新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的製作方法
2023-11-06 07:40:47 2
專利名稱：新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、編碼它們的基因、及其產品和應用。更具體地，本發明涉及以最優量生產PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情況下對自催化活性敏感的異源多肽。更具體地，本發明涉及融合蛋白，其包括異源多肽，例如融合於脂肪酶信號序列的絲氨酸蛋白酶，其可通過重組宿主細胞以期望量表達。本發明還涉及編碼此類融合蛋白的多核苷酸、涉及用於表達此類融合蛋白的表達載體、 涉及用此類多核苷酸/載體轉化的宿主細胞、以及涉及生成此類融合蛋白的方法。
背景技術：
胰蛋白酶是一種高價值的蛋白酶，其具有很多工業和生物醫學應用。持續增長的對具有特殊性能的非動物源的胰蛋白酶的需求已經促進關注在微生物中克隆和表達蛋白酶。由於與蛋白表達和自催化性能相關的困難，有關重組胰蛋白酶表達的報告在成功程度上有很大的差別。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)似乎是生產胰蛋白酶最具潛力的微生物宿主。
胰蛋白酶是 25kDa的絲氨酸蛋白酶，由胰腺的腺泡細胞以無活性的前體-胰蛋白酶原分泌。激活肽胺基酸DDDDK在成熟胰蛋白酶中出現在胰蛋白酶原前面，其由腸激酶在腸道中切割。激活的胰蛋白酶將在可及精氨酸(R)和賴氨酸(K)胺基酸殘基的羧基端切割蛋白。胰蛋白酶不僅消化包含可及R和K的任何蛋白，而且作用於其自身序列的可及R 和K並降解本身(自催化活性)。因此在微生物或哺乳動物系統中生產重組胰蛋白酶是一個非常大的挑戰。並且表達水平非常低。為克服該問題，本發明的發明人已將97個胺基酸的米根黴(Miizopus oryzae)脂肪酶信號序列融合至牛胰蛋白酶原並在巴斯德畢赤酵母中表達。脂酶原序列的存在穩定了胰蛋白酶原的表達並且似乎防止了體內的活化。
脂酶原作為脂肪酶的N端延伸物，與信號序列不同，信號序列是輸送蛋白進入或穿過細胞膜，或分泌進入細胞外基質所必要的。米根黴脂肪酶的69個胺基酸前肽區 (propeptide region)在26-胺基酸信號序列之後。現有研究顯示脂酶原區中的突變(C56 至 S)減緩脂肪酶的摺疊(Beer H. D.，Wohlfahrt G.，Schmid R. D.，McCarthy J. Ε. G.， Biochem. J. 319 :351-359,1996)。用來自於米根黴脂肪酶的脂酶原區替換天然的牛胰蛋白酶原的前區(前肽，propeptide)，驚人地促進了重組牛胰蛋白酶原的穩定性和產量。
現有的技術狀態未能提供一種可接受的令人滿意的/理想的生產方法，能在合適的宿主細胞中表達異源融合多肽的可純化形式。
因此廣泛認為需要一種沒有以上限制的方法，並且有這種方法是非常有利的。
本發明的改進的新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白克服了以上討論的和現有技術中的許多其他缺點和不足。發明內容
本發明的目的
本發明的主要目的是獲得融合多肽，該融合多肽包括融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶。
本發明的另一個主要目的是獲得一種表達融合多肽的方法。
本發明的又一個目的是獲得包括上述序列的載體。
本發明的再一個目的是獲得轉化細胞，該轉化細胞包括上述的可表達方式的序列。
本發明的陳述
因此，本發明涉及一種融合多肽，包括融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養酵母(methyloptropic yeast)中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID NO :1至少80%同源性的胺基酸序列；融合多肽包括融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID NO 2至少80%同源性的核苷酸序列；一種表達融合多肽的方法，包括由甲基營養酵母生產的融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有與 SEQ ID No 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO. 2表示的胺基酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；一種包括上述序列的載體；以及一種包括上述的可表達形式的序列的轉化細胞。
圖1 脂酶原的PCR擴增產物以及牛胰蛋白酶原編碼序列。
圖2 融合的PLBTR擴增的PCR產物。
圖3 通過使用^CbaI和BamHI限制酶切分析來篩選陽性克隆。
圖4 :A、分析從不同克隆獲得的脂酶原牛胰蛋白酶原。
B、使用胰蛋白酶原抗體的SDS PAGE和蛋白印記
C、SDS PAGE 示出活化的 PLBTR
通道1 蛋白分子量標記
通道2:PLBTR 克隆 #1
通道3 =PLBTR 克隆 #2
通道4 =PLBTR 克隆 #3
通道5 =PLBTR 克隆 #4
通道6 =PLBTR 克隆 #5
通道7 =PLBTR 克隆 #6
通道8:GS115 母株
圖5 :pMBL210載體細節
圖6 :CPLBTR/pMBL210克隆#3的限制性內切酶譜。
通道1 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 EcoRI+XhoI (5400bps+1030bps)
通道2 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 &icl (線性化、6426bps)
通道M 基因標尺1Kb DNA梯度。
通道3 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 Ndel+Kpnl (4781bps+1645bps)
通道4 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 XbaI (5104bps+806bps+516bps)
圖 7 :CPLBTR/pMBL210 載體細節。
圖8 =PCR確認基因整合入所有的博萊黴素(Zeocin)抗性克隆的基因組。
通道1-16 :9435Zeo25oo 抗性克隆。
通道17 9435宿主(陰性對照)。
通道18 陽性對照(CPLBTR/pMBL210 質粒)。
通道M :1Kb DNA 梯度。
通道19-22 :9452Zeo25oo 抗性克隆。
通道23 9452宿主(陰性對照)。
圖9 :A、從多個9450克隆獲得的脂酶原牛胰蛋白酶原的分析。
B、從多個9453克隆獲得的脂酶原牛胰蛋白酶原的分析。
C、使用胰蛋白酶原抗體的SDS PAGE和蛋白印記。
圖9A:通道M=蛋白分子量標記
通道1 = PLBTR 克隆 #1
通道2 = CPLBTR 9450 克隆 #1
通道3 = CPLBTR 9450 克隆 #2
通道4 = CPLBTR 9450 克隆 #3
通道5 = CPLBTR 9450 克隆 #4
通道6 = CPLBTR 9450 克隆 #5
通道7 = CPLBTR 9450 克隆 #6
通道8 = CPLBTR 9450 克隆 #7
通道9 = CPLBTR 9450 克隆 #8
圖9B:通道M=蛋白分子量標記
通道1 = PLBTR 克隆 #1
通道2 = CPLBTR 9453 克隆 #1
通道3 = CPLBTR 9453 克隆 #2
通道4 = CPLBTR 9453 克隆 #3
通道5 = CPLBTR 9453 克隆 #4
通道6 = CPLBTR 9453 克隆 #5
通道7 = CPLBTR 9453 克隆 #6
通道8 = CPLBTR 9453 克隆 #7
通道9 = CPLBTR 9453 克隆 #8
圖9C:通道M 蛋白分子量標記
通道1 標準胰蛋白酶
通道2 宿主對照
通道3 =PLBTR 克隆 #1
通道4 :CPLBTR 9450#1
通道5 CPLBTR 9453#6
圖10 =SDS PAGE上的上清液分析(所有樣本均負載15 μ 1)
圖11 發酵裝置運行的典型趨勢(T、pH、D0、WCW)
(Τ =溫度、DO =溶解的氧、WCW =細胞溼重)具體實施方式
本發明涉及一種融合多肽，包括融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID N0:1至少 80%同源性的胺基酸序列。
本發明涉及一種融合多肽，包括融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID N0:2至少 80%同源性的核苷酸序列。
在本發明的一個實施例中，SEQ ID 1或2的68和69號的胺基酸被胺基酸精氨酸和賴氨酸替換。
在本發明的另一個實施例中，68號胺基酸被酪氨酸替換。
在本發明的又一個實施例中，多肽使得胰島素前體形式或胰島素類似物或胰島素衍生物轉化為它們對應的活性型，提供至少50%的步驟產率(st印yield)。
在本發明的另一實施例中，甲基營養酵母屬於畢赤酵母屬(Pichia sp.)。
在本發明的另一實施例中，甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母。
本發明涉及一種表達融合多肽的方法，所述融合多肽包括產於甲基營養酵母的融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有與由SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO 2表示的胺基酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列。
在本發明的一個實施例中，絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶原。
在本發明的另一個實施例中，甲基營養酵母屬於畢赤酵母屬。
在本發明的又一個實施例中，甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母。
本發明涉及一種載體，包括上述的序列。
本發明涉及一種轉化的細胞，包括可表達形式的上述序列。
提供對應於新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白核酸序列的分離的核酸分子。此外，包含對應於多核苷酸的胺基酸序列。具體地，本發明提供分離的核酸分子，包括編碼以SEQ ID NO :1示出的胺基酸序列的核苷酸序列。還提供了脂酶原-牛胰蛋白酶原， 具有由本文中的核酸分子-SEQ ID NO :2編碼的胺基酸序列。
優選融合的胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶樣蛋白具有至少一種自然存在的胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶樣蛋白所具有的生物活性。
本發明也包括與序列表中列出的核苷酸和胺基酸序列基本上同源的變異核酸分子和多肽。此外，提供核苷酸和胺基酸序列的片段和基本上同源的片段。
本發明也提供載體和宿主細胞，用於重組表達本文的核酸分子，以及生產此類載體和宿主細胞的方法，並且使用它們通過重組技術生產本發明的多肽或肽。
參考附圖和所附的說明書可更好地理解本發明的原理和操作。
在詳細說明本發明的至少一個實施例之前，應當理解，本發明的應用並不限於以下說明的或實例示例性列出的細節。本發明可以有其他實施例或通過不同的方式實施或進行。並且，應當理解，本文採用的措辭和術語僅用於說明的目的而不應理解為限制。
現將詳細參考本發明的優選實施例，與以下實例一起，用於說明本發明的原理。
以下列出的實例是用於幫助理解本發明，但不旨在，並且不應解釋為，以任何方式限制本發明範圍。實例不包括用於載體的構造、編碼多肽的基因插入至此類載體或將得到的質粒引入至宿主的傳統方法的詳細說明。實例也不包括用於分析由此類宿主載體系統產生的多肽中使用的傳統方法的詳細說明。此類方法已為本技術領域人員公知並在大量出版物中進行說明，包括以實例的方式。
標準技術已用於各種重組DNA技術、轉化(例如，電穿孔、脂質轉染)和試驗。根據本領域中公知的傳統方法和本說明書中引用和討論的各種一般和專用參考，常規進行重組技術禾口重組實驗。見例如 Sambrook 等人的 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y(2001)),其通過引證結合於此。
在本發明的說明書和權利要求中，下面術語將依據本文的定義使用。
除非本文另有定義，本發明相關使用的科學和技術術語應具有本領域技術人員公知的含義。此外，除上下文另有要求，單數術語應包括複數並且複數術語應包括單數。本發明的方法和技術通常根據本領域公知的傳統方法進行。通常，與本文描述的分子和細胞生物學、生物化學、蛋白和核酸化學和雜交技術相關的命名是公知的且在本領域中通用的。本發明的方法和技術通常根據本領域公知的傳統方法進行。
如本文中使用的，術語「方法」指的是用於完成給定任務的方式、方法、技術和程序，包括但不限於化學、藥理學、生物學、生物化學和醫學從業人員公知的方式、方法、技術和程序或由已知的方式、方法、技術和程序易於得到的方式、方法、技術和程序。
如本文中使用的，術語「載體」指的是能輸送與其連接的另一個核酸的核酸分子。 術語「表達載體」包括能夠合成目標蛋白的質粒、粘粒或噬菌體，此類蛋白由它們各自的載體攜帶的重組基因編碼。優選載體是那些能自我複製和表達它們所連接的核酸的載體。在本說明書中，「質粒」和「載體」可交換使用，因為質粒是最常用的載體形式。此外，本發明旨在包括此類其他方式的表達載體，其提供等同的功能且在本領域中隨後是已知的。
本文使用的術語「重組」用於描述一種蛋白或多肽，是指通過重組多核苷酸表達生產的多肽。本文提到細胞時使用的術語「重組」是指能用作或已被用作重組載體或其他轉化DNA的受體，並且包括已轉染的原始細胞的後代。應當理解，單個親本細胞的後代由於意外或故意的突變可能在形態或基因上不完全相同或與原始親本不完全DNA互補。與親本足夠相似的親本細胞的後代具有相關特徵，例如出現編碼期望的多肽的核苷酸序列，也被視為後代。
「感興趣基因」(GOI)是期望轉錄表達增加的核酸序列。GOI可編碼功能性核酸分子(例如，RNA，如反義RNA分子)或，更典型地，編碼期望產量增加的肽、多肽或蛋白。本發明的載體可用作表達「異源」蛋白。如本文使用的，術語「異源」是意核酸序列或多肽，其來源於外來品種，如果來源於同種，其一般是經過從原始形態修飾的。此外，細胞中非正常表達的修飾的或未修飾的核酸序列或多肽被認為是異源的。本發明的載體可具有一種或多種G0I，在相同或不同的插入位點插入，其中每個GOI可操作地連接於調整的核酸序列，其允許GOI的表達。
脂酶原作為脂肪酶的N端延伸，與信號序列不同，它是輸送蛋白進入或穿過細胞膜或分泌到細胞外基質中所必需的米根黴脂肪酶的69胺基酸前肽區位於26-胺基酸信號序列之後。現有研究已示出脂酶原區中的突變(C56至S)減緩脂肪酶的摺疊(Beer H. D.，Wohlfahrt G.，Schmid R, D.，McCarthy J. Ε. G.，Biochem J. 319 :351-359,1996)。用來自於米根黴脂肪酶脂酶原區替代天然的牛胰蛋白酶原的前區(proregion)，驚人地提高了重組牛胰蛋白酶原的穩定性和產量。
如本文討論的「可操作元件」包括至少一個啟動子、至少一個操作子、至少一個前導序列、至少一個Siine-Dalgamo序列、至少一種終止密碼子、和需要或優選用於載體DNA 的適當轉錄和隨後翻譯的任何其他DNA序列。尤其是，考慮此類載體可包含至少一個宿主微生物識別的複製起點，以及至少一個可選標記，和至少一個能啟動DNA序列轉錄的啟動子序列。此外，在一個實施例中，優選載體包含能發揮調控子作用的某些DNA序列、以及能為調控子蛋白編碼的其他DNA序列。在一個實施例中，此類調控子用於在某些環境情況下或在其他環境情況下防止DNA序列的表達，允許由DNA序列編碼的蛋白的轉錄和隨後的表達。
本文使用的「胺基酸」指的是肽或蛋白序列或其部分。術語「蛋白」、「肽」和「多肽」可替換使用。
本發明提供新型融合的脂酶原胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶分子。「脂酶原胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶分子」是指一種稱為PLBTR的新序列、及其變體和片段。這些全長基因或其片段被稱為「PLBTR」序列，表示它們具有與胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶基因相似的序列。提供了包括編碼胺基酸序列在SEQ ID NO :2中給出的PLBTR多肽的核苷酸序列的分離的核酸分子， 或其變體或片段。編碼PLBTR多肽的核苷酸序列在SEQ ID N0:1中示出。此類序列是胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族成員。
為表達本發明的融合蛋白，核酸可操作地連接至指導基因表達的信號。當位於與另一個核酸序列成功能性關係時，核酸為「可操作地連接」。例如，如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，該啟動子或增強子可操作地連接至編碼序列。一般地，「可操作地連接」是指連接的核酸序列是連續的，並且在需連接兩個蛋白編碼區域處是連續的並且在閱讀框中。
一般很希望在選定用於表達的宿主細胞類型中用啟動子和/或增強子有效地指導重組核酸序列的表達。分子生物學領域的技術人員通常知道啟動子、增強子、以及用於重組多肽表達的細胞類型重組的使用(例如，見Sambrook等人，1989，下文)。在適當的情況下，採用的控制序列可以是構成的、組織特異性的、可誘導的、和/或有用的，以指導重組核酸序列的高水平表達，例如在重組多肽的大規模生產中是有利的。
優選地，本發明的融合多肽具有胺基酸序列，其與SEQ ID NO :1或2至少65%相似。更優選的，與本發明載體多肽的胺基酸序列SEQ ID NO :1或2的相似度為約66%，更優選67 %，更優選68 %，更優選69 %，更優選70 %，更優選71%，更優選72 %、更優選73 %、 更優選74 %、更優選75 %、更優選76 %、更優選77 %、更優選78 %、更優選79 %、更優選 80 %、更優選81%、更優選82 %、更優選83 %、更優選84 %、更優選85 %、更優選86 %、更優選87%、更優選88%、更優選89%、更優選90%、更優選91%、更優選92%、更優選93%、更優選94 %、更優選95 %、更優選96 %、更優選97 %、更優選98 %、更優選99 %、並且最優選 100%,
更優選地，本發明的融合多肽具有與SEQ ID NO :1或2相同的胺基酸序列。
從原核宿主和真核宿主選擇重組表達系統。真核宿主包括酵母細胞(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳動物細胞或植物細胞。細菌和真核細胞可從許多不同來源獲得，包括於本領域技術人員公知的商業途徑，例如，美國典型培養物保藏所(American Type Culture Collection) (ATCC ； Rockville Md.)。用於重組蛋白表達的細胞的商業途徑也提供使用這些細胞的說明。表達系統的選擇取決於用於表達多肽的需要的特徵。
因此，本發明的目的是表達系統或表達盒，其在來源於選自由畢赤酵母菌株組成的組中，尤其是選自由巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanol!ca)和慄酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)組成的組中的細胞是有功能的，並且允許編碼其蛋白片段的期望多肽的表達，位於其表達所需的元件控制下。
優選用表達載體轉化或轉染宿主細胞，宿主細胞包括重組多核苷酸，並且其還包括以及至少一種表達控制序列，其可操作地連接於重組多核苷酸並且能夠控制宿主細胞中的重組多核苷酸的表達，從而能夠生產可溶融合蛋白。
本發明最優選的方面，最優選的宿主細胞是甲基營養酵母。可使用本發明改造的甲基營養酵母菌株包括，但不限於，能在甲醇上生長的酵母菌株，例如畢赤酵母屬、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母(Torulopsis)。優選的甲基營養酵母是畢赤酵母屬。可使用本發明方法改造的甲基營養酵母菌株也包括那些甲基營養酵母菌株，它們已被設計成表達感興趣的一種或多種異源蛋白。
如本文中使用的，術語「轉化」和「穩定轉化」指的是一種細胞，該細胞中已將一種非自身(異源)多核苷酸序列整合入游離質粒，而該游離質粒保存至少兩代。
如本文中使用的，「重組」包括是指一種細胞或載體，其已通過引入異源核酸序列被改造或該細胞源於經如此改造的細胞。
載體可轉化到宿主細胞中，使用的方式包括，但不限於，電穿孔、病毒感染、磷酸鈣沉澱、二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、直接顯微注射、負載DNA的脂質體和 lipofectamine-DNA複合物、細胞聲波降解法、使用高速微粒的基因轟擊或本文中描述的或本領域中公知的任何其他方式。該載體還可包括DNA序列編碼功能以利於基因表達，通常為啟動子、轉錄起始位點、轉錄終止和多腺苷酸化功能。
本發明也涉及一種生產期望蛋白的方法，包括發酵，在一定情況下並且在適合於生產此類蛋白化合物或其類似物，在諸如畢赤酵母屬的有機物中，其中也包含編碼足以指導生產期望的終端產物的多肽的基因。
根據另一個方面，本發明涉及重組生產牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括
(a)用重組DNA載體轉化宿主，其包括融合於編碼脂酶原的核苷酸序列的編碼牛胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列。
(b)在合適的培養基中，在有利於牛胰蛋白酶原表達並分泌到培養基中的情況下培養轉化的宿主，以及
(c)從培養基中回收牛胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
對本領域技術人員，本發明的其他目的、優點、和新型特徵將通過對以下實例的解釋變得顯而易見，實例不是限制的目的。此外，如以上描述和如權利要求部分中要求的本發明的各種實施例和各個方面在以下實例中找到實驗支持。
參考以下實例更充分說明並理解本發明，以下實例以說明的方式給出並且不以任何方式限制本發明的範圍。
一個本領域的技術人員將擁有必要的專門知識獲取或利用合適表達的載體，用於生產本發明的可溶融合蛋白，取決於應用和目的。以下提供關於獲取和利用表達載體的相關通常指導，其可用於轉化或轉染宿主細胞從而使宿主細胞表達重組多肽。更優選地，根據以下實例部分提供的指導原則來獲取和利用本發明的表達載體。如以下實例部分的實例說明和示出，本發明的融合蛋白可由本發明的宿主細胞適當地表達，宿主細胞由表達載體轉化。
因而，本發明還提供用重組多肽和/或表達載體轉染或轉化的宿主細胞。根據應用和目的，本領域的技術人員可按各種方式常規地實踐獲得表達載體。
進一步藉助於以下實例和圖說明本發明。然而，這些實例不應解釋為對本發明範圍的限制。
實例1
脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的核苷酸序列在SEQ ID 1中示出並且對應的胺基酸序列在SEQ ID 2中示出。
從米根黴脂肪酶/pPIC9K載體擴增脂酶原基因片段，使用的是高保真度PWO聚合酶和以下引物
PR0RHILIPFP2 = 5，CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTTCCT GTT TCT GGT AM TC3'
PLBTRRP = 5，TTG TCA TCG TCA TCG GCG CTG TTG GTA GATCCA GA 3』
從牛胰蛋白酶原/TA載體擴增牛胰蛋白酶原基因，使用的是高保真度PWO聚合酶和以下引物對該牛胰蛋白酶原基因進行密碼子優化，使用的是用於密碼子優化的基於軟體的 Entechelon 網。
PLBTRFP = 5，CTA CCA ACA GCG CCG ATG ACG ATG ACA AGATTG TCG GA 3'
BTRPRP1 = 5』 GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGCTTG 3』
使用Qiagen公司的凝膠提取試劑盒純化這些產品。這些純化產品每個2 μ 1用作模板。使用以下引物進行重疊延伸PCR(overlapping PCR)，以融合脂酶原和牛胰蛋白酶原閱讀框內編碼序列。將融合的產品命名為PLBTR。
PR0RHILIPFP2 = 5，CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTTCCT GTT TCT GGT AM TC 3'
BTRPRP1 = 5』 GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGCTTG 3』
得到的PCR產品在的瓊脂糖凝膠上分析。
從以上瓊脂糖凝膠切出正確大小的基因產品，並通過凝膠提取純化。該產品在 16°C下連接入pTZ57R/T載體過夜。該連接混合物轉化入感受態E. coli DH5 α細胞，在包含 100 μ/ml氨比西林的LB瓊脂平板上選擇克隆。使用沸騰微量製備法(boiling miniprep method)篩選獲得的菌落。通過釋放用限制性內切酶^Cbal和BamHI消化的插入片段來確認插入片段的存在。選擇克隆#11並使用Qiagen miniprep kit分離更多的質粒。
實例2
將該產品亞克隆入pPIC9K
使用Biol和EcoRI位點切出PLBTR片段並在相同位點連接入pPIC9K。該連接混合物轉化入感受態E. coli DH5a細胞，在包含100 μ/ml氨比西林的LB瓊脂平板選擇克隆。使用沸騰微量製備法篩選獲得的克隆。插入片段的存在是通過釋放用限制性內切酶Xhol 和EcoRI消化的插入片段確認的。名為PLBTR/pPICTk的正確克隆通過限制消化驗證。
用PLBTR/pPIC9K質粒進行巴斯德畢赤酵母GSl 15菌株轉化
使用McI線性化PLBTR/pPIC9K載體並遵循hvitrogen手冊中描述的方法通過電穿孔轉化入巴斯德畢赤酵母GS115。在0.5mg/ml的G418上篩選約1200個克隆。發現四i^一個克隆抵抗0. 5mg/ml的G418。這些克隆放於2mg/ml的G418上。
檢測所有六個抗性克隆，以檢測感興趣基因的基因組整合的情況。對這些克隆進行脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的誘導表達研究。
下表收集了所有篩選數據
無CFU0.5mg/ml G418r CFU2mg/mlG418r CFUPCR確認12004166
Mut+ 和 Muts 的篩選
使用AOX啟動子FP和AOX終止子RP引物進行PCR篩選Mut+和Muf轉化體的。
GSl 15小規模表達研究
在搖瓶中進行小規模表達研究。簡要地，克隆在BMGY中在30°C下生長，隨後在 BMMY中在30°C下用甲醇誘導。總共用3天進行甲醇的誘導。用六個克隆進行表達研究。簡要地，克隆在BMGY中在30°C下生長，隨後在BMMY中在30°C下用甲醇誘導。總共用3天進行甲醇的誘導。
實例3:
在自製巴斯德畢赤酵母菌株中，畢赤酵母優化密碼子的脂酶原-牛胰蛋白酶原 (CPLBTR)的表達
畢赤酵母優化密碼子的脂酶原-牛胰蛋白酶原(CPLBTR)的合成基因在SEQ ID 3中表示。
PMBL210中胰蛋白酶原的克隆。
1.PCR 擴增:
使用質粒0900098 Seq 3 pMA進行脂酶原-牛胰蛋白酶原的PCR擴增，質粒 0900098 Seq 3 pMA 是使用引物 CPLBTRFP 和 CPLBTRRP 從 Geneart 得到的。
· CPLBTRFP :5』 ACC TCG AGAAGA GAG TTC CAG T 3』
· CPLBTRRP :5，GGG AAT TCT TAG TTA GAA GCG ATA GTT TGC 3，
PCR反應混合物
權利要求
1.一種融合多肽，包含融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID N0:1至少80%同源性的胺基酸序列。
2.一種融合多肽，包含融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID NO :2至少80%同源性的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的融合多肽，其中SEQID 1或2的68和69號胺基酸被胺基酸精氨酸和賴氨酸取代。
4.根據權利要求1或2所述的融合多肽，其中68號的胺基酸被酪氨酸取代。
5.權利要求1、2、3或4所述的融合多肽的應用，其中所述多肽能夠使胰島素或胰島素類似物或胰島素衍生物的前體形式轉化為它們對應的活性形式，有至少50%的步驟產率。
6.根據權利要求1或2所述的融合多肽，其中所述甲基營養酵母屬於畢赤酵母屬 (Pichia sp.) 0
7.根據權利要求1或2所述的融合多肽，其中所述甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)0
8.—種表達融合多肽的方法，所述融合多肽包括由甲基營養酵母生產的融合於脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有與SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2表示的胺基酸序列至少80%同源性的核苷酸序列。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶原。
10.根據權利要求8所述的方法，其中所述甲基營養酵母屬於畢赤酵母屬。
11.根據權利要求8所述的方法，其中所述甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母。
12.—種載體，包括權利要求1、2、3、或4所述的序列。
13.一種轉化細胞，包括可表達形式的根據權利要求9的權利要求1或2所述的序列。
全文摘要
本發明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、編碼它們的基因、及其產品和應用。更具體地，本發明涉及以最優量生產PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情況下對自催化活性敏感的異源多肽。更具體地，本發明涉及融合蛋白，其包括異源多肽，例如融合於脂肪酶信號序列的絲氨酸蛋白酶，其可通過重組宿主細胞以期望量表達。本發明還涉及編碼此類融合蛋白的多核苷酸、涉及用於表達此類融合蛋白的表達載體、涉及用此類多核苷酸/載體轉化的宿主細胞、並且涉及生成此類融合蛋白的方法。
文檔編號C12P21/06GK102482675SQ200980161363
公開日2012年5月30日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年9月10日
發明者克達納斯·薩斯特裡, 南迪尼·納塔拉傑, 帕薩·哈茲拉, 戈庫爾·約蒂拉曼, 桑賈伊·蒂瓦裡, 穆克什·巴布阿帕·帕塔勒, 納加拉傑·戈文達帕 申請人:拜康有限公司