一種分離鑑定糖蛋白n-糖鏈結構的方法
2023-11-03 10:17:27
一種分離鑑定糖蛋白n-糖鏈結構的方法
【專利摘要】本發明公開了一種分離鑑定糖蛋白N-糖鏈結構的方法，屬於糖鏈檢測【技術領域】。本發明通過刀豆凝集素(ConA)分離富集高甘露糖型及非高甘露糖型N-糖鏈，以基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)檢測，以信噪比6為閾值進行數據篩選，結合Glycoworkbench軟體分析。結構表明對照組鑑定出23種N-糖鏈，高甘露糖型與非高甘露糖型兩部分共鑑定出29種N-糖鏈，比ConA富集前多鑑定6種N-糖鏈，具有更高的靈敏度及更豐富的糖鏈信息，對於低峰度糖鏈的鑑定有明顯優勢。
【專利說明】一種分離鑑定糖蛋白N-糖鏈結構的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分離鑑定糖蛋白N-糖鏈結構的方法，尤其是一種以刀豆凝集素分離富集、鑑定高甘露糖與非高甘露糖型N-糖鏈的方法，屬於糖鏈檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]糖基化作為最為常見的一種蛋白質後修飾，與蛋白質的結構和功能有著密切關係，影響蛋白質的摺疊，進而影響到自身生物學功能。異常糖基化與多種疾病相關，特別是與各種癌症的發生和發展密切相關。N-糖鏈在癌症的發生發展過程中是一種重要的生物標誌物，近年研究表明，在晚期乳腺癌患者血清中檢測到N-糖鏈巖藻糖化程度的增高與唾液酸化程度的降低；在卵巢癌患者血清中檢測到唾液酸化Lewis結構的增多。近年來隨著質譜檢測技術的發展，基質輔助雷射解析電離(MALDI)及電噴霧電離(ESI)等軟電離技術具有高靈敏度、高特異性及保護生物大分子的完整性等特點，在糖鏈的檢測方面應用廣泛。然而當對一些樣品內全N-糖鏈進行質譜檢測時，發現其中含有非常豐富的高甘露糖型N-糖鏈、較少的複雜型與雜合型N-糖鏈，在圖譜上，高峰度的高甘露糖型N-糖鏈對低峰度其他N-糖鏈有著明顯的抑制作用，使得低峰度N-糖鏈信息的丟失，不能夠獲得完整N-糖鏈信息。對糖組學研究來說是十分不利的。
[0003]本發明應用凝集素分離富集高甘露糖型N-糖鏈與非高甘露糖型N-糖鏈的方法，達到分離富集不同類型N-糖鏈的目的，獲得更完整豐富的糖鏈信息。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是分離、富集不同類型N-糖鏈以獲得更完整豐富的糖鏈信息。
[0005]為此，本發明提供了一種分離鑑定糖蛋白N-糖鏈結構的方法，尤其是一種以刀豆凝集素分離富集高甘露糖與非高甘露糖型N-糖鏈並以基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)鑑定糖鏈結構的方法；是向變性蛋白中加入ConA，使之與高甘露糖型N-糖基化蛋白相結合，然後通過糖肽酶F (PNGase F)釋放全部N-糖鏈，離心收集未與ConA結合的非高甘露糖型N-糖鏈；再利用競爭性抑制劑將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上競爭性洗脫下來並收集；最後，對收集的糖鏈進行除鹽純化處理、MALD1-T0F/T0F質譜解析。
[0006]所述變性蛋白是將待檢測樣品蛋白質加入到超濾管中，用二硫蘇糖醇及碘乙醯胺使之變性。
[0007]所述競爭性抑制劑優選α -甲基-甘露糖。
[0008]所述方法優選以下步驟:(1)非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:將糖蛋白加入超濾管中，採用尿素初步變性，然後通過二硫蘇糖醇及碘乙醯胺進一步使蛋白變性，向變性蛋白中加入ConA，使之與高甘露糖型N-糖基化蛋白相結合，然後加入糖肽酶F釋放全部的N-糖鏈，離心收集未與ConA結合的非高甘露糖型N-糖鏈；(2)高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:向仍與ConA結合併留在超濾管濾膜上的高甘露糖型N-糖鏈中添加α -甲基-甘露糖，將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上競爭性替換下來，通過離心收集高甘露糖型N-糖鏈；
(3)糖鏈的除鹽純化:利用S印harose 4B對糖鏈進行純化；(4)MALD1-T0F/T0F質譜解析。
[0009]所述糖蛋白優選雞卵清白蛋白。
[0010]所述方法進一步優選以下步驟:
[0011](I)非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:
[0012]取l_2mg蛋白加入超濾管中，14000g離心濃縮至50yL左右，直接加300 μ L的8Μ尿素,充分混勻，14000g離心15min。再加入200 μ L8M尿素溶液至超濾管，14000g離心15min。棄去收集管中的流出液，加入150 μ L的1mM DTT充分混勻，56°C孵育45min，14000g離心lOmin,加入150 μ L20mM的IAM充分混勻，暗處孵育20min, 14000g離心lOmin。棄去收集管中的流出液。加入 150 μ L偶聯緩衝液(0.lmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, lmmol/LCaCl2, lmmol/L MgCl2, lmmol/L MnCl2, pH7.4)至超濾管中，14000g 離心 lOmin,重複加入偶聯緩衝液並離心3次，棄去收集管中的流出液。加入500 μ g ConA凝集素於37°C靜置孵育3h, 14000g離心lOmin，加入用150 μ L的40mM NH4HCO3至超濾管中，14000g離心1min重複加入NH4HCO3並離心3次，棄去收集管中的流出液，換新的收集管。加入用300 μ L的40mMNH4HCO3 溶解的 PNGase F(300000U/mL)充分混勻，37°C靜置孵育 12h，14000g 離心 lOmin，加200 μ L超純水至超濾管中，14000g離心lOmin,重複加入超純水並離心一次,收集流出液，冷凍乾燥得到乾燥的糖鏈以便除鹽操作。
[0013](2)高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:
[0014]向原超濾管中加入300 μ L0.5Μα -甲基-甘露糖洗脫液，於37°C靜置孵育3h，14000g離心lOmin，加200 μ L超純水至超濾管中，14000g離心lOmin，重複加入超純水並離心一次，收集流出液，冷凍乾燥得到乾燥的糖鏈以便除鹽操作。
[0015](3)糖鏈的除鹽純化:
[0016]加100 μ L的Sepharose 4Β分別至1.5mL的離心管中，向各離心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混勻，12000g離心5min，棄上清，重複清洗2次。再向各離心管中加入5:I:1的正丁醇:甲醇:水溶液lmL，混合均勻，12000g離心5min，棄上清，重複清洗2次。分別向步驟(I)、(2)獲得的凍幹的糖鏈樣品中加入500yL的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上樣至Sepharose 4B的離心管中混勻,25°C振蕩反應lh。14000g離心15min,棄上清,重複加入lmL5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液並離心3次。再加入1:1的甲醇:水溶液ImL搖勻，25°C振蕩20min, 14000g離心15min收集上清樣品並於冷凍乾燥儀中凍幹。
[0017](4)不同類型N-糖鏈MALD1-T0F/T0F質譜解析:
[0018]應用Bruker Daltonics 公司的 ultrafIeXtreme MALD1-T0F/T0F-MS 解析蛋白樣品中N-糖鏈。取5 μ L的50%的甲醇溶液完全溶解步驟(3)得到的凍幹N-糖鏈，取2 μ L糖鏈溶液點樣於MTP Anchorchip384點的祀板上,真空抽乾。再加I μ L的20mg/mL的基質DHB(2, 5-二羥基苯甲酸)至樣品板上，真空抽乾。以反射陽性離子模式鑑定多糖，分子量檢測範圍為700-5000，用校正混合物作為外標校正質譜儀。
[0019]數據分析:將糖鏈質譜數據在flexAnalysis軟體中打開，取信噪比大於6。將所得糖鏈的m/z和信號強度結果導出成.txt格式,結合Glycoworkbench軟體分析。分析參數為:選擇GlycomeDB資料庫，離子選擇[M+Na]+，電荷最多為+1，前體離子容忍度為IDa，碎片離子容忍度為0.0Ta，獲得一級糖鏈結構。
[0020]本發明技術原理:蛋白樣品與ConA在1KD濾膜上結合，其中高甘露糖型糖蛋白結合ConA，非高甘露糖型糖蛋白未與ConA結合，經過PNGase F釋放全N-糖鏈；由於非高甘露糖型N-糖鏈未與ConA結合，通過離心，於收集管中收集，相反，高甘露糖型N-糖鏈與ConA結合分子量大於10KD，離心後還留在濾膜上，通過加入α-甲基-甘露糖(與ConA有極強的結合作用，可以競爭性洗脫高甘露糖型N-糖鏈)將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上釋放，通過離心將高甘露糖型N-糖鏈收集，進而分離富集不同類型N-糖鏈用於結構解析。
[0021]本發明相比現有技術的改進之處:本發明以刀豆蛋白A分離、富集高甘露糖與非高甘露糖型N-糖鏈，以基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALD1-TOF-MS)進行鑑定的方法。對雞卵清白蛋白的結構鑑定結果表明:對照組鑑定出23種N-糖鏈，而經ConA分離富集後則多鑑定出6種N-糖鏈結構，高甘露糖型與非高甘露糖型兩部分共鑑定出29種N-糖鏈。可見本發明方法具有更高的靈敏度及更豐富的糖鏈信息，能降低高峰度的高甘露糖型N-糖鏈對低峰度其他N-糖鏈的抑制作用，用以獲得更完整豐富N-糖鏈信息，對於低峰度糖鏈的鑑定有突出優勢。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1:對照組、高甘露糖型及非高甘露糖型部分N-糖鏈結構及分子量
【具體實施方式】
[0023]雞卵清白蛋白(Ovalbumin)購自Sigma-Aldrich 公司。
[0024]試劑:尿素、二硫蘇糖醇、碘乙醯胺、碳酸氫銨、甲醇、正丁醇、Sepharose 4B均購於Sigma-Aldrich,刀豆蛋白 A 凝集素(ConA)購於 Vector labs。
[0025]儀器:ultrafleXtreme基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALD1-TOF-MS)，德國Bruker公司；離心濃縮儀，美國Iabconco公司。
[0026]實施例1雞卵清白蛋白的N-糖鏈結構解析
[0027]1、利用ConA分離、富集高甘露糖型N-糖鏈與非高甘露糖型N-糖鏈
[0028](I)非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:
[0029]取標準蛋白(雞卵清白蛋白)100yg加入超濾管中，直接加300yL的8M尿素，充分混勻，14000g離心15min。再加入200 μ L8M尿素溶液至超濾管，14000g離心15min。棄去收集管中的流出液，加入150 μ L的1mM DTT充分混勻，56°C孵育45min，14000g離心lOmin，加入150 μ L20mM的IAM充分混勻，暗處孵育20min，14000g離心lOmin。棄去收集管中流出液。加入 150 μ L偶聯緩衝液(0.lmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, lmmol/L CaCl2,lmmol/L MgCl2, lmmol/L MnCl2, pH7.4)至超濾管中，14000g離心lOmin,重複加入偶聯緩衝液並離心3次，棄去收集管中流出液。加入500 μ g ConA凝集素於37°C靜置孵育3h，14000g離心1min加入用150 μ L的40mM NH4HCO3並離心3次。棄去收集管中流出液。換新的收集管。加入用300 μ L溶解的PNGase F(300000U/mL)充分混勻，37°C靜置孵育12h，14000g離心1minJP 200 μ L超純水至超濾管中，14000g離心lOmin，重複加入超純水並離心一次，收集流出液，冷凍乾燥。
[0030](2)高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:
[0031]向原超濾管中加入300 μ L0.5M α -甲基-甘露糖洗脫液，於37°C靜置孵育3h，14000g離心10min，加200 μ L超純水至超濾管中，14000g離心10min，重複加入超純水並離心一次，收集流出液，冷凍乾燥。對照組為10yg雞卵清白蛋白未經過ConA進行富集，蛋白質變性後直接經過PNGase F酶解。
[0032](3)糖鏈的純化:
[0033]加100 μ L的Sepharose 4Β分別至1.5mL的離心管中，向各離心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混勻，12000g離心5min，棄上清，重複清洗2次。再向各離心管中加入5:I:1的正丁醇:甲醇:水溶液ImL,混合混勻，12000g離心5min,棄上清,重複清洗2次。向凍幹的糖鏈樣品中加入500μ L的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上樣至S印harose 4B的離心管中混勻，25°C振蕩反應Ih0 14000g離心15min，棄上清，重複加入lmL5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液、離心3次。再加入1:1的甲醇:水溶液ImL搖勻，25°C振蕩20min，14000g離心15min收集上清樣品並於冷凍乾燥儀中凍幹。
[0034]2、不同類型N-糖鏈MALD1-T0F/T0F質譜解析:
[0035]應用Bruker Daltonics 公司的 ultrafIeXtreme MALD1-TOF/TOF-MS 解析樣品蛋白中N-糖鏈。取5 μ L的50%的甲醇溶液完全溶解凍幹N-糖鏈，取2 μ L糖鏈溶液點樣於MTP Anchorchip384點的祀板上,真空抽乾。再加I μ L的20mg/mL的基質DHB至樣品板上，真空抽乾。以反射陽性離子模式鑑定多糖，分子量檢測範圍為700-5000，用校正混合物作為外標校正質譜儀。
[0036]將糖鏈質譜數據在flexAnalysis軟體中打開，取信噪比大於6。將所得糖鏈的m/z和信號強度結果導出成.txt格式，結合Glycoworkbench軟體分析。分析參數為:選擇GlycomeDB資料庫，離子選擇[M+Na]+，電荷最多為+1，前體離子容忍度為IDa，獲得一級糖鏈結構。將一種N-糖鏈的信號強度與該樣品中全N-糖鏈信號強度之和的比記為相對強度(Relative Intensity)。
[0037]經過ConA富集後，從圖1可見，高甘露糖型部分中的高甘露糖型N-糖鏈的信號強度比對照組與非高甘露糖型部分該糖鏈信號強度高(例如:m/zl257.477,1419.526，1581.834) ,m/z 1744.625及1905.825 (高甘露糖型N-糖)兩種N-糖鏈的信號強度也要明顯高於非高甘露糖型部分，可見ConA凝集素對高甘露糖型N-糖鏈的富集是十分明顯及有效的。高甘露糖型與非高甘露糖型兩部分中一些糖鏈沒有在對照組中有檢測到，可見相同含量的雞卵清白蛋白中全N-糖鏈經過ConA分離富集後糖鏈信息更豐富更靈敏。
[0038]且由表1可知，對照組共鑑定23種N-糖鏈，經ConA富集的高甘露糖型N-糖鏈部分共鑑定20種N-糖鏈，非高甘露糖型N-糖鏈部分共鑑定26種N-糖鏈，兩部分共鑑定出29種N-糖鏈，比ConA富集前多鑑定6種N-糖鏈，具有更高的靈敏度及更豐富的糖鏈信息對於低峰度糖鏈的鑑定有明顯優勢。
[0039]表1:對照組以及經過ConA分離富集的高甘露糖型、複雜型雜合型N-糖的相對分子質量及結構
[0040]
【權利要求】
1.一種分離鑑定糖蛋白N-糖鏈結構的方法，其特徵在於，向變性蛋白中加入刀豆凝集素，使之與高甘露糖型N-糖基化蛋白相結合，然後加入糖肽酶F釋放全N-糖鏈，離心收集與ConA結合的非高甘露糖型N-糖鏈；再利用競爭性抑制將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上競爭性洗脫下來並收集；最後，對收集的糖鏈進行除鹽純化處理、MALD1-T0F/T0F質譜解析。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，將樣品蛋白質加入到超濾管中，用二硫蘇糖醇及碘乙醯胺使之變性。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述競爭性抑制劑是α-甲基-甘露糖。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，包括以下步驟:(I)非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:將蛋白加入超濾管中，採用尿素初步變性，然後通過二硫蘇糖醇及碘乙醯胺進一步使蛋白變性，向變性蛋白中加入ConA，使之與高甘露糖型N-糖基化蛋白相結合，然後加入糖肽酶F釋放全部的N-糖鏈，離心收集未與ConA結合的非高甘露糖型N-糖鏈；(2)高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集:向仍與ConA結合併留在超濾管濾膜上的高甘露糖型N-糖鏈中添加α -甲基-甘露糖，將高甘露糖型N-糖鏈從ConA上競爭性替換下來，通過離心收集高甘露糖型N-糖鏈；(3)糖鏈的除鹽純化:利用Sepharose 4Β對糖鏈進行純化；(4)MALD1-T0F/T0F 質譜解析。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，非高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集採用如下具體步驟: 取l_2mg蛋白加入超濾管中，14000g離心濃縮至50yL，直接加300yL的8M尿素，充分混勻，14000g離心15min ;再加入200 μ L8M尿素溶液至超濾管，14000g離心15min，棄去收集管中的流出液； 力口入ΙδΟ μ L的1mM DTT充分混勻，δ6 °C孵育45min，14000g離心lOmin，力口入150 μ L20mM的IAM充分混勻，暗處孵育20min，14000g離心lOmin，棄去收集管中的流出液；加入150 μ L偶聯緩衝液至超濾管中，14000g離心lOmin，重複加入偶聯緩衝液並離心3次，棄去收集管中的流出液；所述偶聯緩衝液組成為:0.lmol/L Tris-HClU50mmol/L NaCl、lmmol/L CaCl2> lmmol/L MgCl2> lmmol/L MnCl2, pH7.4 ； 加入500 μ g ConA於37 °C靜置孵育3h，14000g離心lOmin，加入用150 μ L的40mMNH4HC03至超濾管中，14000g離心1min重複加入NH4HCO3並離心3次，棄去收集管中的流出液，換新的收集管；加入用300 μ L的40mM NH4HCO3溶解的PNGase F充分混勻，37°C靜置孵育12h，14000g離心lOmin，加200 μ L超純水至超濾管中，14000g離心lOmin，重複加入超純水並離心一次，收集流出液，冷凍乾燥得到非高甘露糖型N-糖鏈。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，高甘露糖型N-糖鏈的分離、富集採用如下具體步驟: 向原超濾管中加入300 μ L0.5Μα -甲基-甘露糖洗脫液，於37°C靜置孵育3h，14000g離心1011^11，加20(^1^超純水至超濾管中，1400(^離心lOmin，重複加入超純水並離心一次，收集流出液，冷凍乾燥得到高甘露糖型N-糖鏈。
7.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於，糖鏈的除鹽純化採用如下具體步驟: 加100 μ L的S印harose 4B分別至1.5mL的離心管中，向各離心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混勻，12000g離心5min，棄上清，重複清洗2次；再向各離心管中加入5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液lmL，混合均勻，12000g離心5min，棄上清，重複清洗2次；分別向凍幹的糖鏈樣品中加入500 μ L的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上樣至S印harose 4B的離心管中混勻，25°C振蕩反應Ih ;14000g離心15min，棄上清，重複加入lmL5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液並離心3次；再加入1:1的甲醇:水溶液ImL搖勻，25°C振蕩20min，14000g離心15min收集上清樣品並於冷凍乾燥儀中凍幹。
8.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於，MALD1-T0F/T0F質譜解析步驟為:將凍幹純化的N-糖鏈溶解於50%的甲醇溶液，點樣於MTP Anchorchip 384點的靶板上，真空抽乾；再加基質2，5-二羥基苯甲酸至樣品板上，真空抽乾；以反射陽性離子模式鑑定多糖，分子量檢測範圍為700-5000，用校正混合物作為外標校正質譜儀。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，還包括數據分析:將糖鏈質譜數據在flexAnalysis軟體中打開，取信噪比大於6 ;將所得糖鏈的m/z和信號強度結合Glycoworkbench軟體分析；分析參數為:選擇GlycomeDB資料庫，離子選擇[M+Na]+,電荷最多為+1，前體離子容忍度為IDa，碎片離子容忍度為0.5Da0
【文檔編號】G01N30/08GK104133027SQ201410291021
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】關鋒, 楊剛龍, 譚增琦, 李想, 郭佳, 龐星辰 申請人:江南大學