一種多ShRNA高效協同沉默基因方法及載體的製作方法

2023-10-25 12:54:12 3

專利名稱：一種多ShRNA高效協同沉默基因方法及載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種多SiRNA高效協同沉默基因方法及載 體。
背景技術：
基因打靶是揭示基因功能分析和病理機制的強有力的工具，然而通過同源重組的 基因打靶正確交換的頻率比DNA的隨機整合效率低1000倍以上，因此在很多情況下甚至需 要篩選成千上萬個克隆才能鑑定出一個發生正確交換的重組子。儘管近年來，發展出了很 多改良的基因打靶方法，包括正負標誌物的選擇、啟動子捕獲、病毒轉運，但這些方法不總 能高效地獲得重組子最近也有人發現用小鼠的精原幹細胞來替代胚胎幹細胞來做基因打 靶，通過同源重組獲得敲除occludin基因重組子能達到1. 7%。另外，設計特異性識別某一 特定基因的鋅指核酸酶(ZFN)採用體外特異有時能達到25-50%以上的頻率，但這些改良的 方法是否設用於其他基因、其他細胞以及其他種屬還有待於進一步證實。通過S1RNA的方法來實現基因沉默是另一個選擇，然而常規的SiRNA的基因沉默 效率與傳統的基因敲除相比效率往往不高。因此，現有技術還有待於改進和發展。

發明內容
鑑於上述現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種多SiRNA高效協同沉默基 因方法及載體，旨在解決現有技術中存在的問題。本發明的技術方案如下
一種用於多SiRNA介導協同基因沉默的SiRNA載體，其特徵在於，ShRNA載體上裝載有 一段含有多個^iRNA沉默盒的DNA序列；所述S1RNA沉默盒是從多種不同的SiRNA中選擇。所述的SiRNA載體，其中，所述S1RNA載體上裝載有一段含有三個不同的S1RNA沉 默盒的DNA序列。所述的S1RNA載體，其中，每個SiRNA沉默盒上遊設置有一個慶大黴素應答的啟 動子元件Pdke ；所述慶大黴素應答的啟動子元件Pdke包括一啟動子序列、一慶大黴素應答元 件；所述啟動子序列與慶大黴素應答元件、ShRNA沉默盒依次相連。所述的S1RNA載體，其中，所述啟動子元件還包括一間隔序列，設置在一慶大黴素 應答元件與SiRNA沉默盒之間。所述的S1RNA載體，其中，所述三個不同的SiRNA沉默盒的慶大黴素應答的啟動子 元件Pdre序列如SEQ ID NO. 1-3所示。所述的S1RNA載體，其中，所述裝載有SiRNA沉默盒的DNA序列上遊還設置有一受 四環素控制的沉默子tTS、一強啟動子，所述強啟動子用於組成型表達沉默子tTS，設置在 沉默子tTS的上遊。所述的SiRNA載體，其中，所述強啟動子為CMV啟動子。
所述的S1RNA載體，其中，所述強啟動子為CAG啟動子或UBC啟動子。所述的SiRNA載體，其中，所述CMV啟動子的上遊和受四環素控制的沉默子tTS的 下遊還分別設置有多聚PolyA ；所述多聚PolyA分別用TKpA和bglobpA，TKpA設置在CMV 強啟動子的上遊，bglobpA設置在受四環素控制的沉默子tTS與第一個SiRNA沉默盒的啟 動子元件之間。所述的SiRNA載體，其中，所述S1RNA載體為質粒載體，還含有E. coli的複製子和 ColEl和氨苄抗性基因Amplrtj所述的SiRNA載體，其中，還含有G418抗性基因和強啟動子SV40 ；強啟動子SV40 設置在G418抗性基因的上遊，控制G418抗性基因的表達。所述的S1RNA載體，其中，所述SiRNA載體適用於人類細胞或組織、各種哺乳類動 物細胞或組織以及轉基因動物。一種使用上述的SiRNA載體高效協同基因沉默的方法，其中，根據需要沉默的靶 基因設計多個不同的aiRNA，從中選擇不同的aiRNA，構建一個裝載有一段含有多個SiRNA 沉默盒的DNA序列的S1RNA載體，將所述S1RNA載體轉染到受體細胞後，多個SiRNA協同沉
默靶基因。有益效果本發明提供了一項可誘導性的多SiRNA協同幹擾基因表達的SiRNA載 體，SiRNA經藥物誘導表達後，在靶基因的表達量降至檢查不到水平，而且本發明還具有廣 泛的適用性，可取代傳統的基因敲除技術來實現基因打靶。


圖1為本發明實施例1中多個SiRNA高效協同基因沉默的質粒pPolyShRNA的調 控元件排列。圖2為本發明實施例3中HEK293轉基因細胞株中沉默hSIRTl基因的構建體的結 構示意圖。圖3為本發明實施例3中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，HEK293細胞或其轉 基因細胞株(HEK-hSIRTl-ShRNA123, HEK-hSIRTl-ShRNAl, HEK-hSIRTl-ShRNA2, HEK-hSIRT l-ShRNA3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值 士 SEM)。圖4為本發明實施例3中加與不加慶大黴素(Dox)處理後HEK293細胞或其轉基 因細胞株(HEK-hSIRTl-ShRNA123, HEK-hS I RTl-ShRNAl, HEK-hSIRTl_ShRNA2, HEK-hS I RTl -ShRNA3)中檢測hSIRTl蛋白水平的免疫印跡試驗結果圖。圖5為本發明實施例3中HEK293轉基因細胞株中沉默hSIRTl基因的構建體的結 構示意圖。圖6為本發明實施例3中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，HEK293細胞或其轉 基因細胞株(HEK-hSIRTl-3ShRNAl, HEK-hSIRTl_3ShRNA2, HEK_hSIRTl_ShRNA3)中 hSIRTl mRNA水平(平均值士 SEM)。圖7為本發明實施例3中加與不加慶大黴素(Dox)處理後HEK293細胞或其轉基 因細胞株(HEK-hSIRTl-3ShRNAl, HEK-hSIRTl_3ShRNA2, HEK_hSIRTl_3ShRNA3)中檢測 hSIRTl蛋白水平的免疫印跡試驗結果圖。圖8本發明實施例5中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，hESC細胞或其轉基因細胞株(hESC-Sl, hESC-S2, hESC_S3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值士SEM)。圖9本發明實施例5中加與不加慶大黴素(Dox)處理後hESC細胞或其轉基因細 胞株(hESC-Sl，hESC-S2, hESC-S3)中檢測hSIRTl蛋白水平的免疫印跡試驗結果圖。圖10本發明實施例5中加與不加慶大黴素(Dox)處理後HESC細胞或其轉基因細 胞株(hESC-Sl，hESC-S2, hESC-S3)中檢測hSIRTl蛋白分布的免疫螢光試驗結果圖。圖11本發明實施例7中mESC細胞轉基因細胞株中沉默mSirtl基因的構建體的 結構示意圖。圖12本發明實施例7中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，mESC細胞或其轉基因 細胞株(mESC-Sl，mESC-S2, mESC_S3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值士SEM)。圖13本發明實施例7中加與不加慶大黴素(Dox)處理後mESC細胞或其轉基因細 胞株(mESC-Sl，mESC-S2，mESC_S3)中檢測mSirtl蛋白水平的免疫印跡試驗結果圖。圖14本發明實施例7中mESC細胞或其轉基因細胞株(mESC-Sl，mESC_S2， mESC-S3)中檢測mSirtl蛋白分布的免疫螢光試驗結果圖15本發明實施例9中人胚胎細胞分化而來的感光細胞轉基因細胞株中沉默hRHO基 因的構建體的結構示意圖。圖16本發明實施例8中人胚胎幹細胞向感光細胞分化的流程示意圖。圖17本發明實施例9中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由人胚胎細胞分化而來 的感光細胞(hESC-RC)或其轉基因細胞株(hESC-RCl, hESC-RC2, hESC_RC3)中 hRHO mRNA 水平(平均值士 SEM)。圖18本發明實施例9中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由人胚胎細胞分化而 來的感光細胞(hESC-RC)或其轉基因細胞株(hESC-RCl，hESC-RC2，hESC_RC3)中檢測hRHO 蛋白水平的免疫印跡試驗結果圖。圖19本發明實施例9中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由人胚胎細胞分化而 來的感光細胞(hESC-RC)或其轉基因細胞株(hESC-RCl，hESC-RC2，hESC_RC3)中檢測hRHO 蛋白分布的免疫染色試驗結果圖。圖20本發明實施例11中小鼠胚胎細胞分化而來的感光細胞轉基因細胞株沉默 hRHO基因的構建體的結構示意圖。圖21本發明實施例10中小鼠胚胎幹細胞向感光細胞分化的流程示意圖22本發明實施例11中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由小鼠胚胎細胞分化而來 的感光細胞(mESC-RC)或其轉基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2, mESC_RC3)中 mRho mRNA 水平(平均值士 SEM)。圖23本發明實施例11中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由小鼠胚胎細胞分 化而來的感光細胞(mESC-RC)或其轉基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2, mESC-RC3)中檢測 hRHO蛋白水平的免疫印跡試驗結果圖。圖M本發明實施例11中加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由小鼠胚胎細胞分 化而來的感光細胞(mESC-RC)或其轉基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2, mESC-RC3)中檢測 hRHO蛋白分布的免疫染色試驗結果圖。圖25本發明實施例13中轉基因動物視網膜特異蛋白的免疫印跡檢測試驗結果 圖，樣品為慶大黴素(dox)處理2周後的視網膜蛋白抽提物。
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圖沈本發明實施例13中免疫螢光法檢測rhodopsin的分布圖，樣品為慶大黴素 (dox)處理2周後的視網膜冰凍切片。圖27本發明實施例13中慶大黴素(Dox)處理2周(2w)、一個月(Im)、2個月(2m) 後的視網膜形態學分析(HE染色)。
具體實施例方式本發明提供一種多SiRNA高效協同沉默基因方法及載體，為使本發明的目的、技 術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具 體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。本發明用裝載有三個或多個SiRNA沉默盒的DNA序列(如=PDREl-XhoI-C istronl-AgeI-PDRE2-SalI-Cistron2-MluI-PDRE3-PstI-Cistron3-HindIII)替換 pSingle-MCS-ShRNA 載體(Clontech)中的！"et-TO-MCS 區段，獲得的構建體 pPolyShRNA 在 慶大黴素存在的情況下可以同時啟動多個SiRNA的協同表達。慶大黴素應答啟動子元件 (PDKE1，PME2，Pdke3)以及用於構建載體的各種寡聚多核苷酸見SEQ ID NO. 1-44。慶大黴素應 答啟動子元件(PDRE1，PDRE2，PDRE3)中依次包括了啟動子序列、慶大黴素應答元件DRE和 間隔序列，序列如SEQ ID N0. 1-3所示。SEQ ID N0. 4_44為實施例中各種用於沉默靶基因 所設計的SiRNA序列。^if ^j^^7n#(Tetracycline-responsible elements, TREs) jf tr|5 WJ^ 大黴素應答元件(Doxycycline-responsive elements, DREs)廣泛用於基因表達可控性 的誘導系統的構建。受四環素控制的沉默子(Tetracycline-controlled silencer, tTS) 是一個融合了轉錄阻遏因子kid-1的KRAB-AB結構域的蛋白，在慶大黴素不存在的情況 下tTS能緊密結合RNA多聚酶的結合位點，抑制基因的表達，因此本底的表達很低。從慶 大黴素(Doxycyline，Dox)存在的情況下，在tTS從RNA多聚酶的結合位點上解離下來， 啟動下遊基因的表達。本發明利用這些調控元件，構建了一個多SiRNA高效協同沉默基 因表達的質粒 pPolyShRNAZhu, Z. et al. , Use of the tetracycline-controlled transcriptional silencer (tTS) to eliminate transgene leak in inducible overexpression transgenic mice. J Biol Chem 276 (27), 25222 (2001) 在本發明 中用CMV強啟動子組成型表達tTS，為克服單個SiRNA可能效率低下的問題，將多個SiRNA 的誘導沉默盒串聯在一個載體上，每個SiRNA誘導沉默盒均由自己的慶大黴素應答元件 (Doxycycline-responsive element, DRE)控制。為排除每個啟動子相互幹擾影響RNA多 聚酶的結合，DRE與DRE之間插入了 100-200 nt的間隔子(spacer)。在這個表達系統中， 慶大黴素的添加能同時啟動多個SiRNA的表達。本發明實施例中使用慶大黴素誘導系統用於本發明的SiRNA的表達，其他類似的 誘導系統也能用於本發明的SiRNA的表達，不僅可以是慶大黴素應答元件，也可以是其他 應答元件。本發明實施例中使用的SiRNA含有69個左右的核苷酸，所用的SiRNA種子序列長 度為21個nt，所用的linker序列是TTCAAGAGA。常用的SiRNA種子序列長度有19個、21 個、23個、四個壯，SiRNA會根據種子的不同，linker的不同其序列的長度也會不同，但是 其他序列長度的SiRNA也能用於高效協同沉默靶基因。
本發明實施例中的SiRNA載體上用於表達SiRNA的強啟動子為CMV啟動子，用於 表達S1RNA的強啟動子還可以為CAG，UBC等，或其修飾的啟動子。本發明S1RNA載體的構建操作按標準的克隆方法進行。質粒的製備採用QIApr印 Spin Minipr印試劑盒(Qiagen)。HEK293細胞、人胚胎幹細胞(H9系)、小鼠胚胎幹細胞 (mESC) (129/SV系)用於構建轉基因的穩定表達細胞株。培養人胚胎幹細胞、小鼠胚胎 幹細胞、DNA轉染以及逐步分化試驗是參考發表的文獻進行Thomson，J. A. et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 (5391)， 1145 (1998) ；Wuj H. et al. , Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 104 (34)，13821 (2007) ；Wernigj Μ. et al.，In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES一cell一like state. Nature 448 (7151)，318 (2007) ；Zwakaj Τ. P. and Thomson, J. A. , Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechno 1 21 (3)， 319 (2003) ；Watanabej K. et al.， Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci 8 (3)，288 (2005) ；Ikedaj H. et al.，Generation of Rx+/Pax6+ neural retinal precursors from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 102 (32)，11331 O005)。在構建人胚胎幹細胞的轉基因系時，需將細胞先用胰蛋白酶消 化成單細胞，在此過程中為提高增加細胞的成活率，在用胰蛋白酶消化前用ROCK抑制物處 理 1 小時Watanabe, K. et al. , A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 25 (6)，681 U007)。按文獻所述提取 總RNA的分離並逆轉錄成cDNA，並用qRT-PCR對mRNA的豐度(mRNA aboundance)進行定量Gazin, C. et al. , An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature 449 (7165)，1073 (2007)，用免疫印跡和免疫螢光測定蛋白水平和 其在細胞內的分布。冰凍的組織切片用4%福馬林於室溫固定10分鐘。為對轉基因小鼠 的視網膜的形態進行評估，我們製備石蠟組織切片並進行HE染色。以下實施例中，定量實時PCR (qRT-PCR)用的試劑為Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG with Rox anvitrogen)。同時檢測人肌動蛋白(hActin)和小鼠肌動蛋白 (mActin)作為內參。用於檢測 hSIRTl, mSirtl, hRHO, mliho 的引物參見 SEQ ID N0. 45-57。免疫螢光染色用於檢測細胞或組織中蛋白的分布，免疫印跡用於蛋白的定 量。用到的一抗及其工作稀釋度如下rabbit anti-hSIRTl (1:500-2000, #1104-1， Epitomics), rabbit anti-Sirtl (1:500-1000, #09—845， Millipore), mouse anti-rhodopsin (1:500-2000, #sc_57433, Santa Cruz), rabbit anti-GNATl (1:200-1000，# sc-389, Santa Cruz), goat anti-hCNGAl (1:100-1000，#sc_13690, Santa Cruz), goat anti-mCNGAl (1:500-1000, #sc_13694, Santa Cruz), goat anti-PDC (1:500-1000, #sc_18413， Santa Cruz), anti-PDE6b (1:200-1000, #sc_30717， Santa Cruz), mouse anti-actin (1:2,000-10, 000, #A5228， Sigma-Aldrich)。二抗為偶聯有螢光標記或那根過氧化物酶的抗體，分別為=Alexa Fluor dyes (594 or 488) (1 :500, Invitrogen) ；Anti-mouse IgG peroxidase conjugate (1:50,000, #a2304， Sigma-Aldrich), goat anti-rabbit IgG peroxidase conjugate(1:50,000， #a9169, Sigma-Aldrich)及 rabbit anti-goat IgG peroxidase conjugate (1:80, 000, #a5420, Sigma-Aldricti)。實施例1 :多SiRNA基因沉默DNA構建體的製備。用裝載有三個或多個SiRNA沉默盒的DNA序列(PDREl-XhoI-ShRNAl-AgeI-PDRE 2-SalI- ShRNA 2-MluI-PDRE3_PstI- ShRNA 3_HindIII)替換 pSingle-MCS-ShRNA 載體 (Clontech)中的！"et-TO-MCS區段，獲得的構建體pPolySiRNA。如圖1所示，多個ShRNA 高效協同基因沉默的質粒PPolyShRNA的調控元件排列。多個SiRNA沉默盒放在同一載體 上，其表達受慶大黴素應答元件(DRE)調控。在有慶大黴素(D0XyCyCline，D0X)時，才啟動 SiRNA的表達。G418抗性基因受強啟動子SV40 (Psv4tl)控制。tTS受CMV啟動子(Paw)調 節，多聚PolyA分別用TKpA和bglobpA，為在E. coli中製備質粒，質粒還含有E. coli的復 制子ColEl和氨苄抗性基因(Amplr )。實施例2 :HEK293細胞的培養及其轉基因細胞系的構建。本實施例培養HEK293細胞用的是在添加有10%胎牛血清(FBS)的培養基。另外， 為製備沉默hSIRTl基因的轉基因細胞系，本實施例將打靶質粒經BsaI酶處理線性化後，用 磷酸鈣的方法做瞬時轉染。為了選擇沉默hSIRTl基因表達的轉基因細胞系，在培養基中添 加G418，使其終濃度為400mg/ml。隨機挑選數個G418抗性的轉基因細胞，經慶大黴素處 理後進行進一步的qRT-PCR、免疫印跡以及免疫螢光試驗。實施例3 在HEK293細胞中幹擾hSIRTl基因表達的沉默效率。為檢測該系統的基因沉默效率，本發明利用HEK293細胞系研究了三個不同SiRNA 沉默盒(hSIRTI-ShRNA 1，hSIRTl_ShRNA2，hSIRTl_ShRNA3)裝載在同一載體上針對 hSIRTl 基因(GenBank accession #, NM_00114M98)的沉默效應。為研究每個SiRNA的沉默效 率，同時也構建了將每個SiRNA沉默盒單獨只放一個拷貝在一個載體的質粒。質粒線性化 後轉染HEK293細胞，G418選擇整合有SiRNA沉默盒的陽性細胞，具體步驟參見實施例2。如圖2所示，HEK293轉基因細胞株HEK-hSIRTl_aiRNA123中含有在同一載體上 裝有三個不同 ^iRNA ChSIRTl-ShRNAl, hSIRTl-ShRNA2, hSIRTl-ShRNA3)的沉默 hSIRTl 基因的構建體al，每個SiRNA —個拷貝；HEK293轉基因細胞株HEK-hSIRTl-SiRNAl中為 裝有一個hSIRTl-SiRNAl拷貝的沉默hSIRTl基因的構建體bl ；HEK293轉基因細胞株 HEK-hSIRTl-ShRNA2中為裝有一個hSIRTl_aiRNA2拷貝的沉默hSIRTl基因的構建體cl ； HEK293轉基因細胞株HEK-hSIRTl-aiRNA3中含有裝有一個hSIRTl_aiRNA3拷貝的沉默 hSIRTl基因的構建體dl。如圖3所示，實時定量PCR (qRT-PCR)的結果表明，慶大黴素誘導後，每個SiRNA 沉默盒的基因沉默效率能達到88%-93%。當這三個不同SiRNA沉默盒放在同一載體上時，沉 默效率高達98%以上，表達不同的沉默盒有明顯的疊加效應。如圖4所示(Control:正常 HEK293細胞對照)，免疫印跡實驗結果表明，當使用三個相同的SiRNA沉默盒時仍有殘餘的 hSIRTl蛋白，其表達仍然有10-30%，但當三個不同的SiRNA沉默盒在同一載體上時，hSIRTl 蛋白水平則降到檢測不到的程度，說明這些SiRNA分子不僅可以降解hSIRTl mRNA,也可以 通過結合殘餘的mRNA分子來阻斷其繼續作為翻譯模板的作用。本實施例中也構建了將在同一載體上將同一 SiRNA放三個拷貝的質粒，檢測多個 相同SiRNA拷貝在HEK293細胞中對hSIRTl基因的沉默效率。如圖5所示，HEK293轉基因細胞株HEK-hSIRTl-3ShRNAl中含有在同一載體上裝有三個相同hSIRTHhRNAl拷貝的 沉默hSIRTl基因的構建體a2 ；HEK293轉基因細胞株HEK_hSIRTl_3ShRNA2中含有在同一 載體上裝有三個相同hSIRTl-aiRNA2拷貝的沉默hSIRTl基因的構建體M ；HEK293轉基因 細胞株HEK-hSIRTl-SiRNA3中含有在同一載體上裝有三個相同hSIRTl_aiRNA3拷貝的沉默 hSIRTl基因的構建體c2。如圖6和圖7所示，qRT-PCR和免疫印跡實驗表明，簡單地增加單個SiRNA的拷 貝數不能明顯地進一步線性提升靶基因的沉默效率，提示既增加SiRNA的拷貝數又增加 ShRNA的多樣性比單獨只增加每個SiRNA的拷貝數更有效。圖7中，Control:正常HEK293 細胞對照。實施例4 人胚胎幹細胞的培養及其轉基因細胞系的構建。本實施例採用人胚胎幹細胞(HESC)是H9系。培養人胚胎幹細胞時用到的飼 養細胞是經輻射處理過的來源於SNL小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)。用的DMEM/F12培養 基是添力口有 20% Knockout replacer (Invitrogen) , 10ng/ml bFGF, 1 mM Glutamine, 1% nonessential amino acids (NEAA), 1% penicillin/streptomycin, 0.1 mM 2-mercaptoenthanol。培養基每兩天更換一次，而bFGF則需每天添加。4_6天後傳代，傳代 時用的是 lmg/ml 的 dispase/collagenase IV (Invitrogen)將細胞在 37°C下消化 10-20 分鐘。在構建轉基因細胞系時，需用胰蛋白酶消化成單細胞，這是為了提高細胞的成活率， 在消化前先用IOmM ROCK抑制物Y-27632 (Calbiochem)處理1小時後，再用lmg/ml的 collagenase IV和含有0. 25%胰蛋白酶、20%的KSR、ImM CaCl2於37°C消化7分鐘。用電 穿孔法將線性化的DNA構建體導入細胞。細胞在用電穿孔導入DNA構建體之前，細胞用培養 基淋洗一遍並重新懸浮在新的培養基中，0. 5ml中的細胞數量約為1.5-3. OxlO7，然後再接 到鋪有新的飼養細胞培養皿中。電穿孔是在室溫下進行，線性化DNA用量約40mg，脈衝電壓 為320V，電容為200mF。細胞在導入圖2所示的DNA構建體後繼續培養48小時，然後再添加 G418 (50mg/ml)選擇整合有沉默盒的轉基因細胞。1個星期後，G418的濃度提高至IOOmg/ ml。隨機挑選數個G418抗性的轉基因細胞經慶大黴素處理後進行進一步的qRT-PCR、免疫 印跡以及免疫螢光試驗。實施例5 在人胚胎幹細胞中幹擾hSIRTl基因表達的沉默效率。為驗證這種基因沉默策略是否適用於其他類型的細胞，本發明也檢測了圖2所示 的構建體在人胚胎幹細胞中幹擾hSIRTl基因表達的效率。質粒線性化後轉染人胚胎幹細 胞(hESC)細胞，G418選擇整合有SiRNA沉默盒的陽性細胞，具體步驟參見實施例4。對hESC細胞或其轉基因細胞株(hESC-Sl，hESC_S2，hESC_S3)進行進一步的 qRT-PCR、免疫印跡以及免疫螢光試驗。如圖8所示，qRT-PCR的結果表明，慶大黴素誘 導後，所選的轉基因細胞系中hSIRTl mRNA level降低了 93%以上；如圖9所示，其免 疫印跡表明，hSIRTl蛋白降低到檢測不到的水平。圖9中，Control:正常人胚胎幹細 胞(hESC)對照。如圖10所示，其免疫螢光的數據表明，在正常的細胞中，hSIRTl蛋白的 分布主要在細胞核中，與文獻報導相符Vaquero，A. et al.，SIRTl regulates the histone methyl-transferase SUV39H1 during heterochromatin formation. Nature 450 (7168)，440 (2007) ]0而在這些轉基因細胞系中，經慶大黴素誘導後hSIRTl蛋白信 號幾乎完全消失。因此，殘餘的少量hSIRTl mRNA分子不能再作為蛋白翻譯的有效模板。
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實施例6 小鼠胚胎幹細胞及其轉基因細胞系的構建的培養。本發明採用小鼠胚胎幹細胞(mESC)屬129/SV系。培養小鼠胚胎幹細胞時用到的 飼養細胞是經輻射處理過的來源於SNL小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs )。用的DMEM培養基添加 有 15%FBS, 10ng/ml LIF, 1 mM Glutamine, 1% nonessential amino acids (NEAA), 1% penicillin/streptomycin, 0. 1 mM 2-mercaptoenthanol。培養基每兩天更換一次，而LIF 則需每天添加。為建立整合有沉默盒的細胞系，用蛋白酶將細胞克隆消化單細胞(0. 25%胰 蛋白酶，ImM EDTA，37°C，7*#)。用電穿孔法將線性化的DNA構建體導入細胞。在用電穿 孔導入DNA構建體之前，細胞用培養基淋洗一遍並重新懸浮在新的培養基中，0. 5ml中的細 胞數量約為1.5-3.0 χ 107，然後再接種到鋪有新的飼養細胞培養皿中。電穿孔是在室溫下 進行，線性化DNA用量約40mg，脈衝電壓為250V，電容為500mF。導入DNA構建體培養48小 時後，再添加G418 (400mg/ml)選擇整合有沉默盒的轉基因細胞。7_10天後選擇G418抗 性的克隆經慶大黴素處理後進行qRT-PCR、免疫印跡、免疫螢光和/或建立轉基因小鼠的試 驗。實施例7 在小鼠胚胎幹細胞中幹擾mSirtl基因表達的沉默效率。為驗證這種基因沉默策略是否適用於其他類型的細胞，本發明構建了類似的沉默 小鼠 Sirtl (mSirtl)基因(GenBank accession #, NM_019812)的載體，是在同一載體上 裝有三個不同 ShRNA (mSirtl-ShRNAl, mSirtl-ShRNA2, mSirtl_aiRNA3)沉默 mSirtl 基因 的構建體，每個SiRNA —個拷貝，如圖11所示。質粒線性化後轉染mESC細胞，G418選擇整 合有S1RNA沉默盒的陽性細胞，具體步驟參見實施例6。隨機挑選三組整合有SiRNA沉默盒 的轉基因細胞株mESC-Sl，mESC-S2, mESC_S3進行檢測。加與不加慶大黴素(Dox)處理後，mESC細胞或其轉基因細胞株 (mESC-Sl, mESC-S2, mESC_S3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值士SEM)、檢測 mSirtl 蛋白水 平的免疫印跡試驗、檢測mSirtl蛋白分布的免疫螢光試驗的結果如圖12、圖13和圖14所 示，qRT-PCR、免疫印跡及免疫螢光實驗均表明mSirtl的表達在這些轉基因細胞系中均有 效被抑制。圖14中Control:正常小鼠胚胎幹細胞(mESC)對照。實施例8 人胚胎幹細胞向感光受體細胞的分化。人胚胎幹細胞向感光細胞的分化按圖16所示逐步進行，分化過程是按Oskada 等人的方法分步進行Osakada, F. et al. , Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 26 (2), 215 O008)。具體做法是，用含有 lmg/ml 的 collagenase IV,0. 25% 胰蛋白酶、20%的KSRUmM CaCl2的PBS中37°C下將人胚胎幹細胞的克隆部分消化，再結 合機械法將之解離成5-10個細胞的團塊。通過中在用gelatin包被過的培養皿中溫浴片 刻將飼養細胞除去。細胞團塊轉移至含有20% Knockout replacer (Invitrogen) , IOng/ ml bFGF, 1 mM Glutamine, 1% nonessential amino acids (NEAA), 1% penicillin/ streptomycin, 0.1 mM 2-mercaptoenthanol 的 DMEM/F12 培養基的非粘附性的培養細 菌的培養皿中。兩天後，換成分化培養基(G-MEM) (0.1 % NEAA, ImM Pyruvate, 0. ImM 2-mercaptoenthanol, 15% KSR)。在如圖16所示的時間點，將KSR降為10%。三周後換成 添加lOOng/ml Dkk-I Lefty-A的懸浮培養基。再將細胞團塊按12-15團塊/cm2重的密 度重鋪在經 poly-D-lysine (BD) /laminin (BD) /fibronectin (GIBCO)包被過的培養皿中，用含有10%KSR的貼壁培養基繼續分化過程。為將其分化成感光細胞，人胚胎幹細胞先 在SFEB/DL的條件下培養3-4個月，再換成RA/T分化培養基(G-MEM，5%KSR，0. ImM NEAA, 1 mM pyruvate, 0. ImM mercaptoethanol, ImM retinoic acid (RA), IOOmM taurine, N2 supplement)培養4周。整個過程中，細胞分成兩組，一組一直添加ang/ml的慶大黴素，另 一組不加慶大黴素。qRT-PCR、免疫印跡以及免疫螢光試驗用於分析rhodopsin (視紫紅質) 基因的表達和分布。實施例9 在人胚胎幹細胞分化而來的光受體細胞中幹擾rhodopsin基因表達的
沉默效率。為進一步驗證這種基因沉默策略適用的普遍性，本發明測定了由人胚胎幹細胞分 化過來的子代細胞中對特定基因表達的沉默效率。本實施例中構建了沉默人rhodopsin (hRHO)基因(GenBank accession #』 NM_000539. 3)的 ShRNA 載體，是在同一載體上裝有 三個不同 ShRNA (hRHO-ShRNAl, hRH0-ShRNA2, hRH0_ShRNA3)的沉默 hRHO 基因的構建體， 每個S1RNA —個拷貝，其構成如圖15所示。Iihodopsin是視網膜杆狀細胞中光傳導系統 及構成外節視盤(outer segment disk)的關鍵蛋白Lem, J. et al. , Morphological, physiological, and biochemical changes in rhodopsin knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA 96 (2)，736 (1999) ；Palczewski, K. , G protein-coupled receptor rhodopsin. Annu Rev Biochem 75，743 (2006) 質粒線性化後轉染 mESC 細胞，G418 選 擇整合有SiRNA沉默盒的陽性細胞做體外分化成視網膜杆狀細胞的試驗，具體步驟參見實 施例8。隨機挑選三組整合有ShRNA沉默盒的轉基因細胞株hESC-RCl，hESC-RC2, hESC_RC3， 進行檢測。在加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由人胚胎細胞分化而來的感光細胞 (hESC-RC)或其轉基因細胞株(hESC-RCl, hESC-RC2, hESC_RC3)中 hRHO mRNA 水平(平均值 士 SEM)、檢測hRHO蛋白水平的免疫印跡試驗、檢測hRHO蛋白分布的免疫染色試驗結果如圖 17、圖18和圖19所示，qRT-PCR表明經慶大黴素處理後rhodopsin mRNA水平中降低了 94% 以上；免疫印跡和免疫螢光試驗均證明rhodopsin蛋白降低到檢測不到的水平。圖18中， Control為正常視網膜對照。實施例10 小鼠胚胎幹細胞向感光受體細胞的分化。小鼠胚胎幹細胞的分化按文獻所述逐步進行，分化過程是按Oskada等人的方法分 步進行Osakada, F. et al. , Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 26 (2), 215 (2008) ]0 在圖 21 所示的時間於分化培養基(G-MEM, 5% KSR (GIBC0)，0. 1 mM NEAA, ImM pyruvate, 0. 1 mM 2-mercaptoethanol)中力口入 DKKl (lOOng/ml, R&D systems) , Lefty A(500ng/ml, R&D systems), 5% FBS (GIBCO)禾口 Activin—A (10ng/ml，R&D systems)。細 胞用胰蛋白酶消化後重新懸浮於含有10%FBS的經過包被的培養基的培養皿中。包被用液 Spoly-D-Iysine (BD)/laminin (BD)/fibronectin。10 天后換成無 FBS 的培養基並添 力口 IOmM g-secretase 抑制物(N_[N_(3，5_difluorophenacetyl)-Lalanyl]-S-phenylgl ycine t-butyl ester)。為將其分化成感光細胞，在如圖21所示的時間點換成視網膜細 胞培養基(66%-E-MEM-HEPES (Sigma), 33% HBSS (GIBCO), 1%FBS, N2 (GIBCO)，5· 75 mg/ ml glucose, 200 mM L-glutamine, 50ng/ml aFGF (R&D systems), 10 ng/ml bFGF (R&DSystems),ImM taurine (Sigma), 3nM Shh(R&D systems), 500nM retinoic acid (RA) (Sigma)0在整個過程中，細胞分成兩組，一組一直添加ang/ml的慶大黴素，另一組不加慶 大黴素。qRT-PCR、免疫印跡以及免疫螢光試驗用於分析rhodopsin的表達和分布。實施例11 在小鼠胚胎幹細胞分化而來的光受體細胞中幹擾rhodopsin基因表達 的沉默效率。為進一步驗證這種基因沉默策略適用的普遍性，本發明也測定了由小鼠胚胎幹細 胞分化過來的子代細胞中對特定基因表達的沉默效率。本實施例中構建了類似的沉默小鼠 rhodopsin 基因(mRho) (GenBank accession #, NM_145383)的 ShRNA 載體，是在同一載體 上裝有三個不同 ShRNA (mRho-ShRNAl, mRho-ShRNA2, mI ho-aiRNA3)沉默 mliho 基因的構建 體，每個SiRNA —個拷貝，其構成如圖20所示。將上述構建體線性化後轉染細胞小鼠胚胎幹細胞(mESC)，G418選擇整合有SiRNA 沉默盒的陽性細胞做體外分化成視網膜杆狀細胞的試驗，具體步驟如實施例10所示。隨機 挑選含有SiRNA沉默盒的三組轉基因細胞株mESC-RCl，mESC-RC2, mESC-RC3進行檢測。在加與不加慶大黴素(Dox)處理後，由小鼠胚胎細胞分化而來的感光細胞 (mESC-RC)或其轉基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2，mESC-RC3)中 mRho mRNA 水平、檢測 hRHO蛋白水平的免疫印跡試驗、檢測hRHO蛋白分布的免疫染色試驗結果分別如圖22、圖23 和圖M所示，qRT-PCR結果表明經慶大黴素處理後rhodopsin的mRNA豐度水平降低了 91% 以上；免疫印跡和免疫螢光試驗均證明rhodopsin蛋白降低到檢測不到的水平。圖23中， Control:正常視網膜對照。實施例12 轉基因小鼠的構建。轉基因雄性小鼠胚胎幹細胞注射到C57BL/6的囊胚後產生的嵌合體小鼠 與雌性C57BL/6小鼠交配獲得的子代小鼠用PCR方法進行基因型分析。基因型分 析中用於檢查整合有沉默盒的引物N5和N3與G418抗性基因的部分學列匹配(N5 5'-gctgctctgatgccgccgtgttc ；N3 :5'-gatgtttcgc ttggtggtcgaatg)。注身寸小鼠時慶大黴 素的劑量為2mg/g體重。qRT-PCR、免疫印跡以及免疫螢光試驗用於分析rhodopsin的表達 和分布。石蠟切片經HE染色後用於評估視網膜的感光細胞數量已經視網膜的形態結構。實施例13 在轉基因小鼠視網膜中幹擾rhodopsin基因表達的沉默效率。為進一步驗證該基因沉默策略是否也適用於轉基因動物，本發明利用以上獲得的 一個整合有rhodopsin基因沉默盒的小鼠胚胎幹細胞建立了轉基因小鼠模型(具體步驟參 見實施例12)。實驗中結果表明，在沒有慶大黴素的情況下，轉基因小鼠的rhodopsin能正 常表達，其視網膜也能正常發育。在慶大黴素存在的情況下，rhodopsin的表達顯著性地 受到抑制並導致視網膜退化。免疫印跡表明，經慶大黴素處理兩周後，rhodopsin蛋白降 低到檢測不到的水平而其他多個視網膜特異的標誌蛋白(GNAT1、PDC、PDE6b、CNGAU GRKl 及RD12)在視網膜杆狀細胞中沒有明顯退化前基本不受影響，而rhodopsin蛋白兩周後降 低檢測不到的水平，如圖25和圖沈所示。圖25中，Control:正視網膜對照。圖沈和圖 27中，WT 正常視網膜；IihoKD rhodopsin基因沉默的轉基因視網膜。隨著慶大黴素處理繼 續，感光受體細胞退化越來越明顯。免疫螢光試驗表明，在沒有經慶大黴素處理的情況下， rhodopsin蛋白特異性地高度富集在外節視盤。如圖27所示，組織形態學分析表明，對正 常小鼠慶大黴素本身不會影響感光受體細胞的數量和結構；而對於轉基因小鼠，若不經慶大黴素處理，其光受體細胞的數量和結構與正常小鼠相似，無明顯的缺陷；在慶大黴素處理 兩周之後只是視網膜的外節(OS)長度有些輕微變短；在慶大黴素處理1個月後，儘管光受 體細胞在數量上能有3/4以上的細胞還存活，但視網膜的外節明顯變短；在慶大黴素處理2 個月後，只有不到兩排光受體細胞還存活，而視網膜外節則短得近乎可以忽略。這些表型變 化，與傳統的方法構建的rhodopsin基因敲除動物或其突變體的轉基因動物相一致。從上述實施例中可以看到，就靶蛋白的表達而言，本發明設計的慶大黴素控制下 的多S1RNA協同沉默基因表達系統在小鼠、人等多種哺乳類細胞或器官中均能實現接近 100%沉默效率，表明本發明S1RNA表達載體具有廣泛的適用性，適用於人類細胞或組織、各 種哺乳類動物細胞或組織、其他潛在種屬的細胞或組織以及轉基因動物。應當理解的是，本發明的應用不限於上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可 以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保 護範圍。
權利要求
1.一種用於多SiRNA介導協同基因沉默的SiRNA載體，其特徵在於，ShRNA載體上裝載 有一段含有多個^iRNA沉默盒的DNA序列；所述S1RNA沉默盒是從多種不同的SiRNA中選擇。
2.根據權利要求1所述的SiRNA載體，其特徵在於，所述SiRNA載體上裝載有一段含有 三個不同的SiRNA沉默盒的DNA序列。
3.根據權利要求2所述的S1RNA載體，其特徵在於，每個SiRNA沉默盒上遊設置有一個 慶大黴素應答的啟動子元件Pdke ；所述慶大黴素應答的啟動子元件Pdke包括一啟動子序列、 一慶大黴素應答元件；所述啟動子序列與慶大黴素應答元件、ShRNA沉默盒依次相連。
4.根據權利要求3所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述啟動子元件還包括一間隔序 列，設置在一慶大黴素應答元件與SiRNA沉默盒之間。
5.根據權利要求4所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述三個不同的SiRNA沉默盒的慶 大黴素應答的啟動子元件Pdke序列如SEQ ID NO. 1-3所示。
6.根據權利要求5所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述裝載有SiRNA沉默盒的DNA序 列上遊還設置有一受四環素控制的沉默子tTS、一強啟動子，所述強啟動子用於組成型表達 沉默子tTS，設置在沉默子tTS的上遊。
7.根據權利要求6所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述強啟動子為CMV啟動子。
8.根據權利要求6所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述強啟動子為CAG啟動子或UBC 啟動子。
9.根據權利要求7所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述CMV啟動子的上遊和受四 環素控制的沉默子tTS的下遊還分別設置有多聚PolyA ；所述多聚PolyA分別用TKpA和 bglobpA, TKpA設置在CMV強啟動子的上遊，bglobpA設置在受四環素控制的沉默子tTS與 第一個S1RNA沉默盒的啟動子元件之間。
10.根據權利要求9所述的S1RNA載體，其特徵在於，所述SiRNA載體為質粒載體，還含 有E. coli的複製子和ColEl和氨苄抗性基因Amplrtj
11.根據權利要求10所述的SiRNA載體，其特徵在於，還含有G418抗性基因和強啟動 子SV40 ；強啟動子SV40設置在G418抗性基因的上遊，控制G418抗性基因的表達。
12.根據權利要求1-11任一項所述的SiRNA載體，其特徵在於，所述S1RNA載體適用於 人類細胞或組織、各種哺乳類動物細胞或組織以及轉基因動物。
13.一種使用權利要求1所述的SiRNA載體高效協同基因沉默的方法，其特徵在於，根 據需要沉默的靶基因設計多個不同的SiRNA，從中選擇不同的SiRNA，構建一個裝載有一段 含有多個^iRNA沉默盒的DNA序列的S1RNA載體，將所述S1RNA載體轉染到受體細胞後，多 個SiRNA協同沉默靶基因。
全文摘要
本發明公開了一種多ShRNA高效協同沉默基因方法及載體，提供了一項可誘導性的多ShRNA協同幹擾基因表達的ShRNA載體，ShRNA經藥物誘導表達後，在靶基因的表達量降至檢查不到水平，而且本發明還具有廣泛的適用性，可取代傳統的基因敲除技術來實現基因打靶。
文檔編號C12N15/63GK102061305SQ20101058801
公開日2011年5月18日 申請日期2010年12月15日 優先權日2010年12月15日
發明者劉小青, 黃 俊 申請人:深圳市百恩維生物科技有限公司