一種新型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法
2023-11-06 07:55:57 1
專利名稱：一種新型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法
技術領域：
本發明是關於一種新型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法，屬於生物藥物領域。
背景技術：
大豆蛋白是肉用動物飼料的主要成分之一，近年來，它在人類飲食中的作用也越 來越受到重視。然而，大豆蛋白(對人類而言)並不是一種理想的蛋白質來源，原因是除了 胺基酸組成方面的限制之外，抗營養因子也限制了大豆蛋白的應用。 大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)是一種多肽類或蛋白質。它對植物本身具有保護作 用，可防止大豆籽粒自身發生分解代謝，使種子處於休眠狀態，能調節大豆蛋白質的合成與 分解，並具有抗蟲作用，因而是大豆必需成分。然而其對人類胰蛋白酶的抑制作用而使其 成為大豆中主要抗營養因子，從而降低了大豆蛋白的營養價值。與大豆中的另一種主要抗 營養因子大豆凝血素不同，STI有很強的耐熱能力。大多數經過加熱的豆類食品仍然殘留 20%的胰蛋白酶抑制劑。為了提高大豆對人類營養與健康的價值，需要對大豆蛋白中那些 降低其營養價值的因子有更加深刻的認識。 目前，大豆胰蛋白酶抑制劑抗營養作用主要表現在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 活性、降低蛋白質消化吸收和造成胰腺腫大兩個方面。主要是胰蛋白酶抑制因子與小腸液 中胰蛋白酶、糜蛋白酶結合，生成無活性複合物，消耗和降解胰蛋白酶，導致腸道對蛋白質 消化、吸收及利用能力下降。同時，胰蛋白酶抑制劑與腸內胰蛋白酶結合後隨糞便排出體 外，使腸內胰蛋白酶數量減少。因胰蛋白酶中含有豐富含硫胺基酸，若出現這種內源補償性 分泌和排洩，必然會造成體內含硫胺基酸內源性散失，使原本缺乏含硫胺基酸大豆及豆制 品在食用後，機體內含硫胺基酸不僅得不到有效補充，且因食用大豆或豆製品而大量消耗 和散失，導致機體內含硫胺基酸耗散性缺乏，造成體內胺基酸代謝失調或不平衡。
從大豆中已分離出兩種類型蛋白抑制劑，即Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑 (BBI)和Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(KSTI)。 Bowman-Birk酶抑制劑(BBI)是一種絲氨酸 蛋白酶抑制劑，它有兩個具有不同特異性的功能性抑制域， 一個對Chymotrypsin類似物具 有抑制作用，另一個對Spetrypsin類似物具有抑制作用。它是由71個胺基酸組成的多肽， 分子量為7975，分子內有7個二硫鍵。Ktmitz型胰蛋白酶抑制劑屬典型絲氨酸蛋白酶抑制 劑，主要集中在大豆子葉中。它的分子量約2萬，分子內有2個二硫鍵。
近年來國外報導發現低濃度的BBI在動物體內對直腸癌、肝癌等多種癌症有抑 製作用，其中對直腸癌抑制率達100%、對肝癌抑制率為71%、對口腔上皮癌的抑制率為 86%、對肺癌的抑制率為48%。另有報導大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對於糖尿病治療、調節 胰島素失調有一定效果。大豆分離蛋白生產中普遍採用的鹼溶解酸沉澱的工藝。產生大量 的大豆乳清廢水。大豆乳清廢水中含有多種生理活性成分，如大豆乳清蛋白、胰蛋白酶抑制 劑、大豆低聚糖、異黃酮類化合物等。將此類生理活性物質回收，既可解決廢水汙染問題，又 可獲得一定的經濟效益。因此對具有強抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制劑從大豆乳清廢
3水中進行分離純化，使其成為抗癌、治療糖尿病的新藥用於臨床，對環境保護和治療癌病有 十分積極的意義。 大豆胰蛋白酶抑制劑的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由於大豆胰蛋 白酶抑制劑對熱、酸環境相對穩定。 一般採用水浸酸提、沉析再經離子交換或凝膠層析純化 製得，一般得率和純度都不高。本發明提供了一種新的分離純化大豆胰蛋白酶抑制劑的方 法。利用大豆胰蛋白酶抑制劑可抑制胰蛋白酶的專一性，將胰蛋白酶固定化，分離純化大豆 乳清蛋白獲得高純度的大豆胰蛋白酶抑制劑。
發明內容
本發明的目的之一是提供了一種新型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法。
本發明的目的之二是提供了以大豆胰蛋白酶抑制劑為藥用成分開發新型抗腫瘤 藥物提供了了資料。 本發明的技術解決方案如下 (1)大豆胰蛋白酶抑制劑的提取和初級分離 大豆乳清廢水用HC1溶液調pH，靜止，收集沉澱，離心乾燥，得到大豆乳清蛋白。大 豆乳清蛋白加水，用NaOH溶液調pH，水浴攪拌溶解反應，用無水硫酸銨調飽和度，水浴保溫 反應，離心除沉澱，重複一次。將沉澱先用蒸餾水透析，再用磷酸緩衝液透析去鹽。
透析溶液上離子交換柱，用的HC1洗脫，收集蛋白組分。合併洗脫液減壓濃縮至原 體積1/3，用NaOH溶液調pH，再上離子交換柱用磷酸緩衝液洗脫，收集蛋白組分。
(2)固定化胰蛋白酶製備 鹼性苯乙烯陰離子交換樹脂經酸、鹼、乙醇、去離子水洗活化後待用。取胰蛋白酶 溶於的磷酸緩衝液與處理過的樹脂混合，緩慢攪拌吸附，加戊二醇攪拌均勻，交聯，用的磷 酸緩衝液洗滌至液體無酶活性。
(3)胰蛋白酶抑制劑純化 合併有胰蛋白酶活性的洗脫液，減壓濃縮至原體積1/3。用HC1溶液調pH，上固定 化酶柱，HCl溶液洗脫，在280nm測蛋白質吸收值，至無蛋白吸收峰為止。再用含有NaCl、 CaCl2和異丙醇的HCl溶液洗脫，收集蛋白組分。將得到的洗脫液經濃縮、透析、真空乾燥， 得到白色粉末物質。 本發明利用固定化酶的專一性分離大豆胰蛋白酶抑制劑，該方法操作簡便、費用 低。該發明的技術關鍵在於胰蛋白酶的固定化並保持酶的高活力.使大豆胰蛋白酶抑制劑 與固定化胰蛋白酶充分結合，進而用混合溶劑洗脫下來，獲得了高純度的產品。得到的白色 粉末物質具有強抗癌活性且毒性小，它有望成為一種抗癌、治療糖尿病的新藥用於臨床，並 且對環境保護和治療癌症均有十分積極的意義。
權利要求
一種新型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法，其特徵在於包括以下步驟(1)大豆胰蛋白酶抑制劑的提取和初級分離大豆乳清廢水用HCl溶液調pH，靜止，收集沉澱，離心乾燥，得到大豆乳清蛋白。大豆乳清蛋白加水，用NaOH溶液調pH，水浴攪拌溶解反應，用無水硫酸銨調飽和度，水浴保溫反應，離心除沉澱，重複一次。將沉澱先用蒸餾水透析，再用磷酸緩衝液透析去鹽。透析溶液上離子交換柱，用的HCl洗脫，收集蛋白組分。合併洗脫液減壓濃縮至原體積1/3，用NaOH溶液調pH，再上離子交換柱用磷酸緩衝液洗脫，收集蛋白組分。(2)固定化胰蛋白酶製備鹼性苯乙烯陰離子交換樹脂經酸、鹼、乙醇、去離子水洗活化後待用。取胰蛋白酶溶於的磷酸緩衝液與處理過的樹脂混合，緩慢攪拌吸附，加戊二醇攪拌均勻，交聯，用的磷酸緩衝液洗滌至液體無酶活性。(3)胰蛋白酶抑制劑純化合併有胰蛋白酶活性的洗脫液，減壓濃縮至原體積1/3。用HCl溶液調pH，上固定化酶柱，HCl溶液洗脫，在280nm測蛋白質吸收值，至無蛋白吸收峰為止。再用含有NaCl、CaCl2和異丙醇的HCl溶液洗脫，收集蛋白組分。將得到的洗脫液經濃縮、透析、真空乾燥，得到白色粉末物質。
2. 根據權利要求(1)中所說的大豆蛋白酶抑制劑的提取和初級分離，其特徵在於大 豆乳清廢水用20% (v/v)HCl調pH3.0，靜止6 8h;大豆乳清蛋白按照(m : v = 1 : 5)加 入水，用lmol/L NaOH調pH至4.0，溫度55t:，攪拌反應時間為lh，無水硫酸銨調飽和度至 30-55%，溫度55。C，保溫10min ;蒸餾水透析時間20_24h，0. Olmol/L p朋.8的磷酸緩衝液 透析時間10-12h ;透析液用0. lmmol/LpH5. 0的HC1洗脫，然後0. lmol/L的NaOH調pH8. 0， 再上離子交換柱用0. lmol/L pH7. 8的磷酸緩衝液洗脫。
3. 根據權利要求(2)中所說的固定化胰蛋白酶製備，其特徵在於胰蛋白酶按照 (m : v=l : 100)與0. lmol/LpH6.8的磷酸緩衝液和處理過的樹脂混合，反應lh，然後加 20倍胰蛋白酶量，交聯3h ;0. lmol/LpH6. 8的磷酸緩衝液洗滌。
4. 根據權利要求(3)所說的胰蛋白酶抑制劑純化，其特徵在於用O. lmol/L的HCl 調pH5. 0，固定化酶柱(柱長60cm、直徑2. 5cm、裝柱長度30cm) ，0. lmmol/L HCl洗脫，流速 50 60mL/h ;然後用lmol/L NaCl、0. 01mol/LCaCl2和15%異丙醇的0. Olmol/L HCl，流速 50-60ml/h。
5. 根據權利要求(3)中所說得到的白色粉末物質，其特徵在於它為大豆胰蛋白酶抑制 劑，它有望成為一種抗癌、治療糖尿病的新藥。
全文摘要
本發明公開了一種新型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法。利用大豆胰蛋白酶抑制劑可抑制胰蛋白酶的專一性，將胰蛋白酶固定化，分離純化大豆乳清廢水中大豆乳清蛋白獲得高純度的大豆胰蛋白酶抑制劑。該方法操作簡便、費用低並獲得了高純度的產品。該大豆蛋白酶抑制劑具有強抗癌活性且毒性小，它有望成為一種抗癌、治療糖尿病的新藥用於臨床，並且對環境保護和治療癌症均有十分積極的意義。
文檔編號A61P35/00GK101759801SQ20081016297
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者吳菁, 陳群 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司;吳菁