檢定方法

2023-12-06 13:28:26 1

專利名稱：檢定方法
技術領域：
本發明屬於抗體檢定領域，具體涉及利用簡單方法檢測血液樣品中經諸如感染或接種等之類的抗原激發而產生的抗體，所述簡單方法包括在同一血液樣品中確定淋巴細胞和血漿抗體存在。優選的是，以單一檢定方法同時估定血漿和淋巴細胞抗體。
背景技術：
存在幾種可利用來檢測樣品中抗體水平的技術，例如ELISA檢驗。最常見的情況是，將ELISA用作血清學檢定，但是它也可用於研究抗原或抗體的免疫化學特性，還經常用於，例如，免疫反應的評估及定性，另外還可在雜交瘤技術中用於通過細胞培養研究抗體的產生。
ELISA檢定使用簡單，敏感且相對快速，但是它僅僅能夠對樣品中分泌的靶抗體的存在進行檢定；它無法將應答抗原而即時合成的抗體合成與感染或被動轉移後業已存在的抗體區分開來。只有已經從淋巴細胞中分泌的抗體被檢測到。該技術沒有檢測到沒有分泌的淋巴細胞抗體。
除了ELISA檢驗之外，已經使用ELISPOT或酶聯免疫斑點檢定，綜述參見，例如，Czerkinsky等，ELISA中及其它固相免疫檢定(in ELISA and other Solid phase Immunoassays)，Eds.D.M.Kenneny和S.J.Challacombe編著，1988，第10章，217-239。該技術以ELISA方法為基礎，可對分泌抗一種或多種靶抗原之抗體的淋巴細胞計數。所述ELISPOT基本上是ELISA方法的一種變體，因而可以通過以下方法來揭示抗體分泌細胞(ASC)，即在用靶抗原包被過的經專門改進的ELISA孔中培養淋巴細胞，用酶-底物複合物代替標準ELISA試劑，該酶-底物複合物可在分泌細胞近處生成顯色沉澱(斑點)。然後可通過斑點計數來測算出抗體生成細胞的數目。可在培養基中加入蛋白質合成抑制劑，以確保所檢測到的斑點是由體外孵育期間的抗體從頭合成途徑生成的。
儘管ELISPOT技術在研究體液免疫應答動力學中非常有用，並可用於檢測經免疫受試者外周循環中瞬時出現的自發ASC，但該方法的某些特性限制了它在臨床診斷中的應用。首先，由於每個樣品的斑點都須單個測量，耗時且費力，該方法尤其不適用於大量樣品的分析，例如臨床診斷試驗室中的操作。其次，只檢定每個樣品中的抗體分泌細胞的數目，一般來說，這理論上講需要相當大量樣品體積，例如，幾毫升。另外ELISPOT檢定板也很昂貴，而且該檢定不易自動化。
最近，開發了檢測即時抗體合成的檢定。在此通過參考被結合的WO 96/26443描述了這樣的一種檢驗。在該檢定中，分離淋巴細胞然後進行培養，檢定該培養過程中生成的和從淋巴細胞分泌的抗體水平。
因此，為了能對孵育過程中分泌的抗體進行檢定，該技術需要在約37℃下孵育測試樣品的淋巴細胞。平均孵育時間為2-5小時，這就極大地限制了該檢定的操作速度。另外孵育還需要在測試位點提供適當的裝置，以便其能在檢定步驟前立即執行。這通常意味著淋巴細胞的檢定必須在樣品離體後很短的時間內執行，因為不可以通過例如冷凍貯存樣品，這會導致細胞活力的下降。通過在0℃的冰上儲存或稍差一點在4℃保存純化後的細胞，也只能在相當短的時間內保持活力。
在此通過參考被結合的WO00/77525描述了另一種抗體檢定。該檢定被專門設計檢測在其分泌之前包含抗體的淋巴細胞。在該檢定中，樣品的淋巴細胞被溶解，進而檢測到通過該溶解從淋巴細胞中釋放的抗體。這個檢定基於以下發現，即淋巴細胞裂解可產生足夠數量的「新合成的抗體」，以允許用於免疫診斷目的的檢測。便利地，以這種方法，在溶解之前純化樣品中的淋巴細胞。
因此，WO00/77525中所述的檢定方法不要求用於檢測目的的足夠抗體合成的體外孵育樣品，而這是使用標準抗體檢測檢定的情況，該標準抗體檢測檢定檢測在體外或體內分泌的抗體。因此，該檢定具體用於檢測在諸如感性或防染處理的激發之後較短時期內的急性感染，此時應答該激發而淋巴細胞快速產生抗體。
然而，WO00/77525中所述的方法僅僅允許活性抗體產生出現時的感染檢測，也就是在激發之後的短時期期間。這個窗口對應於細胞處於正在產生可檢測的抗體水平的時限。在激發後，B淋巴細胞開始合成抗體且應答抗原激發而分割。在該時期中，通常感染3到10天，淋巴細胞快速合成感興趣的抗體，且因此這些細胞中的抗體水平為高的。然而，這些細胞是短命的，結果是，在感染後大約兩周，由淋巴細胞產生的相關抗體的數量明顯下降。距離感染近似兩周，存在於溶解的淋巴細胞中的相關抗體的數量回歸到低水平。例如，這被示出在WO00/77525中所示的流行性感冒研究中。因此，這種方法，儘管對檢測急性感染非常有用，但是不能檢測即時感染或感染之後，因此僅僅用於諸如感染或防染處理的激發之後相當短時限。
能夠理解的是，需要允許對來自病人的樣品中的感染進行快速且準確檢測的方法，並且該方法具有對感染的早期檢測相關聯的明顯優點。儘管存在允許對急性感染的檢測技術(例如WO00/77525)和允許對感染後或即時感染的檢測技術，但是不存在單一的測試，即能夠對個體在其生命期中某些點處是否暴露於特定激發(例如感染，也就是具有極性的、即時的(慢性)感染或感染後)的問題提供一種快速反應。因此，在不需要了解激發時間的情況下，能夠識別激發是否已經發生應該是及其有價值的。然後，同樣測試可被用於不管激發時間的樣品分析，例如用於慢性和急性感染。目前沒有單一測試符合這些需要。
這種測試在高吞吐量篩查(high-throughput screening)中將尤其有用，在該高吞吐量篩查中需要關於源有機體的感染狀態的信息。例如，血庫需要快速和準確的測試來確定將被用於輸血的血液的安全。這在高流行血液傳染病的世界區域內尤其重要，諸如HIV(愛滋病)和肝炎，其可被傳遞給血液受體。
檢測HIV感染的目前方法和對經輸血而HIV傳播的風險的控制在某些地區是現場的。例如，在南非已經執行血液安全政策，以及高感染風險的個人接受調查問卷、供體訓練和一對一訪問便於其處理。這種規定和自我排除均有助於明顯降低這群人的血清陽性率。這與普通人口中HIV/AIDS廣泛流行的逐步擴大形成對比。
預期的血液供體中的高HIV血清陽性率在傳染力的免疫靜止「窗口期限」中增加了HIV傳播的風險。在1994年，在南非，估計這種風險在該窗口期限中為每100,000供體中2.2個感染者(Sitas F等的S.Afr.Med.J.1994；84142-144)。在免疫靜止窗口期限期間，使用已知的商業化的可利用的檢定不可能檢測到HIV感染。
如使用標準數學模型所估計的，對構造的風險管理計劃的執行將對血液製品的受體的風險降低至100,000供體中的大約1個。這種實測的風險大約降低四倍，但是這可能是由於難於實現對輸血傳遞的疾病診斷的因素。
目前存在可利用的某些HIV檢驗。例如，使用發展中國家研究所顯示的對HIVI p24抗原檢驗的引入，以縮短免疫靜止窗口期限。P24檢定檢測感染後15-18天的感染(圖1)。
已經被考慮的是，用以檢測單個供體中的血漿衍生的病毒核酸的更敏感的檢驗，可能是最有效率的方法，以更進一步減少傳染性的窗口。這使用核酸檢驗(NAT)是可能的，但是這種技術具有汙染、訓練、實驗室空間、質量保證和顯著的成本的後勤問題。這些因素限制了將NAT引入更流行地區的一些中心區(Busch M.P.Chapter 2；Blood Safety in the New Millennium；Stramer SL Ed；AABB，2001)。該核酸檢驗檢測感染後大約7至10天的感染(圖1)。
對血漿中IgG的檢驗也被用於診斷HIV，然而，因為在產生的強烈期之後的集聚和在感染之後2周中的分泌，在直到感染後20-24天之前，在血漿中沒有出現處於通過常規檢定可檢測的水平的IgG(圖1)。
因此，緊跟在感染之後有7-10天時限，在該時限中目前使用市售的可利用的檢驗不可能檢測到HIV感染，尤其使用適用於在關於大樣本數的常規基礎上的使用的檢驗(圖1)。
此外，由於這些不同檢定依賴的免疫學事件的不同時標，需要平行地進行多重檢定以可靠檢測感染。例如，從圖1可看出，只進行p24檢驗獲得的陰性結果僅能排除疾病某一階段感染的存在。類似地，過早進行的核酸檢測(即早於感染後7～10天)不能檢測感染。由於在實際中個體是否感染是未知的，更不用說他們發生感染的具體時間了，因此這些檢測表現出很大的缺點。
上面提到的時標涉及HIV感染、抗體產生和檢測。在其它的免疫反應激發情況下，該時標可能改變，儘管預期有基本平行的周期，尤其對於慢性感染。然而已認識到，作為基本免疫過程的結果，免疫原刺激引起抗體在血漿中積聚至可檢測水平毫無疑問晚於抗體在淋巴細胞內的產生和該免疫原激發的可檢測時標又可能不同的其它標誌物的產生。因而，根據自免疫原刺激所經歷的時間選擇不同的檢定是合適的。

發明內容
本發明針對這些缺點，進而提供能夠在感染後儘可能早地識別感染，不排除在晚期階段檢測感染的可能性的單個檢測。
驚人的是目前發現單個檢驗可用於確定哺乳動物是否被感染，例如，在感染後約3～7天的任何時間。在該檢驗中進行抗體檢定以確定血漿(即已分泌的抗體)和取自單一血樣中的淋巴細胞中的抗體的存在。該檢定的實施使用樣本的血漿和淋巴細胞部分，相關的淋巴細胞抗體或血漿抗體或兩者的存在提供陽性結果。因此與其它任何公知技術相比，使用該技術時上述對於HIV由免疫靜止「感染窗口」決定的時間間期變短，並且一旦淋巴細胞中的抗體被分泌而不能再從淋巴細胞中檢測到，檢測抗體的能力不消失。該方法因此能夠檢測例如少於20天，例如少於15或10天例如從感染後3或7天至10天。
尤其重要地，鑑於淋巴細胞和血漿抗體檢測結果的結合，感染後淋巴細胞和/或血漿抗體處於低水平的時期可以通過其它類型抗體的加入而補償和加強(例如感染後3周左右)。這在抗體水平處於檢測極限而兩種抗體的聯合能產生可檢測信號時尤其有利。因此，尤其優選結合樣本的相關部分一起檢定的方法，如下文所討論的。這使檢定的進行能夠從早至感染後數天(其間主要檢測新合成抗體)，至感染後數周(主要抗體為血漿抗體)，直到這些血漿抗體水平下降(在感染因素已從機體排出的情況下約產生後12～15個月)。在慢性感染激發因素遺留的情況下，例如HIV或肝炎感染，檢定可持續進行。因此從感染後例如3～7起檢測淋巴細胞抗體或血漿抗體都是可能的。
因此在一個方面，本發明提供在血液樣品中確定針對免疫原的抗體的數量和存在的方法，包含至少以下步驟獲得血液樣本(包含血漿和淋巴細胞)；以及檢測在所述樣本中血漿抗體或其部分以及淋巴細胞抗體或其部分的數量和存在；其中所述血漿和淋巴細胞抗體一起檢測或分別檢定以及它們綜合的數量或存在的檢定確定了針對所述免疫原的抗體的數量和存在。
代替地描述的，所述第一步驟可缺如以及所述檢測步驟可在從一個個體獲得的血液樣本上進行。
此處應用的術語「檢測」和「確定......的數量或存在」包含對抗體產生水平的定量和定性分析，意義是獲得樣本中產生的抗體的數量的絕對值，和指數、比率、百分比、或類似的抗體產生水平的指示，以及半定量或定性分析。術語「確定......的存在」還包含提示抗體缺乏的陰性結果對評估受檢者的免疫反應有價值的情況。
該「綜合的」數量或存在指它們在例如數量或定性形式上獲得的結果的相加，最優選抗體被一起檢測以及它們的綜合數量或存在是用於檢測靶抗體的檢定的讀出，該檢驗作為單一測量來評價。此處應用的「靶」抗體指檢定所針對的抗體，並且其識別特定抗原(至少包含免疫原的抗原決定基)。
此處涉及的「免疫原」是任何作為對免疫系統的激發出現的實體以及優選蛋白質性實體。針對所述免疫原的抗體是那些專門識別所述免疫原上的抗原決定基或所述免疫原一部分者。
此處涉及的「血液樣本」是用於分析的可能以任何方便方式從任何方便來源獲得的血液的樣本。尤其優選取自肢體靜脈的外周血液樣本，對於人類優選臂部。這樣的血液樣本不是完整血液樣本，如下文討論的，包含其至少一種成分例如紅細胞被去除的血液。
此處涉及的「血漿」對應於血液的流動性部分並且幾乎缺乏任何細胞成分。血漿可由公知的技術獲得，例如通過收集沉降後血液的流動性部分或離心細胞成分後的上清液。值得注意的是，血漿是幾乎不含淋巴細胞的。此處應用時，「幾乎」指無高水平的混雜成分，例如去除90至95％的混雜成分。
此處在本方法背景中涉及的「淋巴細胞」涉及產生抗體的淋巴細胞，即B淋巴細胞。但是在存在T淋巴細胞時和有關製備分離的淋巴細胞的方法是指製備包含B和T淋巴細胞的分離的細胞總體時本方法也能夠實施。然而尤其優選在幾乎純化的B淋巴細胞群進行該檢定。
「淋巴細胞抗體」指採取樣本時位於淋巴細胞中的抗體，和/或淋巴細胞被分析時尚未分泌的抗體。這樣的抗體已經在體內響應抗原刺激而產生；在樣本取走後可能在淋巴細胞內繼續產生，例如如果它們被以WO96/26443中所述的方法孵育。可以理解在取出樣本和檢測之間的時間段內可能發生低水平的分泌。因此在分析時那些抗體可能仍然或不再存在於淋巴細胞內，可能已在任何體外過程中被分泌。可能通過裂解而從淋巴細胞中釋放的抗體是「新合成抗體」。
此處使用的術語「新合成抗體」涉及對抗原有活性的抗體(即能夠識別和結合對應於免疫原的抗原)，其已經由淋巴細胞響應體內免疫原的存在作為持續的免疫反應的一部分在淋巴細胞內產生或合成。因此，在由體內免疫原的存在激發的免疫反應過程中抗體被淋巴細胞合成，即在從受檢動物取出包含該淋巴細胞的樣本之前或在其當時合成。該術語與「淋巴細胞抗體」同義。
「血漿抗體」涉及對抗原有活性的抗體(即能夠識別和結合對應於免疫原的抗原)，其已經由淋巴細胞響應體內免疫原的存在作為持續的免疫反應的一部分在淋巴細胞內產生或合成並隨之從個體的淋巴細胞分泌到血液內，因此僅在樣本的血漿中被發現。因此，該抗體為體內免疫原的存在激發的免疫反應過程中由淋巴細胞合成並隨之分泌至血液中的。該分泌因此發生在樣本從動物取出之前或當時。
因此根據從何處檢測來說，血漿抗體顯然不同於上述「淋巴細胞抗體」和新合成抗體，儘管很明確的是一旦被分泌，「淋巴細胞抗體」將成為血漿抗體，並且這些抗體在化學上和結構上是相同的。區別僅反應了樣本取出時抗體分布的瞬間。
然而在分泌之前，淋巴細胞抗體總體中至少一部分可能未經歷翻譯後修飾和/或未處於成熟狀態(見下文)，這些抗體因此在化學和結構上不同於那些已分泌和因此成為血漿抗體的抗體。
此處涉及的「抗體或其部分」涉及對抗原有活性(即能夠識別和結合至免疫原或其某部分)的抗體或其部分。對於淋巴細胞抗體來說這可能是在取樣本時尚未從細胞分泌的物質，以及例如仍未處於最終的成熟狀態儘管它們已具有抗原的性能。如前面提到的，這樣的淋巴細胞抗體及其部分通常對應於早於檢定和/或採集(如果細胞在適當條件下保存，在細胞裂解之前，可能完全在體內或至少部分在體外發生)2小時產生的抗體，儘管分泌途徑的時間過程可能不同。
同時抗體可能在細胞內迅速產生(例如在1-2分鐘內，儘管分泌慢得多)，組成抗體的自由鏈或未糖基化或部分糖基化的抗體或抗體鏈可能出現在淋巴細胞內，並在它們裂解時釋放。由於它們如上所述對抗原有活性，合適情況下這些「部分」可以被檢測和包含在新合成抗體的存在或數量檢測中。從淋巴細胞釋放的抗體或其部分包含新合成抗體或淋巴細胞抗體。
血漿抗體或其部分包含那些保持對抗原的活性(如上述)的部分，但其不相應於分泌形式，例如通過蛋白水解降解而已部分降解者。
此處涉及的「檢定」為用於確定樣本中抗體的存在和數量的合適的技術。下文描述了未達此目的的合適的檢定。
依據本發明對當前和曾經的感染的早期、精確、快速檢測在多種應用中十分有用，尤其在該認識用於確定樣本或源有機體的實用性的應用中。因此，例如，動物的血液可以被檢測以確定它們是否適於出口、進口、旅行、消費、飼養等，例如通過檢測針對口蹄疫病毒群(足-和-口疾病的致病原因)刺激的抗體。
因此，將要分析的樣本可來自於任何動物，血液從該動物取出。然而優選地所述動物為哺乳動物或實驗室動物或農業動物。優選地該動物選自包含以下動物的組魚、雞、鴨、鵝、螞蟻、大鼠、小鼠、兔、狗、貓、山羊、綿羊、奶牛、鹿、豬、馬、驢和人。尤其優選本發明用於檢測人類樣本。
相對小量的血液可用於本檢定。淋巴細胞抗體能夠在來自少至50y1血液的淋巴細胞的溶胞產物中檢測到。因此方便地只需要少於10ml的血液樣本。方便地少至不足1ml可以被用於本發明的方法。然而優選應用少至100～500或100～200μl。
依據本發明檢測其抗體的方法所針對的抗原或免疫原包含細菌和病毒抗原。臨床的重要抗體包含，但不局限於那些來自由例如以下抗體組成的組中者單純皰疹病毒，巨細胞病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)以及任何肝炎病毒、弓形體(Toxoplasma gondii)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、結核病、梅毒(梅毒螺旋體pallidium)(Treponemapallidium)和衣原體(衣原體trachomatis)(Chlamydia trachomatis)。然而通常，作為激發例如感染或疫苗接種的結果產生的免疫原，引起明確的可被本發明的方法檢測到的抗體反應。
在慢性感染導致淋巴細胞內可檢測水平的靶抗體以及隨後這些抗體分泌至血漿的情況下，也可以採用依據本發明的方法檢定這些抗體。從而例如，針對任何免疫原可用傳統ELISA方法檢測的抗體可用本發明的方法檢測。
檢測針對這樣的抗原的抗體可用於快速確定患者被感染，例如用於血液篩查目的或用於確定和/或監測感染。因此本發明還擴展到本發明的方法用於診斷或監測人類或非人類動物或所述動物的部分被免疫原，優選細菌或病毒感染，以及是否被所述免疫原，優選所述細菌或病毒感染或感染的程度，是參考正常對照和/或參照樣本來確定的。
儘管該檢測尤其適合於高吞吐量檢驗，該檢測也可以用於任何需要是或否答案的情況，例如在醫院內、診所、實驗室或醫生的手術室。但更常見的是考慮多個樣本採用同樣的檢測，例如，將用於血庫，尤其在世界上血液傳播感染性疾病如HIV或肝炎流行性高的地區，這些疾病能夠傳染給接受血液者。
血庫需快速明確血液能否用於輸血；不需要將感染劃分為具體的階段或感染後時期。如果發現供血者被感染，他們的詳細診斷可個別實施。血庫僅需要知道該血液能用或不能用。因此在優選的方面，本發明的方法用於同時或順序篩查多個樣本。尤其優選所述篩查為自動的，例如實施高吞吐量篩查。在尤其優選的方面，確定抗體數量或存在的方法用於確定樣本用於移植或自體輸血的適宜性，尤其例如樣本為如由血庫保存的，從一個或多個個體獲得的儲存血液的等分試樣。
可以理解的是概述的用於HIV感染檢測的情況僅是廣泛的疾病、感染和免疫接種種類的一個例子，對它們的檢測將受益於本發明在檢測感染中的應用。
該檢定具有一些優勢，在用作篩查方法時尤其有用，因為它快速回答了個體是否已感染或目前被感染的問題。對這個問題的陽性回答將作出陽性診斷並且，例如排除供者或個體獻血，並且隨後的分析能夠被實施以確定該感染是急性(即抗體位於淋巴細胞中)或曾經的感染(即抗體位於血漿中)。
對淋巴細胞抗體的檢測可以通過任何方法方便地實施。例如使用WO96/26443的方法，在由於暴露於感染或免疫接種而導致的體內刺激之後，抗體的體外主動產生和分泌可以被檢測。
代替地和最方便地對淋巴細胞抗體的檢測通過在所述血液樣本中裂解淋巴細胞來實施，例如如WO 00/77525中所描述的，以及下文更詳細描述的。在WO 00/77525的例子中披露了製備和分析淋巴細胞抗體的合適方法。
因此在優選的方面，本發明提供了確定血液樣本中針對免疫原的抗體的數量或存在的方法，包含至少以下步驟獲得血液樣本(包含血漿和淋巴細胞)；裂解所述血液樣本的淋巴細胞而釋放與所述淋巴細胞相關的抗體或其部分；以及檢測由淋巴細胞釋放的所述淋巴細胞抗體或其部分的數量或存在和血漿抗體的數量或存在；其中所述血漿和淋巴細胞抗體一起或在分開的檢定和確定中檢測——它們的綜合的數量或存在確定針對所述免疫原的抗體的數量和存在。
代替地描述的，所述第一步驟可缺如以及所述檢測步驟可以在由個體獲得的血液樣本上實施。
此處涉及的淋巴細胞為出現在取自受試者的完整血液樣本中的和用於該方法的血液樣本中的淋巴細胞。在該方法過程中實施的各種處理和製備可包含從血液樣本的其它成分部分或全部分離淋巴細胞。因此，淋巴細胞裂解步驟不需總在血液樣本上實施，可以在從血液樣本獲得的淋巴細胞標本上實施。因此涉及所述血液樣本的淋巴細胞涉及出現在全血樣本中的淋巴細胞，無論它們是全部或部分從血液樣本中純化。
在一個優選實施例中，實行單一孔檢定。換言之，血漿抗體和淋巴抗體檢測步驟在單個樣本上實施。如上面提到的，這樣做的優勢是當這些抗體的一種或全部的水平處於可檢測閾值時將單個樣本中的抗體水平增高到血漿和淋巴細胞抗體檢定可檢測到的水平。
在這個實施例中，檢測步驟在其上實施的樣本包含淋巴細胞和血漿。因此，單一檢定將確定樣本中是否存在任何血漿抗體或淋巴細胞抗體。由於這兩種抗體類型將全部與待測抗原或抗體結合，在該檢定中不區分這兩型抗體。
以前未認識到可實施這樣的單一孔檢定。血漿和淋巴細胞抗體的同時出現可能曾被認為對將獲得的結果有負性影響，例如由於稀釋以低於檢測閾值的水平出現的抗體。然而本發明人發現，以兩種成分混合的方式檢測血漿抗體和/或淋巴細胞抗體而敏感性無顯著減少是可能的。
單一樣本，即包含淋巴和血漿抗體的血液樣本可採取在很大程度上未純化的樣本到幾乎純化的淋巴細胞和血漿部分的各種形式。此處涉及的這樣的「部分」涉及包含淋巴細胞或血漿的全部血液的哪些分數部分。這些部分可能包含血液的另外的其它成分。
因而檢測步驟可在全血樣本上實施，一種或更多血液樣本成分已在檢定實施前被去除以產生用於本發明的方法的「血液樣本」。例如，在一個優選實施例中，可以通過利用標準技術，例如基於離心力或親合力的去除，血紅細胞可以從全血樣本中去除。
進一步的成分也可被去除，例如非B淋巴細胞。方便地，這樣的樣本可通過具體成分的陽性選擇獲得，例如在梯度離心後包含B淋巴細胞的部分(例如血沉棕黃層)和包含血漿的部分可被收集用於檢定。
如代替地或附加的，血漿和淋巴細胞部分可使用本領域公知的技術一起或分別從全血樣本的剩餘部分被完全或部分純化。如果它們是從全血分別純化，當進行單一孔檢定時它們將被再次結合，即在進行單一孔檢定之前混合在一起。
因此在優選的方面中，從全血樣本從個體分離出開始，包含血漿的樣本或部分被分離以及包含淋巴細胞的樣本或部分被分別分離。這樣的樣本或部分可從全血樣本的兩個等分試樣開始產生，或可以從分成兩個單獨部分(例如沉降或離心後的上清液和細胞團塊)的單個等分試樣產生，隨後從兩個單獨部分進行兩個分離。在單一孔檢定的情況下，所產生的包含淋巴細胞的樣本或部分和包含血漿的樣本或部分被再結合用於檢驗。
在實行對包含血漿樣本或部分和包含淋巴細胞樣本或部分聯合的檢定中，用於分析的等分試樣優選以1∶1的容積比再次結合。然而各種結合將被容許以及方便地可使用任何血漿淋巴細胞樣本或部分在例如1∶0.4到1∶4的範圍內的結合。優選地，由於淋巴細胞抗體水平相對較低，優選淋巴細胞樣本或部分的容積較高，例如血漿淋巴細胞樣本或部分在1∶1到1∶4的範圍。上述比例依賴於出現在以最高濃度使用的樣本或部分中的抗體，它們以該濃度存在於整個血液(其中淋巴細胞被裂解)。如所需要的，根據用於檢測的檢定的靈敏度和抗體存在的數量，可能進行樣本或部分的稀釋。因而例如達到1∶1的比例，對每1μl血液，存在於該1μl中的血漿可以與用該最初的1μl血液樣本中的淋巴細胞數產生的溶解產物結合。因此，來自1μl完整血液以1∶1比例混合存在的淋巴細胞和血漿抗體數量大約等於該1μl完整血液中存在的抗體數量。在製備用於分析的樣本的過程中，含血漿樣本含淋巴細胞樣本或溶解產物的稀釋可被適當調整，因此保持該比例。
淋巴細胞可使用本領域公知的標準技術分離，例如使用過濾方法或應用吸收材料或淋巴細胞製備試劑盒的技術。這樣例如各種全血標本可方便地用於獲得淋巴細胞，例如從肝素化血液、EDTA-血液等在臨床實驗室常規製備的。
優選地淋巴細胞使用標準淋巴細胞分離介質例如淋巴細胞分離劑(Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)分離，或使用免疫磁性分離(IMS)或類似以固相為基礎的分離系統或其它常用技術。在應用IMS或類似分離技術時，固相例如被覆某系列白細胞特異性抗體的磁珠可用於選擇性分離有用的淋巴細胞。優選地抗-CD19抗體用於B細胞分離。應用分離的淋巴細胞時，細胞可能在應用之前採用標準的洗滌方法洗滌。
血漿可通過任何方便的方法製備，例如通過離心(例如1000xg、5分鐘)全血樣本或僅使全血直立而使細胞成分形成沉澱。
包含血漿和淋巴細胞的樣本可針對其成分被濃縮或可被幾乎純化。此處涉及的「幾乎純化的」樣本涉及那些在其中其它成分以相當小程度存在，例如佔據樣本總容量或重量的＜20％，優選＜10％或5％。這樣，例如，血漿被可能包括淋巴細胞和它們的成分的細胞碎片沾染可以是可預測的和可容許的。類似地淋巴細胞標本可以包含一些其它細胞和/或血漿成分。然而優選這些應當儘可能減少，例如＜1％。
對於單一孔檢定，當產生分離的血漿和淋巴細胞部分用於再次結合時，完全或部分純化的淋巴細胞可以在從樣本加入血漿部分之前或之後裂解。
檢測結合的抗體後，如果樣本產生陽性結果，針對免疫反應發生或階段的進一步的信息可通過再次檢測分離的淋巴細胞和血漿組分產生。
作為單一孔檢定的替代，淋巴細胞和血漿抗體的檢定可分別用兩個檢定進行並且那些檢定獲得的信息可以綜合。優選這樣的檢定同時進行。在這種情況下，血漿和淋巴細胞樣本可如上文描述的用於單一孔檢定的方法製備，僅分別通過任何此處描述的無再結合的方法分別地檢測。在這樣的情況下血漿和淋巴細胞樣本幾乎分別無淋巴細胞或血漿抗體沾染(例如相對於其它抗體形式的數量＜20％，優選＜10或5％)。然而優選該檢定採用單一孔形式實施。
「裂解」淋巴細胞意為包含任何已合成抗體的細胞成分從細胞膜以及內部膜結構的範圍內釋放以使它們能夠被任何方便的生化或化學檢定檢測到。已知免疫球蛋白通過內質網和高爾基複合體在旁路期間合成和分泌。因此，必要地，裂解需要從這些內部結構中釋放。因此，淋巴細胞的裂解可通過公知的細胞裂解方法達到，所述方法有效裂解外部和內部膜結構而不影響所釋放的抗體結合至它們互補的抗原決定基的能力，例如通過使用物理裂解方法和細胞裂解緩衝液或溶液。
裂解可通過使用化學方法或另外的裂解方法達到，所述化學方法使用例如清潔劑、高離液序列製劑、裂解緩衝液例如包含EDTA，所述另外的裂解方法例如超聲波降解或通過產生剪切壓力物理裂解。
然而優選使用裂解緩衝液，因為這通常是最簡單和最方便的技術，例如在此處例子中所描述的，即緩衝液包含清潔劑例如Tween 20和/或NP-40。優選使用終濃度為0.01至0.1％Tween，尤其優選在0.05％左右，和/或使用終濃度為0.1％至1％的NP-40，尤其優選在0.5％左右。可使用適當的裂解緩衝液以穩定釋放的抗體，例如控制PH或降解。因此如果必要可使用例如包含蛋白酶抑制劑的緩衝液。
與裂解緩衝液的孵育在適當的時間內進行以使裂解最大化，例如室溫3至15分鐘，例如持續大約5分鐘左右。
另外的裂解方法包含例如使用凍/融循環或甚至使用液氮。這導致溶解產物，其中釋放的抗體位於用於隨後的步驟的溶液中。
可以理解的是為了在待檢測樣本中獲得足夠數量的新合成抗體，希望的是儘可能多的淋巴細胞被裂解以釋放抗體。於是，優選裂解方法適於此目的以及至少40％或50％、更優選至少60％、70％或80％以及更優選至少90％、95％樣本中的淋巴細胞被裂解。淋巴細胞裂解後樣本中的抗體成分通過合適的技術檢測，該技術允許如下文所述檢測靶抗體。
淋巴細胞和血漿抗體的檢測可通過任何能識別那些結合至關心的免疫原(或其抗原決定基)引起免疫反應的抗體的方法。因此可以使用任何導致反映靶抗體存在的信號產生的檢測技術。例如可使用酶聯檢定，其中可溶或不可溶產物可由底物產生，所述產物的數量可以被估測。
方便地淋巴細胞和血漿抗體可例如通過固相結合檢定的方法檢測，例如ELISA，其中它們結合至該檢定中使用的抗原，儘管所使用的抗原可以與在最初部位激發免疫反應的免疫原不同。因此，檢定中使用的兩種抗原和曾經或正在激發體內抗體產生的免疫原將依靠同樣的或非常類似的抗原決定基同時結合至被檢測的抗體，其它方面抗原和免疫原可能不相同。因此，本發明的方法中使用的抗原可以是包含相關免疫原的所有或某些部分的材料，例如來自感染個體，或來自相同或類似材料的純化部分，以及可以合成製備，例如通過化學合成或重組表達，具有與天然抗體相關的添加的或刪除的部分。因此可使用僅表達適合的抗原決定基的融合蛋白或分子。
方便地，對於檢測步驟，樣本可以與攜帶合適結合配偶體的固相接觸以固定抗體或待檢測抗體。此處涉及的「結合配偶體」為一起形成結合對的兩個配偶體中的一個以及能夠選擇性和特異性結合至另一個，例如配基和受體或抗原和抗體。方便地結合配偶體為抗原(免疫原或其部分)或該抗原(即一個或更多)，被待檢測的抗體或該抗體或其部分識別。
然而在另一替代中，可使用不是靶抗體的抗原的不同結合配偶體，例如蛋白A、蛋白G或識別和結合至待測抗體的抗體。在後者的情況中，不需要高度特異性結合，因為在該檢定方法的實施例中特異性通過隨後抗原的結合產生，所述抗原在檢測過程中特異性結合至待檢測抗體。因此，在所有實施例中產生特異性抗原抗體複合物。優選固定於固相支撐的這樣的複合物的存在，在本發明方法的檢測步驟中是被查實的。
因此在優選的方面中，本發明方法的檢測步驟包含通過形成抗體抗原複合物檢測抗體或其部分，其中所述抗原(優選不是抗體)包含或容納免疫原或其包含至少該免疫原的抗原決定基的部分。
在具體優選的方面中，檢測血漿或淋巴細胞抗體或其部分的數量或存在的步驟包含使所述樣本的包含血漿部分和所述樣本的包含淋巴細胞部分接觸優選攜帶於固相上的一種或更多抗原，其中抗原被待測抗體或該抗體識別。代替地識別待測靶抗體或該靶抗體的一種或更多抗體可以與所述部分接觸。此處描述的樣本的所述部分可以出現在單個樣本並且它們的檢驗可通過結合至同樣的固相支持同時實施。代替地，所述部分可以是獨立的和分離的並且該抗體可在分離的檢定中在那些部分中被檢測。
在此處描述的這個和其它各方法中，結合的抗體的數量可通過與對照和/或參考樣本對比來確定。適當的對照或參考樣本可以是陰性或陽性對照，例如空白、正常樣本或示蹤樣本(spiked samples)。
採用的固相可以是目前廣泛使用或建議用於固定、分離等的任何眾所周知的支撐或介質。這些可採用粒子、片、凝膠體、濾器、膜、或微滴定帶、管或板等形式以及方便地可以由聚合材料製成。然而，為了操作容易和簡便，可以方便地使用標準微滴定板和孔，優選標準ELISA板。
固相也可被修改以允許一個範圍內不同抗原的特異性抗體的檢測。因此例如，合適的固相材料例如硝化纖維或類似者的盤或條帶等可以被覆不同抗原並同時加至微滴定孔或其它合適的容器，不包含任何接觸抗原。抗體結合檢測方法於是可用於在不同抗原間進行區分。因此本發明擴展為使用多個固相，每一固相攜帶可被或對不同靶抗體識別的不同的抗原或抗體。
方便地當使用夾心型檢定時，固相攜帶一種或更多被待測抗體或該抗體或其部分(靶抗體)識別的抗原(固相抗原)。代替地，固相可攜帶一種或更多識別待測抗體或該抗體或其部分(靶抗體)的抗體(固相抗體)。為允許依據本發明的方法檢測，合適的是，根據所述固相支撐是否如上述攜帶抗體或抗原，一種或更多被固定在所述固相上的靶抗體識別的抗原與所述固相接觸，或代替地一種或更多識別固定在所述固相上的靶抗體的抗體與所述固相接觸。這些抗原或抗體然後開始與固相支撐結合，這些抗原或抗體可能被適當標記以使如下文所述能夠被檢測。
均塗覆有與某臨床狀況或綜合症一致的相關抗原的該套盤可被用於識別哪種被疑及的因素導致了疾病。該盤然後將在分離的孔中單獨處理。這是特別節省材料的過程，因為能夠使用同一小量血液實施同時檢測多個不同抗原(或來自相同感染因素或來自在每一病例臨床綜合症或狀況相關的不同感染因素)的檢測。另一方法是在多個孔中使用多個樣本例如包含裂解的淋巴細胞和血漿，所述多個孔均被覆不同的結合配偶體例如抗原或抗體，以及相應地進行檢測。
用於結合配偶體的結合的技術例如抗原至固相也是及其眾所周知和在文獻中廣泛描述的。很多標準的抗原被覆過程被描述，例如在ELISA和其它固相免疫檢定中，理論和實踐問題(Theoretical andPractical Aspects)1988，ed.D.M.Kemeny S.J.Challacombe，JohnWiley Sons。如需要，該板可被洗滌和封閉，再使用標準技術。因此，例如，標準微滴定板如ELISA板可簡單地被包覆結合配偶體，通過在4℃將該板與含有如濃度為0.01至150μg/ml蛋白的結合配偶體的適當緩衝液如磷酸鹽緩衝鹽(PBS)孵育過夜，隨之使用適當封閉介質(通常為包含封閉蛋白如牛血清或來自幹牛奶的蛋白的中性緩衝液例如PBS，)封閉並在例如37℃孵育1至5小時。去除封閉液後該板即備好待用。
方便地，需用於實施本發明的方法的材料和裝置可以試劑盒的形式提供，所述試劑盒例如包含用於檢測步驟的結合配偶體包被的固相、裂解緩衝液和用於淋巴細胞分離的攜帶適當結合配偶體的固相。提供固相支撐時其可以包被有結合配偶體並適當封閉。
抗體與其抗原的結合然後被檢測。檢測步驟，就信號的閱讀來說，方便地在溶液中發生。然而，可能產生不能在溶液中讀出的不溶性產物或信號。可使用任何公知的檢測抗體結合的方法，只要產生可讀信號；例如依靠螢光、化學發光、比色或產生可檢測信號的酶反應。不使用固相時，靶抗體可通過其它血清學方法例如光散射(如用懸液計測量懸液)和諧振過程。方便地，免疫檢測可用作檢定方法，優選酶聯免疫吸附檢定(ELISA)，例如Abbott PRISM ELISA(AbbottLaboratories，Chicago，USA)或Ortho ELISA(Ortho ClinicalDiagnostics，New Jersey，USA)。然而，在本發明檢測抗體的範圍內也可考慮除ELISA外的其它檢測程序。使用包被的盤或玻璃板的技術，例如注滿裂解的淋巴細胞和/或血漿的懸液也是合適的。任何本該領域公知的用於檢測抗體的標準技術例如產生不溶或可溶產物的技術，可以被選擇用於本發明的方法，或用於定量檢測或用於定性(例如是/否)檢測。
免疫檢定，尤其ELISA技術是該領域眾所周知並已在文獻中描述(見例如ELISA和其它固相免疫檢定，理論和實踐問題；1988，ed.D.M.Kemeny S.J.Challacombe，John Wiley Sons)。
在裂解淋巴細胞樣本的接觸後，可以加入酶-抗體軛合物，例如在ELISA檢測方法中，其結合至與固相上的抗原結合的抗體。類似地，如果待測抗體通過結合配偶體例如抗異種抗體的抗體非特異性結合至固相，可以加入特異性結合待測的已固定抗體的酶-抗體軛合物。然後加入酶底物以產生可檢測信號。在本發明中，方便地使用可溶性底物，產生在溶液中可檢測的信號。這是有優勢的，因為其易化和簡化了大量樣本的操作和處理。能夠估計抗體的產生量，儘管上面提到不需絕對定量，以及如需要，可獲得定性或半定量結果。
為方便起見可選擇底物產生分光光度計可檢測的信號，其可通過讀吸收率簡便地讀出，例如使用標準ELISA板讀數器。實際上，可以使用標準ELISA試劑，其具有使本發明的檢定與現有臨床實驗室常規採用的方法和技術兼容的優勢。然而，可以使用其它檢測/信號產生系統，產生可通過螢光、化學發光等檢測的信號。
免疫-酶放大方法也可被用於提高信號和增加靈敏度，例如使用抗生物素蛋白-生物素方法如Sigma提供的Extravidin系統。生物素標記的第二抗體與過氧化物酶抗生物素蛋白複合物一起用作為ELISA試劑。由於一分子抗生物素蛋白能夠結合數分子生物素，抗生物素蛋白-生物素過氧化酶複合物增加了過氧化物酶分子的表面濃度，使該方法具有更高靈敏度。
為確保本發明的檢定方法可靠應用，可包含適當的對照用於確定抗體的存在或數量。例如為確定所記錄的信號不是由於偶然和非特異性(旁觀者)激活的淋巴細胞，可以使用陰性對照抗原。該抗原來自經研究最不可能引起該疾病或感染的感染因素，例如破傷風類毒素。這樣的旁觀者激活的淋巴細胞的數量無論如何應低於陽性結果所需要的。
本發明的淋巴細胞抗體在淋巴細胞裂解後檢測，一個益處是避免了任何孵育步驟或特殊檢定條件。因此，所述樣本中的淋巴細胞優選不在能使抗體在本發明的方法之前，即從全血樣本或衍生標本收集後產生和/或分泌的條件下孵育。允許產生和/或分泌的條件為例如在＞4℃例如從20℃到39℃例如在37℃左右孵育＞5秒鐘，例如30秒鐘至10分鐘或更長。無孵育步驟意味著樣本在取樣後可以方便地處理以實現細胞的裂解或溶解，然後溶解產物在實施檢定步驟之前可被保存，例如冷凍或冷藏一段時間。
代替地，如前所述，在淋巴細胞被裂解前，樣本例如一成分已被去除的全血、半純化(例如血沉棕黃層)或純化標本可被保存例如通過冷凍或冷藏(根據樣本選擇)一段時間例如幾小時或幾天，例如大於4小時，例如從6小時到1、2、3或4天。例如，如必需或想要，在樣本被處理以裂解細胞前純化的淋巴細胞標本可被冷凍保存一段時間例如幾小時或幾天，或冷藏例如幾小時。因此例如，純化的淋巴細胞在被處理裂解或溶解細胞前可在＞0℃≤4℃(例如在4℃)保存幾小時，例如4到6小時。血漿可以被類似地保存。
然而，已發現某些樣本例如全血標本可冷藏保存更長時間而不對細胞產生不利影響以及不幹擾檢測結果。例如已發現在開始淋巴細胞純化過程之前，全血樣本可冷藏(例如4℃)至少6天，如果需要樣本可間歇室溫(18-25℃)存放至少6小時，而不對檢測抗體的實驗的實施產生不利影響。
當血液樣本放置在實驗室和冷藏保存而常規或輔助血漿/血清檢測過程的結果尚未決定時尤其有用。這意味著淋巴細胞的物理完整性在保存過程中是保持的，因此允許隨後淋巴細胞從保存的血液中純化(如需要)並進行淋巴細胞裂解，而不顯著減少被檢測的抗體。
如果樣本即將採取並保存更長時期，則標準方法是分離淋巴細胞，裂解它們，通過冷凍分別保存淋巴細胞溶解產物和血漿。
新的代替方法是冷凍全血。這能通過加入在冷凍過程中保存淋巴細胞完整性的溶液例如包含DMSO的溶液來實施。示例中描述了在冷凍之前向全血中加入等量包含檸檬酸鹽+20％DMSO的緩衝液。DMSO保護細胞避免在冷凍過程中裂解以及，當解凍後，它們可如正常樣本一樣處理。因此在優選的方面，收集的樣本被冷凍在包含終濃度為5-15％優選7.5-12.5％，例如10％的DMSO的溶液中。選擇地DMSO可被補充聚乙二醇，這種情況下DMSO濃度可以減低，例如至3-7％，例如5％。
因此，在優選的實施例中在淋巴細胞裂解之前，例如血液樣本可以保存幾天例如直到6天或更多，尤其當在約4℃(例如從1到6℃)或更低冷藏保存時甚至允許在冷藏期間在兩次或更多次偶然情況下樣本從其冷藏環境取走例如在室溫下例如4到6小時的間隙時期，而不對檢定結果產生不利影響。當血液樣本冷藏保存而但不可避免該樣本被短時間在工作檯上室溫放置時這尤其有用。令人吃驚地，已發現依據本發明的檢定方法細胞活性未被顯著影響而幹擾或妨礙獲得可接受的結果。在另一優選實施例中，當使用純化的淋巴細胞標本時，這些樣本(和/或血漿)可以在低於4℃保存(例如＞0℃到4℃，例如幾天或更長)或在4℃以上保存(直到6小時)。
在該檢定中保存各種待用樣本的可能性使本發明的方法尤其適合於較大型診斷性實驗室，此時昂貴的自動實驗室設備例如ELISA硬體能夠同一時間使用相當大數量的樣本最有效運轉。它也意味著樣本可以在很多不同場所採集並郵寄或運送至中心診斷實驗室用於以類似於其它類型檢測中建立的用於化學血清樣本檢測的過程的方式檢測。
在本發明優選的方面中，使用單一孔檢測，其中全血樣本分為兩個部分，從這兩個部分中製備血漿樣本和淋巴細胞樣本或包含淋巴細胞部分和包含血漿部分被從單獨的全血等分試樣中分離。然後淋巴細胞被裂解以及樣本再次結合，以及抗體水平被檢測。
因此在特別優選的方面中，本發明提供了確定血液樣本中針對免疫原的抗體的數量或存在的方法，包含至少以下步驟獲得全血樣本；從所述樣本的等分試樣分離血漿；從所述樣本的等分試樣分離淋巴細胞；結合所述血漿和淋巴細胞；裂解所述淋巴細胞以釋放與所述淋巴細胞相關的抗體或其部分(此步驟可選擇地在結合之前實行)；以及在單一檢驗中檢測從淋巴細胞釋放的所述淋巴細胞抗體或其部分的數量或存在和血漿抗體的數量或存在；其中所述血漿和淋巴細胞抗體的綜合的數量和存在確定針對所述免疫原的抗體的數量或存在。
特別優選地所述淋巴細胞通過所述固相支撐上的結合配偶體親和結合至固相支撐(例如珠子，例如磁珠)，由此被分離，所述結合配偶體特異結合至所述淋巴細胞上它的結合配偶體，例如所述固相支撐攜帶結合至淋巴細胞上互補分子的抗-CD19。尤其優選地，使用清潔劑尤其優選NP-40和/或Tween 20進行裂解。尤其優選所述靶抗體的檢測通過使靶抗體和一個或更多抗原在固相上接觸而獲得。尤其優選所述全血樣本和/或從其分離的所述血漿或淋巴細胞在檢定前被冷凍。還優選，本發明的方法在多個樣本上實施，例如來自多個個體。


參考以下非限制性的示例，現在將更詳細描述本發明，其中圖1示出HIV感染中可檢測的事件。
具體實施例方式
例1人工方法製備製備檸檬酸鹽儲存溶液(1O×檸檬酸鹽)7g枸櫞酸三鈉二水化物和2.5g枸櫞酸溶於90ml蒸餾水中。將最終容量調至100ml。該溶液在2-5℃儲存。
製備急性血漿(PlasmAcute)緩衝液磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH 7.2±0.5.
每升PBS加入100μl Tween20並混勻。每90ml上述混合液中加入10ml枸櫞酸鹽儲存液。不用時需冷藏。
製備含奶粉的急性血漿緩衝液每100ml急性血漿緩衝液加入10g脫脂奶粉(Clover Elite FatFree)並混勻。使用前澄清泡沫。「脫脂」牛奶通常少於1％的脂肪。該製劑需在每次操作前新鮮配製以及不使用時需冷藏。
製備100ml 10×裂解緩衝液保存液 100ml 10×緩衝液
5M NaCl 30ml1M Tris 10ml100％NP-40 5mlTween 20 0.5ml蒸餾水 54.5ml製備磁珠計算需處理的患者樣本數(EDTA血液)。將1ml急性血漿緩衝液加入艾本德(Eppendorf)管中。必需的磁珠(一種攜帶有共價結合的小鼠單克隆抗CD19抗體的λ螢光珠)容積的計算10μl每樣本+5μl額外。將所計算量的(10μl每樣本+5l額外)磁珠保存溶液加入艾本德管中。
各溶液被輕柔混合，將該管放置在磁力表座。當管放置在表座上時將液體從管中輕柔移出。管從表座移出。加入與開始加入的保存液相同量的急性血漿緩衝液。
分離淋巴細胞標記所處理的對應於患者樣本的艾本德管。在管中加入635μl急性血漿緩衝液。加入10μl提前備好的磁珠懸浮液。在相對應的標記管中加入350μl未凝固血液並輕柔混勻。
以端-端翻轉的方式每秒一次輕柔旋轉各管5分鐘。將各管在磁力表座上放置5分鐘(不多於)。
當各管放置在表座上時將液體從管中輕柔吸出並棄去。各管從磁力表座上移去。
加入1,400μl急性血漿緩衝液，在磁力表座上再將洗滌步驟重複3次，每次3分鐘。最終的磁珠懸浮在175μl急性血漿緩衝液中。
細胞溶解將18μl的10×裂解緩衝液加入175μl細胞懸液中。用吸液管以吸起和放出的方式將其徹底混勻並在室溫下放置5分鐘。加入175μl含10％奶粉的急性血漿緩衝液。
血漿的製備通過離心(1000g，5分鐘)後回收血漿從全血樣本中製備血漿。
抗體檢測這在溶解產物和血漿上實施，混合在一起或並行。
將400μl樣本加至Abbott PRISM ELISA系統(Abbott實驗室，美國，芝加哥)。可選擇地，可應用MUREX的微滴定(microtitre)HIV ELISA-HIV 1/2 Group 0進行分析。
例2自動方法本發明的方法方便地適用於自動分析，下面的方法描述了使用BioRobot M48製備用於分析的淋巴細胞溶解產物的方案。
概述在運行該方案之前，使用者必須將血液樣本(每一待處理樣本400μl)、塑料器具和各試劑(在塑料試劑容器內)放置在遙控設備(robot)內的適當位置。被啟動後，遙控設備將用等量等於血液濃度的緩衝液1稀釋樣本。然後遙控設備將在稀釋樣本中加入CD19珠子並混合孵育5分鐘以使細胞與珠子結合。進行磁性分離，保留珠子/細胞複合物並棄去液體。珠子/細胞複合物在緩衝液1中洗滌2次，最後懸浮於緩衝液2，緩衝液2將裂解細胞膜並釋放細胞內抗體。緩衝液2保持細胞核完整，因此避免了否則將成為技術難題的粘性的增加。該方案的最後階段是用緩衝液3稀釋溶解產物，這樣做是為了加強儲存穩定性並與下遊的應用相適應。
定義平臺BioRobot M48具有六通道吸液管頭，因此同時處理六個樣本。所有與這樣的六個樣本的組直接相關的工作面位置稱為平臺。平臺包含可隨意處理的為每一樣本備有7個孔的檢定盤、六個專用樣本位置(這些在急性血漿方案中未使用，因為它們處於周圍環境溫度)、六個位於加熱平臺上的位置(一行)和六個位於洗脫平臺(溫度控制的)上的位置(一行)。
試劑容器使用者在其中充滿運行所用試劑的塑料盤。BioRobotM48具有7個小的和4個大的試劑容器。
緩衝液1優選PBS/枸櫞酸鹽/Tween緩衝液2優選1×裂解緩衝液緩衝液3優選PBS/枸櫞酸鹽/Tween/奶粉磁性分離概括地，這是一個過程，該過程中順磁性的珠子和任何與它們相聯繫的物質被吸引至磁鐵，而珠子起初在其中懸浮的液相被移除。在BioRobot M48上這通過吸出液相、珠子和細胞的混合物，然後在吸液管頂端加磁鐵以保留珠子和CD19+細胞，同時棄去其它任何物質而完成。
洗滌步驟在洗滌緩衝液中懸浮珠子，然後進行磁力分離。
引導文件這是BioRobot M48方案的一部分，其中每一步驟對於所有選擇的平臺在進行至下一個步驟之前進行。導引文件常用於在樣本處理開始之前向檢定盤和其它平臺位置分配試劑。
平臺文件這是BioRobot M48方案的一部分，其中所有步驟對於一個平臺在進行至下一個選擇的平臺之前進行。平臺文件常用於樣本的處理。
收尾文件這是BioRobot M48方案的一部分，其中每一步驟對於所有選擇的平臺在進行至下一個步驟之前進行。收尾文件常用於在樣本處理後使運轉正常，如熱-和洗脫平臺溫度的稀釋復位以及將分檔器電機回復原位。
方案的描述引導文件P2小試劑容器1中的珠子被重新懸浮以防止任何沉澱物並確保珠子的均勻分布。
P2從小試劑容器1中吸出珠子。
P2將100μl珠子分配至所有待用檢定盤的孔1中。
P3將900μl緩衝液1從大試劑容器1轉移至所有待用檢定盤的孔2和3中。
P4將400μl緩衝液1從大試劑容器2轉移至加熱平臺上待用的所有行的每個管中。
P5將180μl緩衝液2從小試劑容器2轉移至洗脫平臺上待用的所有行的每個管中。
平臺文件B2孔0中的珠子被重新懸浮並移至加熱平臺。
B3血液/緩衝液1/珠子在加熱平臺上混合孵育5分鐘。
B4吸出血液/緩衝液1/珠子，珠子用磁力保留在頂端，液體被棄去。
B5珠子/細胞在孔2的緩衝液1中重新懸浮B5吸出緩衝液1/珠子/細胞，珠子用磁力保留在頂端，液體被棄去。
B6珠子/細胞在孔3的緩衝液1中重新懸浮。
B6吸出緩衝液1/珠子/細胞，珠子用磁力保留在頂端，液體被棄去。
B7珠子/細胞在洗脫平臺上的各管內在180μl緩衝液2中被重新懸浮；細胞膜被溶解。
收尾文件E2將520μl緩衝液3從小試劑容器3中轉移至洗脫平臺上被用過的所有行的每個管中。
E2洗脫平臺的溫度減少至8℃用於保存。
例3處理前全血的冷凍冷凍全血細胞的效果被確定。所用冷凍混合物為含有枸櫞酸鹽(見例1)、含或不含20％DMSO的急性血漿緩衝液。
在全血中加入等量冷凍混合劑。然後混合物被冷凍和儲存(或-20℃或-70℃)。然後樣本被解凍至2-8℃並如新鮮全血一樣被處理(NB 50％細胞/單位容積)。每一儲存溫度全血的四個重複樣本在適當的溫度下保存過夜，然後處理所有樣本的等同容量以通過標準方法重新獲得B細胞(見例1)。使用血細胞計數器對重獲的B細胞顯微計數。用4個重複樣本的均值表示結果。

因此在DMSO存在情況下處理新鮮樣本或冷凍樣本以重獲B細胞無顯著差異。
例4B細胞溶解產物和血漿的混合已經分析了重新結合淋巴細胞溶解產物和血漿對檢定敏感性的效果。所有樣本在艾博特稜鏡(Abbott prism)系統上檢測。所示數據為6樣本和兩次重複的結果。給出了均值。陰性血漿和淋巴細胞溶解產物如例1中所述被製備和再結合，或如下所述與緩衝液結合以檢測背景水平上的再結合的效果。
300μl血漿+100μl 2×裂解緩衝液 0.34sig/cov300μl血漿+100μl 裂解緩衝液 0.34sig/cov300μl血漿+100μl 同源溶解產物 0.4sig/cov僅400μl血漿 0.38sig/covsig/cov是ELISA中產生的信號，由截止值分割，使得任何大於1的sig/cov值作為陽性結果處理以及任何小於1的sig/cov值為陰性結果。截止值基於陰性對照樣本的檢測所產生的信號對於每一實驗經統計學確定。
陰性血漿樣本的值不因或溶解產物或裂解緩衝液的存在而改變。
樣本的再結合也在陽性樣本上被檢驗。來自單一患者的血漿和淋巴細胞溶解產物中的抗體水平首先被分別檢測，然後以不同比例再結合後被檢測。
HIV陽性樣本的血漿 ＝24.5sig/cov來自同一患者的B-細胞溶解產物 ＝0.42sig/cov檢測兩重複樣本，均值在下面給出陽性血漿+同質溶解產物400μl400μl＝10sig/cov400μl0 ＝24.5sig/cov300μl100μl＝19sig/cov200μl200μl＝11sig/cov100μl300μl＝7sig/cov0 400μl＝0.42sig/cov可以看出信號僅有的減低是由於在陽性樣本中加入緩衝液的稀釋作用，即再結合溶解產物和血漿不抑制由檢定產生的信號。
以上所述的適於在艾博特稜鏡系統上應用的實踐中的變化如下400μl血漿+400μl溶解產物；混合；→最少400μl進入PRISMELISA250μl血漿+250μl溶解產物；混合；→最少400μl進入PRISMELISANB僅100μl在該檢定中檢測。
權利要求
1.一種確定血液樣本中對於免疫原的抗體的數量或存在的方法，至少包含以下步驟在所述樣本中檢測血漿抗體或其部分以及淋巴細胞抗體或其部分的數量或存在，其中所述血漿和淋巴細胞抗體被一起或在分開的檢定中被檢測，並且它們的綜合的數量或存在的確定確定了對於所述免疫原的抗體的數量或存在。
2.如權利要求1所要求的方法，其中所述血液樣本的淋巴細胞被裂解由此釋放與所述淋巴細胞相關的抗體或其部分；和從淋巴細胞釋放的所述淋巴細胞抗體或其部分的數量或存在以及血漿抗體的數量或存在被檢測。
3.如權利要求1或2所要求的方法，還包含以下步驟從所述血液樣本分離包含血漿的樣本；和從所述血液樣本分離包含淋巴細胞的樣本。
4.如權利要求1至3中之任一個所要求的方法，其中所述全血樣本被分成兩部分，用於包含淋巴細胞的樣本和包含血漿的樣本的製備。
5.如權利要求1至3中之任一個所要求的方法，其中單一全血的等分試樣被用於製備包含淋巴細胞的樣本和包含血漿的樣本。
6.如權利要求3至5中之任一個所要求的方法，其中所述包含淋巴細胞的樣本和/或所述包含血漿的樣本為純化標本。
7.如權利要求3至6中之任一個所要求的方法，其中所述包含血漿的樣本和所述包含淋巴細胞的樣本在裂解淋巴細胞之前再結合。
8.如權利要求3至6中之任一個所要求的方法，其中所述包含血漿的樣本和所述包含淋巴細胞的樣本在裂解淋巴細胞之後以及在所述檢測步驟之前再結合。
9.如權利要求7或8所要求的方法，其中所述包含血漿的樣本和包含淋巴細胞的樣本的比例為1∶0.4至1∶4之間，優選為1∶1。
10.如權利要求1至9中之任一個所要求的方法，其中所述血漿和淋巴細胞抗體在單一檢定中檢測。
11.如權利要求1至9中之任一個所要求的方法，其中所述血漿和淋巴細胞抗體在分開的檢定中檢測。
12.如權利要求1至11中之任一個所要求的方法，其中所述血液樣本為哺乳動物，優選人類的血液樣本。
13.如權利要求1至12中之任一個所要求的方法，其中所述血液樣本少於1ml。
14.如權利要求1至13中之任一個所要求的方法，其中血紅細胞被從所述血液樣本中去除。
15.如權利要求1至14中之任一個所要求的方法，其中非B淋巴細胞被從所述血液樣本中去除。
16.如權利要求1至15中之任一個所要求的方法，其中所述免疫原來自感染或接種疫苗。
17.如權利要求1至16中之任一個所要求的方法，其中所述免疫原為細菌或病毒抗原，優選抗原來自選自以下抗原的組單純皰疹病毒、巨細胞病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、口蹄疫病毒、弓形體、結核、梅毒和衣原體。
18.如權利要求1至17中之任一個所要求的方法，其中淋巴細胞通過使用化學裂解緩衝液(優選包含清潔劑)或物理裂解方法被裂解。
19.如權利要求1至18中之任一個所要求的方法，其中通過將所述抗體或其部分與一種或更多識別所述抗體或其部分、優選攜帶在固相上的抗原或抗體相接觸來檢測所述抗體或其部分。
20.如權利要求1至19中之任一個所要求的方法，其中釋放的抗體通過固相結合檢定的方法來檢測。
21.如權利要求19或20所要求的方法，其中所述固相攜帶一種或更多被待測抗體或其部分(靶抗體)所識別的抗原(固相抗原)。
22.如權利要求19或20中所要求的方法，其中所述固相攜帶一種或更多被待測抗體或其部分(靶抗體)所識別的抗體(固相抗體)。
23.如權利要求1至22中之任一所要求的方法，其中檢測步驟通過免疫檢定實施，優選為ELISA。
24.如權利要求19至23中之任一所要求的方法，其中一種或更多被固定在所述固相上的靶抗體所識別的抗原與所述固相接觸。
25.如權利要求19至23中之任一所要求的方法，其中一種或更多被固定在所述固相上的靶抗體所識別的抗體與所述固相接觸。
26.如權利要求1至25中之任一所要求的方法，其中所述檢測步驟在溶液中發生。
27.如權利要求1至26中之任一所要求的方法，其中可溶性底物被用於檢測步驟並產生分光光度檢定法可檢定的信號。
28.如權利要求1至27中之任一所要求的方法，其中使用陰性對照。
29.如權利要求19至28中之任一所要求的方法，其中應用多個固相，每個帶有識別不同靶抗體的不同抗原或抗體。
30.如權利要求1至29中之任一所要求的方法，其中用於該方法的血液樣本和/或包含淋巴細胞的樣本和/或包含血漿的樣本在淋巴細胞被裂解前在4℃或更低的溫度下保存。
31.如權利要求30所要求的方法，其中在該方法中使用的血液樣本從全血中獲得，並且所述全血在淋巴細胞被裂解之前使用5-15％DMSO被冷凍。
32.如權利要求1至31中之任一所要求的方法，其中所述樣本中的淋巴細胞不在能夠使抗體先於所述方法產生和/或分泌的條件下孵育。
33.如權利要求1至32中之任一所要求的方法，其中多個樣本被同時或按順序檢測。
34.如權利要求1至33中之任一所要求的方法，被用於識別被免疫原感染的動物，優選為被HIV感染的病人。
35.如權利要求34所要求的方法，其中所述動物被所述免疫原的感染，優選為HIV的感染，發生在從所述動物獲取血液樣本之前的小於10天內。
36.如權利要求1至35中之任一所限定的方法的用途，用於高吞吐量篩查中。
37.如權利要求36中所述的用途，其中所述篩查為血庫血液樣本的篩查。
38.如權利要求1至37中之任一所限定的方法或用途，用於確定樣本用於個體間移植或移注的適用性。
39.如權利要求1至35中之任一所限定的方法的用途，或者由權利要求36或37所限定的用途，用於診斷或監測免疫原、優選為細菌或病毒對人或非人動物或所述動物的一部分的感染，並且由所述免疫原、優選為由細菌或病毒所感染的存在或程度，通過參考適當對照和/或參照樣本來確定。
全文摘要
本發明涉及確定血液中針對免疫原的抗體的數量或存在的方法，包含至少以下步驟在所述樣本中檢測血漿抗體或其部分以及淋巴細胞抗體或其部分的數量或存在，其中所述血漿和淋巴細胞抗體一起或在單獨的檢定中檢測，以及它們的綜合的數量或存在的確定確定了針對所述免疫原的抗體的數量或存在。也提供了該方法在高吞吐量篩查、血庫樣本篩查和診斷中的應用。
文檔編號G01N33/68GK1950702SQ200480035469
公開日2007年4月18日 申請日期2004年11月1日 優先權日2003年10月31日
發明者戴維·派克 申請人:普拉斯馬柯特有限公司