Sweepoviruses病毒實時螢光定量PCR檢測的通用引物、探針及其檢測方法與流程

2023-10-10 03:26:24

本發明涉及生物工程
技術領域：
中的病毒檢測方法，具體涉及一種sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測的通用引物、探針及其檢測方法和應用。
背景技術：
：菜豆金色花葉病毒屬(begomovirus)病毒屬於雙生病毒科(geminiviridae)，是一類重要的植物病毒。系統發育分析發現，侵染甘薯的begomovirus病毒明顯與其它植物的病毒處於不同的分支，具有較大差異，因此被稱為「sweepoviruses」。目前，侵染甘薯的sweepoviruses總共包括11個種，分別為：sweetpotatoleafcurlchinavirus(splccnv)、sweetpotatoleafcurlvirus(splcv)、sweetpotatoleafcurlgeorgiavirus(splcgv)、sweetpotatoleafcurlcanaryvirus(splccv)、sweetpotatoleafcurlsaopaulovirus(splcspv)、sweetpotatoleafcurlsouthcarolinavirus(splcscv)、sweetpotatoleafcurlugandavirus(splcuv)和sweetpotatomosaicvirus(spmv)、sweetpotatoleafcurlhenanvirus(splchnv)、sweetpotatoleafcurlsichuanvirus1(splcsiv1)、sweetpotatoleafcurlsichuanvirus2(splcsiv2)。研究表明，我國甘薯上的sweepoviruses至少有7個種，分別為：splccnv、splcv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2。sweepoviruses是侵染甘薯的一類重要病毒，一般可引起11-86％的產量損失，對甘薯生產危害很大。目前對sweepoviruses尚無特別有效的化學防治方法，對這類病毒的早期檢測和預警以及種植脫毒甘薯是防治sweepoviruses最有效的方法。在對病毒監測預警和培育脫毒甘薯的過程中，都需要對sweepoviruses病毒進行定量檢測，只有儘早發現病毒或種植經過嚴格檢測不含sweepoviruses病毒的種薯種苗才能有效控制病害的發生，否則會引起產量損失和病毒的流行和擴散蔓延。目前對sweepoviruses的檢測主要採用普通pcr方法，但普通的pcr方法不能對病毒進行定量分析，而且靈敏度較低，容易引起漏檢。實時螢光定量pcr(real-timefluorescentquantitativepcr)技術是一種新型核酸定性、定量技術，既有普通pcr靈敏快速的特點，又可實時監測，已應用於多種植物病毒的檢測。但是目前尚無sweepoviruses實時螢光定量pcr檢測方法的研究報導。技術實現要素：為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測的通用引物、探針及其檢測方法和應用。該方法能夠簡便、快速、靈敏的對sweepoviruses病毒進行定量檢測。為了實現上述目的，本發明所採用的技術方案是：一種sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測的通用引物及探針，所述的引物包括上遊引物spv-f和下遊引物spv-r，其中spv-f的序列為5』-ccctacactgggaatgctgt-3』，spv-r的序列為5』-tgtgggacatccatcttgaa-3』；所述的探針為spv-probe，spv-probe的序列為5』-fam-atacctaaggggtgtgtgggtccctgt-bhq-3』。一種利用所述的通用引物及探針的sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測方法，具體為，提取待測樣品的總dna，以總dna為模板，利用通用引物及探針進行實時螢光定量pcr擴增，根據擴增結果，判定樣品是否感染sweepoviruses病毒。所述的實時螢光定量pcr的反應體系為20μl，包括：premixextaq(probeqpcr)10μl、roxreferencedyeii0.4μl、10μmol/lspv-f0.4μl、10μmol/lspv-r0.4μl、10μmol/lspv-probe0.6μl、模板2μl，餘量為ddh2o。所述的實時螢光定量pcr的反應程序為：95℃預變性20s；95℃變性5s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40個循環。所述的實時螢光定量pcr擴增反應後，得到的實時螢光定量pcr的標準曲線為y＝3.261x+40.967，擴增效率為102.603％，相關係數為0.999。一種所述的通用引物及探針在檢測sweepoviruses病毒中的應用。一種所述的實時螢光定量pcr檢測方法在檢測sweepoviruses病毒中的應用。本發明的有益效果：1、本發明根據我國已報導的7種甘薯sweepoviruses病毒的核苷酸序列，通過序列比對，在其相對保守區域設計一對通用引物和一條探針，並通過一系列條件的優化，建立了檢測sweepoviruses病毒的實時螢光定量pcr檢測方法。該方法檢測的靈敏度高，最低可檢測到2×100copies/μl，比常規pcr方法高出100倍。且該方法的特異性好，能夠特異性檢測出sweepoviruses，而對spvg、spcsv等甘薯病毒則無法檢出。同時，該方法具有較好的重複性和穩定性。2、本發明建立了實時螢光定量pcr檢測方法的標準曲線，該標準曲線為y＝3.261x+40.967，斜率為-3.261，擴增效率為102.603％，相關係數為0.999；該方法只能檢測到目的病毒，能定量檢測單個拷貝數的病毒，可作為sweepoviruses病毒互作機制研究的高效工具，具有較高的實用價值。3、本發明的實時螢光定量pcr檢測方法可用于田間甘薯樣品和脫毒甘薯種苗的檢測，為加強sweepoviruses的早期監測預警和流行學研究以及脫毒甘薯質量檢測提供了技術手段，對sweepoviruses的防控具有重要意義。附圖說明圖1為sweepoviruses實時螢光定量pcr上下遊引物濃度篩選結果。其中，1-4分別為上下遊引物終濃度0.2μmol/l、0.1μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l，5為空白對照。圖2為sweepoviruses實時螢光定量pcr探針濃度篩選結果。其中，1-5分別為探針終濃度0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l，6為空白對照。圖3為sweepoviruses實時螢光定量pcr退火溫度的篩選結果。其中，a-d中的1分別為退火溫度49℃、53℃、58℃、61℃，2為空白對照。圖4為sweepoviruses實時螢光定量pcr擴增曲線。其中，1-10分別為模板濃度2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl、2×100copies/μl，11為空白對照。圖5為sweepoviruses實時螢光定量pcr標準曲線。圖6為sweepoviruses常規pcr靈敏度試驗結果。其中，m為dl2000，1-10分別為模板濃度2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl、2×100copies/μl，11為空白對照。圖7為sweepoviruses實時螢光定量pcr特異性檢測結果。其中，1和8為splcgv重組質粒；2和7為splcv重組質粒；3為spvg重組質粒；4為spcsv重組質粒；5為空白對照，6為splccnv重組質粒；9為splccv重組質粒；10為splchnv重組質粒；11為splcsiv1重組質粒；12為splcsiv2重組質粒；13為空白對照。具體實施方式以下結合實施例對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為本領域的常規方法，或按照製造廠商所建議的條件與實施步驟。實施例1、sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測方法的建立1材料與方法1.1材料重組質粒：含有splcgv(登錄號為：kj013563)、spcsv(登錄號為：kc888961)、spvg(登錄號為：eu218531)、splccnv(登錄號為：kj013576)、splcv(登錄號為：kj013555)、splccv(登錄號為：kx033435)、splchnv(登錄號為：kj476507)、splcsiv1(登錄號為：kj476511)、splcsiv2(登錄號為：kj013574)全長基因組的重組質粒由河南省農科院植保所生物技術研究室構建並保存。上述重組質粒中，含有spcsv和spvg重組質粒是含有該病毒的外殼蛋白(cp)基因，其它病毒的重組質粒均為含有該病毒的全長基因組序列，所有重組質粒的克隆載體均為pmd19-t。1.2主要儀器實時螢光定量pcr儀為abi公司的7500型，紫外分光光度計為美國ge公司所生產的產品。1.3sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測方法的建立1.3.1引物和探針的設計根據我國已報導的7種甘薯sweepoviruses病毒的核苷酸序列，通過序列比對，在其相對保守區域設計一對通用引物spv-f/spv-r和一條探針spv-probe，具體序列見表1。表1、引物和探針設計其中，f為上遊引物，r為下遊引物。1.3.2重組質粒標準品的製備選取含有splcgv全長基因組的重組質粒dna為模板，利用引物spv-f和spv-r進行普通pcr擴增，以此驗證所設計引物正確性。結果顯示，擴增片段約為155bp左右，與預期大小相符，所設計引物可以應用於實時螢光定量pcr。引物驗證正確後，將含有splcgv全長基因組序列的重組質粒轉化大腸桿菌tg1，以提取符合要求的陽性重組標準質粒。利用分光光度計對提取的含有splcgv全長基因組的重組質粒進行濃度測定，根據阿伏伽德羅常數將濃度轉化為拷貝數。結果顯示，所提取的重組質粒濃度為607ng/l，a260/a280比值為1.83，a260/a230比值為2.30，說明提取的質粒dna純度符合實時螢光定量pcr標準品要求。根據阿伏伽德羅常數，換算成拷貝數為2×1011copies/μl。同時吸取10μl加入90μlddh2o對重組質粒進行10倍稀釋。按照這個方法依次進行10倍稀釋，得到系列10倍濃度差的重組質粒dna(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11)，選取2×109-2×100copies/μl10個梯度差的重組質粒作為實時螢光定量pcr的標準品和普通pcr的模板。1.3.3反應體系和反應條件的優化1.3.3.1引物和探針濃度的優化選取含有splcgv全長基因組的重組質粒dna(10-5)為模板，對反應體系進行優化，篩選引物濃度和探針濃度。篩選時，擴增反應選擇premixextaqtm試劑盒(購自takara公司)中實時螢光定量pcr的標準體系，反應體系如下：採用單因素實驗來篩選引物和探針的最佳濃度，其中引物終濃度在0.1-0.4μmol/l的範圍以0.1μmol/l遞增設置4個濃度梯度，探針在0.1-0.5μmol/l以0.1μmol/l遞增設置5個濃度梯度。結果表明，當上下遊引物終濃度為0.2μmol/l(圖1、表2)，探針終濃度為0.3μmol/l(圖2、表3)時實時螢光定量pcr能夠檢測到最小ct值和較高的螢光強度增加值，此時即為最佳濃度。表2、sweepoviruses實時螢光定量pcr上下遊引物濃度篩選結果上下遊引物終濃度方法ct值0.1μmol/l絕對定量法16.81380.2μmol/l絕對定量法12.48330.3μmol/l絕對定量法19.270710.4μmol/l絕對定量法22.40567表3、sweepoviruses實時螢光定量pcr探針濃度篩選結果探針終濃度方法ct值0.1μmol/l絕對定量法23.169610.2μmol/l絕對定量法22.985640.3μmol/l絕對定量法22.867790.4μmol/l絕對定量法23.047020.5μmol/l絕對定量法23.01476經過優化後的擴增反應體系為：1.3.3.2退火溫度的優化獲得最佳反應體系後，對退火溫度進行優化，從49-61℃設置4個梯度處理，分別為49℃、53℃、58℃、61℃。採用三步法進行實時螢光定量pcr，即：階段1：(1個循環)95℃預變性20s階段2：(40個循環)95℃變性5s49-61℃設置4個梯度退火30s72℃延伸30s結果表明(圖3、表4)，在58℃時能夠檢測到最小ct值，此時為最佳退火溫度。表4、退火溫度的篩選結果退火溫度方法ct值49℃絕對定量法23.1696153℃絕對定量法22.9856458℃絕對定量法22.8677961℃絕對定量法23.04702經優化的反應程序為：95℃預變性20s；95℃變性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s並收集螢光，反應共40個循環。1.3.4標準曲線的建立分別以稀釋的10倍濃度梯度的標準質粒為模板，進行實時螢光定量pcr擴增。反應結束後，分別根據abi7500繪製的擴增曲線和標準曲線進行分析。結果表明，稀釋10倍濃度梯度的模板均出現了擴增曲線。且模板濃度越高，ct值越小，模板濃度越低，ct值越大(圖4)。根據實時螢光定量pcr儀自帶軟體繪製標準曲線，並進行數據分析，結果顯示：所建立的sweepoviruses標準曲線方程為：y＝3.261x+40.967，斜率為-3.261，擴增效率為102.603％，相關係數為0.999(圖5)。實施例2、sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測方法的驗證2.1靈敏度檢測將含有splcgv全長基因的重組質粒dna進行10倍梯度連續稀釋，以10倍連續濃度梯度(2×109-2×100copies/μl)的重組質粒為模板，同時進行常規pcr與實時螢光定量pcr擴增。反應結束後，分別根據abi7500繪製的擴增曲線和經瓊脂糖凝膠電泳分析的普通pcr結果進行靈敏度比較分析。普通pcr反應體系為：反應程序為：94℃預變性3mim；94℃變性3mim，58℃退火50s，72℃延伸30s，共35個循環；最後一個循環72℃補平10min。結果表明，所建立的實時螢光定量pcr在模板濃度稀釋至2×100copies/μl時仍有螢光曲線(圖4)，表明本發明建立的實時螢光定量pcr方法的檢測靈敏度可達2×100copies/μl。但普通pcr只能檢測到2×102copies/μl(圖6)，表明本發明所建立sweepoviruses實時螢光定量pcr的靈敏度比普通pcr高出100倍。2.2特異性檢測利用含有splcgv全長基因的重組質粒dna作為陽性對照，含有splccnv、splcv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2、spcsv和spvg基因組序列的重組質粒作為檢測對象，對所建立的實時螢光定量pcr方法的特異性進行檢測。結果表明，以重組質粒spvg、spcsv為模板的實時螢光定量pcr未出現擴增曲線，以splcv、splccnv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2為模板的實時螢光定量pcr出現擴增曲線。表明本發明建立的檢測方法可特異性檢測sweepoviruses，而對spvg、spcsv等甘薯病毒則無法檢出(圖7)。2.3重複性檢測從稀釋的10個濃度梯度中挑選5個連續梯度模板(2×108-2×104copies/μl)，分別做3個平行重複對照，分別進行實時螢光定量pcr反應，進行重複性試驗。結果顯示(表5)，其ct值得變異係數為0.52-1.54％。對相同的模板，以相同的反應條件分別在不同次的試驗中進行試驗間重複，結果顯示(表6)，其ct值得變異係數為0.54-1.28％。說明本發明建立的sweepoviruses實時螢光定量pcr方法的具有較好的重複性和穩定性。表5、實時螢光定量pcr方法檢測splcgv的試驗內重複結果表6、實時螢光定量pcr方法檢測splcgv的試驗間重複結果2.4實時螢光定量pcr產物的序列測定為驗證本發明所建立的sweepoviruses實時螢光定量pcr檢測方法所擴增到的產物為目的片段，隨機將部分實時螢光定量pcr擴增產物進行回收和序列測定。利用blast對所測序列與genbank中登錄的sweepoviruses病毒序列進行比較分析。結果表明，經實時螢光定量pcr擴增的核苷酸序列與genbank中登陸的所有sweepoviruses病毒的核苷酸序列一致性均在91％以上，說明擴增出的片段均為目的片段。2.5實時螢光定量pcr檢測方法的應用從田間採集15塊疑似感染雙生病毒的植株所結數塊，提取總dna作為模板，同時分別利用普通pcr和實時螢光定量pcr進行擴增，檢測薯塊帶毒情況。結果表明(表7)，15份樣品中sweepoviruses的檢出率為100％，與普通pcr結果一致。表7、2種檢測方法結果的比較以上所述僅為本發明最佳的實施例，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。sequencelisting河南省農業科學院植物保護研究所sweepoviruses病毒實時螢光定量pcr檢測的通用引物、探針及其檢測方法3patentinversion3.5120dna人工序列1ccctacactgggaatgctgt20220dna人工序列2tgtgggacatccatcttgaa20327dna人工序列3atacctaaggggtgtgtgggtccctgt27當前第1頁12