒表達，任選從相同的質粒表達。35.根據權利要求33或34的方法，其中第一重組基因位於質粒上，所述第一重組基因編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質。36.根據權利要求33的方法，其中將所述第一和第二基因之一或兩者整合入宿主細胞的染色體。37.根據權利要求33或36的方法，其中將所述編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質的第一重組基因整合入宿主細胞的染色體。38.根據權利要求33到37中任一項的方法，其還包含從培養的宿主細胞或培養基中純化表達的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的步驟。39.根據權利要求38的方法，其還包含將純化的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)與載體或稀釋劑進行配製和任選地以單位劑型提供配製的蛋白質的步驟。40.宿主細胞，其包含第一重組基因和第二基因，所述第一重組基因編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質，所述第二基因，如第二重組基因，編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，條件是第一和第二重組基因不存在於宿主細胞內同樣的2pm-家族質粒上。41.編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質的重組基因用於增加期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)在宿主細胞中的表達的用途，條件是編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的重組基因和編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的基因不在宿主細胞中同樣的2nm-家族質粒上共表達。42.質粒，其包含第一重組基因和第二基因，所述第一重組基因編碼包含Orm2p或其變體或片段的序列的蛋白質，所述第二基因，如第二重組基因，編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，條件是所述質粒不是2pm-家族質粒。43.根據權利要求33到42中任一項的方法、用途、宿主細胞或質粒，其中所述期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)如權利要求15到21中任一項所限定。44.包含質粒的宿主細胞，所述質粒包含編碼必需分子伴侶的基因，其中在缺少質粒時，所述宿主細胞不能產生分子伴侶，所述質粒還包含重組基因，其編碼期望的異源蛋白質，如權利要求15到21中任一項所限定的期望的異源蛋白質。45.根據權利要求44的宿主細胞，其中所述必需分子伴侶是真核分子伴侶。46.根據權利要求44的宿主細胞，其中所述必需分子伴侶是酵母分子伴侶。47.根據權利要求44的宿主細胞，其中所述必需分子伴侶是酵母分子伴侶，其包含由選自下組的基因編碼的蛋白質的序列ccz2、ccr丄ccr麼(XT5、CCT6、CCT7、(XTS、C濃、￡磨、iZSP70、朋層、戶D/7、CZ)C37、/C4/2、MG五7、MAS"、iVOB八5^C7、屍5^/、7B/9、iMil^S和7U屍i或這些中任一種的變體或片段。48.根據權利要求44的宿主細胞，其中所述必需分子伴侶是蛋白質二好u鍵異構酶。49.根據權利要求44到48中任一項的宿主細胞，其中，在缺少所述質粒時，所述宿主細胞無法生存。50.根據權利要求49的宿主細胞，其中，在缺少所述質粒時，所述宿主細胞無法生存而且不能通過在培養基中培養宿主細胞和對培養基進行營養添加或改變而使細胞生存，並優選不能通過在培養基中培養宿主細胞和對所述培養基進行任何添加或改變而使細胞生存。51.質粒，其包含編碼對於酵母宿主細胞生存必需的分子伴侶的基因作為唯一的酵母可選擇標記，其意義是當編碼必需分子伴侶的基因在酵母宿主細胞中缺失或失活時，則宿主細胞在培養中無法生存而所述缺陷不能通過對培養基進行添加或改變而彌補。52.根據權利要求51的質粒，其中所述編碼必需分子伴侶的基因是由所述質粒編碼的唯一的可選擇標記。53.根據權利要求52的質粒，其中所述必需分子伴侶是真核分子伴侶。54.根據權利要求52的質粒，其中所述必需分子伴侶是酵母分子伴侶。55.根據權利要求52的質粒，其中所述必需分子伴侶是酵母分子伴侶，其包含由選自如下的基因編碼的蛋白質序列cct2、ccr丄ccr麼ccr5、CCM、CCT7、(XTS、CWW、￡/0/、//5P川、/^PM、屍D/ACDC37、D72、Mi7A7VOi7、SSC7、i^￡/、77M9、屍y!W75和7T屍7或這些中任一個的變體或片段。56.根據權利要求52的質粒，其中所述必需分子伴侶是蛋白質二硫鍵異構酶或Pselp。57.根據權利要求51到56中任一項的質粒，其還包含基因，所述基因編碼期望的異源蛋白質，如權利要求15到21中任一項所限定的期望的異源蛋白質。58.根據權利要求51到57中任一項的質粒，其為2jim-家族質粒。59.根據權利要求51到58中任一項的質粒，其為如權利要求22到25中任一項所限定的質粒。60.根據權利要求44到50中任一項的宿主細胞，其中所述質粒是^4居權利要求51到59中任一項的質粒。61.根據權利要求28的宿主細胞，其中由所述質粒編碼的分子伴侶是必需基因。62.根據權利要求60的宿主細胞，其中，在缺少質粒時，所述宿主細胞不產生分子伴侶。63.根據權利要求1的方法，其中所述宿主細胞是如權利要求61或62所述的宿主細胞。64.根據權利要求63的方法，其中權利要求1的步驟(b)包括在非選擇性培養基如豐富或複合培養基中培養宿主細胞。65.產生期望的重組蛋白質的方法，其包括步驟提供包含質粒的宿主細胞，所述質粒包含第一重組基因，其編碼對於宿主細胞生存必需的分子伴侶("必需分子伴侶")，其中，在缺少所述質粒時，宿主細胞不能產生必需分子伴倡，所述宿主細胞任選為如權利要求44到50或60到62中任一項所限定的宿主細胞，而且其中所述宿主細胞還包含編碼期望的蛋白質的基因；在允許表達必需分子伴侶和期望的蛋白質的條件下在培養基中培養宿主細胞；和任選地，從培養的宿主細胞或或培養基中分離表達的期望的蛋白質；和任選地，將分離的期望的蛋白質純化至商業上可接受的純度水平；還任選地，將純化的蛋白質凍幹或將純化的期望的蛋白質與載體或稀釋劑(如可藥用的載體或稀釋劑)進行配製；和任選地，以單位劑型提供配製的期望的蛋白質。66.權利要求65的方法，其中培養宿主細胞的步驟包括在非選擇性培養基如複合或豐富培養基中培養宿主細胞。67.產生期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括步驟(a)提供如權利要求44到50中任一項所限定的宿主細胞；和(b)在允許表達必需分子伴侶和期望的蛋白質的條件下在培養基中培養宿主細月包。68.權利要求67的方法，其中所述宿主細胞包含如權利要求51到59任一項所限定的質粒。69.權利要求67或68的方法，其中權利要求67的方法中步驟(b)通過在非選擇性培養基如豐富或複合培養基中培養宿主細胞來進行。70.包含編碼對於宿主細胞的生存必需的分子伴侶("必需分子伴侶")的序列的多核芬酸的用途，所述用途是通過將該多核苷酸整合入質粒以產生修^飾的質粒從而增加宿主細胞中質粒的穩定性，其中所述宿主細胞在缺少修飾的質粒時不能產生必需分子伴侶。71.根據權利要求70的用途，用於當在非選擇性條件下，如在豐富或複合培養基中培養所述宿主細胞時，增加宿主細胞中質粒的穩定性。72.根據權利要求70或71的用途，其中所述質粒是2Mm-家族質粒。73.根據權利要求70到72中任一項的用途，其中所述質粒還包括基因，其編碼期望的異源蛋白質，如權利要求15到21中任一項所限定的期望的異源蛋白質。74.根據權利要求70到73中任一項的用途，其中必需分子伴侶是真核分子伴侶。75.根據權利要求70到73中任一項的用途，其中必需分子伴侶是酵母分子伴侶。76.根據權利要求70到73中的任一項的用途，其中必需分子伴侶是酵母分子伴侶，其包含由選自下組的基因編碼的蛋白質序列CCT7、CCT3、CCn(XT5、(XT6、CCT7、(XTS、CAW、￡膽、朋，、朋葡、屍Z)/7、OX37、/""2、MG五7、M757/、iVOW、SSC7、屍5^/、7YMP、/MtWS和7T屍y或這些中任一個的變體或片段。77.根據權利要求70到73中任一項的用途，其中必需蛋白質是分子伴侶，如蛋白質二碌^泉異構酶或Pselp。78.根據權利要求70到77中任一項的用途，用於同時增加質粒在宿主細胞中的穩定性和增加宿主細胞產生蛋白質產品的能力。79.根據權利要求78的用途，其中所述蛋白質產品是內源編碼的蛋白質或異源蛋白質，如由權利要求15到21中任一項所限定的異源蛋白質。80.根據權利要求79的用途，其中所述蛋白質產品是由已整合入宿主細胞染色體中的重組基因編碼的異源蛋白質。81.根據權利要求79的用途，其中所述蛋白質產品是由存在於宿主細胞中質粒上的重組基因編碼的異源蛋白質。82.根據權利要求81的用途，其中所述包含編碼異源蛋白質的重組基因的質粒是與包含編碼必需分子伴侶的多核苷酸的修飾質粒相同的質粒。83.根據權利要求44到82中任一項的宿主細胞、質粒、方法或用途，其中所述宿主細胞是細菌或酵母宿主細胞。84.根據權利要求83的宿主細胞、質粒、方法或用途，其中所述宿主細胞是酵母細胞，任選為以下菌屬的成員酵母屬、克魯維酵母屬、」rxw/a、亞羅酵母屬、假絲酵母屬、裂殖酵母屬、德巴利酵母屬、Xa"//2o;^_y//o/^cas、地黴屬、阿舒囊黴屬、何德菌屬、許旺酵母屬、絲孢酵母屬、Jfa"Ao;/^//om_yc&y或畢赤酵母屬，如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、魯氏接合酵母、拜列氏接合酵母、發酵接合酵母、果蠅克魯維酵母、曱醇畢赤酵母、多形漢遜酵母(也稱作屍/c/z/"awgz^ta)、v4rxw/"at/ew'"/wrara、解脂亞羅酵母、博伊丁假絲酵母、產朊假絲酵母或粟酒裂殖酵母。85.根據權利要求84的宿主細胞、質粒、方法或用途，其中所述質粒是2pm-家族質粒和其中(a)所述質粒基於pSRl、pSB3或pSB4而所述宿主細胞是魯氏接合酵母；(b)所述質粒基於pSBl或pSB2而所述宿主細胞是拜列氏接合酵母；(c)所述質粒基於pSMl而所述宿主細胞是發酵接合酵母；(d)所述質粒基於pKDl而所述宿主細胞是果蠅克魯維酵母；(e)所述質粒基於pPMl而所述宿主細胞是膜醭畢赤酵母；或(f)所述質粒基於2(im質粒而所述宿主細胞是釀酒酵母或卡爾酵母。86.根據權利要求85的宿主細胞、質粒、方法或用途，其中所述質粒基於2pm質粒而所述宿主細胞是釀酒酵母或卡爾酵母。87.多核苦酸的用途，所述多核苦酸包含與編碼分子伴侶的編碼序列可操作連接的啟動子序列，通過在宿主細胞中表達所述多核苷酸序列來增加期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)在宿主細胞中的表達，其中所述啟動子的特徵在於使分子伴侶實現比編碼序列與其天然存在的啟動子可搡作連接時更低水平的表達，任選地，其中所述用途是如權利要求70到82中任一項所限定的用途。88.產生期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括步驟(a)提供包含重組基因的宿主細胞，所述重組基因包含與編碼分子伴侶的編碼序列可操作連接的啟動子序列，所述啟動子的特徵在於使分子伴侶實現比編碼序列與其天然存在的啟動子可操作連接時更低水平的表達，而所述宿主細胞還包含編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的基因，如重組基因；和(b)在允許表達分子伴侶和期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的條件下培養宿主細胞；任選地，其中所述方法可以是根據任何前述方法權利要求的方法。89.權利要求88的方法，其還包括將步驟(b)中產生的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)進行純化的步驟；並任選將純化的蛋白質凍幹。90.權利要求89的方法，其還包括將純化或凍幹的期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)與載體或稀釋劑進行配製的步驟。91.權利要求90所述的方法，其還包括以單位劑型提供配製的蛋白質的步驟。全文摘要本發明提供產生期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)的方法，其包括(a)提供包含第一重組基因、第二重組基因和第三基因的宿主細胞，所述第一重組基因編碼包含第一分子伴侶蛋白序列的蛋白質，所述第二重組基因編碼包含第二分子伴侶蛋白序列的蛋白質，所述第三基因，如第三重組基因，其編碼期望的蛋白質(如期望的異源蛋白質)，其中第一和第二分子伴侶不同；和(b)在培養基中培養宿主細胞以獲得第一、第二和第三基因的表達。文檔編號C12N15/81GK101128587SQ200580048615公開日2008年2月20日申請日期2005年12月23日優先權日2003年12月23日發明者克里斯多福·J·A·芬尼斯,吉利恩·沙特爾沃思,達雷爾·斯利普申請人:諾維信達爾塔有限公司