一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法
2023-10-25 13:15:07
專利名稱：一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法
技術領域：
本發明屬於腫瘤生物治療技術領域，涉及第三類醫療技術的自體免疫細胞治療， 具體是涉及一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法。
背景技術：
腫瘤是嚴重危害人民生活和健康的重大疾病之一。目前，惡性腫瘤是全球第二大 導致死亡的疾病，也是中國城鄉居民第一位死亡原因，中國每年新發病腫瘤患者總數約200 萬人，新增腫瘤患者年均增長率在10%左右。手術、化療、放療仍是腫瘤的主要治療方法。但 是，即使根治性手術也只能解決局部問題，不能避免全身轉移。化療、放療存在的最大問題 是其殺傷作用沒有針對性，長期的化療、放療會損傷機體的免疫系統及各器官組織的功能， 甚至誘發新的癌變。更為重要的是由於腫瘤細胞缺乏特異性的抗原、腫瘤細胞的抗原調變 及MHC分子表達異常等因素導致腫瘤免疫逃逸，成為腫瘤治療的一大難題。由於傳統的手術、放化療的發展已進入平臺期，人們把越來越多的目光投到腫瘤 的生物治療上。腫瘤生物治療(Biotheropy)是應用現代生物技術及其產品進行腫瘤防治 的新療法，它通過調動宿主的天然防衛機制或給予天然(或基因工程)產生的針對性靶向 性很強的物質來取得抗腫瘤的效應。隨著對腫瘤發生發展分子機制的深入研究和生物技術 的發展，生物治療已經成為腫瘤綜合治療中的第四種模式。生物治療對放、化療不敏感及無 法耐受放、化療的老年患者來說是一大福音，可以明顯提高患者的生活質量，延長患者的生 存期，受到越來越多的重視。在37-39屆(美國臨床腫瘤協會會議)ASC0和第7屆中國抗 癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會(CSC0)年會上成為最令人矚目、最鼓舞人心的焦點。自體免疫細胞治療是生物治療中過繼性細胞治療的一類，是將自體的免疫活性細 胞經過體外擴增後輸入患者體內，直接殺傷腫瘤細胞，調節和增強機體的免疫功能。細胞治 療具有增殖速度快殺瘤活性高的特點，可直接殺傷患者體內殘餘腫瘤細胞，解除機體免疫 抑制，增強患者的免疫功能，降低復發率和轉移率，延長腫瘤患者的生存期並提高其生活質 量。包括自然殺傷細胞(NK)、腫瘤浸潤細胞(TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、細胞毒 性T淋巴細胞(CTL)、樹突狀細胞聯合細胞因子誘導的殺傷細胞(DC-CIK)等。其中樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞 (Antigen presenting cells, APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具 有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處於啟動、調控、並維持免疫應答的 中心環節。DC作為目前發現的功能最強的APC，能夠誘導特異性的細胞毒性T淋巴細胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)生成。基於「雙信號學說」的理論基礎，DC聯合CIK是目 前最有效的細胞治療的方法。即使DC-CIK是最強的細胞治療的方法，但是由於腫瘤細胞缺乏特異性抗原、免疫 原性差，對腫瘤的殺傷性仍然很弱。目前解決這一問題的最好途徑是從患者的手術標本中 提取全抗原，應用腫瘤全抗原或抗原多肽體外衝擊致敏DC，回輸或免疫接種於載瘤宿主，可 誘發特異性CTL的抗腫瘤免疫反應，是目前最有效的抗腫瘤免疫反應。
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令人遺憾的是腫瘤組織切除後暴露於體外環境後容易被汙染，而人體的呼吸系 統、消化系統本身是開放或半開放的系統，其術後的腫瘤標本便極可能是被大腸桿菌、球菌 等汙染的標本。腫瘤標本的無菌處理成為全抗原致敏DC細胞治療腫瘤的桎梏，而現有技術 中尚未見有很好地解決辦法。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處 理方法，以獲得既安全又有效的腫瘤抗原致敏的特異性DC細胞，保證患者的安全。本發明的目的通過以下技術方案實現。本發明的技術方案主要基於以下認識腫瘤全抗原的製備是一個複雜的過程，包 括腫瘤組織標本的收集凍存、粉碎凍融、測蛋白濃度、無菌處理及刺激DC細胞等環節，其中 來源於消化道、呼吸道等系統的有菌腫瘤標本的無菌處理是整個過程的關鍵環節，只有確 保腫瘤抗原的無菌才能完成致敏DC細胞無菌培養，保證患者的安全，否則培養過程中細菌 大量繁殖產生的內、外毒素會導致患者休克甚至死亡。一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法，包括 以下步驟1、製備腫瘤全抗原①將手術切出的腫瘤標本置於無菌缸中保存；②在無菌環境下，用含慶大黴素100 160IU/ml的無菌生理鹽水衝洗腫瘤標本 2 3次；③將腫瘤標本分切成組織塊後置於凍存管中，在_86°C _156°C環境下凍存、備 用；④取出腫瘤組織塊，在無菌環境下反覆衝洗、棄除血液，然後將組織塊剪碎；⑤將剪碎的腫瘤組織置於凍存管中，按體積比1 5加生理鹽水，在液氮和37°C水 浴鍋中反覆凍融5 6次；⑥凍融後的腫瘤組織13000g 14000g離心18 22min，取上清液即為腫瘤全抗 原，於-86°C _156°C環境下凍存；2、腫瘤全抗原滅菌處理①檢測腫瘤全抗原的蛋白含量；②根據步驟①所測的腫瘤全抗原的蛋白含量，將提取的腫瘤全抗原按lOOng/ml 加入培養好的DC細胞中，同時加入萬古黴素25 80ug/ml和亞胺培南西司他丁鈉8ug 66ug/ml，再經過2 72小時共培養，即完成腫瘤組織全抗原的滅菌。所述的組織塊規格優選0. 5mmXO. 5mm、厚度< 0. 5cm。所述的抗生素添加濃度，其中萬古黴素優選25 40ug/ml ；亞胺培南西司他丁鈉 優選 8ug 17ug/ml。相對於現有技術，本發明具有以下優點1、亞胺培南具有強大的抑制細胞壁合成的能力，可殺滅絕大部分革蘭氏陽性、陰 性的需氧和厭氧菌，尤其是是革蘭氏陰性菌。萬古黴素對革蘭陽性菌有效，如溶血性鏈球 菌、肺炎球菌、淋球菌及腸球菌等均敏感，對耐藥金葡菌尤為敏感；其作用機制是抑制細菌 細胞壁的合成，它主要和細菌細胞壁結合，而使某些胺基酸不能進入細胞壁的糖肽中。本發明選擇將兩者組合用於腫瘤組織全抗原的滅菌，不僅抗菌殺菌能力強、抗菌譜廣、幾乎不耐 藥外，而且過敏反應發生率極低，安全有效。2、本發明能有效抗復發，由於患者自身腫瘤組織中含有特異性的腫瘤抗原，可以 有效地刺激機體產生抗腫瘤抗體，從而達到特異的殺傷腫瘤細胞的效果。3、目前，國內外最常用的無菌處理方法有過濾法和使用抗生素法。過濾法的不足 之處在於會損失珍貴的腫瘤蛋白，而且如果操作不慎仍然有汙染的危險；常規使用的抗生 素為青黴素及鏈黴素，這兩種抗生素的局限性是均容易發生過敏反應、副作用較大，滅菌率 有效率僅為10 20%，不能應用於臨床，只能用於科研實驗。本發明既考慮了使用的安全 性、有效性，使用的劑量小、成本低，同時儘可能的節約患者的有限的腫瘤標本，充分利用資 源，提高患者的療效。4、該方法操作簡便、成本低廉，滅菌效果顯著，具有良好地應用前景。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步地詳細說明，但實施例並非是對本發明的限定。實施例1取肺部腫瘤的手術組織置於無菌缸中保存，在超菌工作檯中將腫瘤標本取出放於 彎盤中，用含慶大黴素160IU/ml的無菌生理鹽水衝洗2遍。將腫瘤標本剪為0. 5mmX0. 5mm、 厚度< 0. 5cm的組織塊後置於凍存管中，放_156°C超低溫冰箱中凍存、備用。從超低溫冰 箱中取出腫瘤標本，在無菌操作下將組織塊進行反覆衝洗棄除血液，並將組織標本剪碎。將 剪碎的標本放於凍存管中，按體積比1 5加生理鹽水，在液氮和37°C水浴鍋中反覆凍融 5次。將凍融後的標本14000G離心20min，取上清液(上清液即為腫瘤抗原)，於_86°C環 境下凍存。用酶標儀檢測腫瘤全抗原的蛋白濃度後，將提取的腫瘤全抗原按lOOng/ml加入 培養好的DC細胞中，同時添加注射用鹽酸萬古黴素40ug/ml、注射用亞胺培南西司他丁鈉 17ug/ml，之後經過72小時共培養，即可實現腫瘤組織全抗原的滅菌。對滅菌處理後的抗原進行細菌、真菌檢測。微生物檢測在微生物檢測實驗室和無菌試驗室中進行，細菌試驗室內的設備和器 具有用於細菌培養的溫箱、C02培養箱、厭氧培養設備；用於觀察微生物形態及標本直接 鏡檢的顯微鏡；用於物品滅菌的高壓蒸氣滅菌器、幹烤箱；用於儲存培養基、診斷用血清、 抗生素及菌種等的冰箱和冷藏櫃；用於挑起標本、接種等的接種器具，包括接種環和接種 針；製備培養基時用的pint ；微生物檢驗操作時用於接種器具滅菌的火焰燈或酒精燈；還 有各種比用的平皿、試管、吸管等玻璃器皿，以及離心機、天平等。具體實驗步驟1.配置培養基。2.高溫滅菌，防止其他細菌侵入影響實驗。3.肉湯培養基增菌。4. 48 72小時後轉種血平板及TTC平板。5. 48小時觀察有無細菌生長並報告結果。檢測後發現，實施例1所得腫瘤組織全抗原標本達到無菌水平。檢測結果詳見表一、表_-o所獲得的特異性的DC細胞，回輸到患者體內後可以獲得有效地腫瘤免疫，提高患 者的生活質量和延長患者的生存期。實施例2重複實施例1，有以下不同點取直腸腫瘤的手術切片組織進行全抗原滅菌處理。 腫瘤標本用含慶大黴素100IU/ml的無菌生理鹽水衝洗3次。分切後的組織塊後在_86°C環 境下凍存12個月，凍融6次。凍融後的腫瘤組織13000G離心22min，取上清液_86°C環境 凍存。用酶標儀檢測腫瘤全抗原的蛋白濃度後，將提取的腫瘤全抗原按lOOng/ml加入培養 好的DC細胞中，，同時添加注射用鹽酸萬古黴素25ug/ml、注射用亞胺培南西司他丁鈉8ug/ ml，之後經過2小時共培養，即可實現腫瘤組織全抗原的滅菌。對滅菌處理後的抗原進行微 生物檢測，檢測結果為陰性。結果詳見表1，表2。實施例3重複實施例1，有以下不同點取胃腫瘤的手術組織進行全抗原滅菌處理。腫瘤標 本用含慶大黴素130IU/ml的無菌生理鹽水衝洗3次。分切後的組織塊後在-120°C環境下 凍存18個月。凍融5次。凍融後的腫瘤組織14000G離心18min，取上清液_86°C環境凍 存。用酶標儀檢測腫瘤全抗原的蛋白濃度後，將提取的腫瘤全抗原按lOOng/ml加入培養好 的DC細胞中，同時添加注射用鹽酸萬古黴素80ug/ml、注射用亞胺培南西司他丁鈉66ug/ ml，之後經過48小時共培養，即可實現腫瘤組織全抗原的滅菌。對滅菌處理後的抗原進行 微生物檢測，檢測結果為陰性。結果詳見表1，表2。表一萬古黴素濃度及作用時間關係
權利要求
一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法，包括以下步驟(1)製備腫瘤全抗原①將手術切出的腫瘤標本置於無菌缸中保存；②在無菌環境下，用含慶大黴素100～160IU/ml的無菌生理鹽水衝洗腫瘤標本2～3次；③將腫瘤標本分切成組織塊後置於凍存管中，在 86℃～ 156℃環境下凍存、備用；④取出腫瘤組織塊，在無菌環境下反覆衝洗、棄除血液，然後將組織塊剪碎；⑤將剪碎的腫瘤組織置於凍存管中，按體積比1∶5加生理鹽水，在液氮和37℃水浴鍋中反覆凍融5～6次；⑥凍融後的腫瘤組織13000g～14000g離心18～22min，取上清液即為腫瘤全抗原，於 86℃～ 156℃環境下凍存；(2)腫瘤全抗原滅菌處理①檢測腫瘤全抗原的蛋白含量；②根據步驟①所測的腫瘤全抗原的蛋白含量，將提取的腫瘤全抗原按100ng/ml加入培養好的DC細胞中，同時加入萬古黴素25～80ug/ml和亞胺培南西司他丁鈉8ug～66ug/ml，再經過2～72小時共培養，即完成腫瘤組織全抗原的滅菌。
2.根據權利要求1所述的有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法，其特徵在於所述的 組織塊規格為0. 5mm XO. 5mm、厚度< 0. 5cm。
3.根據權利要求1所述的有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法，其特徵在於所述的 抗生素添加濃度，其中萬古黴素為25 40ug/ml ；亞胺培南西司他丁鈉為8ug 17ug/ml。
全文摘要
本發明公開了一種有菌腫瘤組織全抗原的滅菌處理方法。腫瘤標本切碎後經反覆凍融、離心後得到腫瘤全抗原。用酶標儀檢測腫瘤全抗原的蛋白濃度後，將提取的腫瘤全抗原按100ng/ml加入培養好的DC細胞中，同時加入萬古黴素25～80μg/ml和亞胺培南西司他丁鈉8μg～66μg/ml，再經過2～72小時共培養，即實現腫瘤組織全抗原的滅菌。該方法既考慮了使用的安全性、有效性，使用的劑量小、成本低，同時儘可能的節約患者的有限的腫瘤標本，充分利用資源，提高患者的療效。其操作簡便、成本低廉，滅菌效果顯著，具有良好地應用前景。
文檔編號C12N5/0784GK101979507SQ20101028268
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月16日 優先權日2010年9月16日
發明者宋鑫, 楊金豔, 隋軍 申請人:宋鑫;隋軍