一種抗阿片肽的拮抗肽與該拮抗肽的應用的製作方法

2023-10-05 00:41:09

專利名稱：：一種抗阿片肽的拮抗肽與該拮抗肽的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及肽段及其編碼基因與應用，特別是涉及一種具有拮抗嗎啡抗傷害作用的抗阿片肽及其拮抗肽，與該拮抗肽在製備具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的藥物中的應用。
背景技術：
：眾所周知，在世界範圍內猖獗的販毒吸毒活動已成為危害社會的一個毒瘤，嚴重幹擾了有序的經濟建設和社會安定，此外，靜脈吸毒還造成了愛滋病人群感染率的攀升。目前，各國政府雖都加大聯合打擊毒品走私的力度，但吸毒、販毒活動仍屢禁不止，其中一個重要的原因就是嗎啡耐受及依賴的原理尚未真正或完全被闡明，國際上尚無有效的戒毒手段。國外最先採用的」替代療法」是在戒毒過程中用美沙酮一類的藥代替阿片，這種療法將導致病人對美沙酮類藥物的耐受和依賴。在國內，寧波戒毒所楊國棟先生採用東莨菪礆配合其它藥物戒毒，也未完全解決心癮問題。韓濟生教授採用針灸治療儀治療戒斷症狀，試圖通過特定頻率的電脈衝刺激提高體內內源性阿片的合成來減輕症狀，但它的最大缺陷是人群中針刺鎮痛的有效率有限而且持續地針刺也存在耐受問題。近來，石家莊中醫藥專家王巖對阿片戒斷症狀進行辯症施治，採用「金甲丸」治療戒斷綜合症，正在經臨床進一步檢驗和完善。因此，迫切需要一種可從源頭上徹底消除嗎啡耐受及依賴，以及減弱或消除戒斷症狀的戒毒藥物。已知PEBP家族的蛋白，在自然界裡廣泛存在於酵母、線蟲、果蠅及各種植物及哺乳動物的不同器官，它們極具保守性，與其它已知結構或功能的蛋白的序列無同源性。PEBP蛋白的生物功能十分多樣，在植物它對開花信號及分生組織生長的信號起調節作用。在哺乳類動物，PEBP蛋白可通過Raf-I抑制MEK的磷酸化使之不被激活，故又有Raf激酶抑制蛋白(RKIP)之稱，它調節Raf/MEK/ERK—組信號，與細胞的有絲分裂和分化有關，涉及腫瘤細胞的轉移。在中樞神經系統，PEBP蛋白不僅作為海馬刺激膽鹼能神經肽(HCNP)的前身蛋白，而且也作為ATP，阿片和磷脂醯乙醇氨的結合蛋白。OjikaK.等人(OjikaK.,MitakeS.,TohdohN.,AppelS.H.,OtsukaY.,KatadaE.AndMatsukawaN.(2000)Hippocampalcholinergicneurostimulatingpeptides(HCNP).Prog.Neurobiol.60,37-83.IwaseΤ,OjikaK,MatsukewaN,etal.Muscariniccholinergicandglutamatergicreciprocalregulationofexpressionofhippocampalcholinergicneurostimulatingpeptideprecursorproteingeneinrathippocampus.Neuroscience,2001,102(2):341_352)指出在離體內側隔核，海馬膽礆能刺激神經肽(HCNP)提高膽礆乙醯化酶(ChAT)的產物而不是膽礆脂酶(AchE)的產物。HCNP在11天大鼠腦免疫反應陽性較強的部位，主要有大腦皮層、海馬齒狀回、杏仁核、脊髓三叉神經核和脊髓后角等，而在成年大鼠腦HCNP前身物信使RNA相對標記強的，主要分布在大腦皮層、海馬、杏仁核、隔核、內側韁核、黑質、小腦的蒲肯野氏細胞和顆粒層細胞等部位。
發明內容本發明的目的是提供一種具有拮抗嗎啡抗傷害作用的抗阿片肽。本發明所提供的抗阿片肽，命名為21Kd，是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO1；2)將序列表中SEQIDNO=I的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加，具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個胺基酸殘基可以是非結構域中的胺基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響，例如，增加的組氨酸標籤等。序列表中的SEQIDNO:1由186個胺基酸殘基組成。編碼本發明抗阿片肽21Kd的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQIDNO1的DNA序列；3)與序列表中SEQIDNO2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為用0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下雜交並洗膜。序列表中的SEQIDNO2由558個鹼基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO1的胺基酸殘基序列的蛋白質。試驗表明，上述抗阿片肽21Kd具有一系列的活性片段，它們可為下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO3；2)序列表中的SEQIDNO4；3)序列表中的SEQIDNO5；4)將序列表中SEQIDNO:3_5的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個胺基酸殘基可以是非結構域中的胺基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。序列表中的SEQIDNO3由13個胺基酸殘基組成，將其命名為21Kd_13；序列表中的SEQIDNO4由14個胺基酸殘基組成，將其命名為21Kd_14；序列表中的SEQIDNO5由21個胺基酸殘基組成，將其命名為21Kd-21。編碼上述抗阿片肽活性片段的基因、與該基因具有90%以上同源性的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與其限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，也受本發明的保護。所述高嚴謹條件為用0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下雜交並洗膜。序列表中的SEQIDNO6由39個鹼基組成，編碼SEQIDNO3所示的抗阿片肽21Kd活性片段；序列表中的SEQIDNO:7由42個鹼基組成，編碼SEQIDNO:4所示的抗阿片肽21Kd活性片段；序列表中的SEQIDNO:8由63個鹼基組成，編碼SEQIDNO:5所示的抗阿片肽21Kd活性片段。本發明抗阿片肽21Kd的拮抗肽，是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO9；2)序列表中的SEQIDNO10；3)序列表中的SEQIDNO11；4)將序列表中SEQIDNO:9_11的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個胺基酸殘基可以是非結構域中的胺基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。序列表中的SEQIDNO9由13個胺基酸殘基組成，將其命名為CP-21Kd_13；序列表中的SEQIDNO10由14個胺基酸殘基組成，將其命名為CP-21Kd_14；序列表中的SEQIDNO11由21個胺基酸殘基組成，將其命名為CP-21Kd-21。編碼上述抗阿片肽21Kd拮抗肽的基因、與該基因具有90%以上同源性的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與其限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，也受本發明的保護。所述高嚴謹條件為用0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下雜交並洗膜。序列表中的SEQIDNO12由39個鹼基組成，編碼SEQIDNO9所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽；序列表中的SEQIDNO13由42個鹼基組成，編碼SEQIDN0:10所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽；序列表中的SEQIDNO:14由63個鹼基組成，編碼SEQIDN0:11所示的抗阿片肽2IKd的拮抗肽。含有上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌以及擴增該基因中任一片段的引物也屬於本發明的保護範圍。上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽可採用常規的人工合成方法直接獲得，如可用fmoc保護的固相合成法等方法人工合成，或可委託專業的生物公司合成(如美聯(西安)生物科技有限公司或上海閃晶生物多肽合成有限公司等)，此外，也可利用微生物發酵表達的方法獲得。本發明所提供的表達上述拮抗肽的方法，是將含有上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到抗阿片肽21Kd的拮抗肽。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α或E.coliToplO等。用於構建所述含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表達載體的出發載體可為任意一種可在大腸桿菌中表達外源基因的原核表達載體，如pET-22b、pET-11c、pET_30a、pET-28a、pET-28b或pET_28c等。其中，以pET_22b為出發載體，構建的含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表達載體為pET-CP-2lKd-8+5、pET-CP-2lKd-13、pET-CP-2lKd-14或pET-CP-2lKd_21。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。將上述重組表達載體轉化宿主菌的方法可為生物工程領域中常用的轉化方法，如熱激法、電轉化法、接合轉化法或PEG介導的原生質體轉化法等。培養含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的宿主細胞的培養基和培養條件，均可為培養出發宿主的培養基和培養條件。其中，培養所述重組大腸桿菌宿主時需加入誘導劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度可為0.1-1.Ommol/L,優選為0.2mmol/L,誘導溫度可為16-37°C，優選為30°C，誘導時間可為2-4小時，優選為3小時。所述抗阿片肽21Kd的拮抗肽在製備增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的藥物中的應用也是本發明要保護的。當然，以所述抗阿片肽21Kd的拮抗肽為活性成分的藥物，更是本發明需要保護的內容，該藥物具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀的作用。以抗阿片肽21Kd的拮抗肽為活性成分的藥物中，其活性成分可選自以下胺基酸殘基序列中的一個或幾個1)序列表中的SEQIDNO9；2)序列表中的SEQIDNO10；3)序列表中的SEQIDNO11；4)將序列表中SEQIDNO:9_11的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的多肽。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑和穩定劑等。本發明的藥物可以製成注射液、乾粉針劑、片劑或粒劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。上述藥物的成人用量一般為0.01-0.5mg/kg體重/次，可以一次或多次使用，療程一般為10至20天。本發明提供了一種從豬腦中分離純化出的抗阿片肽21Kd及其活性片段，它具有拮抗嗎啡抗傷害作用。吸毒過程伴隨著毒品劑量的增加可促使該蛋白的合成增加，導致嗎啡耐受及依賴的形成。本發明利用蛋白質分子之間存在相互作用的原理，根據其三個活性片段的序列，設計出了的該抗阿片肽21Kd的拮抗肽。實驗證明，人工合成的拮抗肽可作為內源性抗阿片肽的抑制劑，通過靜脈注射三個活性片段的拮抗肽，可以提高嗎啡抗傷害作用的效應，減少嗎啡用量，此外，這些拮抗肽的分子量小於2000道爾頓，較容易通過血腦屏障，在中樞神經系統的相關部位起到抵消內源性抗阿片肽效應的作用，因而可以將其作為活性成分製備成增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的藥物。該藥物具有以下優點1)療效顯著活性成分拮抗肽是通過消除吸毒者體內多餘的內源性抗阿片肽及其效應來達到增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和消除或減弱吸毒者戒斷症狀的目的，可從源頭上消除戒斷症狀；2)獲得的拮抗肽都是一些胺基酸殘基數量不超過25個的短肽，容易合成，便於開發研究；3)這些短肽進入體內容易被降解，不具備產生抗體的副作用，安全性高；4)用藥方便，可通過靜脈注射方式或舌下含片等多種方式給藥，以消除或減弱嗎啡戒斷的症狀；5)該短肽穩定、製備方法簡便易行，可應用於大規模工業化生產，且生產成本低廉，可減輕病人的經濟負擔。本發明的抗阿片肽21Kd及其活性片段與其拮抗肽將在醫學及戒毒藥物的製備領域發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為狗腦提取物對電脈衝引起小鼠輸精管收縮影響的檢測結果圖2為側腦室內注入狗腦粗提物對大鼠針刺鎮痛效應影響的檢測結果圖3A和圖3B為抗阿片肽21Kd對嗎啡抗傷害作用的拮抗效應的檢測結果圖4A-圖4C為抗阿片肽21Kd的活性肽段21Kd_21，21Kd_14和21Kd_13對嗎啡抗傷害作用影響的檢測結果圖5為ScFv對嗎啡抗傷害作用影響的檢測結果圖6為在嗎啡耐受小鼠側腦室內注入不同劑量的ScFv對挑戰劑量嗎啡(50mg/kgi.p.)抗傷害作用的影響的檢測結果圖7為NMDA受體和NOS在抗阿片肽21Kd及其活性片段拮抗嗎啡抗傷害作用中的影響的檢測結果圖8A-圖8C為CP-21Kd-21，CP-21Kd-14和CP-21Kd_13對嗎啡抗傷害作用影響的檢測結果具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual)(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。下述實施例中所用實驗小鼠均為將8-10周齡、體重20_22g的昆明雄性小鼠(購自中國科學院動物研究所)實施例1、抗阿片肽21Kd及其活性片段的獲得與功能驗證一、豬腦抗阿片肽21Kd的獲得1、抗阿片肽的發現在離體的小鼠輸精管標本，給以方波脈衝(0.IMS波寬，1次/秒)刺激可引起收縮(具體方法參見文獻J.Hughesetal(1975)EffectofmorphineonadrenergictransmissionintheMouseVasdeferens.AssessmentofagonistandantagonistpotenciesofNarcoticanalgesics53,371-381),然後，先後在灌流液中力卩入鹽酸嗎啡(3.2nM)或狗腦提取物(A0S，200l·!g/mL)(為狗腦提取濃縮液先後經S印hadexG-50凝膠(購自pharmacia公司)過濾，羧甲基-纖維素(CM-C，購自H.Reeve-Angel&.Co.Ltd公司)陽離子交換層析後，得到樣品)，觀察對電刺激小鼠輸精管引起收縮效應的影響。如圖1所示(M代表給嗎啡，MAP代表給狗腦提取物)，實驗發現在狗腦粗提物中，存在著可增強電刺激小鼠輸精管收縮的成分，且該樣品的增強收縮效應與嗎啡抑制電刺激小鼠輸精管收縮的效應恰恰相反，因此，將該狗腦粗提物注入小鼠側腦室內後，可觀察到嗎啡的抗傷害作用被顯著地抑制。此外，將上述狗腦粗提物注入針刺鎮痛有效大鼠(6隻)的側腦室(400μg/20y1/只)，以生理鹽水(Saline)為對照(6隻)，10分鐘後開始電針誘導刺激，每間隔十分鐘，觀察大鼠對傷害刺激的嘶叫反應。結果如圖2所示(I.C.V.代表通過預先埋藏於側腦室內的導管微量注射樣品，EA代表電針誘導針刺鎮痛；橫坐標為狗腦粗提物注射後時間，縱坐標為嘶叫閾的變化)，以生理鹽水(Saline)為對照，經針刺誘導後，大鼠出現針刺鎮痛效應；狗腦粗提物注射後，再進行針刺誘導，大鼠的針刺鎮痛效應則消失，上述實驗結果提示腦內存在的抗阿片物質可能是針麻鎮痛不全的內在因素。2、豬腦抗阿片肽21Kd的獲得從豬腦中分離純化抗阿片肽_21Kd的方法，同樣是參考楊樹長等人的方法並稍做改進(楊樹長等人(1997)，豬腦抗嗎啡鎮痛肽的分離純化及其抗血清對嗎啡耐受影響的初步研究，中國生物化學雜誌13卷3期322-326)，具體方法為將豬腦提取物的濃縮液先後經S印hadex_G50凝膠過濾，S-sepharoseFastFlow離子交換層析(S_s印haroseFastFlow層析柱購自Pharmacia公司)分離後，取第4個洗脫峰的樣品，經FPLCmonos陽離子(FPLCmonos層析柱購自Pharmacia公司)交換後，用微量反相HPLC純化，得到經純化的抗阿片肽物質。由於該蛋白N-末端的20個胺基酸殘基及部分水解片斷的胺基酸殘基序列，與牛腦存在高度的同源性。在已測定的106個胺基酸殘基中，僅N-末端第5、95、103位殘基存在差異。其分子量為20932道爾頓，與牛腦的21Kd蛋白(又稱磷脂醯乙醇氨結合蛋白PhosphatidylethanolamineBindingProtein,PEBP)的分子量20，847道爾頓相當，故將該蛋白稱為21Kd(又稱PEBP或RKIP)。因此，上述豬腦21Kd蛋白可能屬於PEBP蛋白家族。對獲得的抗阿片肽進行全序列測定，測序結果表明該抗阿片肽具有序列表中SEQIDNO1的胺基酸殘基序列，由186個胺基酸殘基組成，其編碼基因具有序列表中SEQIDN0:2的核苷酸序列，由558個鹼基組成。二、豬腦抗阿片肽21Kd拮抗嗎啡抗傷害作用檢測1、側腦室注射途徑檢測豬腦抗阿片肽21Kd拮抗嗎啡抗傷害作用將純化的21Kd蛋白在腹腔注入嗎啡(20mg/kg)10分鐘後，作小鼠側腦室內注射，注射劑量分別為0.24nM、0.48nM和0.96nM,以相同體積的生理鹽水(Saline)為對照，然後檢測嗎啡的抗傷害作用。結果如圖3A所示(橫坐標表示嗎啡注射後時間，縱坐標表示嘶叫閾的變化(％)，n為每組小鼠數量，i.p.表示腹腔注射，i.e.v.表示側腦室內注射)。21Kd蛋白對小鼠的基礎痛反應無效應，但對嗎啡(20mg/kgi.p.)的抗傷害作用具有顯著的拮抗效應，而且受不同濃度21Kd蛋白(0.24nM，0.48nM和0.96nM)的影響，21Kd蛋白不同注射濃度下嗎啡抗傷害曲線下的面積分別為98.5士9.5、67.7士8.0和55.6士6.6(cm2)，而對照組的面積為134.3士6.7(cm2)，方差分析結果表明實驗組與對照組之間存在顯著的統計學差異(P<0.05，P<0.001和P<0.001，df=28)。2、尾靜脈注射途徑檢測豬腦抗阿片肽21Kd拮抗嗎啡抗傷害作用在小鼠腹腔注射20mg/kg嗎啡(M2tl)10分鐘後，在小鼠側腦室內由尾靜脈注入純化的21Kd蛋白，注射劑量分別為lmg/kg、2mg/kg和4mg/kg，以相同體積的生理鹽水(Saline)為對照，然後檢測嗎啡的抗傷害作用。結果如圖3B所示(橫坐標表示嗎啡注射後時間，縱坐標表示嘶叫閾的變化(％)，η為每組小鼠數量，i.p.表示腹腔注射，i.v.表示尾靜脈內注射)，尾靜脈內注射不同濃度的21Kd蛋白對嗎啡(20mg/kgi.p.)的抗傷害作用也具有顯著的拮抗效應，而且與21Kd蛋白的濃度有關。21Kd蛋白不同注射濃度下嗎啡抗傷害曲線下的面積分別為111.2士8.5,61.7士5.4禾Π36.5士6.1(cm2)，與對照組128.0士5.0(cm2)相比，存在顯著的統計學差異(P<0.1、P<0.OOl和P<0.001)。上述試驗結果證明，本發明的抗阿片肽21Kd具有顯著的拮抗嗎啡抗傷害作用。三、抗阿片肽21Kd活性片段的獲得及其活性檢測1、抗阿片肽21Kd活性片段的獲得推測由步驟二證實尾靜脈注射途徑給於抗阿片肽21Kd對嗎啡抗傷害作用的拮抗效應是因21Kd蛋白在血液中被降解為較小的片斷，通過血腦屏障在中樞起作用的結果。為驗證上述推測，參考文獻(Zh.W.Chenetal(1988)Isolationandcharacterizationofporcinediazepam-bindinginhibitor,apolypeptidenotonlyofcerebraloccurrencebutalsocommoninintestinaltissuesandwitheffectsonregulationofinsulinreleaseEur.J.Biochem174，239-245)，將21Kd蛋白用胰酶降解後，經微量HPLC分離得到21個峰樣品，用與步驟二相同的方法檢測其中幾個主要成分樣品的拮抗嗎啡抗傷害作用，結果獲得三個具有拮抗嗎啡抗傷害作用的成分，測定其胺基酸殘基序列，將具有序列表中SEQIDNO:3的胺基酸殘基序列的肽段命名為21Kd-13，由13個胺基酸殘基組成，其編碼基因具有序列表中SEQIDNO6的核苷酸序列，由39個鹼基組成；將具有序列表中SEQIDNO4的胺基酸殘基序列的肽段命名為21Kd-14，由14個胺基酸殘基組成，其編碼基因具有序列表中SEQIDNO7的核苷酸序列，由42個鹼基組成；將具有序列表中SEQIDNO5的胺基酸殘基序列的肽段命名為21Kd-21，由21個胺基酸殘基組成，其編碼基因具有序列表中SEQIDNO:8的核苷酸序列，由63個鹼基組成。由於這三個肽段的胺基酸殘基序列與牛腦PEBP蛋白相應的肽段的胺基酸殘基序列完全一致，因此證明本發明的21Kd蛋白確實屬於PEBP蛋白家族。2、抗阿片肽21Kd活性肽段21Kd-21，21Kd-14和21Kd_13的活性檢測由美聯(西安)生物科技有限公司及上海閃晶生物多肽合成有限公司人工合成21Kd-21，21Kd-14和21Kd_13這三個肽段。用與步驟二相同的方法檢測不同劑量的活性肽段21Kd-21(l.0、2.0、4.OnM)、21Kd_14(0.64,3.2、6.4nM)和21Kd_13(5.7、11.4,22.7nM)對嗎啡(M20，20mg/kgi.P.)抗傷害作用的影響，以生理鹽水(Saline)為對照。檢測結果如圖4A-圖4C所示(橫坐標表示嗎啡注射後時間，縱坐標表示嘶叫閾的變化(％)，η表示各組實驗小鼠數量，i.P.表示腹腔內注射，i.e.v.表示測腦室內注射)，21Kd-21，21Kd-14和21Kd-13拮抗嗎啡抗傷害作用的劑量範圍依次分別為1.0-2.0-4.OnMU.6-3.2-6.4nM和5.7-11.4-22.7ηΜ，它們拮抗嗎啡抗傷害作用都與劑量相關實施例2、檢測抗阿片肽21Kd與嗎啡耐受及依賴的關係一、抗阿片肽21Kd的可溶性單鏈可變區抗體片段的獲得及其功能檢測利用噬菌體展示技術，使用義大利InternationalSchoolforAdvancedStudies(SISSA)DanieleSblattero和AndrewBradbury等構建的人原噬菌體抗體庫[構建方法參見SblatteroD,LouJL,MarzariR,etal.Invivorecombinationasatooltogeneratemoleculardiversityinphageantibodylibraries.ReviewsinMolecularBiotechnology.2001,74303315]，從噬菌體抗體庫中篩選出分子量約20,000道爾頓的抗阿片肽21Kd的可溶性單鏈可變區抗體片段，簡稱為ScFv。在腹腔注入嗎啡(Mltl,IOmg/kg)10分鐘後，將ScFv單獨注入正常小鼠的側腦室內，注射劑量為4.8μg/6y1，以相同體積的磷酸緩衝液(PBS)為對照，然後檢測嗎啡的抗傷害作用。檢測結果如圖5所示(η為每組小鼠數量，i.p.表示腹腔內注射，i.e.v.表示測腦室內注射)，側腦室內注入ScFv可使嗎啡(10mg/kgi.p.)的抗傷害作用顯著增強。在110分鐘內，實驗組小鼠嗎啡抗傷害曲線下的面積為603.8士38.4，是對照組(239.4士16.1)的2.5倍，存在顯著的統計學差異(P<0.001,t=8.7407,t0.OOi=4.140，df=14)，該實驗結果進一步證明正常小鼠腦中確實存在21Kd蛋白對嗎啡抗傷害作用的抑制作用。二、檢測抗阿片肽21Kd與嗎啡耐受的關係選取20隻健康小鼠，每天三次，皮下注射遞增劑量的鹽酸嗎啡，注射劑量由IOmg/kg遞增至60mg/kg，持續10天形成嗎啡耐受小鼠。然後將20隻嗎啡耐受小鼠分成嗎啡耐受對照組(不注射21Kd-ScFv)及注射三個不同濃度的21Kd-ScFv抗體組(每組5隻)。在第11天，先由腹腔注入挑戰劑量的嗎啡(50mg/kg)，10分鐘後，再於側腦室內分別注入4μg/6μ1，6μg/6μ1禾口8μg/6μ1三種劑量的21Kd"ScFv,分別觀察它們的嗎啡抗傷害效應，以非嗎啡耐受的健康小鼠為空白對照組。結果如圖6所示(η為小鼠數量，縱坐標為嗎啡抗傷害作用曲線下的面積，橫坐標為不同實驗組)，在形成嗎啡耐受的對照組，90分鐘內挑戰劑量嗎啡抗傷害作用曲線下的面積為121.52士21.2(cm2)，2IKd-ScFv(4.0μg/6μ1，6μg/6μ1禾口8μg/6μ1)三個劑量組的嗎啡(50mg/kgi.p.)抗傷害作用曲線下的面積分別為170.18士25.3,224.25士49.6和269.97士31.3(cm2)。不同劑量的2IKd-ScFv都不同程度地逆轉了挑戰劑量嗎啡的抗傷害作用，其中，21Kd-ScFv6μg/6l·!1和8μg/6l·!1劑量組的逆轉嗎啡抗傷害作用具有統計學意義(*代表與耐受的對照組相比ρ<0.05；**代表與耐受的對照組相比P<0.01)。與非耐受的空白對照組(261.65士27cm2)相比，21Kd-ScFv(8yg/6y1)組已達到完全逆轉嗎啡耐受的程度。上述實驗結果表明，在嗎啡耐受的形成過程中，內源性抗阿片肽21Kd的合成量增加，可能是形成嗎啡耐受的重要因素之ο三、檢測抗阿片肽21Kd與嗎啡依賴的關係選取12隻健康小鼠，每天三次，皮下注射遞增劑量的嗎啡，注射劑量由10mg/kg遞增至80mg/kg，持續12天形成嗎啡耐受及依賴小鼠。然後將12隻嗎啡耐受及依賴小鼠分成對照組和實驗組。其中，對照組是在最後一次注射嗎啡後6-8小時期間，腹腔注射阿片肽拮抗劑納絡酮(Naloxone)(購自Sigma公司，10mg/kgi.p.)，觀察小鼠可能誘發的戒斷症狀_跳躍的次數。實驗組與對照組是完全配對進行實驗觀察，操作上的差異僅僅是腹腔注射Naloxone(10mg/kg)前，先經側腦室注入2IKd-ScFv(8μg/10μ1)。結果如表1所示，對照組小鼠出現跳躍的次數依次為0、1、15、36、89、90；而實驗組小鼠出現跳躍的次數均消失，但經側腦室注入21Kd-ScFv抗體的量不等，有1隻需三次側腦室注入21Kd-ScFv後跳躍才消失，有2隻在兩次側腦室注入21Kd-ScFv後跳躍消失，有3隻僅一次注入21Kd-ScFv後就不再出現跳躍。上述實驗結果說明，每天三次，以遞增劑量皮下注射嗎啡持續12天形成嗎啡耐受及依賴的小鼠存在較大的個體差異，Naloxone所誘發的跳躍的次數可達0_90次，而側腦室注入21Kd-ScFv可以消除次戒斷症狀-跳躍，但所需要的21Kd-ScFv抗體量卻不等，從而證明嗎啡耐受及依賴的形成也與腦內21Kd蛋白合成量的增加密切不可分。表1在嗎啡耐受及依賴小鼠，側腦室內注入不同劑量的21Kd蛋白可溶性單鏈抗體(ScFvi.e.v.)後對由納絡酮(10mg/kgi.p.)誘發的戒斷症狀-跳躍次數的影響編號I對照組Γ^實驗組No.5~~0Ν^Γ0ScFv(i.C.ν.)8μgXlNo.3No.110ScFv(i.C.v.)8μgXlNo.915No.120ScFv(i.C.v.)8μgX1No.6~~36No.106—0ScFv(i.C.v.)8μgX2No.7~~89^Λ8—0ScFv(i.C.v.)8μgX2No.8~~90？toT245—0ScFv(i.C.v.)8μgX3實施例3、檢測NMDA受體和NOS在抗阿片肽21Kd及其活性片段拮抗嗎啡抗傷害作用中的作用研究表明，興奮性胺基酸NMDA受體和一氧化氮合成酶系統(NOS)在成年小鼠嗎啡耐受及依賴過程起到至關重要的作用，用NMDA受體拮抗劑或NOS抑制劑對小鼠進行預處理後，可抑制嗎啡耐受及依賴的形成，防止戒斷症狀的出現[AdamsML,KalickiJM,MeyerER,CiceroTJ(1993)Inhibitionofthemorphinewithdrawalsyndromebynitricoxidesynthaseinhibitor,NG-Nitro-L-argininemethylester.LifeSci52PL245-PL249；CappendijkSL,VriesR,DzoljicMR(1993)Inhibitoryeffectofnitricoxide(NO)synthaseinhibitorsonnaloxone-precipitatedwithdrawalsyndromeinmorphine-dependentmice.NeurosciLett162:97_100；HermanBH,VocciF,BridgeP(1995)TheeffectofNMDAreceptorantagonistsandnitricoxidesynthaseinhibitorsonopioidtoleranceandwithdrawal.Neuropsychopharmacology13269-293；VaupelDB,KimesAS,LondonED(1995b)Nitricoxidesynthaseinhibitors!preclinicalstudiesofpotentialusefortreatmentofopiateaddiction.Neuropsychopharmacology13315-322；TrujilloK.Α.(2000)Areviewofpreclinicalstudies:AreNMDAreceptorsinvolvedinopiate-inducedneuralandbehavioralplasticity？Psychopharmacology151121-141；HeinzenEL,PollackG.Μ.(2004)Thedevelopmentofmorphineantinociceptivetoleranceinnitricoxidesynthase-deficientmice.Biochem.Pharmacologyvol67(4):735_741]。分別用興奮性胺基酸NMDA受體拮抗劑MK-801(購自Sigma公司，0.lmg/kgi.p.)於注射嗎啡前15分鐘以及用一氧化氮合成酶NOS抑制劑L-NAME(購自Sigma，45mg/kgi.p.)於注射嗎啡前20分鐘，對小鼠進行預處理，以未經預處理的小鼠為空白對照(Blank)，再用21Kd(0.96nM)、21Kd-13(22.7nM)、21Kd_14(6.4nM)和21Kd_21(4.OnM)檢測對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害效應的影響，以生理鹽水(Saline)為對照(Control)。結果如圖7所示(縱坐標為嗎啡抗傷害作用曲線下的面積，單位cm2，橫坐標各項目為三種對照，21Kd，21Kd-13，21Kd_14和21Kd-21)，抗阿片肽21Kd及其活性片段21Kd-13，21Kd_14，21Kd_21肽段對嗎啡抗傷害作用的拮抗作用被解除，說明抗阿片肽21Kd及其活性短肽拮抗嗎啡抗傷害作用需要NMDA受體和NOS的介導。上述實驗結果表明，用NMDA受體拮抗劑及NOS抑制劑處理，可抑制嗎啡耐受及依賴的形成及防止戒斷症狀的出現，可能是腦內21Kd蛋白及其活性片段對嗎啡抗傷害作用的抑制效應被解除，進一步說明腦內21Kd蛋白與嗎啡耐受及依賴密切相關。實施例4、抗阿片肽21Kd拮抗肽的獲得及其活性檢測一、CP-21Kd-13、CP-21Kd_14和CP-21Kd_21拮抗Jft的獲得根據蛋白質分子之間存在相互作用的原理，參考文獻(J.R.Healetal(2002)Specificinteractionsbetweensenseandcomplementarypeptides:TheBasisfortheproteomiccodeChemBIOChem3，136-151)設計出21Kd-13、21Kd-14、21Kd_21三個短月太的拮抗肽，其中，將21Kd-13的拮抗肽命名為CP-21Kd-13，具有SEQIDNO:9的胺基酸殘基序列，由13個胺基酸殘基組成，其編碼序列具有序列表中的SEQIDNO12的核苷酸序列，由49個鹼基組成；將21Kd-14的拮抗肽命名為CP-21Kd-14，具有SEQIDN0:10的胺基酸殘基序列，由14個胺基酸殘基組成，其編碼序列具有序列表中的SEQIDNO13的核苷酸序列，由42個鹼基組成；將21Kd-21的拮抗肽命名為CP-21Kd-21，具有SEQIDNO11的胺基酸殘基序列，由21個胺基酸殘基組成，其編碼序列具有序列表中的SEQIDN0:14的核苷酸序列，由63個鹼基組成；二、CP-21Kd-13、CP-21Kd"14和CP-21Kd_21拮抗肽的活性檢測1、檢測CP-21Kd_13、CP-21Kd_14和CP-21Kd_21對嗎啡抗傷害作用的影響用與實施例1步驟二中相同的方法檢測CP-21Kd_21、CP-21Kd_14、CP-21Kd_13肽段對嗎啡抗傷害作用的影響，方法為選取正常昆明小鼠，分三組(每組5或6隻，η=5或6)，分別由尾靜脈注入CP-21Kd-13(6mg/Kgi.v.)、CP-21Kd_14(5mg/Kgi.v.)禾口CP-21Kd-21(5.6mg/Kgi.v.),再檢測對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害效應的影響，以生理鹽水為對照(Saline50μ1i.V.)，其中CP-21Kd_13，CP-21Kd_14和CP-21Kd_21注射組的檢測結果如圖8A-圖8C所示(橫坐標表示嗎啡注射後時間(min)，縱坐標表示嘶叫閾的變化(%)，η表示各組實驗小鼠數量，i.p.表示腹腔內注射，i.v.表示尾靜脈內注射)，與對照組相比，注射CP-21Kd-21、CP-21Kd-14或和CP-21Kd_13後，嗎啡的抗傷害作用顯著地增強，顯然這些拮抗肽起著抗阿片肽抑制劑的作用，抵消了內源性抗阿片肽的效應。此外，由於這些拮抗肽分子量小於2000道爾頓，由尾靜脈注入體內可通過血腦屏障進入中樞神經系統，奠定了拮抗肽CP-21Kd-21、CP-21Kd-14、CP-21Kd_13具有製備增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的藥物，並可對所述藥物進行臨床應用的前景。2、CP-21Kd-21、CP-21Kd_14和CP-21Kd_13對由納絡酮(Naloxone)誘發的嗎啡戒斷效應的影響選取健康小鼠，每天三次，皮下注射遞增劑量的嗎啡，注射劑量為10mg/kg遞增至80mg/kg，持續12天形成嗎啡耐受及依賴小鼠。然後將嗎啡耐受及依賴小鼠分成對照組(注射生理鹽水)和實驗組。在第13天最後一次注射嗎啡後6-8小時，尾靜脈分別注射拮抗肽CP-21Kd-21(15mg/kg)、CP-21Kd_14(15mg/kg)和CP-21Kd_13(15.5mg/kg)，以生理鹽水(Saline80μ1i.V.)為對照，5分鐘後腹腔注射Naloxone(10mg/kg)，觀察小鼠誘發戒斷症狀_跳躍的次數。CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd_13組的實驗結果如表2和表3所示，說明由尾靜脈分別注射拮抗肽CP-21Kd-21(15mg/kg)、CP-21Kd_14(15mg/kg)和CP-21Kd-13(15.5mg/kg)，Naloxone(lOmg/kgi.P.)誘發的戒斷效應-跳躍可被消除或明顯減弱。此外，秩和檢驗結果表明與對照組-1相比較，CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13實驗組都存在顯著差異(P=1-0.025=0.975)，加大劑量的CP-21Kd_14和CP-21Kd-13組與對照-3相比也存在極顯著的差異，因此，拮抗肽CP-21Kd-21、CP-21Kd_14和CP-21Kd-13均可有效抑制或消除戒斷效應。表2尾靜脈注射拮抗肽CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13對納絡酮(Naloxone10mg/kgi.P.)誘發嗎啡戒斷症狀一跳躍的影響tableseeoriginaldocumentpage13秩和檢驗表明與對照組相比，差異極顯著(P=1-0.025=0.975)。表3尾靜脈注射拮抗肽CP-21Kd-14(64mg/kgi.v.)和CP-21Kd_13(48mg/kgi.v.)對納絡酮(Naloxone10mg/kgi.P.)誘發嗎啡戒斷症狀一跳躍的影響tableseeoriginaldocumentpage13***秩和檢驗表明與對照組相比，差異極顯著(P=1-0.025=0.975)。權利要求抗阿片肽的拮抗肽，其胺基酸殘基序列如序列表中的SEQIDNO10所示。2.編碼權利要求1所述的抗阿片肽拮抗肽的基因。3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO13的DNA序列所示。4.含有權利要求2或3所述的基因的表達載體。5.含有權利要求2或3所述的基因的轉基因細胞系。6.含有權利要求2或3所述的基因的宿主菌。7.以權利要求1所述的抗阿片肽的拮抗肽為活性成分的增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的藥物。全文摘要本發明公開了一種抗阿片肽及其拮抗肽與應用。該抗阿片肽是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO1；2)SEQIDNO3-5；3)將序列表中SEQIDNO1、SEQIDNO3-5的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。其拮抗肽是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO9-11；2)將序列表中SEQIDNO9-11的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷症狀作用的多肽。本發明的抗阿片肽及其活性片段與拮抗肽將在醫學及戒毒藥物的製備領域發揮重要作用，應用前景廣闊。文檔編號C12N15/11GK101798338SQ20101012261公開日2010年8月11日申請日期2007年6月28日優先權日2007年6月28日發明者吳才宏,曲紅,陳玉珍申請人:北京大學