二(5-丁基-2-吡啶甲酸-n1,o2)合銅(ⅱ)在製備抗結核病藥物中的應用的製作方法

2023-10-25 15:50:12

專利名稱：：二(5-丁基-2-吡啶甲酸-n1,o2)合銅(ⅱ)在製備抗結核病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體涉及金屬絡合物在抗結核菌領域的應用，尤其涉及二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)在製備抗結核病藥物中的應用。
背景技術：
：由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)引起的結核病是嚴重危害人類健康的傳染病，而且隨著耐藥菌株增加和在愛滋病人群中並髮結核病等諸多原因，近年來全球結核病的發病呈增高趨勢。據世界衛生組織(WHO)估計，目前全球受Mtb感染的人口佔世界人口的三分之一，其中5%10%的感染者成為結核病患者。我國每年出現活動性肺結核病人130萬例，其中傳染性肺結核約60萬例，是全球結核病高負擔國家之一。自20世紀50年代初，抗結核藥物相繼問世，使結核病的治療起到劃時代的變化。傳統的第一線抗結核藥物有異煙肼、鏈黴素、對氨水楊酸鈉，其他則為第二線藥物如利福平等老藥及利福黴素、喹諾酮類等新藥。然而由於結核病患者的治療管理尚不十分規範，不規則化療，濫用抗結核藥物，不執行歸口管理等問題仍然嚴重，使結核病耐藥情況日益嚴重，且耐藥性的變化更趨向於多種藥物同時耐藥，尤其是對異煙肼和利福平同時耐藥的多重耐藥性結核(MDR-TB)發生率高，這給結核病的防治工作造成極大困難。海洋微生物由於其所處的特殊環境，發展出了各種獨特的代謝方式，這不僅確保其在極端環境中生存，也為人類提供了在陸地微生物中難以發現的大量新穎代謝產物，其中不少具有潛在的實際應用價值，已被認為是尋找藥理活性物質的新源泉。此外，海洋微生物易於採集和培養，人工發酵產生的代謝產物比高等生物所含的物質更易提純，成本更低，符合可持續發展的資源開發原則，所以從中篩選到的活性化合物更利於工業化生產。來源於紅樹林內源真菌F^flWwmsp.ZZF51的銅離子絡合物——二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(11)，其結構式如式(I)所示，為藍色晶體，化學式組成為C2oH24CuN204，分子質量為419.1019。formulaseeoriginaldocumentpage4(I)譚倪等人譚倪、邵長倫、何麗仙等，Cu(II)促進海洋真菌Fusariumsp.ZZF51產生代謝產物二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)的研究，中山大學學報(自然科學版)，2008年第47巻第4期已經給出式(I)所示銅離子絡合物的提取方法以及結構分析，但未研究該銅離子絡合物的醫藥學性質。目前尚未見有二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)具有抗結核活性的相關報導。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供來源於海洋紅樹林內源真菌的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)在製備抗結核病藥物中的應用。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的發明人從紅樹林內源真菌F^"n'wmsp.ZZF51的培養液的乙酸乙酯萃取部位，經矽膠柱層析，在乙酸乙酯/石油醚(體積比為90/10)的洗脫液中得到二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(n)，其結構式如式(I)所示，外觀為藍色晶體，化學式組成為(32(^240^204，分子質量為419.1019，紅外光譜羰基吸收峰為1653cm—1，飽和脂肪烴基吸收峰為2929，1342,701(^1-1，核磁共振氫譜在化學位移S0.8961.668和10.01311.326出現兩組包狀吸收信號，顯微電鏡(能譜)給出化合物中含有銅元素，如下結構被X射線單晶結物證實。本發明人先用卡介苗做應試菌株，採用紙片擴散法對二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)的抗結核菌活性進行初步試驗，根據初步試驗的結果，本發明再用固體培養基稀釋法測定了該化合物對卡介苗、結核分枝桿菌標準株H37RV株、臨床分離耐ISREMTB株、臨床分離耐ISEMTB株四種結核菌的最小抑菌濃度，實驗結果證實二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)具有很強的抗結核菌活性，可作為治療結核菌感染疾病的先導化合物，也可用於製備治療結核病藥物。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明提供了一種新的可用於抗結核病治療的化合物——二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(11)，從而擴大了抗結核菌藥物的種類；2.針對目前結核病發病率高、結核桿菌多重耐藥菌株及人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現，使結核病發病率和死亡率呈上升趨勢的現狀，本發明發現二(5-丁基-2-妣啶甲酸-Nl，02)合銅(II)具有抗結核菌和耐藥性結核菌活性的特點，可用於抗結核藥物的製備，具有非常廣闊的應用前景；3.二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)來源於海洋紅樹林內生真菌，從真菌中提取化合物的方法簡單，而優化培養方法將使大量發酵生產本化合物的成本低廉。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例並不對本發明做任何限定。實施例l二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)的製備配製培養基，其配方為含葡萄糖10g/L、蛋白腖2g/L、酵母膏lg/L、粗海鹽2g/L，pH為7.0。採用上述培養基對紅樹林內源真菌i^^n'wwsp.ZZF51進行懸浮態發酵培養，在25"靜置培養22天，過濾，收集發酵液。將上述發酵液採用乙酸乙酯萃取，萃取物拌矽膠裝柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，從體積比為9:l的乙酸乙酯和石油醚的洗脫液中得到絡合物粗品，經一次製備薄層層析，一次重結晶純化後可製得純品二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)。實施例2固體培養基稀釋法測定二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(n)抗卡介苗絕對濃度從斜面上刮取卡介苗培養物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarlandNo.1)比濁，即配成lmg/ml的卡介苗菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養基(該培養基已經12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘、冷卻至5055。C)，混勻，製成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60ug/ml、40yg/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml禾口10ug/ml的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的卡介苗菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種於含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37。C培養48周，觀察實驗結果，結果如表l所示。本實施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養基和Middlebrook7H11瓊脂培養基為本領域技術人員進行結核菌培養時的常用培養基，其配方採用常規配方即可。實施例3固體培養基稀釋法測定二(5-丁基2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)抗結核分枝桿菌標準株H37RV株絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌標準株H37RV株培養物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarlandNo.1)比濁，即配成lmg/ml的H37RV株菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養基中(該培養基已經12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，並冷卻至5055°C)，混勻，製成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60iig/ml、40iig/ml、30yg/ml、20ug/ml、15yg/ml禾n10ug/ml的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的H37RV株菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種於含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37。C培養48周，觀察實驗結果，結果如表l所示。實施例4固體培養基稀釋法測定二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)抗結核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株(耐異煙肼、鏈黴素、利福平、乙胺丁醇結核桿菌臨床分離株)培養物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarlandNo.l)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養基中(該培養基已經12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，並冷卻至5055。C)，混勻，製成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60ug/ml、40yg/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml和10ug/ml的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種於含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37C培養48周，觀察實驗結果，結果如表l所示。實施例5固體培養基稀釋法測定二(5-丁基-2-吡旋甲酸-Nl，02)合銅(II)抗結核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株絕對濃度從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株(耐異煙肼、鏈黴素、乙胺丁醇結核桿菌臨床分離株)培養物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，於渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarlandNo.l)比濁，配成lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株菌懸液。將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7Hl1瓊脂培養基中(該培養基已經12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，並冷卻至5055°C)，混勻，製成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)濃度分別為60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20yg/ml、15ug/ml和10ug/ml的斜面培養基。將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種於含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置於37。C培養48周，觀察實驗結果，結果如表1所示。表l二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)抗卡介苗、結核分枝桿菌標準株H37RV株、結核分枝桿菌臨床分離株耐ISREMTB株、結核分枝桿菌臨床分離株耐ISEMTB株的MIC(yg/ml)tableseeoriginaldocumentpage10權利要求1、二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)在製備抗結核病藥物中的應用。2、根據權利要求1所述應用，其特徵在於所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對卡介苗的最小抑菌濃度為15ug/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對結核分枝桿菌標準株H37RV株的最小抑菌濃度為15yg/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對結核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株的最小抑菌濃度為40iig/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合銅(II)對結核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株的最小抑菌濃度為10iig/ml。全文摘要本發明公開一種二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)在製備抗結核菌藥物中的應用。二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)具有抗結核菌和耐藥性結核菌活性的特點，可用於抗結核菌藥物的製備，而且二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)來源於海洋紅樹林內生真菌，從真菌中提取化合物的方法簡單，而優化培養方法將使大量發酵生產本化合物的成本低廉，因此將二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合銅(II)用於製備抗結核藥物具有非常廣闊的前景。文檔編號A61K31/44GK101669947SQ200910192549公開日2010年3月17日申請日期2009年9月22日優先權日2009年9月22日發明者佘志剛,林永成,潘嘉慧,軍王,賴小敏申請人:中山大學