糖鏈抗原242化學發光定量檢測試劑盒的製作方法

2023-10-05 09:57:34

專利名稱：糖鏈抗原242化學發光定量檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於體外臨床檢驗和化學發光免疫法技術領域，具體涉及一種用於糖鏈抗 原對2(0々242)化學發光定量檢測試劑盒及相關製備方法和使用方式。
背景技術：
糖鏈抗原242 (carbohydrate antigen 242，CA242)於 1985 年經單克隆抗體 C242 篩選而得。1983年Limdholm等人用結、直腸癌細胞C0LD205免疫小鼠得到系列抗體，以後 相繼發現了與這些抗體相應的系列抗原，包括CA 19-9, CA 50, CA 125, CA 242等。這一系 列抗原的決定簇均為糖鏈結構，且出現於同種粘蛋白表面，但又有不同的腫瘤特異性，故可 作為不同的腫瘤標誌物。CA242是一種唾液酸化的糖蛋白，在健康人和良性疾病血清中含量 很低，消化道惡性腫瘤時，血清CA 242出現升高。目前胰腺癌的治療和預後均不理想，臨床確診的病人往往已處於進展期，因此早 期診斷非常重要，現階段用於胰腺癌診斷的腫瘤標誌物主要是CA 19-9、CA 50XA 2420經 臨床應用，前兩者均有較好的靈敏度，但特異性不高，即兩者均易受肝功能及膽汁鬱積的影 響，導致在良性阻塞性黃疸及肝實質損害性疾病時出現假陽性。CA 242是胰腺癌病人中首 先出現的一種與腫瘤相關抗原，多數報告認為它與CA 19-9、CA 50具有相當或稍低的靈敏 度，但更特異，即在良性肝膽疾病和胰腺炎時，血清CA 242水平很少或僅輕微升高，其出現 的假陽性率明顯低於CA 19-9，CA 50。在結、直腸癌的診斷中，目前應用最多的腫瘤標誌物是CEA，但其在疾病早期靈敏 度太低。有報導通過對術前結、直腸癌病例的回顧性診斷，發現CA 242和CEA的聯合檢測， 靈敏度比單用CEA提高25% 50% ；在術後結、直腸癌監測中，CA 242與CEA聯用對癌症 復發的診斷率是88%。CA 242水平的改變通常可證實CEA的升高，某些病例中，CA 242的 升高早於CEA的升高及臨床復發症狀的出現。故CA 242與CEA聯用於結、直腸癌的診斷及 術後監測有較高的價值。化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)於 1977 年問世， 1985年第一代化學發光免疫試劑盒研製成功並投放市場。上世紀70年代中期Arakawe首 次報導用發光信號進行酶免疫分析，利用發光的化學反應分析超微量物質，特別是用於臨 床免疫分析中檢驗超微量活性物質。目前，這一技術已從實驗室的稀有技術過渡到臨床醫 學的常規檢測手段。化學發光免疫分析是將化學發光或生物發光體系與免疫反應相結合， 用於檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。其檢測原理與放射免疫(RIA)和 酶免疫(EIA)相似，不同之處是以發光物質作為底物，並藉助其自身的發光強度直接進行 測定。化學發光標記免疫分析是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常 用於標記的化學發光物質有吖啶酯類化合物一acridinium ester (AE)，是有效的發光標記 物，其通過起動發光試劑(NaOH-H2O2)作用而發光，強烈的直接發光在一秒鐘內完成，為快 速的閃爍發光。還有以三聯吡啶釕(Ru(byp)32+)標記物為發光底物，用另一反應物三丙胺(TPA)來激發光反應，在電極表面反覆進行氧化還原反應從而產生高效穩定連續發光的電 化學發光免疫分析。這些免疫分析方法都需要高精度複雜的自動測量儀器，目前在國內還 難以實現。化學發光酶免疫分析是以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免 疫反應，免疫反應複合物上的酶再作用於發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測 定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(ALP)，它們 有各自的發光底物。HRP常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲醯胼，luminol)或其衍生 物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲醯胼)等，魯米諾的氧化反應在鹼性緩衝液中進行，在過氧 化物酶及活性氧的存在下，生成激發態中間體，當其回到基態時發光，其波長為425nm。發光 強度依賴於酶免疫反應物中酶的濃度。如果不使用增強劑，魯米諾體系的發光基本上為閃 光型且信號弱，通過加入某些特殊的增強劑可增強發光的信號並可大大延長發光的持續時 間。化學發光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度(檢測限度可達10_15 10_18mol/ L)，又具有酶聯免疫的操作簡便、快速的特點，易於標準化操作，且測試中不使用有害的試 劑。試劑保持期長，應用於生物學、醫學研究和臨床實驗診斷工作，成為非放射性免疫分析 法中最有前途的方法之一。但是，國外的自動化學發光酶免疫分析儀及與之相匹配的試劑 盒多採用封閉體系配合使用，價格昂貴，操作複雜，在國內不易推廣。

發明內容
本發明將化學發光技術與免疫分析技術相結合，提供了一種能夠定量檢測CA 242 的試劑盒。本發明技術方案如下一種糖鏈抗原242化學發光定量檢測試劑盒，包括反應板，酶結合物，發光底物， 校準品，質控品，濃縮洗滌液，所述的反應板包被有糖鏈抗原242抗體。所述的校準品以糖鏈抗原242純品配製，濃度優選為0、15、50、100、150、200U/ml。所述的質控品以糖鏈抗原242純品配製，由質控品I和質控品II兩部分組成，質 控品I的濃度為3-95U/ml，質控品II的濃度為105_195U/ml。所述的質控品I的濃度優選為16. 1 U/ml，質控品II的濃度優選為150. 9U/ml。所述的酶結合物為HRP標記的糖鏈抗原242抗體，所述的反應板材質是不透明的 聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發光底物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液是 pH7. 0-pH8. 0的中性緩衝液。本發明提供的試劑盒具有開放性系統，可以應用於多種不同公司的化學發光檢測 儀器，無需昂貴的專用配套儀器，並具有簡便，快速，穩定的檢測能力，易於在國內市場推
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本 發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 :CA 242化學發光定量檢測試劑盒的製備(1)抗CA 242的抗體包被板製備a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去離 子水定容至IOOOml即成10倍包被液，臨用前稀釋十倍，加入適量CA 242單抗(購買自 Fujirebio)混勻，然後加入到微孔板板孔中，100 μ 1/孔，4°C 16小時；b.封閉棄去包被液，在吸水紙紙上拍幹，加入含有3% BSA和0.05%防腐劑 (Procl in 300)的磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小時；c.封袋棄去封閉液，在吸水紙上拍幹，室溫下於真空乾燥箱中抽5小時，立即進 行真空封袋，檢查有無漏氣，如有重新封袋，貼上標籤後於2-8°C保存。(2)酶標記物的製備用含有2. 5% BSA、1. 5%的脫脂奶粉和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽 緩衝液(pH 7.4)配製緩衝系統。CA 242抗體(購買自Fujirebio)用過碘酸鹽氧化法與辣根過氧化物酶交聯。(3) CA 242校準品的製備用含有3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4)配製 緩衝系統。用CA 242純品配製校準品工作液(CA 242純品購買自Fujirebio)，分別為0、15、 50、100、150、200U/ml 6 個工作濃度。(4) CA 242質控品的製備小牛血清與去離子水6 4混合，並添加0. 05%防腐劑(Proclin 300)，配製成 質控品緩衝液。用CA 242純品製備質控品工作液(CA 242純品購買自Fujirebio)分裝16. 1、 150.9U/ml。(5)化學發光底物液的製備使用 PIERCE 公司的SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate 作為配套檢測液。A液、B液各1瓶。(6) 20 X濃縮洗滌液製備取NaCl 170g吐溫-20 IOml加水定容至IL即成，臨用前稀釋20倍。(7)半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝後即為半成品。抽檢合格後組裝成試劑盒成品，成品還需 抽檢，合格後才能出廠。實施例2 =CA 242化學發光定量檢測試劑盒的使用方法1.試劑和樣本準備(1)試劑準備a.將試劑盒置室溫(1846°C )平衡20分鐘。b.從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用新鮮的純化水1 20稀釋後加入洗板機的洗液 瓶中。(2)樣本準備
使用前將待測的合格血清或血漿置室溫(1846°C )平衡20分鐘。2.操作步驟a.取出所需的CA 242抗體包被微孔板置於微孔架上b.加入校準品1-6、質控品1、2和待測樣本，每孔25 μ 1。c.加入酶標記物100 μ 1/孔。d.輕柔震蕩混勻。e.室溫孵育120分鐘。f.棄去孔內廢液。手工洗滌棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔、靜置5秒，甩幹，重複5次後拍幹；洗板機洗滌每孔350 μ 1，重複4次，洗滌後拍幹。g.加發光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化學發光儀中檢測信號值。3.實驗結果的計算可以採用作圖法或計算法進行結果計算作圖法以標準品抗原含量的Ig值為橫坐標⑴，以其對應的信號值為縱坐標⑴ 繪製出標準曲線，然後根據檢測樣本測得的信號值在標準曲線上查出相應的抗原含量Ig 值，再計算出抗原含量。計算法以標準品抗原含量的Ig值為自變量(X)，以其對應的信號值為因變量 (Y)，求出回歸方程，將待測標本的信號值帶入回歸方程，求得相應的抗原含量。
權利要求
1.一種糖鏈抗原242化學發光定量檢測試劑盒，其特徵在於，包括反應板，酶結合物， 發光底物，校準品，質控品，濃縮洗滌液，所述的反應板包被有糖鏈抗原242抗體。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的校準品以糖鏈抗原242純品配製， 濃度為 0、15、50、100、150、200U/ml。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的質控品以糖鏈抗原242純品配 制，由質控品I和質控品II兩部分組成，質控品I的濃度為3-95U/ml，質控品II的濃度為 105-195U/mlo
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述的質控品I的濃度為16.lU/ml，質控 品II的濃度為150. 9U/ml。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的酶結合物為HRP標記的糖鏈抗原 242抗體，所述的反應板材質是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發光底物為魯米諾、異 魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液是pH7. 0-pH8. 0的中性緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種糖鏈抗原242化學發光定量檢測試劑盒，該試劑盒包括糖鏈抗原242檢測反應板，反應板包被有糖鏈抗原242抗體。糖鏈抗原242定量檢測試劑盒，還包括酶結合物，發光底物，校準品，質控品，濃縮洗滌液。本發明可以專一的定量檢測出病人血清糖鏈抗原242的含量，用於輔助診斷胰腺癌等消化道惡性腫瘤及其預後和療效監測。與傳統的ELISA技術相比，本發明不僅保留了ELISA技術的高度特異性，檢測結果的穩定性、可靠性和操作的簡便性，同時採用的化學發光法能提高檢測的靈敏度。
文檔編號G01N21/76GK102095846SQ200910200390
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者汪寧梅, 王通, 穆宇豪, 穆海東 申請人:上海裕隆生物科技有限公司