銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中表達3α-羥基類固醇脫氫酶的DNA序列的製作方法

2023-10-05 12:36:49

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表達3α-羥基類固醇脫氫酶的DNA序列的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有3α-羥基類固醇脫氫酶（3α-hydroxysterioddehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽鏈的DNA序列，包括其互補鏈序列。其特徵在於，該DNA序列的表達產物具有3α-羥基類固醇脫氫酶活性，是一種新型的銅綠假單胞菌（ Pseudomonasaeruginosa ）3α-羥基類固醇脫氫酶。內容包括利用生物信息學分析獲得的銅綠假單胞菌3α-羥基類固醇脫氫酶基因序列；含有銅綠假單胞菌3α-羥基類固醇脫氫酶3-hsdA基因序列的重組表達載體；表達3α-羥基類固醇脫氫酶3-hsdA的基因工程菌；3α-羥基類固醇脫氫酶的酶促動力學參數。
【專利說明】銅綠假單胞菌(Aei/i/cV7/0/7aS 中表達3 Ct -輕 基類固醇脫氫酶的DNA序列

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種具有3α -輕基類固醇脫氫酶（3a -hydroxysteriod dehydrogenase，〗a -HSD)活性的多肽鏈的DNA序列，包括其互補鏈序列。其特徵在於， 該DNA序列的表達產物具有3 α -羥基類固醇脫氫酶活性，是一種新型的銅綠假單胞菌 (Aewt/offlmas aerwgifliosaWa-輕基類固醇脫氫酶。該蛋白的酶學性質為首次鑑定，具有 應用於磺酸化膽汁酸臨床檢測的實用性，屬於生物工程領域。

【背景技術】
[0002] 3 a -輕基類固醇脫氫酶（3 a-hydroxysteriod dehydrogenase，3 a-HSD)是廣 泛存在於哺乳動物細胞和原核細胞中的一類氧化還原酶。細菌3 a -HSD是膽汁酸（bile acids，BAs)、橫酸化膽汁酸（sulfated bile acids，SBAs)和雄留酮等物質定量分析中不可 缺少的酶試劑，具有較高的實用價值。
[0003] 磺酸化膽汁酸（sulfated bile acids, SBAs)是體內膽固醇代謝產物膽汁酸 (bile acids，BAs)的主要排洩形式之一。在正常生理情況下，體內95%的BAs經腸肝循環 (enterohepatic circulation)回到肝膽系統中，少量BAs會隨糞便和尿液排出體外。BAs 在體內會發生磺酸化作用形成SBAs，這是機體減低BAs的毒性作用和增加 BAs溶解性，以利 於BAs排洩的一種機制。研究表明，尿中的BAs主要是以磺酸化的形式存在。通常，健康人 尿液中SBAs的含量極低。當發生肝膽病變時，由於肝膽結構的破壞，大量BAs便會從肝膽 系統中漏出，從而造成尿中SBAs含量異常增高。目前，尿液中SBAs已經被建議作為肝膽疾 病早期診斷和治療監測的重要指標。在日本，尿中SBAs的含量已經成為肝膽功能評估、肝 癌（liver cancer)和肝硬化（hepatocirrhosis)診斷的重要指標。SBAs的定量檢測具有 很高的臨床應用價值。
[0004] 在SBAs的各種測定方法中，酶-比色測定法具有操作簡單、準確性較高、測試 時間短和設備成本較低等特點，是一種有潛在臨床應用價值的檢測方法。近年來，本實 驗室一直致力於開發滿足臨床應用需求的SBAs測定方法，先後將流動注射分析技術 (flow injection analysis，FIA)、固定化酶技術（immobilized enzyme)和化學發光法 (chemiluminescence)引入SBAs的酶法測定中，實現了對SBAs的自動分析測定，提高了測 定的靈敏度，並建立了一種新型的SBAs生物傳感器，開發了尿中SBAs測定試劑盒。這些分 析測定技術具有極大的臨床應用前景。但是，這些測定方法都需要昂貴的3α_羥基類固醇 脫氫酶（3 a -hydroxysteriod dehydrogenase, 3 a -HSD)。昂貴的酶試劑是影響這些 SBAs 檢測技術推廣應用的主要因素。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是開發一種新型3α_羥基類固醇脫氫酶，
【發明內容】
如下： 1.提供能產生一種新型銅綠假單胞菌aeiiifliosaWa-輕基類固醇脫 氫酶的基因序列信息（SEQ ID NO: 1 )。
[0006] 2.提供一種根據基因信息得到的銅綠假單胞菌aeragiflosa ) 3 α -羥基類固醇脫氫酶的胺基酸序列信息。
[0007] 3.含有銅綠假單胞菌aerwgifliosaW α -輕基類固醇脫氫酶基因的 DNA序列的重組表達載體。
[0008] 4.攜帶含有銅綠假單胞菌(Aewt/offioftas aerwgifliosaW α -輕基類固醇脫氫酶基 因的DNA序列的重組表達載體的大腸桿菌菌株。
[0009] 5.得到重組3 α -羥基類固醇脫氫酶的酶促反應動力學參數。
[0010] 本發明的各種特徵如下： 1.通過生物信息學分析發現銅綠假單胞菌Serwgifl(Osa)PAOl基因組中 第2356713 bp到2357573 bp鹼基基因序列（SEQ ID NO: 1)與已知的睪丸酮假單胞菌Gd. (WP_020684122. 1)序列的比對，發現具有51%的同源性，但是功能未 知。本研究通過基因工程技術克隆了該段基因；構建了含有該段基因的克隆載體和表達載 體；在原核大腸桿菌中進行了誘導表達，並對其酶學性質進行了研究，確認了該基因序列表 達的產物具有3 α -羥基類固醇脫氫酶活性。
[0011] 2.通過基因重組技術構建了包含特徵1所述的基因序列的重組表達載體，方法 為： Α.銅綠假單胞菌G01SeworOfflmas aerwgifliosa )，其3 α -輕基類固醇脫氫酶基因3-hsdA 原始克隆的大小為1134bp，其聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR)體系如 下：

【權利要求】
1?具有 3a-輕基類固醇脫氫酶（3a-hydroxysteriod dehydrogenase，3a-HSD)活 性的多肽鏈的DNA序列（SEQ ID NO: 1)，包括其互補鏈序列；其特徵在於，該DNA序列的 表達產物具有3a-羥基類固醇脫氫酶活性，是一種新型的銅綠假單胞菌 aerwgifliasa) 3 a -輕基類固醇脫氫酶。
2. 含有權利要求1所述的DNA序列的原核或真核細胞表達載體；其特徵在於，是一種 通過DNA重組技術獲得的含有權利要求1所述的DNA序列的原核或真核細胞表達載體。
3. 含有權利要求2所述的重組表達載體的宿主細胞；其特徵在於，是一種通過基因工 程技術獲得的含有權利要求2所述的表達載體的宿主細胞。
4. 通過基因工程技術生產的由權利要求1所述的DNA序列編碼的具有3 a -羥基類固 醇脫氫酶活性的蛋白產物。
5. 權利要求4所述的新型3 a -羥基類固醇脫氫酶在磺酸化膽汁酸檢測試劑盒等臨床 診斷產品中的應用開發。
【文檔編號】C12N15/53GK104388440SQ201410591668
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】高秀峰, 陳建敏, 李永生 申請人:四川大學