使用包含cmp或酪蛋白種類的給料來分離骨橋蛋白的方法

2023-12-12 13:56:37 2

使用包含cmp或酪蛋白種類的給料來分離骨橋蛋白的方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於從包含酪蛋白巨肽和/或游離β酪蛋白的乳源給料（例如，像基於乳血清或甜乳清的一種給料）中分離骨橋蛋白的方法。具體來說，本方法涉及使用該乳源給料的一個窄窗位的pH和比電導，這已經出乎意料地被證明實現了從化學上複雜的給料中非常有效地分離骨橋蛋白。
【專利說明】使用包含CMP或酪蛋白種類的給料來分離骨橋蛋白的方法
發明領域
[0001]本發明涉及一種用於從一種乳源給料(例如,基於乳血清(milk serum)或甜乳清的一種給料)中分離骨橋蛋白的方法。具體來說，本方法涉及使用該乳源給料的一個窄窗位的PH和比電導，這已經出乎意料地被證明實現了從化學上複雜的給料中非常有效地分離骨橋蛋白。
[0002]發明背景
[0003]骨橋蛋白是一種酸性的、高度磷酸化的、唾液酸豐富的、鈣結合蛋白。骨橋蛋白含有約28摩爾結合磷酸鹽/摩爾骨橋蛋白，並且結合約50摩爾鈣/摩爾骨橋蛋白。
[0004]骨橋蛋白(OPN)是在許多生物過程中涉及的一種多功能生物活性蛋白，這些生物過程如骨重塑、異位鈣化抑制、以及細胞粘附與遷移、還有若干免疫功能。骨橋蛋白具有細胞因子樣特性並且是啟動T輔助I型免疫應答的一個關鍵因素。骨橋蛋白存在於大多數組織和體液中，並且發現在乳中濃度最高。
[0005]為了支持在異位鈣化中OPN的抑制功能，使用了 OPN缺陷小鼠的體內模型在外源性添加這種蛋白質時顯示出鈣化減弱。此外，在泌尿道防禦腎結石的形成中涉及0PN，因為OPN可以抑制一水草酸鈣晶體的生長和聚集。
[0006]目前尚不清楚乳中OPN的生物學作用；然而，可以推測若干功能。已經報導在乳腺發育和分化中涉及骨橋蛋白，並且已經在泌乳早期在乳腺中觀察到高水平的OPN表達。此外，該蛋白質的高陰離子性質可以使得OPN能夠與鈣離子形成可溶性絡合物，並且從而抑制乳中無意的鈣結晶和沉澱。
[0007]在科學文獻中，骨橋 蛋白典型地是從骨或乳中純化出的，並且該蛋白質典型地以20mg/L的濃度存在於牛乳中。在乳中，骨橋蛋白是一種血清蛋白，但取決於Ca2+的水平還可能在一定程度上與酪蛋白膠束締合。酸乳清是用於骨橋蛋白的工業生產的優選原材料。當酸乳清形成時，骨橋蛋白被認為在Ca2+洩漏進入血清相時離開酪蛋白膠束。此方面使酸乳清成為骨橋蛋白的一個直接來源。由於相同的原因，甜乳清具有稍低的骨橋蛋白質含量。此外，甜乳清含有來自K-酪蛋白(kappa-casein)的酶裂解的酪蛋白巨肽(CMP)。CMP與骨橋蛋白在生化方面具有許多相似之處-都是小的、柔性的、酸性的、磷酸化的糖蛋白。由於此原因，CMP和骨橋蛋白被認為在其結合離子交換樹脂方面相當類似，這將在從含CMP的原材料中純化骨橋蛋白中造成問題。另一方面是由用於奶酪製作的蛋白水解酶所引起的骨橋蛋白的可能降解。無論是對於工業生產還是對於科學研究，這三個方面可能已導致避免使用這種原材料來純化骨橋蛋白。
現有技術
[0008]W002/28413A1描述了一種藉助於低pH陰離子交換來從給料(如乳和酸乳清)中生產含骨橋蛋白的組合物的方法。在W002/28413A1中，強調了無論是工藝給料還是所得的產品都不可能含有cGMP，cGMP是已知結合陰離子交換劑並且將抑制骨橋蛋白的結合的一種類型的CMP。[0009]W001/149741A2描述了一種方法，其中通過以下方式從一種乳材料中純化出骨橋蛋白:將該乳材料與可溶性鈣混合併調節該混合物的PH，以便選擇性地沉澱乳清的其他蛋白質組分同時保留溶液中的骨橋蛋白。
[0010]發明簡述
[0011]本發明人已經發現，出乎意料地並且與在現有技術中發現的偏見相反，可以通過陰離子交換從多種複雜的乳源給料中以高產量和高純度分離出骨橋蛋白，儘管給料存在多種競爭蛋白。本發明人已經發現，給料的比電導對於骨橋蛋白的產量和純度特別重要，並且已經確定了用於從乳源給料中分離骨橋蛋白的最佳比電導窗位。
[0012]因此，本發明的一個方面涉及一種用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法，該方法包括以下步驟:
[0013]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-10mS/cm的範圍內的比電導，
[0014]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0015]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0016]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0017]本發明可以例如涉及一種用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法，該方法包括以下步驟:
[0018]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-1OmS/cm的範圍內的比電導，並且其中所述乳源給料進一步包含
[0019]-相對於乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1%（w/w)的酪蛋白巨肽，或
[0020]-游離α酪蛋白和游離酪蛋白，
[0021]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0022]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0023]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0024]因此，在本發明的一些優選實施例中，用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括以下步驟:
[0025]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-1OmS/cm的範圍內的比電導，並且其中所述乳源給料進一步包含相對於乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的酪蛋白巨肽，
[0026]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0027]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0028]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。[0029]在本發明的其他優選實施例中，用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括以下步驟:
[0030]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-1OmS/cm的範圍內的比電導，並且其中所述乳源給料進一步包含游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白，
[0031]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0032]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0033]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0034]在本發明的另外的優選實施例中，用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括以下步驟:
[0035]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-1OmS/cm的範圍內的比電導，並且其中所述乳源給料進一步包含
[0036]-相對於乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1%(w/w)的酪蛋白巨肽，以及
[0037]-游離a酪蛋白和游離P-酪蛋白，
[0038]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，`
[0039]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0040]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0041]除了上面所提到的優點外，本方法允許更具成本效益地使用該陰離子交換介質，並且允許每kg陰離子交換介質骨橋蛋白的更高產量。
[0042]本方法的另一優點是如實例5中所展示的每個陰離子交換周期提高的骨橋蛋白產量。
[0043]水溶液的「比電導」(有時被稱為「比電導率」)是該溶液導電能力的一個量度。該比電導可以(例如)通過測量該溶液在兩個電極之間的AC電阻來確定，並且典型地以單位毫西門子每釐米(mS/cm)來給出結果。比電導的測量可以例如根據EPA (美國環境保護署)方法第120.1號進行測量。
[0044]本發明的又一方面涉及通過本方法獲得的含骨橋蛋白的組合物。
[0045]本發明的再一方面因此涉及一種含骨橋蛋白的組合物。
[0046]附圖簡述
[0047]圖1.在5.5mS/cm的比電導下甜乳清源給料的pH對骨橋蛋白的純度和產量的影響，
[0048]圖2.在pH4.3下甜乳清源給料的比電導對骨橋蛋白的純度和產量的影響，以及
[0049]圖3.在pH4.3下酸乳清源給料的比電導對OPN的純度和產量的影響。
[0050]發明詳細說明
[0051]如所提到的，本發明的一個方面涉及一種用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法，該方法包括以下步驟:
[0052]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-10mS/cm的範圍內的比電導，並且
[0053]其中所述乳源給料進一步包含
[0054]-相對於乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1%(w/w)的酪蛋白巨肽，或
[0055]-游離α酪蛋白和游離酪蛋白，
[0056]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0057]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0058]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0059]典型地按順序執行該方法的這些步驟，例如，步驟a)、b)、c)、以及d)。然而，在本發明的一些實施例中，該方法的步驟c)被省略，並且在這種情況下，該方法包括步驟a)、b)、以及d) ο
[0060]在本發明的背景中，術語「分離骨橋蛋白」涉及相對於在步驟d)過程中從陰離子交換介質中回收的蛋白質的總重量而言重量百分比為至少70% (w/w)、優選為至少80% (w/W)、並且甚至更優選為至少90%(w/w)的骨橋蛋白富集。分離骨橋蛋白可能例如涉及相對於在步驟d)過程中從陰離子交換介質中回收的蛋白質的總重量而言重量百分比為至少95%(w/w),如至少97% (w/w)的骨橋蛋白富集。
[0061]該方法對於改進從包含等電點(pi)小於5.0的額外蛋白質的乳源給料(例如，含有CMP的乳源給料)中選擇性富集骨橋蛋白特別有用。術語「選擇性富集」應被理解為提高該乳源給料的骨橋蛋白與其他蛋白質的總量之間的摩爾比。
[0062]蛋白質的等電點優選通過在25°C下進行等電聚焦來確定。
[0063]在本發明的背景中，術語「乳源給料」涉及接觸陰離子交換介質的液體給料。
[0064]該乳源給料是源於來自一種或多種哺乳動物源的乳，如來自人、牛、綿羊、山羊、水牛、駱駝、美洲駝、馬和/或鹿的乳。在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料是源於牛乳。
[0065]在本發明的背景中，術語「乳源給料」、「甜乳清源給料」、「酸乳清源給料」、以及「乳血清源給料」涉及其中至少總蛋白質的50% (w/w)分別來源於乳、甜乳清、酸乳清或乳血清的給料。在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料的總蛋白質的至少90% (w/w)、並且優選地基本上全部來源於乳、甜乳清、酸乳清或乳血清。
[0066]在本發明的背景中，術語「乳」涉及從處於泌乳期間的哺乳動物的乳腺獲得的液體。術語「乳」應被廣義地解釋，並且涵蓋生乳(即，直接從乳腺獲得的液體)和標準化乳製品(例如像脫脂乳或全脂乳)兩者，其中乳脂肪的濃度相對於最初的生乳已被降低。
[0067]乳清是一個集體術語，是指在從乳製造奶酪或酪蛋白的過程中產生的水樣副產物。
[0068]在本發明的背景中，術語「甜乳清」涉及在基於凝乳酶的乳凝結過程中獲得的乳清，該凝結過程例如發生在黃奶酪的生產過程中。
[0069]在本發明的背景中，術語「酸乳清」涉及在乳的化學或生物酸化過程中獲得的乳清，該酸化過程例如發生在農家奶酪或夸克奶酪(quark)的生產過程、或在酪蛋白/酪蛋白酸鹽的生產過程中。
[0070]在本發明的背景中，術語「乳血清」也被稱為「血清乳清」、「原生乳清」或「抗乳血清」，它涉及已除去乳脂肪和酪蛋白膠束的乳。然而，乳血清典型地含有一些游離酪蛋白種類，這些游離酪蛋白種類在膠束被除去之前已經從這些原生酪蛋白膠束中離解。乳血清可以例如通過將一種脫脂乳微濾通過具有約0.1微米的孔徑的過濾器或膜，並且收集所得的滲透物作為乳血清來生產。根據Evans等人可以生產乳血清。
[0071]如將理解的，可能已經使該乳、甜乳清、酸乳清或乳血清經受若干處理步驟來製備乳源給料。
[0072]乳或乳相關的產品的處理典型地涉及一個或多個熱處理過程，如巴氏滅菌(例如，72°C下持續15秒)或高巴氏滅菌(例如，85°C下持續20秒)。
[0073]可替代地、或另外地，該處理可以涉及一個或多個過濾步驟。微濾可以被用來除去微生物，或可替代地來濃縮酪蛋白。超濾或納濾可以(例如)被用來濃縮乳清蛋白或乳血清蛋白。
[0074]可替代地，或另外地，該處理可以涉及一個或多個離心步驟，例如，用於從脫脂乳中分離脂肪和/或從乳中分離微生物。
[0075]可替代地，或另外地，該處理可以涉及一個或多個蒸發步驟以用於除去水並且從而濃縮乾物質，如蛋白質和/或礦物質。
[0076]該處理還可以包 括一個或多個pH調節。酸化可以(例如)被用來使酪蛋白凝結並且當該處理涉及離子交換色譜法時PH調節更為重要。
[0077]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含來自其他乳蛋白部分(如過濾的、熱處理的乳清或a-乳清蛋白和/或(6-乳球蛋白-貧化乳清)的生產的一種或多種工藝物流。
[0078]在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料包含一種乳血清源給料，或甚至基本上由其組成。該乳源給料可以例如是一種乳血清、並且優選的是一種乳血清蛋白濃縮物，例如，處於通過超濾乳血清獲得的滲餘物的形式。
[0079]該乳源給料中的骨橋蛋白的含量取決於特定的給料類型。在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.01%至20% (w/w)的範圍內的骨橋蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在
0.05%至5% (w/w)的範圍內的骨橋蛋白。該乳源給料可能(例如)包含量在0.1%至2% (w/w)的範圍內的骨橋蛋白。
[0080]可替代地，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.1%至1% (w/w)的範圍內的骨橋蛋白。
[0081]在本發明的背景中，被陳述為「基本上由」一個或多個子組分或一個或多個活動「組成」的一種產品、組分、方法、或方法步驟由一個或多個所具體提到的子組分或一個或多個所具體提到的活動組成，但還可以包括實質上不影響本發明的一個或多個基本和新穎的特徵的一個或多個額外的未命名的子組分或活動。
[0082]如上文所提到，本方法對於從複雜的給料，即含有幹擾骨橋蛋白的分離的分子實體(如具有低於5.0的pi的蛋白質)的給料中分離骨橋蛋白特別有效。已經發現這類蛋白質與骨橋蛋白競爭陰離子交換介質的官能團。[0083]具有小於5.0的pi的蛋白質的多個實例是α乳清蛋白、豚蛋白腖_3、際蛋白腖_5、和際蛋白腖-8、以及酪蛋白衍生肽，如酪蛋白巨肽和/或酪蛋白磷酸肽。因此，該額外蛋白質可以包括來自下組的一種或多種蛋白質，該組由以下各項組成:α乳清蛋白、月示蛋白腖-3貯蛋白腖_5、和際蛋白腖-8、酪蛋白衍生肽、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、以及其組合。游離α酪蛋白和游離酪蛋白是具有小於5.0的pi值的蛋白質的其他實例。
[0084]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少0.1% (w/w)的具有小於5.0的Pl的額外蛋白質。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少0.5% (w/w)的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。
[0085]可替代地，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少2% (w/w)的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。如將理解的，具有小於5.0的pi的額外蛋白質不包括骨橋蛋白，但典型地包括具有特定範圍內的Pl的一種或多種其他蛋白質。
[0086]在本發明的其他實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.1%至50% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的Pl的額外蛋白質。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.5%至40% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在2%至25% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。
[0087]該乳源給料可能(例如)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.1%至20% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.3%至15% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。可替代地，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在0.5%至10% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。
[0088]在本發明的進一步 的實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在至少1%至50% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在10%至45% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。可替代地，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在15%至40% (w/w)的範圍內的具有小於5.0的pi的額外蛋白質。
[0089]在本發明的一些優選實施例中，具有小於5.0的pi的額外蛋白質具有小於4.5的Pl、並且優選小於4.0的pi。
[0090]在本發明的背景中，術語「蛋白質」涵蓋多肽的大聚集體、單多肽鏈以及肽類，如二肽或三肽。在化學上，蛋白質是包含通過所謂的肽鍵連接的不同和/或相同的胺基酸的聚合物。
[0091 ] 在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料進一步包含酪蛋白巨肽(CMP )。
[0092]在本發明的背景中，術語「CMP」或「酪蛋白巨肽」涉及當暴露於凝乳酶時從K -酪蛋白中釋放的一種小蛋白。CMP涵蓋該蛋白質的糖基化變體和非糖基化變體兩者。該蛋白質的糖基化變體有時被稱為酪蛋白糖巨肽(cGMP )。
[0093]在本發明的其他優選實施例中，該乳源給料包含甜乳清源給料，或甚至基本上由其組成。該乳源給料可以例如是一種甜乳清、並且優選的是甜乳清蛋白濃縮物，例如，處於通過甜乳清的超濾獲得的滲餘物的形式。[0094]在本發明的一些實施例中，該乳源給料可以包含一種酸乳清源給料，或甚至基本上由其組成。該乳源給料可以例如是一種酸乳清、並且優選的是一種甜乳清蛋白濃縮物，例如，處於通過酸乳清的超濾獲得的滲餘物的形式。
[0095]在本發明的背景中，術語「乳血清蛋白濃縮物」、「甜乳清蛋白濃縮物」、或「酸性乳清蛋白濃縮物」涉及一種水性組合物，該水性組合物含有分別存在於原始乳血清、甜乳清、或酸乳清中的總蛋白質的至少80%(w/w)，並且具有相對於該水性組合物的乾重而言為至少25% (w/w)的總蛋白質含量。
[0096]然而，在本發明的其他實施例中，該乳源給料不是一種酸乳清源給料。
[0097]在本發明的優選實施例中，該乳源給料(例如，一種甜乳清源給料)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的CMP。例如，該乳源給料(例如，一種甜乳清源給料)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少5% (w/w)、優選為至少10% (w/w)、並且甚至更優選地相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為至少15% (w/w)的CMP。
[0098]在本發明的一些實施例中，該乳源給料(例如，一種甜乳清源給料)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在1%至40% (w/w)的範圍內的CMP。例如，該乳源給料(例如，一種甜乳清源給料)可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在5%至35%(w/w)的範圍內、優選地在10%至30% (w/w)的範圍內、並且甚至更優選地在相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為15%至25% (w/w)的範圍內的CMP。
`[0099]本發明人已經觀察到，出乎意料地，當給料是基於乳血清或其濃縮物時在本方法過程中形成了沉澱。這種沉澱在陰離子交換過程期間導致問題，並降低該陰離子交換過程的穩健性。
[0100]本發明人已經對該沉澱進行了研究並發現跡象表明該沉澱含有多個沉澱的酪蛋白種類，這些酪蛋白種類以溶解形式如游離(6-酪蛋白或游離a-酪蛋白存在。
[0101]在本發明的背景中，術語「游離(6-酪蛋白」或「游離a-酪蛋白」涉及未結合乳製品的原生酪蛋白膠束的(6-酪蛋白分子或a-酪蛋白的分子。這類游離(6-酪蛋白或游離a-酪蛋白包括(6-酪蛋白或a-酪蛋白的溶解單分子或a-酪蛋白和/或(6-酪蛋白的小聚集體。例如已知(6-酪蛋白的單分子形成小的(6-酪蛋白膠束，該膠束也是游離(6-酪蛋白的一個實例。
[0102]因此，在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料進一步包含游離a-酪蛋白和游離(6-酪蛋白。游離a-酪蛋白和游離(6-酪蛋白典型地存在於乳血清源給料中。
[0103]本發明人已經發現，此沉澱問題可以通過在陰離子交換前從該乳源給料中除去該沉澱來解決。因此，在本發明的一些優選實施例中，該方法的步驟a)涉及從有待形成該乳源給料的酸化液體中除去沉澱。這種除去可能(例如)涉及對該酸化液體的離心或過濾。
[0104]該沉澱問題的另一種解決方案是使用該給料的其中沉澱被限制或甚至不存在，例如，在pH5.0-6.5的範圍內的pH。
[0105]因此，該乳源給料可以具有在5.0-6.5的範圍內、並且優選地在pH5.0-6.0的範圍內的pH。
[0106]當在此pH範圍內執行陰離子交換時，進一步建議使用高於15°C，如20°C至40°C的給料/過程溫度。在此溫度範圍內，溶解的(6-酪蛋白形成小的(6-酪蛋白膠束，而不與乳的原生酪蛋白膠束混淆，並且這些β-酪蛋白膠束似乎比單一 β-酪蛋白分子更少幹擾陰離子交換過程。
[0107]因此，在步驟b)的過程中該乳源給料和陰離子交換材料的溫度可以是在15°C至40°C的範圍內、並且優選地在20°C至38°C的範圍內。
[0108]該乳源給料可能(例如)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為至少
0.5% (w/w)的游離α-酪蛋白和游離β-酪蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為至少2%( w/w)的游離α-酪蛋白和游離酪蛋白。該乳源給料可能(例如)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為至少10% (w/w)的游離α-酪蛋白和游離β-酪蛋白。
[0109]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為在0.5%至40% (w/w)的範圍內的量的游離α-酪蛋白和游離β-酪蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為在2%至20% (w/w)的範圍內的量的游離α-酪蛋白和游離β-酪蛋白。該乳源給料可能(例如)包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為在5%至15% (w/w)的範圍內的量的游離α -酪蛋白和游離酪蛋白。
[0110]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (W/V)的α-乳清蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少10% (w/w)、優選為至少20% (w/w)、並且甚至更優選相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為至少30% (w/w)的α-乳清蛋白。
[0111]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在1%至50% (w/w)的範圍內的`α-乳清蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在5%至40% (w/w)的範圍內、優選地在10%至35% (w/w)的範圍內、並且甚至更優選地在相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為12%至30% (w/w)的範圍內的α-乳清蛋白。
[0112]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (W/V)的β-乳球蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少15% (w/w)、優選為至少30% (w/w)、並且甚至更優選相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為至少40% (w/w)的β_乳球蛋白。
[0113]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在1%至70% (w/w)的範圍內的β-乳球蛋白。例如，該乳源給料可能包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在10%至65% (w/w)的範圍內、優選地在20%至60% (w/w)的範圍內、並且甚至更優選地在相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為35%至55%(w/w)的範圍內的乳球蛋白。
[0114]已知酪蛋白在處於或低於約4.6的pH值下沉澱。因此，在本發明的一些實施例中，優選的是具有在約3.6-4.6的範圍內的pH的乳源給料具有相對低濃度的酪蛋白，如相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為至多1% (w/w)。
[0115]在本發明的一些實施例中，該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為至多0.1%的酪蛋白(w/w)。甚至可能優選的是該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言為至多0.01%的酪蛋白(w/w)。[0116]在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料包含總量在6_250g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。例如，該乳源給料可能包含總量在50-150g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。甚至可能優選的是該乳源給料包含總量在75-125g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。
[0117]可替代地，該乳源給料可能包含總量在50_250g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。例如，該乳源給料可能包含總量在50-150g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。甚至可能優選的是該乳源給料包含總量在75-150g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。
[0118]還可能優選的是該乳源給料可能包含總量在75_250g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。
[0119]在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料包含總量為至少6g/L乳源給料的蛋白質。例如，該乳源給料可能包含總量為至少50g/L乳源給料的蛋白質。甚至可能優選的是該乳源給料包含總量為至少75g/L乳源給料的蛋白質。
[0120]在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料具有在25°C下在pH3.8-6.0的範圍內的pH。優選地，在25°C下的該乳源給料的pH在pH4.0-5.5的範圍內。甚至更優選地，在25°C下該乳源給料的pH是在pH4.2-5.0的範圍內，例如像pH4.3-4.5。
[0121] 該乳源給料的所希望的比電導可以例如通過以下方式獲得:
[0122]-通過部分除去水和/或添加鹽來濃縮該乳源給料，這引起一個增大的比電導，或
[0123]-通過部分除去鹽和/或添加水來使該乳源給料脫鹽，這引起一個減小的比電導。
[0124]從水性液體中除去水和/或鹽的技術是本領域中的技術人員所眾所周知的。
[0125]在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料具有在25 °C下4.5-9.0mS/cm的範圍內的比電導。例如，該乳源給料的比電導可以是在25°C下5.0-8.0mS/cm的範圍內。在本發明的一些優選實施例中，甚至可能更優選的是該乳源給料的比電導是在25°C下
5.5-7.0mS/cm 的範圍內。
[0126]該乳源給料可能例如具有在25°C下4-7mS/cm的範圍內的比電導。可替代地，該乳源給料可能具有在25°C下7-lOmS/cm的範圍內的比電導。可替代地，該乳源給料可能具有在25°C下5-8mS/cm的範圍內的比電導。
[0127]在本發明的一些優選實施例中，該乳源給料具有在25°C下4_7mS/cm的範圍內的比電導以及在25°C下pH3.6-5.0的範圍內的pH。
[0128]在本發明的其他優選實施例中，該乳源給料具有在25°C下7-lOmS/cm的範圍內的比電導以及在25°C下pH5.0-6.5的範圍內的pH。
[0129]在本發明的進一步優選的實施例中，該乳源給料具有在25°C下5_8mS/cm的範圍內的比電導以及在25°C下pH4.0-5.5的範圍內的pH。
[0130]例如，該乳源給料可能具有在25°C下5-6mS/cm的範圍內的比電導以及在25°C下pH4.2-5.0的範圍內的pH。
[0131]在本發明的一些實施例中，該乳源給料具有在3.6至6.5的範圍內的pH，並且
[0132]-如果pH是在3.6-5.0的範圍內，則比電導是
[0133]至少4mS/cm並且
[0134]至多比電導最大=1.38mS/cm*pH+l.03mS/cm,並且
[0135]-如果pH是在5-6.5的範圍內，則比電導是
[0136]至少比電導最小=1.33mS/cm*pH_2.67mS/cm,並且[0137]至多比電導最大=1.38mS/cm*pH+l.03mS/cm。
[0138]因此，如果這些實施例中的給料的pH是(例如)pH6.0,則比電導是
[0139]至少比電導最小=1.33mS/cm*6.0-2.67mS/cm=5.3mS/cm,並且
[0140]至多比電導最大=1.38mS/cm*6.0+1.03mS/cm=9.3mS/cm。
[0141]例如,該乳源給料可能具有在3.6至5.0的範圍內的pH和以下比電導至少4mS/cm並且
[0142]至多比電導最大=1.38mS/cm*pH+l.03mS/cm。
[0143]可替代地，該乳源給料可能具有在5.0至6.5的範圍內的pH和以下比電導
[0144]至少比電導最小=1.33mS/cm*pH_2.67mS/cm,並且
[0145]至多比電導最大=1.38mS/cm*pH+l.03mS/cm。
[0146]除非另有說明，否則比電導和pH值是在具有25°C的溫度的給料中進行測量的。
[0147]在本發明的一些實施例中，陰離子交換介質包含一種固相和一種或多種陽離子基團。
[0148]優選地，該陽離子基團中的至少一些附接到該固相的表面上和/或附接到通過該固相的表面可接近的多個孔的表面上。
[0149]在本發明的一些實施例中，陰離子交換介質的固相包含選自下組的一種或多種組分，該組由以下各項組成:多個粒子、一種過濾器、以及一種膜。
[0150]該固相可以例如包含多糖，或甚至基本上由其組成。特別優選交聯多糖。有用的多糖的實例是纖維素、瓊脂糖，和/或葡聚糖。
[0151]可替代地，該固相可以包含一種非碳水化合物聚合物或甚至基本上由其組成。有用的非碳水化合物聚合物的實例是甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、和/或苯乙烯-二乙烯基苯。
[0152]在本發明的一些優選實施例中，這些陽離子基團包括氨基，或甚至基本上由其組成。叔氨基是特別優選的並且在適當的PH條件下生成季銨基。季銨基為陰離子交換介質提供了強陰離子交換特性。
[0153]可替代地，或另外地，這些陽離子基團可以包含一種或多種伯氨基或仲氨基。大量的伯氨基或仲氨基典型地為陰離子交換介質提供了弱陰離子交換特性。
[0154]每個周期的最佳蛋白加載取決於陰離子交換色譜法系統的設計和陰離子交換介質的特徵。
[0155]在陰離子交換色譜法過程中的處理條件(包括壓力、流速等)取決於實際的處理實施、所使用的設備以及所使用的陰離子交換介質。
[0156]在步驟b)過程中該乳源給料的溫度典型地是低的足以避免微生物生長和蛋白質與陰離子交換介質的熱損傷，但同時是高的足以提供一個可接受的粘度。
[0157]在本發明的一些實施例中，在步驟b)過程中該乳源給料的溫度是在2°C至40°C的範圍內。優選地，在步驟b)過程中該乳源給料的溫度是在4°C至20°C的範圍內，並且甚至更優選地在6°C至12°C的範圍內。
[0158]有關陰離子交換色譜法及其工業實施的更多細節可以在斯科普斯(Scopes)中找到，其出於所有目的通過引用結合在此。
[0159]在本發明的一些優選實施例中，本發明的方法包括一個在使陰離子交換介質與乳源給料進行接觸後用一種洗滌溶液洗滌該陰離子交換介質的步驟C)。有用的洗滌溶液是能夠從該陰離子交換介質中除去鬆散結合的分子的典型地PH中性或弱酸性的水溶液。人們可以例如使用去礦物質的水或氯化鈉的一種PH中性水溶液(例如，0.1M NaCl)作為洗滌液。
[0160]在本發明的其他優選實施例中，本發明的方法不包括步驟c)。
[0161]本發明的步驟d)涉及回收結合至陰離子交換介質的骨橋蛋白。該回收典型地通過使陰離子交換介質與一種洗脫劑進行接觸並收集所得的洗脫液，即該洗脫劑加上從陰離子交換介質釋放出的分子。
[0162]正常地，該洗脫劑是具有足以從陰離子交換介質釋放結合的骨橋蛋白的離子強度和/或PH的一種水溶液。有用的洗脫液的實例是鹽(如NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、或其組合)的pH中性的、1.0M的水溶液。
[0163]可以使回收的組合物經受另外的處理步驟(例如)以用於使該組合物去礦物質和濃縮，並隨後將其轉變成粉末。
[0164]因此，在本發明的一些優選實施例中，使該回收的組合物進一步經受選自下組的一個或多個處理步驟，該組由以下各項組成:濃縮、滲濾、蒸發溶劑、噴霧乾燥、以及取代結合了蛋白質的陽離子。
[0165]例如，可以使該回收的組合物經受一個濃縮步驟。
[0166]可替代地，或另外地，可以使該回收的組合物經受一個滲濾步驟。
[0167]可替代地，或另外地，可以使該回收的組合物經受一個蒸發步驟。
[0168]可替代地，或另外地，可以使該回收的組合物經受一個噴霧乾燥步驟。
[0169]在本發明的一個優選實施例中，可以使該回收的組合物經受以下步驟:
[0170]i)濃縮，例如，通過超濾，
[0171]ii)滲濾，例如，通過水，
[0172]iii)可任選地，另一濃縮步驟，例如，通過蒸發，
[0173]iv)陽離子置換，通過使步驟ii)或iii)的水性組合物與一種水溶性鈣鹽(例如，CaCl2)進行接觸，
[0174]V)巴氏滅菌，並且
[0175]vi)噴霧乾燥，以將該巴氏殺菌的組合物轉化成粉末。
[0176]本方法可以作為分批方法亦或半分批方法來實施。該半分批方法可以例如通過以下方式來實施:操作一個第一陰離子交換柱和一個第二陰離子交換柱，並且在該第一陰離子交換柱上執行步驟b)，同時在該第二陰離子交換柱上執行步驟c)和/或d)，並且反之亦然。
[0177]因此，在本發明的一些優選實施例中，用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括以下步驟:
[0178]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料是一種甜乳清蛋白濃縮物，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-10mS/cm的範圍內的比電導，
[0179]並且其中所述乳源給料進一步包含相對於乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的酪蛋白巨肽，[0180]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0181]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0182]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0183]在本發明的其他優選實施例中，用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括以下步驟:
[0184]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳給料是一種乳血清蛋白濃縮物，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-10mS/cm的範圍內的比電導，並且其中所述乳源給料進一步包含游離α酪蛋白和游離β_酪蛋白，
[0185]b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸，
[0186]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且
[0187]d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
[0188]本發明的又一方面涉及可通過在此描述的方法獲得的一種含骨橋蛋白的組合物。
[0189]上文已經參考多個具體實施例對本發明進行了描述。然而，除上文描述的以外的其他實施例同樣有可能在本發明的範圍之內。除非另有說明，否則本發明的各種實施例和方面的不同特徵和步驟可以按照除在此描述的這些以外的其他方式進行結合。
`[0190]實例
[0191]實例1.從受控電導甜乳清濃縮物中富集骨橋蛋白
[0192]試驗方案
[0193]下面的純化實驗是在裝備有裝在一個13.3mL (170mmX10mm)柱中的強陰離子交換樹脂Q-瓊脂糖大珠的快速蛋白液相色譜(FPLC)設備上進行的。在所有實驗的整個加載、洗滌、以及洗脫過程中，將流量保持在3.33ml/min。原材料是一種甜乳清蛋白分離物，並且在每個實驗過程中將70克的總蛋白質加載到該柱上。對原材料中的CMP的含量進行分析。將原材料的樣品稀釋到最終蛋白質濃度為10%w/v，此後通過分別添加HCl和NaCl對pH(ρΗ3.0-5.7，在4.7mS/cm下)和比電導(2.3-10.3mS/cm，在ρΗ4.3下)進行調節。通過3個床體積的IOOmM NaCl、pH5.0的溶液將未結合的蛋白質從柱中洗出。隨後，通過使IM NaCl,PH5.0的溶液流動通過該柱來洗脫結合的蛋白質，直到洗脫液中檢測不到蛋白質為止。
[0194]對於各洗脫液樣品，使用以下技術對骨橋蛋白(0PN)、CMP、以及總蛋白質的含量進行分析。
[0195]總蛋白質的測定
[0196]通過如在科恩(Cohen)中所描述的標準凱式氮分解法(standard Kjeldahldi gest ion )對洗脫液的總蛋白質含量進行測定。
[0197]通過HPLC方法對OPN進行定量
[0198]分析原理:
[0199]將樣品通過0.22 μ m的過濾器過濾，並且使其經受HPLC，其中柱為MonoQHR5/5(Iml)(法瑪西亞公司(Pharmacia))並且在280nm下進行檢測。通過外標法(與已知OPN含量的標準品的峰面積進行比較)來計算樣品的濃度。由於該方法的低特異性，因此對於此分析程序，一個先決條件是這些樣品包含相對純的OPN，例如，如通過SDS-PAGE (Laemmli,1970)所測定的。
[0200]試劑:0PN標準品、密理博(Milli Q>K(HPL(^S)、NaCl (默克公司(Merck))、TrisHCl (西格瑪公司(Sigma))
[0201]緩衝液A:10mM NaCl, 20mM Tris HCL, pH8.0
[0202]緩衝液B:0.8M NaCl, 20mM Tris HCl，pH8.0
[0203]標準的校準曲線是從緩衝液A中的OPN標準品的在l-10mg/ml的濃度範圍內的5個標準品製成的。在加載到柱上之前，所有的標準品都通過0.22 y m的過濾器進行過濾。
[0204]採樣和預處理:
[0205]如果用於分析的樣品在該標準曲線的範圍之外的話，則用密理博水(HPLC級)將這些樣品進行稀釋。在一些情況下，如果存在太多的來自洗脫劑的NaCl，為了使得OPN能夠結合至陰離子交換樹脂，稀釋也是必要的。注入相當於25ii L的量的l-10mg/mL的OPN以用於分析。在注入至HPLC之前，將樣品通過0.22 y m的過濾器過濾。
[0206]HPLC 條件:流量 lml/min,注入體積 25 y L，梯度:0_3min0%B, 3-17min0_60%B,17-30min60%-100%B,30_33minl00%B，33_34minl00%-0%B，34_40min0%B。
[0207]結果的計算和表達:
[0208]每個樣品中的OPN的濃度是通過參考標準曲線並通過觀察所採用的稀釋來計算的。
[0209]通過OPN與總蛋白質之間的比率，使用OPN特定瓊斯係數7.17來計算純度，這是因為在當前背景中通過凱氏氮分解法測定的大部分或全部蛋白是0PN。
[0210]通過HPLC對主要乳清蛋白進行定量
[0211]通過凝膠滲透色譜法對主要乳清蛋白、a-乳清蛋白、(6-乳球蛋白、以及CMP (酪蛋白糖巨肽)進行分離和定量。
[0212]該凝膠滲透色譜法使用2個與附接的預柱PWxl (6mmX4cm) (Tosohass,日本)串聯連接的 TSKgel3000PWxl (7.8mmX30cm)柱來進行。
[0213]用於該系統的校準的標準溶液由以下項組成:溶解在500.0ml0.02M磷酸鹽緩衝液7.5中的225mg CMP、225mg a -乳清蛋白以及50mg P -乳球蛋白。
[0214]樣品的預處理:將粉末樣品以lmg/ml溶解於磷酸鹽緩衝液中並且放置過夜以用於溶液化。可替代地，將液體樣品用磷酸鹽緩衝液進行稀釋，以便獲得約0.1%的蛋白質含量。如果蛋白質含量低於0.1%，則在未稀釋的情況下測定該樣品。在注入至柱之前，使所有的樣品都通過0.22 i! m的過濾器過濾。
[0215]結果的計算和表達:
[0216]根據AX0.1XF來計算樣品中單獨蛋白質的百分比，其中
[0217]B
[0218]A=樣品中所測得的面積
[0219]0.1=用於0.1%溶液的換算係數
[0220]F=稀釋係數(100，000/樣品重量(單位mg))
[0221]B=0.1%標準溶液中單獨蛋白質的計算出的面積[0222]結果
[0223]CMP的含量
[0224]該甜乳清原材料中的CMP的含量是20.1%，但出乎意料地在實例I的富集的OPN組合物中不能檢測到CMP。[0225]給料pH對骨橋蛋白的純度和產量的影響:
[0226]圖1中示出的伴隨著改變所採用的給料的pH值的第一系列實驗表明，OPN的產量(來自給料中的70g總蛋白質的mg 0ΡΝ)隨pH從pH3增大至約pH4.3而增加。當pH增加到超過pH4.3時高產量得到保持。所獲得的OPN製劑中的OPN的純度在低pH值下是非常高的，但當pH增大超過約pH4.5時,純度緩慢下降但仍然是可接受的,直到達到約pH6.5。然而，高純度OPN的最佳產量是在pH窗位pH3.8-5.5中，並且特別是在pH4.3-4.5的範圍內獲得的。
[0227]給料比電導對骨橋蛋白的純度和產量的影響:
[0228]圖2中示出了伴隨著改變比電導的一系列實驗的結果。在低比電導下，產量高而純度低。隨著比電導增大，純度增大並且在約5.5mS/cm下達到100%。當比電導進一步增大時，純度仍然很高，而當比電導超過約lOmS/cm時，OPN的產量開始下降。然而，高純度OPN的最佳產量似乎是在比電導範圍4.5-9.0mS/cm內，並且特別是在5-8mS/cm的範圍內獲得的。
[0229]討論/結論
[0230]pH的影響:
[0231]從圖1可見，在低於約pH3.6的pH值下，OPN逐漸減少其電荷並且因此逐漸減少其與樹脂的陽離子基團的結合。在高於約PH4.5的pH值下，由於給料的其他蛋白質變得帶負電荷並且開始結合樹脂，所以OPN的純度開始降低。因此，我們已經確認了在pH3.6-6.5範圍中的一個最佳pH值窗位以用於分離高純度且高產量的OPN，即使給料含有大量的CMP。在得到的OPN製劑中，CMP是不能檢測出的。
[0232]比電導的影響:
[0233]從圖2可見，在低於約4mS/cm的比電導下，由於其他蛋白質可以結合樹脂，所以OPN的純度逐漸下降。在高於約6mS/cm的比電導下，OPN與樹脂的結合變弱，並且產量緩慢下降但是可以接受，直到達到約lOmS/cm的比電導。因此，我們已經確認了最佳用於OPN生產的從約4-10mS/cm的一個窄範圍。在此窄範圍內，OPN可以甚至從含有約20%的CMP的原材料中以高產量和高純度進行分離。
[0234]已經進行了若干探索基於甜乳清的給料中所要求的pH/比電導窗位的另外的實驗，並且這些另外的實驗證實了上述結論。
[0235]實例2從受控電導酸乳清濃縮物中富集骨橋蛋白
[0236]以下的純化實驗是在與實例I類似的FPLC設備上進行的。然而，原材料是具有10% (w/w)的總蛋白質含量的酸乳清濃縮物，並且將約70g總蛋白質加載到柱上。
[0237]將濃縮的酸乳清稀釋至不同程度，這產生了在從2.5至lOmS/cm的範圍內的比電導。通過實例I中所描述的方法對在給料和洗脫液中的OPN和總蛋白質進行測量。
[0238]通過添加HCl將pH調節至4.3，並且將原材料施加到陰離子交換柱上。通過3個床體積的0.1M NaCl將未結合的蛋白質從柱中洗出，並且隨後通過使IM NaCl溶液流動通過該柱將結合的蛋白質進行洗脫，直到洗脫液中檢測不到蛋白質為止。
[0239]在從濃縮的酸乳清中富集OPN的過程中比電導對OPN純度和產量的影響示出於圖3中。
[0240]圖3中的數據示出了通過所描述的程序從酸乳清中富集0PN。與其中使用甜乳清作為原材料的實例I 一樣，再次觀察到，給料中的低比電導增加了產品產量而犧牲了產品純度。然而，由於酸乳清源給料不含有大量的CMP，因此對於OPN的富集的影響不如在給料是源於甜乳清的情況下那樣有害。酸乳清源給料確實含有多種微量組分，這些微量組分的結合可以通過如為避免CMP的結合而採用的相同的參數設定來最小化。因此，可以觀察到，在實例I中確認的OPN分離的窄最佳範圍同樣適用於從酸乳清中分離0PN。
[0241]我們已經進行了若干探索基於酸乳清的給料中所要求的pH/比電導窗位的另外的實驗，並且這些另外的實驗證實了上述發現。
[0242]實例3從受控電導乳血清濃縮物中富集骨橋蛋白
[0243]根據前面的實例，可以使用乳血清作為用於通過所披露的方法生產OPN的原材料。通過在24度下對脫脂乳進行微濾(過濾器孔徑為約0.1微米)以便除去膠束酪蛋白來生產乳血清。其後，通過HCl將乳血清的樣品調節至pH4.3或pH4.7，並且將乳血清的樣品滲濾來獲得在4-10mS/cm的範圍內的比電導和約5%或10% (w/w)的總蛋白質含量。隨後，如實例I所描述，在約5°C下通過陰離子交換從修飾的乳血清樣品中富集0PN。
[0244]結果和觀察
[0245]所進行的這些試驗表明，源於乳血清的給料也可以用於本方法中。
[0246]出乎意料地，在該方法過程中觀察到未確認的沉澱，該沉澱導致在一些陰離子交換周期後陰離子交換材料的堵塞或`汙染。該沉澱問題通過在陰離子交換前使酸化的乳血清通過濾紙過濾而得到解決。我們已經看到多個跡象表明該沉澱與溶解的酪蛋白種類，如在原生酪蛋白膠束被除去時留在乳血清中的游離a-酪蛋白和游離(6-酪蛋白有關。
[0247]討論/結論
[0248]乳血清通過對脫脂乳進行微濾以便除去酪蛋白來生產，而甜乳清和酸乳清分別在凝乳酶或酸的作用下通過酪蛋白的沉澱而將酪蛋白耗盡。因此，所有三類乳源給料基本上沒有膠束的酪蛋白，這些膠束的酪蛋白由於酪蛋白的沉澱和絮凝而將幹擾陰離子交換色譜法程序。
[0249]我們已經看到多個跡象表明溶解的酪蛋白在陰離子交換過程中引起問題。這個問題可以通過在陰離子交換前使用(例如)微過濾器來過濾這些乳源給料而得以解決。
[0250]可替代地，陰離子交換步驟可以在其中沉澱被限制或甚至不存在的pH下進行，例如，在pH5.0-6.5的範圍內進行。當在此pH範圍內執行陰離子交換時，進一步建議使用高於15°C，如20°C至40°C的給料/過程溫度。在此溫度範圍內，溶解的(6-酪蛋白形成小的
酪蛋白膠束，而不與原生酪蛋白膠束混淆，並且這些(6-酪蛋白膠束比單一 (6-酪蛋白分子更少幹擾陰離子交換過程。
[0251]實例4在無受控電導下從甜乳清濃縮物中富集骨橋蛋白
[0252]以下的純化實驗是在與實例I類似的FPLC設備上進行的。原材料是甜乳清分離物並且約Ig的總蛋白質被加載到柱上。在加載到柱上之前，將該甜乳清通過超濾進行濃縮、在添加等體積的水後進行透濾、並且最後再次通過等體積的水進行稀釋。得到的比電導為2.lmS/cm。CMP和總蛋白質通過實例I中所描述的方法在給料和洗脫液中進行測量。由於給料和洗脫液兩者中的幹擾蛋白質，不能測定OPN的量。表1中的OPN數據是根據實例I的實驗中的已知產量估計而來的。
[0253]通過添加HCl將pH調節至4.3，並且將原材料施加到陰離子交換柱上。多種未結合的蛋白質通過3個床體積的水從柱中洗出，並且結合的蛋白質其後通過使IM NaCl溶液流動通過該柱而被洗脫，直到洗脫液中檢測不到蛋白質為止。
[0254]表1.低電導甜乳清的陰離子交換的結果
[0255]
【權利要求】
1.一種用於從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法，該方法包括以下步驟: a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3.6-6.5的範圍內的pH以及在25°C下4-lOmS/cm的範圍內的比電導，並且其中所述乳源給料進一步包含 -相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的酪蛋白巨肽，或 -游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白， b)使所述乳源給料經受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換介質進行接觸， c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質，並且 d)回收結合至該陰離子交換介質的蛋白質，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種組合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中該乳源給料進一步包含具有小於5.0的等電點(Pl)的額外蛋白質。
3.根據權利要求2所述的方法，其中該一種或多種額外蛋白質包含選自下組的一種或多種蛋白質，該組由以下各項組成:a-乳清蛋白、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、豚蛋白腖_3、豚蛋白腖_5、豚蛋白腖-8、以及它們的混合物。
4.根據權利要求3或4所述的方法，其中該一種或多種額外蛋白質包括酪蛋白巨肽(CMP)0
5.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含一種乳血清源給料、或甚至基本上由其組成。
6.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含甜乳清源給料、或甚至基本上由其組成。
7.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的CMP。
8.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在1%至40% (w/w)的範圍內的CMP。
9.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言總量為至少0.5% (w/w)的游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白。
10.根據權利要求9所述的方法，其中該乳源給料具有在5.0-6.5範圍內的pH，例如在pH5.0-6.0的範圍內。
11.根據權利要求9所述的方法，其中該乳源給料具有在15°C_40°C範圍內的溫度，例如在20°C -38°C的範圍內。
12.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中提供該乳源給料的步驟a)涉及從一種將形成該乳源給料的酸化液體中去除沉澱。
13.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的a-乳清蛋白。
14.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在1%至50% (w/w)的範圍內的a-乳清蛋白。
15.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量為至少1% (w/w)的(6-乳球蛋白。
16.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含相對於該乳源給料的蛋白質的總量而言量在1%至70% (w/w)的範圍內的β-乳球蛋白。
17.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料包含總量在6-250g/L乳源給料的範圍內的蛋白質。
18.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料具有在25°C下pH3.8-5.5的範圍內的pH。
19.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料具有在25°C下4.5-9.0mS/cm的範圍內的比電導。
20.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料具有在25°C下4-7mS/cm的範圍內的比電導。
21.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料具有在25°C下5-8mS/cm的範圍內的比電導。
22.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該乳源給料具有在25°C下7-10mS/cm的範圍內的比電導。
23.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該陰離子交換介質包含一種固相和一種或多種陽離子基團。
24.根據權利要求23所述的方法，其中該陰離子交換介質的該固相包含選自下組的一種或多種組分，該組由以下各項組成:多個粒子、一種過濾器、以及一種膜。
25.根據權利要求23或24所述的方法，其中該固相包含多糖、或甚至基本上由其組成。
26.根據權利要求23-25中任一項所述的方法，其中該固相包含交聯多糖、或甚至基本上由其組成。
27.根據權利要求23-26中任一項所述的方法，其中該固相包含瓊脂糖、或甚至基本上由其組成。
28.根據以上權利要求23-27中任一項所述的方法，其中這些陽離子基團包括氨基、或甚至基本上由其組成。
29.根據以上權利要求中任一項所述的方法，其中該回收的組合物進一步經受選自下組的一個或多個處理步驟，該組由以下各項組成:濃縮、滲濾、蒸發溶劑、噴霧乾燥、以及取代結合了蛋白質的陽離子。
30.通過以上權利要求中任一項所述的方法可獲得的包含骨橋蛋白的組合物。
【文檔編號】C07K1/18GK103492408SQ201280015495
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年3月5日 優先權日:2011年3月3日
【發明者】漢斯·貝特爾森, 彼得·朗堡·魏謝, 特賴因·特魯格瓦森 申請人:阿拉食品公司