一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-10-05 01:42:54

一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢桿菌及其應用，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)DC-Tx,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCCNO.9462，保藏日期：2014年7月15日。本發明篩選出高產納豆激酶的枯草芽孢桿菌DC-Tx，能夠生產具有高纖溶活性和顯著抗氧化功能的發酵鷹嘴豆。結果表明，本發明菌株生產的發酵鷹嘴豆，其纖溶活性可達30(X)FU/g，?0H清除率可達88.5%,Fe3+還原能力是鮮鷹嘴豆的3.33倍。同時本發明的方法具有操作簡單，成本低，周期短，來源豐富易取，成本低，無環境汙染，所用設備、試劑價格便宜，易於實現等優點。
【專利說明】一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢杆 菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢桿菌，同時還 涉及該枯草芽孢桿菌的應用，屬於微生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 近年來，由於飲食不平衡、環境惡化、遺傳特質等原因，血管栓塞類疾病大幅增加， 嚴重威脅著人類的健康與生命安全，每年死於腦梗塞、心肌梗死的病人多達幾百萬，居各種 疾病之首。溶解血栓是治療這類疾病的首選方法，因此，具有高纖溶活性溶栓藥物的研發日 益受到人們的關注，有著廣闊的發展前景。目前溶栓藥物研究的焦點之一，是通過細菌發酵 生產口服有效的溶栓功能性食品和保健食品--納豆激酶，但該方法所得的納豆激酶纖溶 活性多不盡如人意。
[0003] 另一方面，活性氧和自由基是人體新陳代謝過程的次生代謝產物，正常情況下總 是處於不斷產生和消除的動態平衡中，但如果其含量過高，動態平衡被破壞，就會引起氧化 應激反應，從而引發癌症、冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經系統失靈、免疫力降低、關節 炎等100多種常見疾病。其中動脈粥樣硬化又可引起心腦血管疾病，產生血栓，因此，活性 氧和自由基也是心腦血管疾病的病因之一。目前有研究表明，通過食用抗氧化性功能食品 補充抗氧化物質，是預防包括心腦血管疾病在內的多種疾病的有效措施之一。
[0004] 綜上所述，活性氧和自由基可引起包括心腦血管疾病在內的多種疾病，而具有抗 氧化功能的食品和保健食品可以清除活性氧和自由基，因此也具有預防心腦血管疾病的作 用；而高纖溶活性的保健食品可溶解已經形成的血栓，從而治療心腦血管疾病，如能研發一 種具有纖溶活性和抗氧化功能的食品，則既具有預防心血管疾病發生的功能，又能在血栓 產生後具有治療效果，從而達到預防和治療相結合的目的，但目前還沒有相關研究的報導。
[0005] 鷹嘴豆（chickpea)學名Cicer arietinum L.，富含人類所需的多種糖類、植物蛋 白和胺基酸、纖維素、維生素及無機鹽，具有預防高血壓及動脈硬化、降低膽固醇和血脂血 糖，利尿、治療失眠等作用。有研究表明，鷹嘴豆蛋白的酶解產物（鷹嘴豆短肽），具有顯著 的抗氧化功能，也有報導指出，用納豆芽孢桿菌發酵鷹嘴豆，可以得到高纖溶活性的納豆激 酶，但目前還未見具有纖溶活性和抗氧化功能的發酵鷹嘴豆的報導。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢杆 菌及其應用，採用本發明的枯草芽孢桿菌生產發酵鷹嘴豆，可以得到具有高纖溶活性和顯 著抗氧化作用的鷹嘴豆發酵產物，且該方法具有操作簡單，成本低，周期短和易於實現的優 點，為納豆激酶的產業化提供了技術支持，並為其作為功能性食品和保健食品的開發應用 研究提供了新的思路。
[0007] 為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是提供一種生產具有纖溶和抗 氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis)DC-Tx，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址： 北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCC NO. 9462,保藏日期：2014年7月15日。
[0008] 本發明從豆豉中篩選出高產納豆激酶的枯草芽孢桿菌DC-Tx，採用本發明的菌株， 能夠生產具有高纖溶活性和顯著抗氧化功能的發酵鷹嘴豆。實驗結果表明，本發明菌株生 產的發酵鷹嘴豆，其纖溶活性可達3000FU/g，羥基自由基（· 0H)清除率可達88. 5%，Fe3+ 還原能力是鮮鷹嘴豆的3. 33倍。
[0009] 本發明所採用的技術方案還在於提供一種枯草芽孢桿菌在生產具有纖溶和抗氧 化功能發酵鷹嘴豆方面的應用。
[0010] 本發明枯草芽孢桿菌生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的方法，包括以下步 驟：
[0011] (1)挑取枯草芽孢桿菌接種於LB液體種子培養基，在28-40°C條件下，120-180rpm 搖床恆溫培養12-18h，得到枯草芽孢桿菌種子液；
[0012] (2)將鷹嘴豆浸泡過夜，浙幹水分，高壓滅菌，冷卻至室溫後，按照1-8%的接種量 接種枯草芽孢桿菌種子液，在28-40°C條件下發酵培養36-72h ;
[0013] (3)將步驟（2)的鷹嘴豆發酵培養產物低溫真空冷凍乾燥，粉碎，過80-120目篩即 得。
[0014] 所述LB液體種子培養基包括以下質量分數的原料：蛋白腖1%，酵母粉0.5%， NaCl l%;pH6.8，121°C 高壓滅菌 20min。
[0015] 所述低溫真空冷凍乾燥的條件為：預冷溫度-50°C，真空度20-100Pa，凍幹溫度 45°C，凍幹時間24-48h。本發明中冷凍乾燥選擇低溫真空冷凍乾燥，而不採用噴霧幹 燥，目的是為了更好地保持所得發酵產物的纖溶和抗氧化功能。
[0016] 本發明利用枯草芽孢桿菌DC-Tx發酵生產具有高纖溶活性和顯著抗氧化功能的 發酵鷹嘴豆，該方法具有操作簡單，成本低，周期短和易於實現的優點。同時，本發明採用鷹 嘴豆為原料，來源豐富易取，成本低，無環境汙染，所用設備、試劑價格便宜，便於規模化生 產。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 以下結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0018] 圖1為本發明發酵鷹嘴豆纖溶活性測定結果；
[0019] 圖2為本發明發酵鷹嘴豆· OH清除率測定結果；其中，
[0020] a為GSH，b為發酵36h鷹嘴豆，c為發酵48h鷹嘴豆，d為發酵72h鷹嘴豆，e為鮮 鷹嘴豆；
[0021] 圖3為本發明發酵鷹嘴豆Fe3+還原能力測定結果；其中，
[0022] a為GSH，b為發酵36h鷹嘴豆，c為發酵48h鷹嘴豆，d為發酵72h鷹嘴豆，e為鮮 鷹嘴豆。

【具體實施方式】
[0023] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0024] 實施例I
[0025] I、納豆激酶高產菌株的篩選
[0026] I. 1納豆激酶高產菌株的初篩取市售豆豉，分離樣品10g，加入IOOmL無菌水中， 充分振蕩，KKTC沸水煮沸5min，靜置片刻，取上層混濁液，梯度稀釋後，分別取100 μ L不同 稀釋度的溶液，均勻塗布於LB平板上，37°C過夜培養，挑單菌落進行劃線培養，連續兩次。 挑取LB分離平板上的單菌落點種到纖維蛋白平板上，37°C培養18h，測量溶解圈直徑，溶解 圈較大的菌株液體發酵進行復篩。
[0027] 1. 2納豆激酶高產菌株的復篩將初篩透明圈直徑較大的菌株，用LB種子培養基 活化（37°C、150r/min、過夜），按照5%的接種量分別接入液體發酵培養基（以質量分數計： 6 %大豆粉，2 %葡萄糖，0· 06 % CaCl2，0· 07 % MgSO4, ρΗ6· 5)中，37°C發酵72h，其發酵產物用 PH7. 4的磷酸緩衝液稀釋，取稀釋液10 μ L，加樣於纖維蛋白平板上37°C恆溫培養18h，測定 透明圈直徑，選取溶解圈最大的菌株，命名為DC-Tx。
[0028] 菌株DC-Tx的特徵如下：
[0029] 形態特徵：
[0030] LB平板上37°C培養24h，菌株DC-Tx菌落呈圓形，邊緣微有葉狀齒，白色不透明； 菌體形態呈小短杆狀，長3. 0-4. 0 μ m，寬0· 8-1. 0 μ m，革蘭氏陽性，芽孢中生，橢圓形。
[0031] 生理生化特徵見表1。
[0032] 表1菌株DC-Tx的生理生化特徵
[0033]

【權利要求】
1. 一種生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的枯草芽孢桿菌，其特徵在於，所述枯 草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)DC-Tx，保藏單位：中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCC NO. 9462,保藏日期：2014年7月15日。
2. -種如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆 方面的應用。
3. -種如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的 方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 挑取枯草芽孢桿菌接種於LB液體種子培養基，在28-40°C條件下，120-180rpm搖床 恆溫培養12-18h，得到枯草芽孢桿菌種子液； (2) 將鷹嘴豆浸泡過夜，浙幹水分，高壓滅菌，冷卻至室溫後，按照1-8%的接種量接種 枯草芽孢桿菌種子液，在28-40°C條件下發酵培養36-72h ; (3) 將步驟（2)的鷹嘴豆發酵培養產物低溫真空冷凍乾燥，粉碎，過80-120目篩即得。
4. 根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的方 法，其特徵在於，所述LB液體種子培養基包括以下質量分數的原料：蛋白腖1%，酵母粉 0· 5%，NaCl 1% ;ρΗ6· 8,121°C高壓滅菌 20min。
5. 根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌生產具有纖溶和抗氧化功能發酵鷹嘴豆的方 法，其特徵在於，所述低溫真空冷凍乾燥的條件為：預冷溫度-50°C，真空度20-100Pa，凍 幹溫度彡-45°C，凍幹時間24-48h。
【文檔編號】A23L1/29GK104212741SQ201410401745
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】周伏忠, 陳曉飛, 馮菲, 胡宜亮, 陳國參, 孫玉飛, 王雪研 申請人:河南省科學院生物研究所有限責任公司