組氨酸-脯氨酸環二肽的液相合成法的製作方法

2023-10-10 18:51:59 1

專利名稱：組氨酸-脯氨酸環二肽的液相合成法的製作方法
技術領域：
本 發明屬生物化學領域，具體涉及一種活性肽類物質組氨酸-脯氨酸環二肽 (Cyclo (His-Pro)，簡稱CHP)的製備方法。
背景技術：
CHP為內源性環狀二肽，廣泛存在人及動物的體液和組織中，具有多方面的生物學 活性，包括對抗乙醇的麻醉、降溫及降低腦中cAMP水平的作用，對治療酒精依賴綜合症和 糖尿病有一定的作用。其體內合成由促甲狀腺素釋放激素(TRH)經焦穀氨酸氨肽酶水解， 脫去焦穀氨酸後環化而成。由於其結構中的組氨酸和脯氨酸都帶有雜環結構，形成環狀二 肽結構更為複雜，給體外合成CHP帶來很大的困難，本發明採用的液相法生產工藝可以提 供一種有效的體外合成方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種工藝簡化、成本降低、工時減少、操作安全的組氨酸-氨 酸環二液相合成方法。本發明是一種液相化學合成法，過程主要有氨基全保護的組氨酸的合成、線性二 肽的合成、環二肽合成等步驟。是以組氨酸為原料，通過二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得 到N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸；N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁 氧羰基-L-組氨酸與L-脯氨醯胺反應得到N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組 氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽；N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨 醯胺線性二肽經過脫保護環合反應得到組氨酸_脯氨酸環二肽。應用本專利所述方法，還 可以合成其它的線性二肽或環二肽。具體工藝步驟如下
(1)取15克 25克L-組氨酸懸浮於35 70毫升水中，然後加入70 140毫升的四 氫呋喃；在_5°C 5°C條件下，加入50 60克二碳酸二叔丁酯；然後在_5°C 5°C條件下， 以0. 10 0. 20ml/min的速度滴加35 70毫升的10% 20%碳酸鉀水溶液，邊滴加邊攪 拌，滴加完畢後繼續攪拌20 50分鐘；自然升溫至室溫，反應12 24小時；減壓去除四氫 呋喃，水相用40 80毫升乙醚提取兩次，然後用70 140毫升飽和硫酸氫鉀溶液調節pH =1 5 ；將此反應液用乙酸乙酯提取三次，合併提取液，加無水硫酸鎂乾燥，減壓除去乙酸 乙酯，即得到N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )_叔丁氧羰基-L-組氨酸白色粉末。(2)取30克 40克得到的N(im)-叔丁氧羰基_Ν( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸懸 浮於150 300毫升四氫呋喃中，加入15 25克N，N'-羰基二咪唑，攪拌使其全部溶解； 攪拌反應20 40分鐘後，在_5°C 5°C條件下加入10 20克的L-脯氨醯胺，加完後，繼 續攪拌20 50分鐘，自然升溫至室溫，反應12 24小時；減壓去除四氫呋喃，將水相用 40 80毫升乙酸乙酯提取五次，合併提取液，然後用0. 3% 0. 6% (ν/ν)的濃鹽酸/飽和 食鹽水溶液75毫升 150毫升洗滌五次，有機相中加無水硫酸鎂乾燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽粉末。(3)在帶有溫度計、pH電極、回流冷凝管、加熱攪拌裝置的容器中，將所得到的 N(im)-叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽分散於30毫 升 60毫升水中，升溫攪拌，在95°C 105°C條件下，滴加濃鹽酸調節pH = 3 7，保溫 反應10 20小時，HPLC監測原料消耗完畢後，加入活性炭0. 5克 5. 0克保溫攪拌1 3小時，然後熱過濾，減壓濃縮，甲醇溶解，分散於冰乙醚中，過濾後得到本專利所述的組氨 酸-脯氨酸環二肽產品。


圖1是本專利製備的組氨酸-脯氨酸環二肽的HPLC譜圖。具體的分析條件包括 進樣量為5微升；檢測時間為30min;檢測波長為220 nm ；色譜柱型號為Discovery C18 column (250X4. 6mm I. D.);流速為 1. 0 mL/min ；流動性 Buffer A 為 0. 10%TFA+H20 ；流動 相 Buffer B 為 0. 10%TFA+CH3CN ；梯度洗脫條件為 0. 1_50%B in 0-15 minutes。檢測結果 顯示CHP的保留時間在3. 67583min,峰高是1124. 59mV,峰面積為4388. 59mV. sec,面積百 分比為100%。具體的實施方式
實施例1 :N(im)_叔丁氧羰基-Ν( 叔丁氧羰基_L_組氨酸的合成 取19克L-組氨酸懸浮於56毫升水中，然後加入112毫升的四氫呋喃；在0°C條件下， 加入60克二碳酸二叔丁酯；然後在0°C條件下，以0. 15ml/min的速度滴加56毫升的13% 碳酸鉀水溶液，邊滴加邊攪拌，滴加完畢後繼續攪拌30分鐘，自然升溫至室溫，反應22小時 後，減壓去除四氫呋喃，水相用47毫升乙醚提取兩次，然後用119毫升飽和硫酸氫鉀溶液調 節pH = 1 2，將此反應液用乙酸乙酯47毫升提取三次，合併提取液，加無水硫酸鎂28克 乾燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )_叔丁氧羰基-L-組氨酸白色 粉末約36克。實施例2 =N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨醯胺線性 二肽的合成
取36克得到的N(im) -叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸懸浮於200毫升 四氫呋喃中，加入16克N，N』 -羰基二咪唑，攪拌使其全部溶解，攪拌反應30分鐘後，在0°C 條件下加入12克的L-脯氨醯胺，加完後，繼續攪拌30分鐘，自然升溫至室溫，反應20小時 後，減壓去除四氫呋喃，將水相用50毫升乙酸乙酯提取五次，合併提取液，然後用0. 5% (ν/ ν)的濃鹽酸/飽和食鹽水溶液100毫升洗滌五次，有機相中加無水硫酸鎂10克乾燥，減壓 除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨醯胺線 性二肽粉末約18克。實施例3 組氨酸_脯氨酸環二肽的合成
在帶有溫度計、PH電極、回流冷凝管、加熱攪拌裝置的容器中，將所得到的N(im)_叔丁 氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽分散於50毫升水中，升溫攪 拌，在100°C條件下，滴加濃鹽酸15. 8克保持pH = 6. 5，保溫反應16小時，HPLC監測原料 消耗完畢後，加入活性炭0. 5克保溫攪拌1小時，然後熱過濾，減壓濃縮，用50毫升甲醇溶 解，分散於500毫升冰乙醚中，過濾、乾燥後得到組氨酸-脯氨酸環二肽產品約15. 3克。
權利要求
1.組氨酸-脯氨酸環二肽的製備方法，其包括如下步驟(1)通過二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得到N(im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰 基-L-組氨酸；(2)N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸與L-脯氨醯胺反應得到 N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽；(3)N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽經過脫 保護、環合反應得到組氨酸-脯氨酸環二肽。
2.如權利要求1所述的組氨酸-脯氨酸環二肽的製備方法，其特徵在於取15克 25 克L-組氨酸懸浮於35 70毫升水中，然後加入70 140毫升的四氫呋喃；在_5°C 5°C 條件下，加入50 60克二碳酸二叔丁酯；然後在-5°C 5°C條件下，以0. 10 0. 20ml/min 的速度滴加35 70毫升的10% 20%碳酸鉀水溶液，邊滴加邊攪拌，滴加完畢，繼續攪拌 20 50分鐘；自然升溫至室溫，反應12 M小時；減壓去除四氫呋喃，水相用40 80毫 升乙醚提取兩次，然後用70 140毫升飽和硫酸氫鉀溶液調節pH = 1 5 ；將此反應液用 乙酸乙酯提取三次，合併提取液，加無水硫酸鎂乾燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔 丁氧羰基_N( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸白色粉末。
3.如權利要求1所述的組氨酸-脯氨酸環二肽的製備方法，其特徵在於取30克 40克得到的N(im)-叔丁氧羰基_Ν(α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸懸浮於150 300毫升四 氫呋喃中，加入15 25克N，N'-羰基二咪唑，攪拌使其全部溶解；攪拌反應20 40分鐘 後，在-5°C 5°C條件下加入10 20克的L-脯氨醯胺，加完後，繼續攪拌20 50分鐘， 自然升溫至室溫，反應12 M小時；減壓去除四氫呋喃，將水相用40 80毫升乙酸乙酯 提取五次，合併提取液，然後用0. 3% 0. 6% (ν/ν)的濃鹽酸/飽和食鹽水溶液75毫升 150毫升洗滌五次，有機相中加無水硫酸鎂乾燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到N(im)_叔丁氧 羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽粉末。
4.如權利要求1所述的組氨酸-脯氨酸環二肽的製備方法，其特徵在於將N(im)_叔 丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽分散於30毫升 60毫升 水中，升溫攪拌，在95°C 105°C條件下，滴加濃鹽酸調節pH = 3 7，保溫反應10 20小 時，HPLC監測原料消耗完畢後，加入活性炭0. 5克 5. 0克保溫攪拌1 3小時，然後熱過 濾，減壓濃縮，甲醇溶解，分散於冰乙醚中，過濾後得到組氨酸-脯氨酸環二肽產品。
全文摘要
本發明屬生物化學領域，具體涉及一種活性肽類物質組氨酸-脯氨酸環二肽(Cyclo(His-Pro)，簡稱CHP)的製備方法。過程主要有氨基全保護的組氨酸的合成、線性二肽的合成、環二肽合成等步驟。是以組氨酸為原料，包括二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸、N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸與L-脯氨醯胺反應得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽、N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨醯胺線性二肽經過脫保護環合反應得到組氨酸-脯氨酸環二肽等步驟。本發明所述方法具有簡化工藝、降低成本、減少工時、安全操作的優良效果，能夠製備高純度、高活性的組氨酸-脯氨酸環二肽產品。
文檔編號C07K5/12GK102093470SQ20101058191
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者李丹勝, 賴宏森, 趙春暉 申請人:大連伊美生物科技有限公司