對抗腸病毒71型的單源抗體及其用途的製作方法

2023-10-05 11:44:09

專利名稱：對抗腸病毒71型的單源抗體及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學之領域用於神經細胞保護的用途，特別是涉及與腸病毒71型結合及/或中和的單源抗體。
背景技術：
腸病毒71型為一種歸類於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)的正股RNA病毒。自從在1969年於美國加州出現第一件EV71型感染案例以來，全球各地定期會出現該病毒感染人類的案例。受到腸病毒71型(與其某些遺傳上相近的對應體，如柯沙奇病毒16(CA16)及CA10)感染，已知會造成輕微發疹症狀，在嬰兒及孩童身上可能顯示為口足手病(HFMD)/皰疹性咽峽炎。在過去10-12年中，亞洲-太平洋地區定期爆發腸病毒71型感 染大流行，已經造成會導致許多受感染兒童死亡的肺水腫/出血症狀。於腸病毒71型基因群中，基因群B與C的病毒已經於1986年到2008年之間發生在中國臺灣的大流行中被分離出來。1999年到2002年間的流行活動，主要是與基因群B病毒有關。在2006及2007年，鑑定出一種具有基因型B5的腸病毒71型，而且再度出現於2008年的中國臺灣大流行中。不斷竄出的腸病毒71型感染，已經被當做一種對全球公眾健康造成威脅的問題來討論。在過去，尚未有對治療腸病毒71型感染有效的抗病毒藥，及用來防治病毒大流行的有效預防性疫苗，而且預期在近期的未來仍無可利用者。對於過去10年來發生在中國的腸病毒71型大流行，已利用投藥複合型人類迦瑪球蛋白，來治療罹患與腸病毒71型感染相關的腦炎患者。但是，該項試驗並未達到令人滿意的結果。已有將一種使SP70曝露於VPl衣殼蛋白表面之，免疫優勢抗原決定基與鑰井孔蟲戚血藍蛋白(KLH)共軛，產生能中和基因型C的腸病毒71型分離株(其已在中國巡迴流行)的鼠類單源抗體。 對於用來遞送至免疫系統的適當免疫調配物的選擇，可能會決定性影響所產生抗體的專一性。目前尚無可利用的單源抗體，能專一對抗近幾年已在中國臺灣巡迴流行的基因型B腸病毒71型病毒株。

發明內容
於一方面，本發明涉及一種單源抗體或其結合片段，其系專一地與SEQ ID N055所列之多肽結合。於另一方面，本發明系關於一種與腸病毒(EV) 71型結合的單源抗體或其結合片段，其包含a)具有SEQ ID NO :70所列的胺基酸序列的重鏈互補決定區域I (CDRl)多肽，與具有SEQ ID NO 71所列的胺基酸序列的重鏈互補決定區域2 (⑶R2)多肽；及b)具有SEQID NO -J2或73所列的胺基酸序列的輕鏈CDRl多肽，具有SEQ ID NO 74或75所列的胺基酸序列的輕鏈⑶R2多肽，與具有SEQ ID NO :76或77所列的胺基酸序列的輕鏈⑶R3多肽。於另一方面，本發明涉及一種單離核酸，其包含編碼一包含SEQ ID N0:82所列的胺基酸序列的重鏈多肽的核苷酸序列。於另一方面，本發明涉及一種單離核酸，其包含一編碼包含選自SEQ ID NO 78,79,80及81所列的胺基酸序列的輕鏈多肽的核苷酸序列。
於另一方面，本發明涉及一種宿主細胞，其包含如前所述的單離核酸。於另一方面，本發明涉及一種用於中和或保護對抗基因型B的腸病毒71型感染的組合物，其包含一或多種如前所述的單源抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。於另一方面，本發明涉及一種組合物，其包含一種如前所述的單源抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。再於另一方面，本發明涉及一種活體外偵測腸病毒71型是否存在一生物樣本中的方法，其包含a)將該樣本與前述的組合物接觸；及13)分析該抗體的結合以測定腸病毒71型的存在。又於另一方面，本發明涉及一種與腸病毒71型結合的單源抗體或其結合片段，其包含a)包含SEQ ID NO :82所列的胺基酸序列的重鏈多肽；及幻包含選自SEQ ID NO :78、79,80及81所列的胺基酸序列的輕鏈多肽。 本發明之此等及其它方面，將自下列較佳實施例之敘述，並結合所列圖式而彰顯出來，然而在不偏離本發明新穎創作概念之精神與範圍下，可進行各種變異及修改。附隨的圖式是為了例舉說明本發明之一或多種實施範例，且與本說明書所載之實施方式一起用於闡釋本發明之原理。各圖式中所使用具有相同號數之符號組件，在各實施範例中皆代表相同或相似的意義。


圖I為顯示同型N1、N3、N4及N6抗體分型的吸光值圖；圖2為顯示分別含有所指定單源抗體N1、N3、N4及N6的腹水液體樣本的凝膠電泳分析結果的照片；圖3為顯示E71/E59病毒蛋白分別由存在腹水液體樣本中之所指定單源抗體NI、N3、N4及N6結合的西方轉潰分析結果的照片；圖4列示NI、N3、N4及N6抗體之輕鏈可變區(VL)的單字母胺基酸序列。FW :骨架KDR :互補決定區域；圖5列示NI、N3、N4及N6單源抗體之重鏈可變區(VH)的共有胺基酸序列；圖6A-6D顯示抗原決定基定位分析的結果；圖7為顯示各別及混合型抗體之中和活性的分析結果圖。
具體實施例方式本說明書中所使用之術語通常在發明所屬技術領域中、本發明內文中及個別術語被使用之特定內文中具有其一般意義。以下(或說明書的其它地方)論述某些用於描述本發明之術語，以提供實施該策略者有關本發明內容額外的指引。為了方便起見，一些特殊術語將會使用斜體字與/或引號強調出來，但使用強調的標示並不會影響某一術語本身的範圍與意義；某一術語在同一內文中不論其是否被標示，其範圍與意義是相同的；同樣的事情有一個以上的說法是可理解的。因此，本文中所論述之一或多個術語可使用替代性的語言及同義詞，其是否在本文中被詳細描述或討論並不特別重要。一些特殊術語的同義詞一或多個同義詞之引用並不排除可使用其它同義詞。在本發明所使用之包括了任一本文中所論述之術語的實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明或任何所例舉術語之範圍與定義。同樣，本發明不受限於各種在本說明書中所載之實施範例。除非另有規定，本文中所使用的技術和科學術語，具有和發明所屬技術領域中具有通常知識者，所共通了解之相同的意義。若是在有所衝突的情況下，將在本文件(包括定義)提出管制。本文中所使用的「約」、「大約」或「大概」應廣義地意指，在所給予數值或範圍之20 %以內，較佳地10 %以內，且更佳地5 %以內。本文中所給予之數量為近似值，表示在無明確指示下，可引用術語「約」、「大約」或「大概」。本發明所使用之「製備」一般應意指某物被製備、製造，及某一物質經過特殊製備。本文中所使用的術語「抗體」意指一種免疫球蛋白分子，或具有可與特定抗原專一性結合之能力的免疫球蛋白分子片段。抗體為免疫學領域中具有通常知識者所熟知的。本文中所使用的術語「抗體」不僅指全長抗體分子，亦包括保有抗原結合能力的抗體分子片段。此類片段亦為該項技藝所熟知，常用於活體外和活體內。尤其，本文中所使用的術語「抗體」不僅指全長之免疫球蛋白分子，亦包括具抗原結合活性的片段，例如已熟知的活性片段F (ab' ) 2、Fab、Fv 及 FcL一抗體之可變區域系稱作FV區，且其為與抗原結合的最重要區域。Ig單體為一種"Y"-字型分子，其系由四條多肽鏈所組成；兩條相同的重鏈與兩條相同的輕鏈，彼此間以雙硫鍵相連結。Y-字型的臂部(例如)含有和抗原結合的位置，而因此能辨識特別的外來物。抗體的這個區域稱為Fab (片段，抗原結合)區域。其系由來自抗體之每一重鏈與輕鏈的，一個恆定區與一個可變區所組成。本發明涉及四種腸病毒EV 71型-專一性中和抗體，命名為NI、N3、N4及N6。該等抗體系使用原始融合瘤技術分離得，包括將經過活的EV71/E59單離株免疫之BALB/c(H-2d)小鼠脾臟與NS-I骨髓瘤細胞進行融合。中和抗體可用於製備用來治療感染的醫藥組合物，特別是用於阻斷病毒散播。於該項技藝已知可將一哺乳動物抗體的非-⑶R區域置換以同種動物或異種動物抗體的類似區域，而仍保持原始抗體之抗原決定基的專一性。此在研發及使用「人源化」抗體時最容易表示，其中系將非人類CDRs與人類FR及/或Fc/pFc,區域進行共價接合，而產生具有功能性的抗體。因此，例如，PCT國際公開案號WO 92/04381教示關於人源化鼠類RSV抗體的製造及使用，其中已將至少一部分鼠類FR區域，置換以人類來源的FR區域。此類抗體(包括具有抗原結合能力之全長抗體片段)，通常稱之為「嵌合型」抗體。可製造出此類其中抗-EV 71抗體的某些或全部FR區域，已經被置換成其它同源性人類FR區域的嵌合型抗體。非人類(例如鼠類)抗體之人源化型式為嵌合型免疫球蛋白，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的免疫球蛋白鏈或片段(例如，Fv、Fab、Fab'、F(ab' ) 2或抗體之其它抗原結合性次序列)。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受體互補決定區域(CDR)之殘基，被置換以來自例如小鼠、大鼠或兔子等非人類物種(供者抗 體)之⑶R的殘基，其具有所希望之專一性、親和性及能力。於某些案例，系將人類免疫球蛋白之Fv骨架殘基置換以相對應的非人類殘基。人源化抗體亦可包含未出現在受者抗體中，或未存在於所引進之或骨架序列中的殘基。一般，人源化抗體會包含實質上全部至少一種(代表性地兩種)可變區域，其中全部或實質上全部⑶R區域，系相當於非人類免疫球蛋白之CDR區域，且全部或實質上全部FR區域，為人類免疫球蛋白共有序列的FR區域。人源化抗體最佳亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，代表性的系來自人類免疫球蛋白[Jone s 等人，Nature，321 :522-525(1986) ;Riechmann 等人，Nature，332 :323-329 (1988)；及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.，2 :593-596(1992)]。將非人類抗體人源化的方法，為該項技藝所熟知。一般，人源化抗體具有一或多個從非人類來源導入的胺基酸殘基，此等非人類胺基酸殘基通常稱為「引進」殘基，代表性地取自一「引進」可變區域。人源化作用基本上可依照Winter與同僚所述之方法[Jones等人，Nature, 321 :522-525(1986) ;Riechmann 等人，Nature, 332 :323-329 (1988) ；Verhoeyen等人，Science, 239 :1534-1536 (1988)]，藉 由將嚙齒類CDRs或CDR序列取代人類抗體的對應序列。於是，此類「人源化」抗體為嵌合型抗體(U.S. Pat. No. 4，816，567)，其中已將實質上少於一個完整的人類可變區域，由來自非人類物種之相對應序列取代。實際應用上，人源化抗體代表性地為其中某些CDR殘基，及可能一些FR殘基被來自嚙齒類抗體中類似位置的殘基取代。亦可使用各種該項技藝已知的技術，包括卩遼菌體展示抗體庫(phage displaylibraries)來製造人類抗體。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單源抗體(Cole等人，單源抗體與癌症療法，Alan R. Liss, p. 77 (1985);及Boerner等人，J. Immunol. ,147(1) :86-95 (1991))。同樣，可藉由將人類免疫球蛋白基因座導入基因轉殖動物，例如其中內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全被去活之小鼠中。於攻毒期間，觀察到有人類抗體製造，其非常類似於在人類各方面所觀察到的，包括基因重排、組裝及抗體譜(antibody repertoire)。此製程經描述於(例如)美國專利案5, 545, 807 ；5, 545, 806 ；5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016號。此類完全人類或人源化單源抗體，特別可用於不希望會引起對抗該抗體本身的免疫反應者。參見美國專利案7，622，113號，其完整以引用方式併入本文。抗體可進行標定及固定於固態撐體上。語詞「標記」用於本文係指直接或間接與抗體接合，以致產生「被標定」抗體之可偵測化合物或組合物。標記本身為可偵測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或是酵素標記的情況，可催化進行受質化合物或組合物之化學變化使其為可偵測的。為引發產生能夠交叉中和近幾年來在中國臺灣巡迴流行之腸病毒71型基因型B病毒的單源抗體，將小鼠接種活的中國臺灣單離株(具有基因型B4之EV71/59)，而令動物能引發對抗較廣範圍存在天然病毒抗原內之抗原決定基的B淋巴細胞。然後，可經由選殖方法來分離出，製造具有所希望特性之抗體的融合瘤。本發明描述由四種融合瘤克隆所製造之單源抗體的特徵。使用於細胞生產，並經過蔗糖梯度離心純化之，活的具有基因型B4之腸病毒71型(命名為EV71/E59)，為用來產生EV71-專一性單源抗體的免疫原。篩選出四種從經過EV71/E59-預先致免之BALB/c (H_2d)小鼠脾臟，與呈現穩定生長之NS-I骨髓瘤細胞進行融合所衍生得的融合瘤克隆，用於進一步特徵分析。基於觀察到彼等於其K輕鏈基因表現不同的互補決定區域(⑶Rs)，證明所產生之融合瘤確實是獨立的克隆。由各別克隆所製造之經純化腹水，在西方轉潰分析中會針對病毒衣殼蛋白(VPl)反應，且辨識位於C-端之共通抗原決定基的不同位置。每一單源抗體皆呈現有效對抗致免病毒株，及其它兩株分別屬次基因群B4與B5，命名為N0781-TW-01與N2838 (常出現在中國臺灣近幾次大流行)的中和活性。亦觀察到在中和EV71/E59病毒時，單源抗體會相互合作行動。於一方面，本發明涉及一種單源抗體或其結合片段，其系專一地與SEQ ID N055所列的多肽結合。於本發明之一項具體實施方案，該單源抗體為人源化抗體。於本發明之另一項具體實施方案，該單源抗體為抗體片段。於另一方面，本發明涉及一種與腸病毒(EV) 71型結合之單源抗體或其結合片段，其包含a)具有SEQ ID NO :70所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區域I (CDRl)多肽，與具有SEQ ID NO :71所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區域2 (⑶R2)多肽；及b)具有SEQ IDNO -J2或73所列之胺基酸序列的輕鏈⑶Rl多肽，具有SEQ ID NO 74或75所列之胺基酸序列的輕鏈⑶R2多肽，與具有SEQID NO 76或77所列之胺基酸序列的輕鏈⑶R3多肽。 於本發明之一項具體實施方案，該結合片段包含一 Fv片段。於本發明之另一項具體實施方案，該結合片段包含一 Fab片段。於本發明之另一項具體實施方案，該抗體為完全人類單源抗體。於本發明之另一項具體實施方案，該抗體為人源化單源抗體。於本發明之另一項具體實施方案例，該抗體或結合片段系中和具有基因型B之腸病毒71型。於本發明之另一項具體實施方案，該抗體或結合片段包含具有SEQ ID N0:82所列之胺基酸序列的重鏈多肽。於本發明之另一項具體實施方案，該抗體或結合片段包含具有選自SEQ IDNO :78、79,80及81所列之胺基酸序列的輕鏈多肽。於本發明之另一項具體實施方案，該如前所述之單源抗體或其結合片段系經標定。於本發明之另一項具體實施方案，該如前所述之單源抗體或其結合片段系與腸病毒衣殼蛋白VPl結合。於另一方面，本發明涉及一種單離核酸，其包含編碼一包含SEQ ID NO 82所列之胺基酸序列的重鏈多肽之核苷酸序列。於另一方面，本發明涉及一種單離核酸，其包含一編碼包含選自SEQ ID NO 78,79、80及81所列之胺基酸序列的輕鏈多肽之核苷酸序列。於另一方面，本發明涉及一種宿主細胞，其包含如前所述之單離核酸。於另一方面，本發明涉及一種用於中和或保護對抗基因型B之腸病毒71型感染的組合物，其包含一或多種如前所述之單源抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。於另一方面，本發明涉及一種組合物，其包含一種如前所述之單源抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。再於另一方面，本發明涉及一種活體外偵測腸病毒71型是否存在一生物樣本中之方法，其包含a)將該樣本與前述之組合物接觸；及13)分析該抗體之結合以測定腸病毒71型的存在。又於另一方面，本發明涉及一種與腸病毒71型結合之單源抗體或其結合片段，其包含a)包含SEQ ID NO :82所列之胺基酸序列的重鏈多肽；及幻包含選自SEQ ID NO :78、79,80及81所列之胺基酸序列的輕鏈多肽。實施例無意限制本發明的範圍，以下提供根據本發明之各種實施例所例舉的儀器、裝置、方法和其相關結果。應注意，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。此外，在本說明書中也提出並披露某些理論；然而，無論彼等是對的還是錯的，只要該發明是根據本發明所實施的，都應被限制在本發明的範圍之內，而不需考慮任何特定的理論或實施方案。材料與方法小鼠及免疫將購自實驗動物中心(中國臺灣)，並維持於由本中心動物照護及使用委員會檢定合格之動物養護設備，的六至七周齡雌性Balb/c (H-2d)小鼠各別進行免疫接種三次，每次經由腹膜內途徑，免疫106溶菌斑形成單位(PFUs)之，經過蔗糖梯度純化的EV71/E59病毒。於最後一次追加免疫10天後對動物抽血，並使用經熱去活之EV71/E59 (HI-EV71/E59)病毒塗布的直接酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)，來測定血清抗體。將已呈現最強對抗該病毒之抗體反應的小鼠，以相同劑量之活病毒施予最後一次追加免疫，經過7天之後，將其脾臟取出用於進行融合。病毒之生產、純化及特徵分析將得自美國菌種保藏中心(ATCC，Rockville, MD，USA)生長於VP-SFM無血清培養基(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。EV71/E59單離株系得自中國臺灣疾病管制中心(CDC)。具基因型B4之N0781-TW-OI及具基因型B5之N2838-TW-03系由Jen-RenWang教授(成功大學醫技系，臺南，中國臺灣)提供。藉由將各種病毒以10-5之感染複數(MOI)接種入，培養於850cm2旋轉培養瓶(Corning，NY，USA)之I. 5-2. 0 X 108VER0細胞培養物中，完成病毒之大量製造。將培養瓶固定於旋轉架(Wheaton，Millville，NJ，USA)上，置於37°C培養室中設定轉速為0. 33rpm以促進病毒生長。於5天後收取培養物上清液，通過0. 65iim濾膜(Sartorius, Hayward, CA, USA)過濾以去除細胞碎片,最後藉由將其通過Minimate 100K切向應力流動過濾(TFF)套管(Pali生命科學,AnnArbor,MI,USA),而濃縮至大約50. OmL。將濃縮樣本置於10-50%連續鹿糖梯度(Merck, West Point, PA, USA)上，並於32，OOOrpm下離心3小時。將位於35-37%梯度之條帶部分收集，並對I. OLl XPBS, pH7. 2 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)交換三次進行透析。使用免疫溶菌斑形成分析，測定所純化得之病毒製備物的力價。產生EV71/E59-專一性單源抗體將I. OX 107個從所選擇實驗小鼠取得之不含紅血球的脾臟細胞，與2X 107NS-1細胞(ATCC , Rockville, MD，USA)，根據先前技藝所述已建立的方法(Kohler與MiIstein (1975) 「融合細胞之連續培養物分泌具有預定專一性的抗體」 Nature 256，495-497)，使用購自 Sigma/Aldrich(St Louis, MO, USA)之 Hybri Max[p7306, PEG3000-3700Da溶於二甲亞碸(DMSO)]進行融合。從在HT(次黃嘌呤與胸苷)培養基(Sigma/Aldrich, St Louis, MO, USA)中生長良好之融合瘤收集培養物上清液。以每井孔含0. 3個細胞，於培養基[CM:補充以 10. 0%胎牛血清(Biological Industries, Kibbutz BeitHaemek, Israel)與青黴素 / 鏈黴素混合物(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)之Dubecco』 s 修改的 Eagle，s 培養基(DMEM) (Gibco/Invitrogen, Carl sbad, CA, USA)]中，在有5. OX 105個經照射(2000rads)之BALB/c (H_2d)脾臟細胞(做為餵養細胞)存在下，進行可產生能中和致免病毒之EV71/E59-專一性抗體的融合瘤純系。將有生長之融合瘤增生，並經特徵分析確定其克隆性(clonality),及所產生之單源抗體的特性。腹水之製造與純化將藉由5 X 105個注射入個別> 6-月齡，經降植烷處理之BALB/c小鼠中的，各別融合瘤克隆所產生之腹水液體，與0. 04mL之10%硫酸葡萄聚糖溶液(Sigma/Aldrich,St Louis, MO, USA)及 I. OmT,之 I. OM 氯化 丐(Sigma/Aldrich, St Louis, MO, USA)，以I 0. 04 l(v/v)之比例混合而使其去脂質。經過5分鐘後，將混合物於10，OOOXg下離心 10 分鐘(離心機型號Legend Micro 17R, Sorvall Thermo Scientif ic)。收集上清液部分，並於 I. OL 溶於 dH20 之 IXTris 緩衝食鹽水(TBS)，pH 7. 2(137mM NaCl 與 IOmM Tris, Sigma/Aldrich, St Louis,MO, USA)中進行透析過夜，之後將其加載至使用AKTA起動泵(GEHealthcare，鹽湖城，USA)之蛋白質G管柱上。將與蛋白質G結合之抗體，以10. OmM甘胺酸-HCl (Sigma/Aldrich, St Louis, MO, USA), pH 3. 0 緩衝液溶析出。將溶析液以每 I. OmL流份收集，並立即對 I. OL 之 I XPBS. pH 7. 2 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進行透析。分析EV71/E59-專一性單源抗體之Vh與\區域將使用購自Qiagen (Valencia, CA, USA)之RNea sy套組,從各融合瘤克隆萃取得的 RNA,以 Transcriptor High Fidelity cDNA 合成套組(Roche, IN,USA)中所提供的試劑進行反轉錄作用。將由各別融合瘤表現之K鏈互補決定區域(CDR)，使用前向引子5』-GGATAC AGT TGG TGC AGC ATC-3』 (SEQ ID NO 1)與簡併性反向引子 5』 -GAY ATT GTG MTSACM CAR WCT-3』 (SEQ ID NO 2)，以下列循環程序94°C下 I 分鐘，94°C下 I. 5 分鐘，50°C下2. 0分鐘，72°C下3. 0分鐘，72°C下I. 0分鐘，進行40次循環之聚合酶鏈反應(PCR)完成擴增。將得到的PCR產物以Be iVI限制酶(Fermentas，St Leon Rot，德國)處理，將衍生自NSI融合夥伴之變異的K鏈DNA進行消化。將經過消化之PCR產物於2.0%瓊脂糖凝膠(Sigma/Aldrich, St Louis, MO, USA)上進行電泳,使DNA片段分離。使用凝膠片段萃取套組(Geneaid,汝止市，中國臺灣)，將位於大約360bp之條帶萃取出，並寄送到MissionBioteck(中國臺灣，南港，臺北，中國臺灣)進行定序。VH之⑶Rs (重鏈的高可變區)鏈系使用含有9種簡併性正向引子，與單一種反向引子(5，-AGG GGC CAG TGG ATA GAC-3，；SEQ ID NO 3)進行擴增。該等正向引子為OVHl(5』-SAG GTC CAG CTG CAG CAG YYT GG_3』；SEQ ID NO :4)、0VH2(5』_CAG GTR CAG CTGAAG SAG TCA GG_3』；SEQ ID NO :5)、0VH3 (5』_GAK GTG CAG CTT CAG CAG TCR GG_3』；SEQ IDNO :6)、0VH5-1(5』 -GAV GTG AffG CTG GTG GAG TCT GA_3』；SEQ ID NO :7)、0VH5_2 (5』 -GAVGTG AffG CTG GTG GAG TCT GG-3』 ；SEQ ID NO :8)、OVHll (5』 -GAA GTG CAG CTG TTG GAGACT GG-3』；SEQ ID NO :9)、0VH14_1 (5』_GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GG_3』；SEQ ID NO:10)、0VH14-2(5，-GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GT_3，;SEQ ID NO :11)及 0VH15 (5，-CAGGTT CAC CTA CAA CAG TCT GG-3』 ；SEQ ID NO :12)。用於產生具有大約 300bp 之 DNA 片段的PCR程序設定如下92°C下3分鐘，92°C下I分鐘，68°C下30秒，72°C下I分鐘，72°C下10分鐘，進行25次循環。從2. 0%瓊脂糖凝膠萃取出所預期的PCR產物，並加以處理定序。
SDS-PAGE與西方轉潰分析將20微升經由BCA蛋白質分析(Pierce, Rockford, IL, USA)測定，含有0. 12u g總體蛋白質之經過蔗糖梯度純化、熱去活化(於85°C熱水中10分鐘)的EV71/E59病毒，與5. 0 ii L之5X濃縮加樣染料(Bionovas Biotech Co. ,Ltd.,多倫多,加拿大)混合,並於10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠,於I XTris-甘胺酸SDS-電泳緩衝液(Amersham Biosciences,Piscataway, NJ, USA)中進行電泳分析。使用 Mini Trans-Blot Cell (Biorad),將經電泳分離之病毒蛋白質轉移至PVDF膜(Biorad，Hercules，CA，USA)上。將含有蛋白質之膜於5. 0%配製於 PBS, pH 7. 2 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)之脫脂牛奶(安佳，紐西蘭)中進行封阻，清洗，然後置於 Mini-Protene II Multiscreen 裝置(Biorad,Hercules,CA，USA)中。將2. 0 ii g配製於分析緩衝液(I. 0%脫脂牛奶溶於PBS，pH7. 2)之各別測試單源抗體(N1、N3、N4或N6)加入反應室中。將膜以0. 5mL經I : 10，000稀釋(於分析緩衝液)之山辣根過氧化酶(HRP)-共軛的驢子抗-小鼠抗血清(Jackson Immuno-ResearchLab.，West Grove, PA，USA)處理。經過0. 5小時培育後，將膜清洗，置於衛生紙上印幹，然後將之化學發光受質(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)淹蓋於該膜上。將膜於X-光底片(柯達，Rochester，NY，USA)上曝光0. 5、I. 5及10分鐘，以偵測結合狀況。肽類合成由Kelowna國際科學公司(三重市，中國臺灣)合成總共57種，跨越具基因型C2之腸病毒71型單離株(命名為TW/2086/98)之全長VPl衣殼蛋白，相互重迭10個胺基酸的15-員肽類(表I)，用以分析可對抗EV71/E59之VPl衣殼蛋白的N1、N3、N4及N6單源抗體之細密專一性特徵。已藉由使用高效能液態層析術(HPLC)，將用於本研究之各別肽類純化至> 90%純度。表I列示用於分析NI、N3、N4及N6單源抗體之細密專一性特徵的15-員肽類。表I
權利要求
1.一種單源抗體，或其結合片段，其專一地與SEQ ID N0:55之多肽結合。
2.根據權利要求I所述的單源抗體，其為人源化抗體。
3.根據權利要求I所述的單源抗體，其為抗體片段。
4.一種與腸病毒(EV) 71型結合的單源抗體，或其結合片段，其包含 a)具有SEQID NO 70的胺基酸序列的重鏈互補決定區域I (⑶Rl)多肽，與具有SEQID NO 71的胺基酸序列的重鏈互補決定區域2 (⑶R2)多肽；及 b)具有SEQID NO 72或73的胺基酸序列的輕鏈CDRl多肽，具有SEQ IDNO 74或75的胺基酸序列的輕鏈CDR2多肽，與具有SEQ ID NO 76或77的胺基酸序列的輕鏈CDR3多肽。
5.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該結合片段包含一Fv片段。
6.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該結合片段包含一Fab片段。
7.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該抗體為一完全人類單源抗體。
8.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該抗體為一人源化單源抗體。
9.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該抗體或結合片段系中和具有基因型B的腸病毒71型。
10.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該抗體或結合片段包含具有SEQIDNO 82的胺基酸序列的重鏈多肽。
11.根據權利要求4所述的抗體或結合片段，其中該抗體或結合片段包含具有選自SEQID NO :78、79、80及81的胺基酸序列的輕鏈多肽。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的單源抗體或結合片段，其為經標定者。
13.根據權利要求I或4所述的抗體或結合片段，其中該抗體或結合片段與腸病毒衣殼蛋白VPl結合。
14.一種單離核酸，其包含編碼一包含SEQ ID NO :82的胺基酸序列的重鏈多肽的核苷酸序列。
15.一種單離核酸，其包含一編碼包含選自SEQ ID NO :78、79、80及81的胺基酸序列的輕鏈多肽的核苷酸序列。
16.一種宿主細胞，其包含根據權利要求14或15所述的單離核酸。
17.一種用於中和或保護對抗具有基因型B的腸病毒71型感染的組合物，其包含一種或一種以上根據權利要求1-11中任一項所述的單源抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。
18.—種組合物，其包含根據權利要求1-11中任一項所述的單源抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。
19.一種於活體外偵測腸病毒71型是否存在一生物樣本中的方法，其包含 a)將該樣本與根據權利要求18所述的組合物接觸'及 b)分析該抗體之結合以決定腸病毒71型的存在。
20.一種與腸病毒71型結合的單源抗體或其結合片段，其包含 a)一包含SEQ ID NO 82的胺基酸序列的重鏈多肽；及 b)一包含選自SEQ ID NO :78、79、80及81的胺基酸序列的輕鏈多肽。
全文摘要
本發明涉及與腸病毒(EV)71型結合的單源抗體，或其結合片段。本發明揭示保有腸病毒71型-結合能力的抗體，與此類抗體中仍保留腸病毒71型-結合能力的片段，完全人類抗體或人源化抗體，以及包含此等所揭示抗體的醫藥組成物。本發明亦揭示編碼本發明抗體的單離核酸，及經該等核酸轉染的宿主細胞。此外，本發明又揭示利用本發明抗體及核酸的預防、治療和診斷方法。
文檔編號A61K39/42GK102702348SQ20111015450
公開日2012年10月3日 申請日期2011年6月9日 優先權日2010年6月9日
發明者劉家齊, 莊再成, 張燻文, 謝鐸源 申請人:財團法人衛生研究院