氧化顯色化合物或其鹽及其製備方法、以及試劑組合物及使用其的試驗用具的製作方法

2023-12-12 21:56:47 1

專利名稱：氧化顯色化合物或其鹽及其製備方法、以及試劑組合物及使用其的試驗用具的製作方法
技術領域：
本發明涉及氧化顯色化合物及其製法、以及試劑組合物及使用其的試驗用具，更詳細而言，本發明涉及優選用於生物成分測定的氧化顯色化合物及其製法、以及試劑組合物及使用其的試驗用具。

背景技術：
目前，作為以血液和尿為代表的體液(樣品)中的生物成分的測定法之一，廣泛使用利用酶的比色分析法。這些方法將測定試劑盒、自動分析儀、幹化學法試驗用具等組合，多用於日常的臨床檢查中(例如參見特開2004-223115號公報)。
作為上述測定法之一，有下述定量方法，即，使特異性氧化酶(氧化酶)作用於被測物質生成過氧化氫，進而使過氧化氫在過氧化物酶的作用下形成活性氧，用該活性氧將顯色試劑氧化，對生成的色素進行比色定量。
作為此處使用的酶，例如在葡萄糖測定中可以使用葡萄糖氧化酶、在膽固醇測定中可以使用膽固醇氧化酶、在尿酸測定中可以使用尿酸酶、在丙酮酸測定中可以使用丙酮酸氧化酶等。由於上述酶僅特異性地氧化被測物質的基質，所以能夠從含有多種成分的樣品中僅限定地定量各測定對象物。
另外，作為顯色試劑，可以使用通過被活性氧氧化其吸收波長特性或吸收強度等發生變化的色素或色素的前體(顯色團)。即，通過測定根據活性氧的量而變化的顏色，能夠定量被測物質的量。上述色素或顯色團，包括僅一分子發揮功能或不同的兩分子偶合(coupling)發揮功能的色素或顯色團。
其中，以一分子發揮功能的色素或顯色團，可以舉出無色型色素(leuco type pigment)等。作為化合物，可以舉出聯苯胺、鄰聯甲苯胺、鄰聯茴香胺、2，2』-氨基-雙(3-乙基苯並噻唑啉酮-6-磺酸)(ABTS)、雙-(4-二乙氨基)-2-磺苯基甲烷(BSPM)、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)、10-N-甲基氨基甲醯基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)、3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMBZ)、雙[4-(N-烷基-N-磺丙基)-2，6-二甲基苯基]甲烷(Bis-MAPS)、N，N，N』，N』，N」，N」-六(3-磺丙基)-4，4』，4」-三氨基三苯甲烷(TMP)等。
另外，以兩分子發揮功能的代表性的方法，包括使成色化合物(coupler compound)和Trinder’s試劑氧化偶合的方法(例如參見Trinder，P.，Am.Clin.Biochem.，6，24，1969及Barham，D.and Trinder，P.，Analyst(London)，97，142，1972)。
作為成色化合物，可以使用4-氨基安替比林(4-AA)、香草醛雙胺磺酸(vanillin diamine sulfonic acid)、甲基苯並噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯並噻唑啉酮腙(SMBTH)、氨基二苯胺或其衍生物等 作為Trinder’s試劑，例如可以使用苯酚衍生物、苯胺衍生物。作為苯酚衍生物的例子，可以舉出苯酚、4-氯苯酚、2，4-二氯苯酚、2，6-二氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2，4-二溴苯酚、2，6，4-三氯苯酚、2，6，4-三溴苯酚、3，5-二氯-2-羥基苯磺酸、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸等。另外，作為苯胺衍生物的例子，可以舉出N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙醯基乙二胺(EMAE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀醯乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺(CEMB)、N，N-雙-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺(TODB)、N-乙基-N-(2-琥珀醯氨基乙基)-3-甲基苯胺(ESET)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HSDA)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺(FDAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)等。
在實際產品中，由於存在以一分子發揮功能的色素形成試劑組合物時穩定性差的情況，所以有更多使用以兩分子發揮功能的色素的傾向。另外，在以兩分子發揮功能的色素中，多使用上述化合物中最穩定的4-氨基安替比林(4-AA)作為成色化合物，與揮發性高的苯酚衍生物相比，多使用穩定且在顯色強度或波長方面更有利的苯胺衍生物作為Trinder’s試劑。


發明內容
近年，隨著患有糖尿病和高血脂症之類生活習慣病的患者的增加，對以高精度在極短時間內測定血中葡萄糖和膽固醇濃度的技術的需求急劇增加。
鑑於上述現狀，為了增加利用顯色原理的試驗用具的價值，要求降低試劑的經時劣化，或進一步提高測定精度。另外，從檢測較微量成分的觀點考慮，也需要比現有試驗用具更加靈敏的檢測體系。現狀是在利用顯色原理的試驗用具領域中期望開發用於解決上述課題的方法。
因此，本發明的目的在於提供一種以高精度且迅速地、以高靈敏度測定各種成分濃度(例如血中濃度)的方法。
本發明人等為了解決上述課題深入地進行了各種研究，結果發現了能解決上述課題的新型成色化合物，從而完成了本發明。
即，本發明提供下述(1)～(21)所示的氧化顯色化合物及其製備方法、以及試劑組合物及使用其的試驗用具。
(1)一種氧化顯色化合物或其鹽，如下述化學式(1)所示
式中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基， R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基、或它們的鹽，此時，R3～R7中的至少一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，且其他為氫原子。
(2)如上述(1)所述的化合物或其鹽，在上述化學式(1)中，R1及R2為甲基。
(3)如上述(1)或(2)所述的氧化顯色化合物或其鹽，在上述化學式(1)中，R5為羧基或磺酸基或它們的鹽，且R3、R4、R6和R7為氫原子。
(4)如上述(1)或(2)所述的氧化顯色化合物或其鹽，在上述化學式(1)中，R4為羧基或磺酸基或它們的鹽，且R3、R5、R6和R7為氫原子。
(5)如上述(1)或(2)所述的氧化顯色化合物或其鹽，在上述化學式(1)中，R4及R6為羧基或磺酸基或它們的鹽，且R3、R5和R7為氫原子。
(6)一種試劑組合物，含有上述(1)～(5)中任一項所述的氧化顯色化合物或其鹽、Trinder’s試劑、氧化酶和過氧化物酶。
(7)如上述(6)所述的試劑組合物，其中，上述Trinder’s試劑是選自N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙醯基乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀醯乙二胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺、N，N-雙-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-琥珀醯氨基乙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺中的一種或兩種以上。
(8)如上述(6)或(7)所述的試劑組合物，還含有pH緩衝劑或增溶劑。
(9)如上述(8)所述的試劑組合物，其中，上述pH緩衝劑為有機酸鹽。
(10)如上述(9)所述的試劑組合物，其中，上述有機酸鹽為有機羧酸鹽。
(11)如上述(10)所述的試劑組合物，其中，上述有機羧酸鹽是選自乙酸、丙酸、丁酸、富馬酸、馬來酸、苯二甲酸、琥珀酸、丙二酸、檸檬酸和蘋果酸中的一種或兩種以上。
(12)如上述(8)～(11)中任一項所述的試劑組合物，其中，上述pH緩衝劑的pH為4.0～6.0。
(13)如上述(8)～(12)中任一項所述的試劑組合物，其中，上述增溶劑是選自羧甲基纖維素、聚乙二醇、對叔辛基苯酚聚氧乙烯醚、脫水山梨醇烷基化物、脫水山梨醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯壬基酚(polyoxyethylene nonylphenol)和聚氧乙烯正烷基醚中的一種或兩種以上。
(14)如上述(6)～(13)中任一項所述的試劑組合物，其中，上述氧化顯色化合物或其鹽與上述Trinder’s試劑的含量的摩爾比為1∶1～2∶1。
(15)如上述(6)～(14)中任一項所述的試劑組合物，其中，上述氧化酶為葡萄糖氧化酶。
(16)一種試驗用具，將上述(6)～(15)中任一項所述的試劑組合物保持在載體上。
(17)如上述(16)所述的試驗用具，其中，上述載體為高分子膜。
(18)如上述(17)所述的試驗用具，其中，構成上述高分子膜的材料為聚碸或聚醚碸。
(19)如上述(16)～(18)中任一項所述的試驗用具，其中，每1cm3上述載體上的上述氧化顯色化合物或其鹽的含量為15～62μmol，上述Trinder’s試劑的含量為7.5～62μmol，上述pH緩衝劑的含量為40～155μmol，上述增溶劑的含量為19～45mg。
(20)上述(1)～(5)中任一項所述的氧化顯色化合物或其鹽的製備方法，包括使化學式(2)表示的化合物和化學式(3)表示的化合物反應的步驟，
式中，R1為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基，
式中，R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基或它們的鹽，此時，R3～R7中至少有一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，其他為氫原子。
(21)上述(1)～(5)中任一項所述的氧化顯色化合物或其鹽的製備方法，包括以化學式(4)表示的化合物作為起始物質，進行亞硝化反應和隨後的還原反應的步驟，
式中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基， R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基或它們的鹽，此時，R3～R7中至少有一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，且其他為氫原子。
從下述(a)～(c)方面考慮，本發明的氧化顯色化合物及試劑組合物比現有公知的顯色化合物或試劑組合物更優異。
(a)溶解性高特別是在保持在膜狀載體上進行使用的情況下，給與(提供)樣品時本發明的氧化顯色化合物在樣品中迅速溶解，均勻化，發生呈色反應，因此可以迅速且穩定地測定。另外，可以避免在其他試劑成分和樣品中成分的影響下化合物析出等導致無法正確測定的不良情況。
除了上述優點之外，還可以調節高濃度的試劑液，有助於提高靈敏度。結果，載持在紙或膜狀載體上進行使用時，可以提高塗布液濃度，使更多的試劑保持在載體上。
(b)試劑濃度變化時對測定值的影響小即，即使在氧化顯色化合物經時地劣化，其量減少的情況下，也對測定值的影響小。另外，載持在紙或膜狀載體上進行使用時，由於塗布不勻導致的試劑濃度不均對測定值的影響變小。
(c)靈敏度高使用本發明的氧化顯色化合物或試劑組合物檢測·定量對象物質時，與使用現有的成色化合物的情況相比，可以期待吸光度變大、測定靈敏度提高。
參考下述說明和附圖中列舉的優選實施方式，說明本發明的進一步的其他目的、特點和特質。



[圖1]為表示在下述實施例5中相對於成色劑濃度的反射吸光度變化率的曲線圖。
[圖2]為表示在下述實施例6中相對於10秒反射吸光度的血糖值的曲線圖。
[圖3]為表示在下述實施例7中反射吸光度的時間變化的曲線圖。
[圖4]為表示在下述實施例8中基於改變血糖值濃度時的反射吸光度值而繪製的標準曲線的曲線圖。
[圖5]為表示在下述實施例9中熱加速(heat acceleration)後的試驗片中含有的4-AA和CP2的殘留率的曲線圖。
[圖6]為表示在下述實施例10中按照L18正交表測定相對於pH緩衝劑的pH和種類的變化的測定靈敏度變化的結果的曲線圖。
[圖7]為表示在下述實施例11中改變增溶劑的種類，測定相對靈敏度經時變化的結果的曲線圖。
[圖8]為表示下述實施例12中測定相對於成色化合物的濃度和Trinder’s試劑的濃度變化的測定靈敏度變化的結果的曲線圖。

具體實施例方式 以下，詳細說明本發明的實施方式。
[氧化顯色化合物或其鹽] 本發明的第1發明提供下述化學式(1)表示的氧化顯色化合物或其鹽(以下也簡單地稱作「氧化顯色化合物/鹽」)，
式中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基， R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基或它們的鹽，此時，R3～R7中的至少一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，且其他為氫原子。
在上述化學式(1)中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基。優選R1及R2為相同的烷基。作為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基的例子，例如可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基和新戊基。其中，如果考慮上述化學式(1)表示的氧化顯色化合物/鹽的溶解性，則R1及/或R2較優選為甲基、乙基、丙基，最優選R1及R2都是甲基。如果為上述實施方式，則上述化學式(1)表示的氧化顯色化合物/鹽顯示出充分的溶劑溶解性，抑制產生使其載持於載體上時的塗布不均，可以將試劑濃度變化時對測定值的影響抑制在最低限度。另外，與適當的Trinder’s試劑組合使其氧化顯色時可以顯著地提高測定精度。
另外，在上述化學式(1)中，R3～R7為氫原子、羧基(-COOH)或磺酸基(-SO3H)或它們的鹽。此時，R3～R7中至少有一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，且其他的R3～R7為氫原子。需要說明的是，R3～R7可以相同，也可以不同。其中，如果考慮上述化學式(1)表示的氧化顯色化合物/鹽的溶解性，則優選下述實施方式，R5為羧基或磺酸基或它們的鹽，R3、R4、R6和R7為氫原子；R4為羧基或磺酸基或它們的鹽，R3、R5、R6和R7為氫原子；或R4及R6為羧基或磺酸基或它們的鹽，R3、R5和R7為氫原子。根據上述實施方式，上述化學式(1)表示的氧化顯色化合物/鹽顯示出充分的溶劑溶解性，能夠抑制產生使其載持於載體上時的塗布不均，可以將試劑濃度變化時對測定值的影響抑制在最低限度。另外，與適當的Trinder’s試劑組合使其氧化顯色時可以顯著地提高測定精度。
即，作為本發明的優選氧化顯色化合物，可以舉出下述化合物。
·4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-COOH、R3、R4、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-SO3H、R3、R4、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(3-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-COOH、R3、R5、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-SO3H、R3、R5、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(3，5-二羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4、R6＝-COOH、R3、R5、R7＝H) ·4-氨基-1-(3，5-二磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4、R6＝-SO3H、R3、R5、R7＝H) ·4-氨基-1-(3-羧基-5-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1，R2＝-CH3、R4＝-COOH、R6＝-SO3H、R3、R5、R7＝H) 其中，作為本發明的較優選氧化顯色化合物，可以舉出下述化合物。
·4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-COOH、R3、R4、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-SO3H、R3、R4、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(3-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-COOH、R3、R5、R6、R7＝H) ·4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化學式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-SO3H、R3、R5、R6、R7＝H) 需要說明的是，羧基及磺酸基為離子性官能團，這些官能團可以是游離狀態，或者也可以形成鹽，即，R3、R4、R5、R6和R7可以是羧基或磺酸基的鹽。此時，與上述酸基形成鹽的反荷離子可以是無機離子，也可以是有機離子。例如可以舉出鈉離子、鉀離子、鈣離子等來自無機鹼的陽離子；銨離子；來自烷基胺類等有機鹼的陽離子；以及來自胺基酸類等兩性化合物的離子等。其中，上述化學式(1)表示的氧化顯色化合物是鹽的形態時，優選為鈉鹽、鉀鹽或銨鹽，較優選為鈉鹽。此處，在本發明的試劑組合物中，可以僅含有一種上述氧化顯色化合物/鹽，也可以含有兩種以上。
本發明的氧化顯色化合物/鹽的製備方法沒有特別限定，可以以同樣的方式應用現有公知的製備方法，或者對其進行適當修飾或適當組合後適當地應用。以下，說明本發明的氧化顯色化合物/鹽的製備方法的優選實施方式，但本發明的技術範圍並不限定於下述實施方式。
本發明的氧化顯色化合物/鹽優選例如通過下述製備方法進行製備，所述製備方法具有使下述化學式(2)表示的化合物(以下，也稱作「化合物(2)」)和下述化學式(3)表示的化合物(以下，也稱作「化合物(3)」)反應的步驟(以下，也稱作「步驟(A)」)。需要說明的是，在下述化學式(2)及化學式(3)中，R1及R3～R7的定義與上述化學式(1)中的定義相同，所以此處省略詳細的說明。

在步驟(A)中，使化合物(2)與化合物(3)反應時的混合比沒有特別限定。優選化合物(2)與化合物(3)分別以等摩爾混合，或相對於化合物(3)使化合物(2)稍多地進行混合。具體而言，化合物(2)的混合量相對於1摩爾化合物(3)優選為0.8～2摩爾，較優選為1～1.2摩爾。另外，化合物(2)與化合物(3)的反應條件只要是它們的反應進行的條件即可，沒有特別限定。例如反應溫度優選為20～200℃，較優選為80～150℃。另外，反應時間優選為0.5～5小時，較優選為1～1.5小時。進而，化合物(2)與化合物(3)的反應可以在無溶劑條件下進行，或也可以在溶劑中進行。作為在後者情況下可以使用的溶劑，可以舉出甲醇、乙醇、丙醇等醇類；四氫呋喃(THF)、乙醚、二氧雜環己烷等醚類；吡啶、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸等溶劑。其中，優選使用THF。在化合物(2)與化合物(3)的反應後，通過向適當的溶劑中加入反應混合物使產物固化，可以將產物從原料化合物中分離、回收。需要說明的是，步驟(A)中得到的反應產物具有下述化學式(4)中R2為氫原子(H)的結構。
接著，通過將上述步驟(A)中得到的反應產物烷基化，得到下述化學式(4)表示的化合物(以下，也稱作「化合物(4)」)(步驟(B))，
在步驟(B)中，烷基化反應可以使用以碘甲烷、碘乙烷等滷代烴為代表的烷化劑來進行。但是，烷化劑不限定於滷代烴，其他公知的烷化劑也可以同樣地進行使用。在步驟(B)的反應中也可以使用適當的溶劑或鹼。另外，反應可以在室溫或加熱條件下進行。具體而言，作為可以使用的溶劑，可以舉出與上述步驟(A)的說明欄中列舉的溶劑相同的溶劑，其中，可以優選使用甲醇或THF。另外，作為鹼，可以舉出三乙胺(TEA)、二異丙基乙基胺(DIEA)、4-(二甲氨基)吡啶等，其中可以優選使用TEA。
在步驟(B)中，烷化劑的使用量只要是可以充分地將上述步驟(A)中得到的反應產物進行烷基化的量即可，沒有特別限定。如果舉出一例，則烷化劑的使用量相對於1摩爾上述步驟(A)中得到的反應產物優選為0.5～5摩爾，較優選為1～2摩爾。另外反應條件也沒有特別限定，但上述步驟(A)中得到的反應產物的烷基化反應優選在40～200℃下，較優選在100～140℃下進行，且優選進行1～24小時，較優選為10～20小時。
接著，以上述步驟(B)中得到的化合物(4)作為起始物質，進行亞硝化反應，該亞硝化反應之後進行還原反應(步驟(C))。
在步驟(C)中，亞硝化反應也可以在無溶劑條件下進行，但優選在溶劑中進行。具體而言，亞硝化反應如下進行，將水、有機酸、或兩者的混合物用作溶劑，用鹽酸或硝酸(優選為鹽酸)等將反應體系調節至酸性，優選pH1～5，較優選pH1～2，然後加入亞硝酸鈉。此處，作為有機酸，可以舉出乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸等，優選為乙酸。另外，亞硝酸鈉的量沒有特別限定，但通常以與起始物質摩爾數相等或過剩的量進行使用，相對於起始物質優選使用1.0～4.0當量，較優選使用1.1～1.5當量。
在步驟(C)中，亞硝化反應的反應條件只要是可以充分進行亞硝化反應的條件即可，沒有特別限定。具體而言，反應溫度優選為-20℃～40℃，較優選為0～25℃。另外，反應時間優選為5秒鐘～40分鐘，較優選為10秒鐘～15分鐘。由於通過該亞硝化反應得到的產物析出，所以容易將其從反應體系中分離回收。
然後，步驟(C)在亞硝化反應之後進行還原反應。此處，還原反應可以在無溶劑條件下進行，但優選在溶劑中進行。作為可以在還原反應中使用的溶劑，只要是可以溶解亞硝化反應中得到的亞硝化反應產物的溶劑即可，沒有特別限定。作為上述溶劑，例如可以舉出水；甲醇、乙醇、丙醇等醇；乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸等有機酸等。上述溶劑可以僅單獨使用一種，也可以以混合物的形態同時使用兩種以上。另外，還原劑也沒有特別限定，例如可以使用鋅等金屬或連二亞硫酸鈉等還原性無機鹽，反應溶液可以為中性，或通過加入氫氧化鈉或鹽酸適當地調節至鹼性或酸性。優選反應溶液的pH為1～12，較優選為1～5。
在上述還原反應後，通過添加適當的溶劑使產物析出，通過過濾或使用適當的有機溶劑提取進行回收。亞硝化反應及還原反應也可以不取出亞硝化反應的產物，在同一釜中連續進行。有時被回收的產物通過重結晶或柱色譜純化，能夠得到更高純度的產物。
上述製備方法根據需要還可以包括在反應步驟之前導入適當的保護基，之後脫去保護基的步驟。作為保護基，例如相對於羧酸，可以舉出甲酯、乙酯等。
以上，說明了本發明的氧化顯色化合物/鹽的優選製備方法的例子，但本發明並不限定於這些製備方法。
本發明的第2發明是一種含有本發明第1發明的氧化顯色化合物/鹽、Trinder’s試劑、氧化酶和過氧化物酶的試劑組合物。
對本發明的試劑組合物中含有的氧化顯色化合物/鹽的具體形態如上欄中所述，此處省略詳細的說明。
對本發明的試劑組合物中的氧化顯色化合物/鹽的含量沒有特別限定，舉出一優選例為，試劑組合物為液體狀態時，溶液中的氧化顯色化合物/鹽的濃度優選為7～30mmol/100mL，較優選為10～18mmol/100mL。
以下，對本發明的試劑組合物中含有的除氧化顯色化合物/鹽之外的成分的具體實施方式
進行說明。但是，本發明的技術範圍並不限定於下述實施方式。
[Trinder’s試劑] 對Trinder’s試劑的具體形態沒有特別限定，可以適當參見現有公知技術。如果舉出一例，則可以舉出N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙醯基乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀醯乙二胺、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺、N，N-雙-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-琥珀醯氨基乙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺等。將這些Trinder’s試劑與上述氧化顯色化合物/鹽組合包含在試劑組合物中時，與使用4-氨基安替比林等已知的成色化合物時相比，測定時的發光時的吸光度增大，可以提高測定靈敏度。其中，從可以改善標準曲線斜率(即，可以提高測定靈敏度)的觀點考慮，特別優選N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)。需要說明的是，在本發明的試劑組合物中，可以僅含有一種Trinder’s試劑，也可以含有兩種以上。
將本發明的試劑組合物作為試劑用於檢測·定量對象物質時，上述氧化顯色化合物/鹽與Trinder’s試劑以1∶1(摩爾比)結合，形成色素，從而呈色。因此，氧化顯色化合物/鹽與Trinder’s試劑的含量比在理論上為1∶1(摩爾比)。但是，實際上由於上述試劑受溶解性或反應性能的影響，所以從使反應有效地進行的觀點考慮，本發明的試劑組合物中的氧化顯色化合物/鹽與Trinder’s試劑的含量比以摩爾比計優選為1∶1～2∶1，較優選為1.3∶1。
[氧化酶] 氧化酶特異性地氧化通過利用本發明的試劑組合物進行檢測·定量的對象物質，生成過氧化氫。對氧化酶的具體形態沒有特別的限定，可以適當地參見現有公知的知識。即，可以根據期望使用本發明的試劑組合物進行檢測·定量的對象物質的種類，適當地選擇氧化酶的種類。例如在葡萄糖的檢測·定量中使用葡萄糖氧化酶、在膽固醇的檢測·定量中使用膽固醇氧化酶、在尿酸的檢測·定量中使用尿酸酶、在丙酮酸的檢測·定量中使用丙酮酸氧化酶。但是，並不限定於此，當然也可以使用其他的氧化酶。本發明的試劑組合物中的氧化酶的含量沒有特別限定，但從使反應有效地進行的觀點考慮，相對於上述氧化顯色化合物/鹽的含量(1摩爾)，優選為26～130kU，較優選為26～108kU。需要說明的是，在本發明中，採用按照比色活性測定法測定得到的值作為氧化酶含量的值。
[過氧化物酶] 過氧化物酶作用於由檢測·定量的對象物質的氧化而生成的過氧化氫，生成活性氧。對過氧化物酶的具體形態沒有特別限定，可以適當參見現有公知的知識。本發明的試劑組合物中的過氧化物酶的含量沒有特別限定，但從使反應有效地進行的觀點考慮，相對於上述氧化顯色化合物/鹽的含量(1摩爾)，優選為69～470kU，較優選為69～350kU。需要說明的是，採用由比色活性測定法測定得到的值作為過氧化物酶含量的值。
[其他成分] 本發明的試劑組合物，除上述必須成分之外，根據需要還可以含有其他成分。作為試劑組合物中可以含有的其他成分，例如可以舉出pH緩衝劑、增溶劑、滲透壓調節劑、表面活性劑、穩定劑、保護劑等。對上述各成分的具體形態沒有特別限定，可以適當參見現有公知的知識。特別優選還含有pH緩衝劑和增溶劑中的至少一方。
檢測·定量對象物質時為了儘量抑制試劑組合物與樣品接觸時的pH變化，可以配合pH緩衝劑，由此，無論對試驗用具給與何種樣品都可以將反應體系的pH維持一定。結果，可以一直在相同條件下進行反應，並提高測定精度。作為pH緩衝劑的具體例，例如可以舉出磷酸鹽、硼酸鹽等無機酸鹽、或有機羧酸鹽、有機磷酸鹽、有機磺酸鹽、有機硼酸鹽、胺基酸或其鹽等有機酸鹽。其中，從提高試劑穩定性和顯色性能的觀點考慮，優選有機酸鹽，較優選有機羧酸鹽。作為用作pH緩衝劑的有機羧酸鹽的例子，例如可以舉出選自乙酸、丙酸、丁酸、富馬酸、馬來酸、苯二甲酸、乙二酸、琥珀酸、丙二酸、檸檬酸、蘋果酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸中的一種或兩種以上的酸的鹽。其中，從提高試劑穩定性和顯色性能的觀點考慮，優選苯二甲酸、琥珀酸、檸檬酸、丙二酸、乙二酸、富馬酸、馬來酸，特別優選琥珀酸、檸檬酸。pH緩衝劑為鹽的形態時，作為與酸一同形成鹽的反荷離子，例如可以舉出鋰離子、鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子、銨離子、烷基銨離子等，特別優選鈉離子、鉀離子。需要說明的是，在試劑組合物中可以單獨含有僅一種pH緩衝劑，也可以含有兩種以上。
在形成用於測定的酶或色素的過程的反應中，其反應速度多依賴於pH。因此，通過將反應體系的pH設定為試劑組合物中的酶的最適pH，可以加快反應速度。另外，根據不同情況，通過設定為適於反應體系的顯色反應的pH，也可以加快反應速度。進而，通過設定為適當的pH，也可以提高試劑成分的溶解性，加快反應速度。另外，通過設定為適當的pH，還可以提高試劑成分的保存穩定性。考慮到上述情況，pH緩衝劑的pH沒有特別限定，可以根據試劑組合物的其他成分進行適當地設定，但從顯色的反應速度優異的觀點考慮，pH緩衝劑的pH優選為4.0～6.0，較優選為4.0～5.0。另外，在優選的實施方式中，試劑組合物中的pH緩衝劑的含量，相對於上述氧化顯色化合物/鹽的含量(1摩爾)優選為1～6.7摩爾，較優選為1.9～5摩爾。
在檢測·定量對象物質時為了試劑組合物與樣品接觸時使兩者均勻地混合，可以配合增溶劑，由此可以使反應迅速地進行。另外，在本發明的試劑組合物例如以載持在載體上形成試驗用具的形態進行使用時，增溶劑也具有使載體表面的潤溼性提高的功能，結果也可以使樣品在載體表面均勻地展開。進而，也有助於使樣品一邊與試劑成分混合·反應一邊向載體內部滲透的過程均勻且迅速地進行。另外，增溶劑還具有包圍試劑成分從而減小與空氣的接觸面積的效果，還具有防止對氧化等不穩定的成分的經時劣化的功能。進而，酶等蛋白質處於乾燥狀態時，增溶劑還具有使該蛋白質的高級結構穩定化，防止其劣化的功能。作為增溶劑，例如可以使用水溶性高分子、表面活性劑等。具體而言可以舉出羧甲基纖維素(CMC)、聚乙二醇(PEG)、對叔辛基苯酚聚氧乙烯醚(例如，Union Carbide Chemicals and Plastic Co.公司制Triton(註冊商標)系列)、脫水山梨醇烷基化物(例如，ICI Americas，Inc.公司制Span(註冊商標)系列)、脫水山梨醇聚氧乙烯醚(例如，Uniqema公司制Tween系列)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物(例如，BASF AG公司制Pluronic(註冊商標)系列)、聚氧乙烯壬基酚(例如，日光Chemicals公司制Nikkol NP系列)和聚氧乙烯正烷基醚(例如，ICI Americas，Inc.公司制Brij(註冊商標)系列)。其中，優選CMC、PEG-5000～60000、Triton(註冊商標)、Tween、Pluronic(註冊商標)、NP-40、Brij(註冊商標)-58，特別優選Triton(註冊商標)X-100、Tween 20、Pluronic(註冊商標)-F68。另外，在優選方案中，試劑組合物中的增溶劑的含量，相對於上述氧化顯色化合物/鹽的含量(1摩爾)優選為480～2000g，較優選為600～1300g。
除此之外，作為本發明的試劑組合物中可以含有的成分，根據需要可以選擇滲透壓調節劑、穩定劑、保護劑等。
本發明的試劑組合物的形態沒有特別限定，可以是液體狀、粉末狀、片劑等任何一種形態。另外，優選以保持在載體上的形態使用本發明的試劑組合物。即，本發明的第3發明是將本發明第2發明的試劑組合物載持在載體上而形成的試驗用具。在上述方案中，本發明的第3發明的試驗用具包括例如載持本發明第2發明的試劑組合物形成的層，除此之外，根據需要還可以包括測量層、展開層、過濾層、固定層等其他層。使用上述試驗用具的對象物質的檢測·定量中，給與樣品後，可以採用目視判定顏色變化的方式或用分光光度計測定反射吸光度的方式。對於測定值，通過與預先製作的標準曲線相對照，可以換算為測定目標物(對象物質)的量。
以下，更詳細地說明本發明的第3發明的具體實施方式
，但本發明的技術範圍並不限定於下述實施方式。例如本發明的第2發明的試劑組合物如上所述以液體狀態使用時，將本發明的第2發明的試劑組合物與樣品混合，使之反應後，可以採用以目視判定顏色變化的方式或用分光光度計測定透過吸光度的方式。
將試劑組合物保持在載體上進行使用時，可以使用將溶解於適當溶劑的試劑組合物的溶液塗布在載體上的方法、或將含有試劑組合物的母體前體成型使其形成試驗層的方法等公知的方法。
作為載體的構成材料，可以使用紙、布帛、高分子膜等多孔質物質。其中，從顯色性能優異的觀點考慮，特別優選將高分子膜用作載體的構成材料。需要說明的是，所謂「高分子膜」是指由高分子形成的水不溶性的多孔質膜。對構成高分子膜的高分子沒有特別限定，例如可以舉出聚碸、聚醚碸、纖維素、乙酸纖維素、硝酸纖維素、聚丙烯腈、聚醯胺、芳香族聚醯胺、聚碳酸酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚醯亞胺、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇。其中，從顯色性能優異的觀點考慮，優選使用聚碸或聚醚碸。為了將上述高分子制膜形成高分子膜，可以使用公知的制膜方法。
為了將試劑組合物塗布在載體上，可以採用工業上使用的一般塗布法。
在本發明的試驗用具中，將本發明的第2發明的試劑組合物保持在載體上，保持在載體上的各成分的量沒有特別限定，可以考慮到溶液的粘性等來適當地決定各成分的量。作為保持在載體上的試劑組合物含有pH緩衝劑和增溶劑時的優選例為，每1cm3載體上，上述氧化顯色化合物/鹽的保持量優選為15～62μmol，較優選為23～39μmol。另外，每1cm3載體上Trinder’s試劑的保持量優選為7.5～62μmol，較優選為15～39μmol。進而，保持在載體上的試劑組合物含有pH緩衝劑時，每1cm3載體上pH緩衝劑的保持量優選為40～155μmol，較優選為76～115μmol。另外，保持在載體上的試劑組合物含有增溶劑時，每1cm3載體上增溶劑的保持量優選為19～45mg，較優選為24～30mg。
為了降低塗布後的液體流動和不均勻乾燥，使用準確測量少量液體後進行塗布之類的精密印刷技術，但該方法必需製備高試劑濃度的塗布液。在此方面，4-氨基安替比林等已知的成色化合物是在用於測定的各種試劑中溶解性最低的化合物，不易將其製成高濃度的塗布液。相對於此，本發明的試劑組合物中含有的上述成色化合物溶解性高，從製成高濃度的塗布液的觀點考慮，也為優選。
將本發明的第2發明的試劑組合物保持在載體上形成的本發明的第3發明的試驗用具，在給與樣品後，首先試劑組合物中含有的各成分溶解於樣品中的液體成分中，與其混合引起反應。然後，生成呈色化合物，通常向位於試驗用具的給與樣品面的相對側的讀取面移動，測定該讀取面上的色調變化，經過上述步驟進行定量。因此，試劑成分的溶解性高不僅有利於由樣品產生的均勻溶解、均勻化、迅速反應，而且還具有下述優點，即由於生成的色素也具有優異的溶解性，所以可以順利且均勻地向讀取面移動。上述特徵有助於縮短測定時間、提高測定精度、降低測定值不均。
使含有現有的作為成色化合物的4-氨基安替比林的試劑組合物保持在載體上構成試驗用具時，試劑成分經時劣化減少，與之相伴產生測定值升高的問題。作為伴有試劑成分減少的測定值升高的原因，一般認為不是由於酶反應或呈色反應的阻礙，而是由於化合物的濃度越高，對其他試劑類的溶解和移動、或生成色素的流動性產成了某種妨礙。根據本發明，與使用現有的4-氨基安替比林的情況相比較，即使量有所增減，對測定值的影響也較小，可以改善使用4-氨基安替比林呈現出的上述問題。
另外，使4-氨基安替比林等已知的成色化合物保持在載體上作為試驗用具使用時，存在濃度變化對測定值產生影響的問題。可以推測出在對大塊載體塗布時產生塗布不均的情況下，在除去塗布不均使用的各試驗用具之間產生靈敏度差，或在保存中經劣化分解使量發生變化的情況下對測定值產生影響。相對於此，根據本發明，與現有的4-氨基安替比林相比，對濃度的測定值的影響小，而且在能夠改善上述問題方面也是有利的。
實施例 用以下實施例更具體地說明本發明，但本發明的技術範圍並不限於以下實施例。
(實施例1) 4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(簡稱CP1)的合成 1-1)1-(4-羧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮的合成 將5.0g苯肼-4-甲酸(關東化學株式會社制41179-1A)與5.9g 3-氧代丁酸乙基酯(東京化成工業株式會社制A0649)的混合物於120℃下加熱攪拌1小時。放冷後過濾收集析出的固體，用乙醇洗滌後，乾燥，得到8.3g目標物。
1-2)1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯的合成 將3.0g上述1-1)中得到的1-(4-羧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮、3.9g碘甲烷(關東化學株式會社制I0060)、100mL甲醇加入高壓反應容器中，於120℃下加熱攪拌15小時。蒸發乾固反應混合物後，使之溶解於氯仿中，水洗後，用無水硫酸鈉乾燥有機層。蒸發乾固有機層，得到2.6g目標物。
1-3)4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯的合成 將2.0g上述1-2)中得到的1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯溶解於25mL 0.4N鹽酸中，在冰冷下經2分鐘加入1.2mL40％亞硝酸鈉水溶液(關東化學株式會社制37402-00)。接著，於室溫下攪拌10分鐘，將析出的固體過濾收集、洗滌、乾燥。將固體溶解於10mL甲醇中，加入2mL 4N鹽酸、1.1g鋅粉(關東化學株式會社制48005-00)，於45℃下攪拌10分鐘。過濾反應混合物後，將濾液濃縮幹固，用於以甲醇/氯仿(1∶9)作為溶劑的矽膠柱色譜。濃縮幹固主要餾分，得到1.0g目標物。
1-4)4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 將0.37g上述1-3)中得到的4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯溶解於5mL甲醇，加入0.25mL 4N氫氧化鈉水溶液，於室溫下反應30分鐘。將反應混合物用強酸性陽離子交換樹脂(Aldrich公司制216534-250G)處理後，濃縮幹固，得到0.25g目標物。
如上所述得到的目標物的NMR的分析結果如下述表1所示。
[表1] 1H -NMR(DMSO-d6)2.08ppm(s，3H，C-CH3)，2.73ppm(s，3H，N-CH3)，3.83pm(br，2H ，NH2)，7.29-7.94ppm(4H，芳香性) (實施例2) 4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(簡稱CP2)的合成 2-1)1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 將3.0g 1-(4-磺苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(Aldrich公司制134163-25G)、3.4g碘甲烷(關東化學株式會社制I0060)、100mL甲醇加入高壓反應容器中，於130℃下加熱攪拌15小時。蒸發乾固反應混合物後，用乙醇進行重結晶，得到1.4g目標物。
2-2)4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 將0.5g上述2-1)中得到的1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮溶解於10mL 0.4N鹽酸中，在冰冷下加入亞硝酸鈉(關東化學株式會社制37402-00)的40％水溶液0.35mL，攪拌1分鐘，加入500mg鋅粉(關東化學株式會社制48005-00)，進而於室溫下攪拌10分鐘。過濾反應混合物後，濃縮幹固濾液，得到0.41g目標物。
如上所述得到的目標物的NMR的分析結果如下述表2所示。
[表2] 1H NMR(D2O)2.27ppm(s，3H，C CH3)，3.15ppm(s，3H，N-CH3)，7.44-7.99ppm(4H，芳香性) (實施例3) 4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(簡稱CP6)的合成 3-1)1-(3-磺苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮的合成 將5.0g苯肼-3-磺酸與6.1g 3-氧代丁酸乙基酯的混合物於120℃下加熱攪拌1小時。將反應混合物放冷，將析出的固體過濾收集，洗滌、乾燥，得到8.0g目標物。
3-2)1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 將3.0g上述3-1)中得到的1-(3-磺苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮、3.4g碘甲烷、100mL甲醇加入高壓反應容器中，於130℃下加熱攪拌15小時。蒸發乾固反應混合物後，用乙醇進行重結晶，得到1.5g目標物。
3-3)4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 將0.5g上述3-2)中得到的1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮溶解於10mL 0.4N鹽酸中，在冰冷下加入0.35mL 40％亞硝酸鈉水溶液，攪拌1分鐘，加入500mg鋅粉，進而於室溫下攪拌10分鐘。過濾反應混合物後，將濾液濃縮幹固，得到0.37g目標物。
如上所述得到的目標物的NMR的分析結果如下述表3所示。
[表3] 1H-NMR(D2O)2.24ppm(s，3H，C-CH3)，3.11ppm(s，3H，N-CH3)，7.35-8.21ppm(4H，芳香性) (實施例4) 以用於測定葡萄糖的塗布液組成為例，對能否製成幾倍厚度的塗布液進行實驗。即，使用下述基本組成，即使用改變各成色劑的種類和量(使其成為與4-氨基安替比林相等的摩爾量)的組成，來增加全部試劑時，觀察是否可以得到達到幾倍量的均勻溶液。結果如下述表4所示。
基本組成(在100mL水中) 1.0g成色化合物(4-AA)、0.8g Trinder’s試劑(TOOS)、5.0g Triton(註冊商標)X-100、2.0g葡萄糖氧化酶、0.5g過氧化物酶、0.05M檸檬酸鈉-檸檬酸(調節pH＝5.0) [表4] 由上表4可知，與目前作為成色劑通常使用的4-氨基安替比林相比，本發明的化合物(CP1、CP2和CP6)均顯示出較高溶解性，因此通過使用本發明的化合物，可以製備濃厚的塗布液。
(實施例5) 製備僅改變成色劑濃度的組成的試驗膜，評價對葡萄糖定量值的影響。即，使用下述組成的塗布液，在聚醚碸膜(泰爾茂株式會社制、膜厚130μm)上進行塗布，於35℃下乾燥18小時。將膜衝載為邊長1cm的正方形，將其置於反射分光光度計後，從試驗膜上部滴加1μL的樣品，測定10秒後的反射吸光度。使用將紅細胞比積值調節至40％、血糖值調節至100mg/dL的人血液作為樣品。其結果示於圖1。
如圖1所示，與4-氨基安替比林(圖1中的「4AA」)相比，本發明的化合物(CP1、CP2、CP6)均呈現出靈敏度的濃度依存性降低。
塗布液組成(在100mL 0.1M檸檬酸鈉-檸檬酸緩衝液(pH＝5.0)中) 4.0g/5.6g/8.0g成色化合物、3.2g Trinder’s試劑(MAOS)、20.0gTriton(註冊商標)X-100、8.0g葡萄糖氧化酶、2.0g過氧化物酶 (實施例6) 在實施例5製備得到的成色劑濃度中，對於使用CP2的所得的產物，製成基本組成相同的試驗膜。使用此試驗膜，根據在多種葡萄糖濃度下測定得到的值，繪製標準曲線，觀察定量靈敏度。需要說明的是，評價法與實施例5所示的方法相同。結果如圖2中標準曲線所示。在圖2中，由於x軸表示反射吸收度、y軸表示血糖值，所以斜率越平緩，表示靈敏度越高。
如圖2所示，本發明的4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(CP2)與作為Trinder’s試劑的MAOS組合使之顯色時，與使用4-氨基安替比林時相比，該標準曲線的斜率有所改善、可以顯著地提高測定靈敏度。
(實施例7) 使用如下述表5所示組成的塗布液，通過吻合塗布法(kiss-coat)，將其塗布在泰爾茂株式會社制聚醚碸膜(膜厚130μm)上，於37℃乾燥18小時。之後，將膜裁成邊長1cm的正方形，得到試驗片。
[表5] 塗布液組成(在100mL 0.4M琥珀酸鈉緩衝液(pH＝5.0)中) 利用血液的評價如下進行將試驗片固定在反射分光光度計上後，從試驗膜上部滴加1μL樣品，通過測定連續的或規定時間內的反射吸光度進行評價。
作為成色化合物，使用4-氨基安替比林(4-AA)、CP1或CP2，使用按上述方法製成的試驗片，將紅細胞比積值調節為40％、血糖值調節為400mg/dL的人血液作為樣品，測定反射吸光度的時間變化。結果示於圖3。由圖3所示的結果可知，作為現有成色化合物的4-AA，反射吸光度值達到穩定需要15秒左右，但CP1在不足5秒內反射吸光度值達到穩定，CP2在3秒左右反射吸光度值達到峰值。即，表明通過採用本發明的試劑組合物，可以縮短測定時間。
(實施例8) 使用實施例7中製作的試驗片，將紅細胞比積值為40％、使血糖濃度變化為血糖值50、100、400、600mg/dL的人血液作為樣品，測定反射吸光度值，由所得的反射吸光度值繪製標準曲線，對測定靈敏度進行比較。結果示於圖4。由於圖4的Y軸(縱軸)為血糖值濃度(輸入值)，X軸(橫軸)為反射吸光度值(輸出值)，所以標準曲線的斜率越小表示測定靈敏度越高。由圖4所示的結果可知，CP1及CP2與4-AA相比，標準曲線的斜率變小。即，表明通過採用本發明的試劑組合物，可以提高測定靈敏度。
(實施例9) 使用如下述表6所示的組成的塗布液，通過吻合塗布法，將其塗布在泰爾茂株式會社制聚醚碸膜(膜厚130μm)上，於37℃乾燥18小時。之後，將膜裁成成Φ6mm的圓，得到試驗片。
[表6] 塗布液組成(在100mL 0.4M琥珀酸鈉緩衝液(pH＝5.0)中) 將試驗片在真空狀態的60℃烘箱內保存1小時，實施熱加速後，用1mL 60％乙腈水溶液，進行超聲波處理10分鐘，進行提取。所得的提取液在下述條件下用HPLC測定試劑量，洗脫液60％乙腈/50mM磷酸緩衝液(pH7.5)、洗脫液流速1mL/min、柱溫40℃、色譜柱HydrosphereC18250×4.6mm(株式會社YMC制)、測定波長254nm、進樣量20μL。通過上述方法，比較相對於熱加速前的試驗片、熱加速後的試驗片中含有的4-AA和CP2的殘留率。結果示於圖5。由圖5所示的結果可知，4-AA的殘留率為70％以下，相對於此CP2的殘留率約為100％。即，表明通過採用本發明的試劑組合物，可以提高試驗用具的經時穩定性。
(實施例10) 使用根據L18實驗正交表(9因素、3水平)將下述表7所示的組成的塗布液組合所得的塗布液，通過吻合塗布法，將其塗布在泰爾茂株式會社制聚醚碸膜(膜厚130μm)上，於37℃乾燥18小時。之後，將膜裁成成邊長為1cm的正方形，得到試驗片。
[表7] 塗布液組成(在100mL緩衝液中) 利用血液的評價如下進行將試驗片固定在反射分光光度計上後，從試驗膜上部滴加1μL的樣品，通過測定連續的或規定時間內的反射吸光度進行評價。
對於各試驗片，將紅細胞比積值為40％、使血糖濃度變化為血糖值50、100、400、600mg/dL的人血液作為樣品，測定反射吸光度值，由得到的反射吸光度值繪製標準曲線，計算測定靈敏度。在18種組合中，對pH緩衝劑的pH和pH緩衝劑的種類分別計算測定靈敏度，並進行比較。結果如圖6所示。由圖6所示的結果可知，pH緩衝劑的pH越低，測定靈敏度越高，琥珀酸、檸檬酸作為pH緩衝劑優異。
(實施例11) 使用如下述表8所示組成的塗布液，通過吻合塗布法，將其塗布在泰爾茂株式會社制聚醚碸膜(膜厚130μm)上，於37℃乾燥18小時。之後，將膜裁成邊長1cm的正方形，得到試驗片。
[表8] 塗布液組成(在100mL 0.4M琥珀酸鈉緩衝液(pH＝5.0)中) 利用血液的評價如下進行將試驗片固定在反射分光光度計上後，從試驗膜上部滴加1μL的樣品，通過測定連續的或規定時間內的反射吸光度進行評價。
使用Triton(註冊商標)X-100、Tween20、Pluronic-F68作為增溶劑，將按上述方法製成的試驗片於60℃下在避光乾燥狀態下保存一定時間(熱加速試驗)。對保存一定時間的試驗片，使用紅細胞比積值40％、血糖值400mg/dL的人血液作為樣品進行測定，將測定得到的相對靈敏度的經時變化示於圖7。由圖7所示的結果可知，上述3種增溶劑中，Triton(註冊商標)X-100的相對靈敏度的減小最少，經時穩定性優異。
(實施例12) 利用實施例10中製成的試驗片，使用紅細胞比積值為40％、使血糖濃度變化為血糖值50、100、400、600mg/dL的人血液作為樣品，對各試驗片進行測定，由所得的反射吸光度值繪製標準曲線，計算測定靈敏度。在18種組合中，對成色化合物的濃度和Trinder’s試劑的濃度分別計算測定靈敏度，並進行比較。結果示於圖8。由圖8所示的結果可知，成色化合物的濃度為5mmol/100mL與為10mmol/100mL相比，測定靈敏度明顯低，在10mmol/100mL以上的狀態下，測定靈敏度穩定，因此成色化合物的必要最低濃度為10mmol/100mL以上。另外，Trinder濃度在設定的濃度範圍內測定靈敏度穩定，因此可以依照作為偶合對象的成色劑的濃度進行設定。
需要說明的是，本申請以2007年3月20日申請的日本專利申請第2007-72807號及2007年9月28日申請的日本專利申請第2007-254475號為基礎，作為參考，其公開的內容全文引用。
權利要求
1、一種氧化顯色化合物或其鹽，如下述化學式(1)所示
式中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基，
R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基或它們的鹽，此時，R3～R7中的至少一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，且其他為氫原子。
2、如權利要求1所述的氧化顯色化合物或其鹽，在所述化學式(1)中，R1及R2為甲基。
3、如權利要求1或2所述的氧化顯色化合物或其鹽，在所述化學式(1)中，R5為羧基或磺酸基或它們的鹽，且R3、R4、R6和R7為氫原子。
4、如權利要求1或2所述的氧化顯色化合物或其鹽，在所述化學式(1)中，R4為羧基或磺酸基或它們的鹽，且R3、R5、R6和R7為氫原子。
5、如權利要求1或2所述的氧化顯色化合物或其鹽，在所述化學式(1)中，R4及R6為羧基或磺酸基或它們的鹽，且R3、R5和R7為氫原子。
6、一種試劑組合物，含有權利要求1～5中任一項所述的氧化顯色化合物或其鹽、Trinder’s試劑、氧化酶和過氧化物酶。
7、如權利要求6所述的試劑組合物，其中，所述Trinder’s試劑是選自N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙醯基乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀醯乙二胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺、N，N-雙-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-琥珀醯氨基乙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺中的一種或兩種以上。
8、如權利要求6或7所述的試劑組合物，還含有pH緩衝劑或增溶劑。
9、如權利要求8所述的試劑組合物，其中，所述pH緩衝劑為有機酸鹽。
10、如權利要求9所述的試劑組合物，其中，所述有機酸鹽為有機羧酸鹽。
11、如權利要求10所述的試劑組合物，其中，所述有機羧酸鹽是選自乙酸、丙酸、丁酸、富馬酸、馬來酸、苯二甲酸、琥珀酸、丙二酸、檸檬酸和蘋果酸中的一種或兩種以上。
12、如權利要求8～11中任一項所述的試劑組合物，其中，所述pH緩衝劑的pH為4.0～6.0。
13、如權利要求8～12中任一項所述的試劑組合物，其中，所述增溶劑是選自羧甲基纖維素、聚乙二醇、對叔辛基苯酚聚氧乙烯醚、脫水山梨醇烷基化物、脫水山梨醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯壬基酚和聚氧乙烯正烷基醚中的一種或兩種以上。
14、如權利要求6～13中任一項所述的試劑組合物，其中，所述氧化顯色化合物或其鹽與所述Trinder’s試劑的含量的摩爾比為1∶1～2∶1。
15、如權利要6～14中任一項所述的試劑組合物，其中，所述氧化酶為葡萄糖氧化酶。
16、一種試驗用具，是將權利要求6～15中任一項所述的試劑組合物保持在載體上而形成的。
17、如權利要求16所述的試驗用具，其中，所述載體為高分子膜。
18、如權利要求17所述的試驗用具，其中，構成所述高分子膜的材料為聚碸或聚醚碸。
19、如權利要求16～18中任一項所述的試驗用具，其中，每1cm3所述載體上的所述氧化顯色化合物或其鹽的含量為15～62μmol，所述Trinder’s試劑的含量為7.5～62μmol，所述pH緩衝劑的含量為40～155μmol，所述增溶劑的含量為19～45mg。
20、權利要求1～5中任一項所述的氧化顯色化合物或其鹽的製備方法，包括使化學式(2)表示的化合物和化學式(3)表示的化合物反應的步驟，
式中，R1為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基，
式中，R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基或它們的鹽，此時，R3～R7中的至少一個為羧基或磺酸基或它們的鹽，其他為氫原子。
21、權利要求1～5中任一項所述的氧化顯色化合物或其鹽的製備方法，包括以化學式(4)表示的化合物作為起始物質，進行亞硝化反應和隨後的還原反應的步驟，
式中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基，
R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基或它們的鹽，此時，R3～R7中至少有一個為羧基或磺酸基或它們的鹽、且其他為氫原子。
全文摘要
本發明的目的在於提供一種以高精度且迅速地、高靈敏度測定各種成分濃度的方法。本發明涉及所述化學式(1)表示的氧化顯色化合物或其鹽及其製備方法、以及試劑組合物及使用其的試驗用具，在所述化學式(1)中，R1及R2分別獨立地為碳原子數1～5的直鏈狀或支鏈狀的烷基，R3、R4、R5、R6和R7分別獨立地為氫原子、羧基或磺酸基、或它們的鹽，此時，R3～R7中的至少一個為羧基或磺酸基、或它們的鹽，且其他為氫原子。
文檔編號C07D231/46GK101641334SQ20088000879
公開日2010年2月3日 申請日期2008年3月6日 優先權日2007年3月20日
發明者川西徹朗, 齊藤讓, 有賀貴子 申請人:泰爾茂株式會社