一種測定納米金表面上巰基修飾線性dna或核酸適配體構象的方法

2023-10-26 03:56:57 1

一種測定納米金表面上巰基修飾線性dna或核酸適配體構象的方法
【專利摘要】本發明涉及一種測定納米金表面上巰基修飾線性DNA或核酸適配體構象的方法，是利用動態光散射測定組裝過程中線性DNA或核酸適配體與納米金複合物的水合粒徑，結合吸附動力學，分別測定線性DNA或核酸適配體在不同表面包被量時在納米金表面上的構象。利用本發明的方法發現在中等表面探針容量時，線性DNA在納米金表面上的構象為連接巰基的一端纏繞在納米金表面，另一端與表面垂直向外伸展，隨著表面探針容量的增加，每條DNA探針纏繞在納米金表面上的長度不斷減小，而同時向外延伸的尾部越來越長，但納米金表面保持被DNA鹼基吸附包裹的低表面自由能狀態上述構象可以描述為DILOT模型，對於核酸傳感器探針設計和基於DNA雜交的納米組裝等應用具有重要的指導意義。
【專利說明】—種測定納米金表面上巰基修飾線性DNA或核酸適配體構象的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種測定納米金表面上巰基修飾線性DNA或核酸適配體構象的方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]由巰基線性DNA或核酸適配體修飾的納米金複合物(DNA/AuNP)，從自組裝材料製備、生物傳感技術，到藥物傳輸等領域，都擁有十分重要的應用。但是最近的研究表明DNA鹼基會與納米金表面發生非特異性相互作用，部分吸附在納米金的表面，使得線性DNA雜交效率下降，使得核酸適配體與其靶標的識別能力下降。因此深入了解線性DNA或核酸適配體探針在納米金表面的構象，對於優化探針設計具有十分重要的價值。現階段對線性DNA在平面金表面上的構象研究較多，有多種表徵技術，例如X射線光譜，表面等離子體共振等都被用於線性DNA在平面金表面上的構象研究。但是對於線性DNA或核酸適配體探針在納米金表面上構象的研究卻很少。目前僅有瓊脂糖凝膠電泳技術被用於線性DNA在納米金表面上構象的系統研究(Parak,W.J.；Pellegrino,T.；Micheel,C.M.；Gerion,D.；ffilliams,
S.C.；Alivisatos, A.P.NanoLett.2003，3，(I)，33-36.)。該方法通過測定 DNA/AuNP 在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率計算其有效粒徑，然後通過其有效粒徑測定線性DNA的構象。瓊脂糖凝膠電泳技術雖然可以用於研究線性DNA的構象變化，但是這種方法卻存在許多缺陷:1.瓊脂糖凝膠電泳技術需要的樣品量較大，樣品不能重複使用，費時費力，不適合動力學研究；2.短鏈DNA(小於40個核苷酸)修飾的納米金在實際應用中很常見，但是瓊脂糖凝膠電泳無法獲得單條短鏈DNA的解析度；3.凝膠方法計算所得的DNA/AuNP粒徑實驗誤差較大，受凝膠比例影響，需要多次測量，費時費力；4.納米金在瓊脂糖凝膠電泳之前需要修飾提高納米金穩定性的小分子，防止電泳時發生聚集，但在實際應用中這些小分子的存在卻會干擾DNA在納米金表面的實際構象情況，從而無法得到正確的構象信息；5.具有二級構象的適配體DNA會摺疊成為緊密的二級結構，影響電泳的遷移率，從而影響對構象的研究。因此非常需要尋找一種可以高效、精確和靈敏的表徵方法來探測線性DNA或核酸適配體探針在納米金表面上的構象。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種測定納米金表面上巰基修飾線性DNA或核酸適配體構象的方法，該方法包括如下步驟:步驟一:利用動態光散射(DLS)測定線性DNA或核酸適配體的納米金複合物在其組裝過程中的水合粒徑，步驟二:結合吸附動力學模型擬合，並通過對線性DNA或核酸適配體納米金複合物水合粒徑的直接比較，測定在不同表面容量時線性DNA或核酸適配體在納米金表面上的構象。
[0004]本發明的具體實驗步驟:
[0005](I)利用動態光散射測定組裝過程中不同長度巰基修飾線性DNA或核酸適配體納米金複合物的水合粒徑的動態變化過程；
[0006]具有巰基修飾的線性DNA或核酸適配體與二硫蘇糖醇(DTT)在2% (V/V)的三乙胺(TEA)溶液下還原後利用NAP-5柱進行兩次純化。純化後的線性DNA或核酸適配體與納米金(AuNP)按照一定物質的量比例混合於磷酸鹽緩衝液(IOmM PB，pH7.4)中，室溫(25°C)下孵育並利用動態光散射測定DNA/AuNP粒徑變化過程。包被過程包括三個階段:老化，加鹽，溫育。老化過程即包被後的17個小時內，使線性DNA或核酸適配體通過自組裝過程包被於納米金表面，該過程不另外添加鹽，選取多個時間點測定粒徑值；加鹽過程即老化過程完成後，逐漸向納米金與線性DNA或核酸適配體混合溶液中滴加濃度為IM氯化鈉(NaCl)的磷酸鹽緩衝溶液使得鹽濃度緩慢增至0.3M，選取多個鹽濃度點測定DNA/AuNP的粒徑；溫育過程即加鹽過程完成之後等待一段時間使線性DNA或核酸適配體更加完全地包被於納米金表面，選取數個時間點測定粒徑。
[0007](2)螢光測定老化過程中DNA在納米金表面DNA鏈數；
[0008]利用螢光標記和巰基修飾的線性DNA或核酸適配體在(I)相同的條件下還原並與納米金包被。在老化過程中(0-17h)選取數個時間點對樣品進行離心純化，將包被上DNA鏈的納米金沉澱復溶於二硫蘇糖醇(DTT)磷酸鹽緩衝溶液並過夜並離心取上清，根據標準曲線測定其上清液探針濃度並計算每個納米金上DNA的包被量。相對應公式為:
[0009]
【權利要求】
1.一種測定納米金表面上巰基修飾線性DNA或核酸適配體構象的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟:步驟一:利用動態光散射(DLS)測定線性DNA或核酸適配體的納米金複合物在其組裝過程中的水合粒徑，步驟二:結合吸附動力學模型擬合，並通過對線性DNA或核酸適配體納米金複合物水合粒徑的直接比較，測定在不同表面容量時線性DNA或核酸適配體在納米金表面上的構象。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟一是利用動態光散射測定組裝過程中不同長度巰基修飾線性DNA或核酸適配體納米金複合物的水合粒徑的動態變化過程。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟一如下:具有巰基修飾的線性DNA或核酸適配體與二硫蘇糖醇(DTT)在2% (V/V)的三乙胺(TEA)溶液下還原後利用NAP-5柱進行兩次純化；純化後的線性DNA或核酸適配體與納米金(AuNP)按照一定物質的量比例混合於磷酸鹽緩衝液(IOmM PB, pH7.4)中，室溫(25°C )下孵育並利用動態光散射測定DNA/AuNP粒徑變化過程；包被過程包括三個階段:老化，加鹽，溫育；老化過程即包被後的17個小時內，使線性DNA或核酸適配體通過自組裝過程包被於納米金表面，該過程不另外添加鹽，選取多個時間點測定粒徑值；加鹽過程即老化過程完成後，逐漸向納米金與線性DNA或核酸適配體混合溶液中滴加濃度為IM氯化鈉(NaCl)的磷酸鹽緩衝溶液使得鹽濃度緩慢增至0.3M，選取多個鹽濃度點測定DNA/AuNP的粒徑；溫育過程即加鹽過程完成之後等待一段時間使線性DNA或核酸適配體更加完全地包被於納米金表面，選取數個時間點測定粒徑。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟二還包括如下步驟:螢光測定老化過程中DNA在納米金表面DNA鏈數和老化過程DNA在納米金表面吸附動力學擬合。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟I還包括利用動態光散射測定非巰基修飾DNA鏈包被納米金的過程。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，螢光測定老化過程中DNA在納米金表面DNA鏈數是如下步驟: 利用螢光標記和巰基修飾的線性DNA或核酸適配體在(I)相同的條件下還原並與納米金包被；在老化過程中(0-17h)選取數個時間點對樣品進行離心純化，將包被上DNA鏈的納米金沉澱復溶於二硫蘇糖醇(DTT)磷酸鹽緩衝溶液並過夜並離心取上清，根據標準曲線測定其上清液探針濃度並計算每個納米金上DNA的包被量，相對應公式為:
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，建立線性DNA在納米金表面上的構象DILOT(Dynamic Inner-Layer and Outer-Tail)模型,測定在不同表面容量時線性DNA在納米金表面上的構象。
8.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟一還包括如下步驟:利用動態光散射測定鹽濃度對線性DNA或核酸適配體在納米金表面構象的影響。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，還包括如下步驟:紫外定量加鹽和溫育過程線性DNA或核酸適配體在納米金表面上的數量: 完成包被過程的DNA/AuNP經過離心，取上清，利用紫外測定其濃度，根據包被時投入的DNA、納米金和離心後上清的濃度和體積計算包被量，相對應公式為: 投入投入 ~
K如Λ滬 投入則S入


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10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，還包括如下步驟:測定在加鹽和溫育過程不同表面容量時線性DNA或核酸適配體在納米金表面上的構象。
【文檔編號】G01N15/02GK103926176SQ201410171224
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】婁新徽, 王文杰, 丁小凡 申請人:首都師範大學