一種檢測豬瘟病毒抗體的elisa方法及檢測試劑盒的製作方法
2023-10-10 11:48:54 1
一種檢測豬瘟病毒抗體的elisa方法及檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測豬瘟病毒抗體的ELISA方法，該方法將全長的豬瘟病毒（CSFV）Erns蛋白基因序列進行優化，建立一種豬瘟病毒Erns蛋白的真核表達系統—畢赤酵母表達系統，實現Erns蛋白的高效表達；利用表達的Erns蛋白作為抗原，通過ELISA條件優化建立一種大規模篩查豬瘟特異性抗體的ELISA血清學診斷方法。本發明還提供了用於上述檢測的ELISA試劑盒，該試劑盒具有良好的特異性、敏感性和重複性，能夠快速有效地對豬瘟病毒抗體進行檢測。本發明在很大程度上促進我國的豬瘟血清抗體監測的發展，並促進豬瘟分子標記疫苗的使用和推廣，推動我國的活豬和新鮮豬肉的出口貿易，具有良好的經濟效益和社會效應。
【專利說明】—種檢測豬瘟病毒抗體的ELISA方法及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體涉及檢測豬瘟病毒抗體的ELISA方法，本發明還涉及用於該檢測的ELISA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]Langedijk等研究發現，在CSFV的Ems蛋白上存在一處抗原表位，該表位具有鑑別診斷功能，位於Ems蛋白C末端191-227胺基酸處，它不僅能夠將CSFV、BVDV, BDV區分開來，而且在未來的新型疫苗(以E2為目的蛋白)應用中，能夠將疫苗免疫豬和野毒感染豬鑑別開，因此具有很好的應用前景。豬瘟病毒感染豬後能夠誘導產生針對Ems糖蛋白的抗體。Ems糖蛋白的分子解析能夠確定病毒感染後誘導產生的抗體，能夠幫助設計有效的診斷抗原和疫苗。Lin等將豬瘟病毒Alfort/187多聚蛋白胺基酸序列297到776之間做缺失分析，Alfort/187多聚蛋白包括Ems的C端(aa) 27-227，整個El蛋白(aa) 1-195和E2蛋白N端(aa)l-87。不同缺失的基因片段連接於原核表達載體pET30，在原核細胞中表達，通過WesternBlot方法檢測它們與豬瘟病毒感染豬血清的反應性，顯示Ems基因可以分為三個抗原區域:Ems(aa)65-145、Erns(aa)84-160和Ems(aa) 109-220。每一個獨立的區域或包含這3個區域的片段，都能跟豬瘟病毒感染豬血清很好的反應。儘管不同的瘟病毒株Ems基因內存在保守的或變異的區域，豬瘟病毒感染特異的血清學檢測和瘟病毒感染的普遍性檢測都能通過使用Ems基因某一片段或多個片段的組合應用。
[0003]當標記疫苗採用E2蛋白作為免疫原時，Erns蛋白可以作為配套的鑑別診斷試驗的抗原來檢測自然感染產生的抗體。最常用的檢測CSFV抗體的方法所用抗原多為CSFVE2蛋白或濃縮純化的細胞培養CSFV抗原，對於大多數比較成功的標記疫苗來說，這些方法大都不能作為配套的鑑別診斷實驗。到目前為止，作為診斷抗原的Ems(EO)蛋白都是由重組雞痘病毒、昆蟲細胞表達的或直接以合成肽的形式或用原核表達系統來表達的【1_7】，成本較高，且產量方面也受到一定限制。`
【發明內容】
[0004]針對上述不足，本發明提供一種檢測豬瘟病毒抗體的ELISA方法。
[0005]為實現上述目的，本發明首先提供Ems蛋白體外表達方法，包括如下步驟:人工合成SEQIDN0.1所示序列的基因並克隆到畢赤酵母表達載體中得到重組表達載體，將重組表達載體轉化畢赤酵母，篩選陽性克隆，培養並誘導表達，分離純化得到Ems蛋白。在本發明實例中所述畢赤酵母表達載體為PPIC9K，所述基因克隆到α因子信號肽序列下遊；所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。
[0006]進而本發明提供一種檢測豬瘟病毒抗體的ELISA方法，包括如下步驟:將上述方法製備的Ems蛋白作為抗原包被酶標板，將待測樣品經稀釋後加入酶標板溫育，加入酶標二抗溫育後顯色。
[0007]優選，所述抗原包被濃度為6.25 μ g/mL,包被條件為37°C，2h，再於4°C過夜。[0008]優選，待測樣品為血清，按1:100稀釋後加入酶標板，37°C溫育I小時。
[0009]優選，所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG，稀釋10000倍後加入酶標板，37 °C反應30min。
[0010]當被檢血清樣品的OD450≥0.38時，判為陽性；0D45Q < 0.33判為陰性，介於兩者之間的視為可疑，重檢。
[0011]本發明還提供一種豬瘟病毒ELISA檢測試劑盒，其包括包被上述方法製備的Ems蛋白的酶標板和選自以下試劑中的一種或多種:酶標二抗、稀釋液、顯色液、終止液、陽性標準品、陰性標準品。
[0012]本發明用酵母真核表達系統來表達豬瘟兔化弱毒株Ems蛋白並建立檢測Ems抗體的間接ELISA方法，為進一步開發診斷試劑盒和研究Erns蛋白的免疫學功能奠定基礎。另外，本發明研究發現酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關，本發明將豬瘟病毒(CSFV) Ems蛋白基因進行了改造，即選擇性地對密碼子的優化，並在片斷5』端加EcoRI酶切位點，3』端加NotI酶切位點，實現Ems蛋白的有效表達，具有較高的表達效率。
[0013]本發明採用巴斯德畢赤酵母高效表達具有生物學活性的Ems蛋白，其中，畢赤酵母真核表達系統具有原核表達系統或低級真核表達系統不具備的優勢:①畢赤酵母更接近高等真核細胞，不含內毒素和其他有害物質，使用安全；②同釀酒酵母一樣，繁殖速度快，對培養條件要求低,培養基價廉,能進行高密度培養,且能耐受較高的液體靜壓,便於工業化生產；③該系統的載體能與核基因組進行整合，因此構建的菌株較穩定，一般不會在傳代過程中出現丟失現象；④在畢赤酵母中表達的蛋白既可存在於胞內，又可在分泌信號作用下將蛋白分泌到胞外；⑤具有強有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOXl)或磷酸甘油酸脫氫酶(GAP)基因啟動子作為外源基因啟動子，可對外源蛋白的表達進行嚴格的調控；⑥作為真核表達系統，可對表達的外源蛋白進行翻譯後的加工和修飾，即二硫鍵的形成、脂肪的醯化、蛋白磷酸化、摺疊、信號序列加工、N糖基化、O糖基化，從而使目的蛋白具有所應有的生物學活性；⑦外源蛋白表達量高，同時自身分泌的背景蛋白少，表達產物易於純化；⑧和釀酒酵母相比，畢赤酵母中加到翻譯蛋白上的糖鏈長度平均每條側鏈為8-14個甘露糖殘基，比釀酒酵母每條側鏈平均50-150個甘露糖殘基短得多。畢赤酵母極少出現過度糖基化，可避免外源蛋白生產過強的免疫原性或因糖鏈過長幹擾外源蛋白正確摺疊而影響其功能，而且糖鏈中不含具有致敏作用的α-1，3-甘露糖，使其作用更加安全。
[0014]本發明使用的載體pPIC9K具有釀酒酵母a -factor分泌信號肽，在這個分泌信號的引導下，外源蛋白在內質網和高爾基體中經修飾和加工後能夠由胞內轉移至胞外，將成熟的蛋白質分泌到細胞外，以分泌方式表達外源蛋白。外源蛋白可佔培養物上清總蛋白的80%左右，更有利於目的蛋白的分離純化，此表達載體還具有pAOXl誘導型強啟動子，受甲醇的嚴格調控，可以有效的調控外源基因的表達，存在抑制/去抑制和誘導兩種調控機制:培養物中抑制物(如葡萄糖或甘油)去除後，並不能使基因大量轉錄，只有在甲醇誘導下，基因才能大量轉錄。
[0015]本方法獲得的陽性克隆表達量可達54mg/L。利用巴斯德畢氏酵母表達的Ems蛋白接近天然Ems蛋白，沒有出現過度糖基化，建立的間接ELISA反應表現出對Ems蛋白產生抗體的專一性和敏感性，這提供了一種更為低價豬瘟診斷試劑盒的方法。由此，可建立一種大規模篩查豬瘟特異性抗體的血清學ELISA診斷試驗，也為E2蛋白標記疫苗的推廣應用打下基礎。
[0016]本發明檢測試劑盒具有良好的特異性、敏感性和重複性，能夠快速有效地對豬瘟病毒抗體進行檢測。本發明在很大程度上促進我國的豬瘟血清抗體的監測的發展，並促進豬瘟分子標記疫苗的使用和推廣，推動我國的活豬和新鮮豬肉的出口貿易，具有良好的經濟效益和社會效應。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是重組載體pGM_T/Ems酶切鑑定圖，其中1_2為陽性克隆的質粒酶切條帶；M為 DL2000 分子量 marker。
[0018]圖2是重組分泌載體pPIC9K/Ems構建示意圖。
[0019]圖3是重組酵母基因組DNAPCR分析圖，其中1_6為重組酵母PCR結果；MSDL2000分子量marker。
[0020]圖4是重組酵母培養誘導上清SDS-PAGE電泳分析結果,其中1_2為重組酵母誘導上清液；3為空載體轉化子誘導上清液；4為GS115菌誘導上清；5為重組酵母誘導沉澱；Marker為SDS-PAGE低分子量標準蛋白質。
[0021]圖5是重組酵母Western-Blotting分析結果，其中M為SDS-PAGE低分子量標準蛋白質；1為重組酵母菌誘導沉澱；2，3為陽性重組酵母菌誘導上清。
[0022]圖6是Ems蛋白純化收集圖譜。
[0023]圖7是可溶性Ems蛋白純化後SDS-PAGE結果，其中M為SDS-PAGE低分子量標準蛋白質；1為陽性誘導菌純化後上清。
[0024]圖8是本發明ELISA方法構建的流程圖(圖8A、圖8B)。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用於進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。任何不背離本發明精神和實質下的修該或替換，均屬於本發明要求保護的範圍。
[0026]實施例1 Ems蛋白的體外表達及活性檢測
[0027]1.重組表達載體構建
[0028]1.1將豬瘟病毒(CSFV) Erns蛋白基因進行了改造，選擇性地對密碼子進行優化，並在片斷5』端加EcoRI酶切位點，3』端加NotI酶切位點。優化過的Ems全長序列如SEQIDN0.1所示,進一步通過人工合成得到所述序列。
[0029]1.2將人工合成得到的SEQIDN0.1與pGM_T質粒按照5:1的比例建立反應體系連接，然後將連接產物10 μ L輕輕加入到DH5 α感受態細胞中，輕輕轉動EP管以混勻內容物，冰上放置30min。42°C水浴熱激90sec後快速轉移至冰上，放置2~3min後加入800 μ LLB液體培養基，200rpm振搖45~60min，使菌體復甦並表達抗性基因。然後吸出IOOyL塗在Amp抗性的LB板上，培養16h~18h至平板上長出菌落。
[0030]使用限制性內切酶EcoR1、NotI雙酶切鑑定陽性克隆菌株的質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，分別出現片段條帶和質粒條帶，說明目的基因片段通過連接後整合進入克隆載體。(見圖1)。
[0031]1.3將含有Ems基因全編碼序列的pGMT/Ems進行進行EcoRI和NotI雙酶切，回收後插入到相同酶切的畢赤酵母分泌表達載體PPIC9K中，並位於α因子信號肽序列下遊，獲得重組質粒pPIC9K/Ems，構建過程(見圖2)
[0032]表達載體構建完成後，隨機挑取轉化子提取質粒進行0.8%瓊脂糖電泳，以陰性質粒作為對照，根據質粒電泳速度，初步判斷出插入目的片段的轉化子，陽性質粒遷移速度比陰性對照遷移速度慢，進而通過測序驗證陽性質粒目的片段的存在以及序列是否與設計序
列一致。
[0033]2.重組酵母構建
[0034]pPIC9K/Erns線性化轉化酵母GSl 15後塗布MD平板，從MD平板挑取60個酵母重組轉化子點種於含有l_6mg/mLG418的YPD平板上篩選多拷貝轉化子，在6mg/mLG418的YPD板上共獲得6個陽性高拷貝轉化子。根據酵母操作手冊，當轉化子是甲醇利用快型時，則引物P1、P2可擴增出兩條條帶，分別為2.2Kb和1174bp，當轉化子是甲醇利用慢型時，引物P1、P2隻能在1174bp處擴增出I條條帶。重組酵母的菌落PCR鑑定如圖3示，6個陽性轉化子均在1174bp處和2.2Kb處各有I條帶，將在1174bp處擴增出條帶的酵母進行MM平板篩選，點種在MM平板上的重組酵母全部不能夠正常生長，說明獲得的重組酵母全部為甲醇利用快型。[0035]Pl:5/ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'
[0036]P2:5/ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'
[0037]3.Erns蛋白的誘導表達及分離純化
[0038]3.1挑取篩選到的重組酵母接種於25mLBMGY培養基中，菌體生長16_18h後，即OD600在4時，轉入到IL的BMGY中繼續28_30°C培養，至OD6tltl在4左右，再轉入4LBMMY培養基中進行誘導表達，28~30°C、250rpm搖床連續培養，每24h加100%的甲醇至甲醇終濃度為0.5%~1%，每24h收集ImL菌液，直至最佳誘導時間出現為止。培養96h或144h後，12000rpm離心5min，將上清和沉澱分開放於_80°C冰箱，後續試驗備用。以電轉化時使用PPIC9K陰性質粒獲得的重組酵母作為陰性對照。分別處理上清和菌體後進行SDS-PAGE，結果樣品上清在約47-48KDa左右處有特異條帶，空載體轉化子誘導後的上清無此條帶，樣品沉澱進行蛋白電泳後只有微弱的特異條帶(見圖4)，說明重組蛋白主要以分泌的形式得到表達。
[0039]3.2Erns蛋白生物活性分析如圖5示:對重組酵母表達上清和空載體轉化的酵母進行SDS-PAGE和Western-Blotting，結果96h誘導上清在47_48KDa處出現特異性條帶，重組菌誘導沉澱只有很微弱的條帶出現，表明重組蛋白主要以分泌的形式進行表達，且用酵母表達系統使表達的目的蛋白具有天然的生物活性，為進一步研究Ems蛋白的特性奠定了紮實的基礎。
[0040]3.3利用CLCProtein Workbench Version5.1蛋白分析軟體對Erns蛋白進行分析，其Pl值為7.57，根據其等電點，將誘導表達96h上清經pH計調至所用交換柱要求的pH範圍內，0.22μηι過濾器過濾待純化。利用GE公司的AKTApurifierlOO層析儀對可溶性蛋白Erns進行離子交換層析，首先將Al管道放入緩衝液或平衡液中，將BI管道放入高鹽溶液中或洗脫液中進行泵清洗；然後選擇流速為lmL/min、輸入填料的耐受壓力為高耐受，待陰離子交換柱平衡好了(觀察電導COND，pH的數值和變化趨勢)即準備上樣；將Erns樣品約4~5mL吸進注射器，推掉氣泡，推入樣品環，用緩衝液儘量將穿透峰洗回基線後收集洗脫液，每管收集體積為ImL/管。觀察蛋白峰圖，記錄下蛋白達到峰值時的樣品管編號並儲存以備下一步檢測和利用。用Microcon超濾管YM-1O將純化後的Ems蛋白進行進一步濃縮。
[0041]使用Unicon5.20蛋白純化分析軟體對Ems進行了結果分析(圖6)，對洗脫峰後的兩個蛋白峰分別進行多管超濾濃縮後進行SDS-PAGE和Western-Blotting,結果顯示收集管為15~16兩管的蛋白為目的蛋白，在280nm蛋白吸收光下，此目的蛋白峰為486.915mAu，除了洗脫過程、蛋白處理過程和蛋白本身降解外，此得率說明蛋白純化純度和質量都不錯。更有利於下步ELISA的操作。
[0042]收集到的峰蛋白進行SDS-PAGE鑑定，目的蛋白條帶上有一條雜帶出現(圖7)，利用蛋白含量分析軟體BandScan version5.0對蛋白條帶進行了分析,結果顯示目的蛋白佔85.2%，可見純化效果比較好。
[0043]4.純化Ems蛋白濃度的測定
[0044]純化後Ems蛋白，經紫外分光光度計測定樣品在A260nm和A280 nm波長的光吸收值。Α280=1.038 ；Α260=1.801 代入公式蛋白質濃度(mg/mL) = (l.45XA280 —0.74XA260) X稀釋倍數，計算蛋白濃度為:17.24mg/mL。
[0045]用上述軟體並對其抗原性進行了分析，Erns是唯一可分泌到豬瘟病毒浸染細胞培養上清的糖蛋白。
[0046]Erns的抗原表位位於332-412位胺基酸、351-427位胺基酸和376-487位胺基酸三個重疊抗原區中。
[0047]實施例2豬瘟病毒抗體檢測ELISA方法的建立
[0048]1.豬瘟病毒抗體檢測ELISA方法的建立
[0049]使用方陣滴定的方法確定抗原Ems的最佳抗原包被濃度和待檢豬血清的稀釋度，同時確定最佳反應程序。以陽性、陰性血清孔OD值之比即P/N值作為指標，對包被抗原濃度、血清稀釋倍數、酶結合物最適工作濃度、各步反應時間等項目進行比較試驗，確定各項最適反應條件,將純化的重組Ems蛋白用0.025mol/L碳酸鹽緩衝液(pH9.6)稀釋至適當濃度，包被96孔酶標板，每孔加入50μ L經1:20,1:40、1:80、1:160、1:320、1:640倍比稀釋的純化重組抗原，每個稀釋度重複兩排，置溼盒中，37°C，4h後，再4°C包被過夜，用含 0.05%Tween-20 的 0.01mol/LPBS (pH7.4)的(PBST)洗滌 5 次，間隔 2min,期間振搖；以50g/L脫脂奶粉37°C封閉2h，同上步驟洗板；將豬瘟陽性和陰性血清分別用PBST進行1:25、1:50,1 =IOOU:200倍比稀釋，加入封閉後的酶標板，每孔50yL，用封口膜封閉，37°C感作60min，同上步驟洗板；將辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG以不同比例稀釋，每孔加入50μ L，37°C感作30min,同上洗板；加入50 μ L底物液(TMB)，避光顯色15~30min，最後加Λ 50 μ L終止液(2mol/LH2S04)終止反應，用酶標儀檢測OD450,計算陽性血清孔的平均OD450值(P)和陰性血清孔的平均OD45tl值(N)之比(P/N)。
[0050]利用方陣滴定法對抗原包被濃度、血清稀釋濃度、酶標二抗工作濃度等ELISA參數進行優化。結果抗原稀釋在1:40和抗體稀釋在1:100時P/N值相對最大，且陰性血清的非特異性反應不明顯，所以選擇抗原作1:40，血清1:100為最佳稀釋度。此時抗原的最佳包被濃度為6.25 μ g/mL。(當用此抗原包被濃度和血清稀釋度時，經過幾次試驗驗證，標準陰性血清的OD45tl值< 0.10，標準陽性血清的OD450值≥0.7)。
[0051]根據抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋度的確定結果，將純化抗原和CSFV陽性血清分別作最佳稀釋後進行ELISA操作，酶標抗體分別作1:8000，1:1OOOO，1: 15000，1:20000四個稀釋度進行ELISA試驗，測其OD45tl值並計算P/N。通過OD45tl值下降幅度及ELISA判定標準，認為二抗濃度均作10000倍稀釋最佳。
[0052]用重組蛋白Ems以其最佳抗原包被濃度條件下包被ELISA反應板，37°C，2h，再4°C過夜，將血清及其酶標二抗都作最佳稀釋倍數，分別在37°C下反應1.5h，lh,40min,30min,進行ELISA測定，測定OD45tl值並求其P/N值，以確定血清和酶標二抗的最佳反應時間，通過試驗最終確定一抗結合時間為Ih, 二抗結合時間為30min。
[0053]對50份陰性血清進行間接ELISA檢測，按照已經確定的ELISA程序進行測定，讀出OD45tl值，進行樣本OD45tl值平均值(X)、標準方差(S.D)的計算。計算出50份血清的OD450的平均值和標準方差S.D，確定陽性血清臨界值為0.37，陰性血清臨界值為0.33，即當被檢血清樣品的OD45tl≥0.37時，判為陽性；0D45(i < 0.33判為陰性，介於兩者之間的視為可疑，
需要重檢。
[0054]2.豬瘟病毒抗體檢測ELISA方法的特異性
[0055]建立的Ems-ELISA檢測豬瘟陽性血清、豬瘟陰性血清、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)陽性血清、豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清、口蹄疫病毒(FMDV)陽性血清、豬傳染性胸膜肺炎陽性血清(TGEV)、副豬嗜血桿菌病陽性血清(HPS )、豬圓環病毒-2型(PCV-2 )陽性血清、豬細小病毒(PPV)陽性血清，結果顯示被檢血清的OD45tl值均低於0.30，均為陰性，表明該ELISA法具有良好的特異性。見表1。
[0056]表1豬瘟抗體間接ELISA交叉特異性檢測結果
[0057]
【權利要求】
1.Erns蛋白體外表達方法，包括如下步驟:人工合成SEQIDN0.1所示序列的基因並克隆到畢赤酵母表達載體中得到重組表達載體，將重組表達載體轉化畢赤酵母，篩選陽性克隆，培養並誘導表達，分離純化得到Ems蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述畢赤酵母表達載體為PPIC9K，此表達載體具有pAOXl誘導型強啟動子，所述基因克隆到α因子信號肽序列下遊。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。
4.一種檢測豬瘟病毒抗體的ELISA方法，包括如下步驟:將權利要求1~3任一項所述方法製備的Ems蛋白作為抗原包被酶標板，將待測血清樣品經稀釋後加入酶標板溫育，加入酶標二抗溫育後顯色，測定反應後血清樣品OD450值。
5.根據權利要求4所述的ELISA方法，其特徵在於，所述抗原包被濃度量為6.25 μ g/mL，包被條件為37°C，2h，再於4°C過夜。
6.根據權利要求4或5所述的ELISA方法，其特徵在於，待測樣品為血清，按1:100稀釋後加入酶標板，37 C溫育I小時。
7.根據權利要求4或5所述的ELISA方法，其特徵在於，所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG，稀釋10000倍後加入酶標板，37°C反應30min。
8.根據權利要求4或5所述的ELISA方法，其特徵在於，當被檢血清樣品的OD45tlS0.38時，判為陽性；0D45(i < 0.33判為陰性，介於兩者之間的視為可疑，重檢。
9.豬瘟病毒ELISA檢測試劑盒，其包括包被權利要求1~3任一項所述方法製備的Ems蛋白的酶標板和選自以下試劑中的一種或多種:酶標二抗、稀釋液、顯色液、終止液、陽性標準品、陰性標準品。`
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於，Ems蛋白包被濃度為6.25μ g/mL，包被條件為37°C，包被2h，再於4°C過夜。
【文檔編號】C12N15/81GK103882051SQ201410104452
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2014年3月20日
【發明者】孫惠玲, 劉彥, 白佳樺, 許曉玲, 馮濤, 李桂萍, 張平 申請人:北京市農林科學院