一種鐵皮石斛組培苗的培養方法

2023-10-10 10:41:34 1

一種鐵皮石斛組培苗的培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，屬於植物組織培養【技術領域】。本發明的步驟為：步驟一、種子的誘發及培養，選取鐵皮石斛果莢作為外植體，將果莢內的種子散播在外植體誘導培養基上，誘導種子萌發形成胚芽；步驟二、胚芽增殖繼代培養，將胚芽轉接於增殖繼代培養基上進行培養，將增殖繼代培養基放在培養室中，培養得到鐵皮石斛幼苗；步驟三、生根苗的培養，將鐵皮石斛幼苗轉入到生根培養基上，對其進行培養，培養得到鐵皮石斛壯苗；步驟四、移栽，將生根培養後的鐵皮石斛壯苗進行煉苗後移栽。本發明解決了傳統的鐵皮石斛的培養方法所帶來的生根緩慢、成活率不高的問題，為大規模培育出優質鐵皮石斛苗提供便利。
【專利說明】一種鐵皮石斛組培苗的培養方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物組織培養【技術領域】，更具體地說，涉及一種鐵皮石斛組培苗的培 養方法。

【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛為多年生草本，屬附生蘭類，俗名鐵皮楓鬥，因其老莖外呈黑色，又名為 黑節草，石斛是常用的名貴中藥，應用歷史悠久，在《神農本草經》中被列為上品，現已證實 它具有滋陰清熱、生津益胃、止咳潤肺、潤喉明目、提高人體免疫功能、防治腫瘤和心血管疾 病以及改善睡眠、防治白內障、延年益壽等功效。但由於生長環境特殊和分布局限，以及長 期採挖，自然資源日趨枯竭，已被國家列為重點保護的野生藥材並鼓勵人工大面積栽培鐵 皮石斛。
[0003] 植物組織培養作為一種有效的技術手段已被廣泛應用於生產實踐的各個領域。傳 統的鐵皮石斛的培育主要是通過扦插、分株的方式，但其繁殖率較低，生根緩慢，生長周期 長。為了滿足市場的需求，國內外許多科研人員進行了鐵皮石斛組織培養技術的研究，期望 能進行批量生產並提高種苗的繁殖係數及移栽成活率，這是目前亟待解決的問題。而要提 高種苗的移栽成活率，用於組織培養的培養基配方至關重要。
[0004] 通過專利檢索，關於鐵皮石斛組織培養技術的技術方案，已有相關技術方案公開。 如中國專利申請號201310173395. 0,申請日為：2013. 05. 13,發明創造名稱為：一種鐵皮石 斛組培苗方法，該申請案公開了一種鐵皮石斛組培苗方法，包括如下操作步驟：製作鐵皮石 斛組培苗的培養基，按下列質量配比裝入容器中，然後燒開，經過灌裝機將培養基灌入組培 瓶中，殺菌消毒，1000?1500克香蕉攪拌成糊狀，白糖200?300克，硫酸亞鐵90?105 毫升，硝酸銨25?33克，硝酸鉀35?40克，硫酸鎂5?8克，甘氨酸8?12毫升，維生素 B11?3暈升，B21?3各暈升，糖胺基酸20?30暈升，萘乙酸20?30暈升，自來水1000 毫升；用成熟鐵皮石斛種子的花粉播種在上述培養基上，經過3個月後母苗長出。
[0005] 又如，中國專利申請號201210102034. 2,申請日為：2012. 03. 31，發明創造名稱 為：一種鐵皮石斛無激素組織培養的方法，該申請案公開了一種鐵皮石斛無激素組織培養 的方法，該方法包括鐵皮石斛種子萌發為圓球莖，圓球莖的生長，增殖分化，莖段的生根、壯 苗四個組織培養階段，這四個階段所用的培養基依次為：無激素的MS培養基、無激素的MS 基本培養基+ 土豆泥15?20g/L培養基、無激素的MS基本培養基+香蕉泥15?20g/L+ 土豆泥15?20g/L培養基和無激素的1/2MS基本培養基+香蕉泥15?20g/L+ 土豆泥 15?20g/L培養基。上述兩個申請案中：中國專利申請號201310173395.0公開的技術方 案是用成熟鐵皮石斛種子的花粉播種在上述培養基上，經過3個月後母苗長出，然後人工 接種分苗，這種培養方式在實際應用中無法保證成活率，推廣應用難度大。中國專利申請號 201210102034. 2公開的技術方案主要是採用了無激素組織培養技術，但是其培養基的配方 不盡合理，需要進一步改進。


【發明內容】

[0006] 1.發明要解決的技術問題
[0007] 本發明的目的在於克服現有技術中鐵皮石斛組培苗培養技術的不足，提供了一種 鐵皮石斛組培苗的培養方法，採用本發明的技術方案，能夠提高鐵皮石斛組培苗的繁殖系 數及移栽成活率。
[0008] 2?技術方案
[0009] 為達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0010] 本發明的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其步驟為：
[0011] 步驟一、種子的誘發及培養
[0012] 選取鐵皮石斛果莢作為外植體，用無菌刀切開鐵皮石斛果莢，將果莢內的種子散 播在外植體誘導培養基上，誘導種子萌發，將外植體誘導培養基置於培養架上，培養溫度為 23?25°C，光照時間為12小時/天，光照強度1500LX條件下培養30?45天，種子萌發形 成胚芽；
[0013] 步驟二、胚芽增殖繼代培養
[0014] 將步驟一中形成的胚芽轉接於增殖繼代培養基上進行培養，將增殖繼代培養基放 在培養室中，培養溫度為23?25°C，光照時間為12小時/天，光照強度1800?2000LX條 件下培養80?90天，得到鐵皮石斛幼苗；
[0015] 步驟三、生根苗的培養
[0016] 將步驟二中得到的鐵皮石斛幼苗轉入到生根培養基上，對其進行培養，培養溫度 為25?26°C，光照時間為12小時/天，光照強度1800?2000LX條件下培養100?120 天，得到鐵皮石斛壯苗；
[0017] 步驟四、移栽
[0018] 將步驟三進行生根培養後的鐵皮石斛壯苗進行煉苗後移栽。
[0019] 更進一步地，步驟一中的外植體誘導培養基以MS培養基作為基本培養基，在基本 培養基中添加瓊脂5?9g/L，白糖28?30g/L，活性炭0? 5?0? 6g/L，香蕉65?75g/L， 自製有機液肥1. 5?2g/L，滅菌劑1. 5?2. 5ml/L，外植體誘導培養基的pH為5. 4?5. 8， 對上述的外植體誘導培養基進行滅菌操作，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時間為10? 40min〇
[0020] 更進一步地，步驟二中的增殖繼代培養基以MS培養基作為基本培養基，在基本培 養基中添加瓊脂5?9g/L，白糖30?32g/L，活性炭0? 48?0? 5g/L，香蕉45?50g/L，滅 菌劑1. 5?2. 5ml/L，增殖繼代培養基的pH為5. 4?5. 8,對上述的增殖繼代培養基進行滅 菌操作，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時間為10?40min。
[0021] 更進一步地，步驟三中的生根培養基以自制母液作為基本培養基，在基本培養基 中添加瓊脂5?9g/L，白糖20?22g/L，活性炭0? 5?0? 55g/L，香蕉50?55g/L，自製天 然有機液肥1. 5?1. 8g/L，滅菌劑1. 5?2. 5ml/L，生根培養基的pH為5. 4?5. 8,對上述 的生根培養基進行滅菌操作，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時間為10?40min。
[0022] 更進一步地，所述的外植體誘導培養基和生根培養基中添加的自製天然有機液肥 配方相同，該自製天然有機液肥的配方具體如下：生麩3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、 水50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、紅糖6000g、海帶3000g、五花肉500g、魚骨 粉500g、雞蛋6個。
[0023] 更進一步地，所述的生根培養基中的自製母液的配方具體為：硫酸銨0. 46g/L、氯 化鈣〇? 17g/L、肌醇0? lg/L、硝酸鉀2. 83g/L、硫酸亞鐵0? 03g/L、1-萘乙酸2mg/L、磷酸二氫 鉀 0. 4g/L、硫酸鎂 0. 19g/L。
[0024] 3?有益效果
[0025] 採用本發明提供的技術方案，與現有技術相比，具有如下顯著效果：
[0026] (1)本發明的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，通過在鐵皮石斛組織培養各階段 採用特定的天然有機物用量和培養基對其進行培養，解決了傳統的鐵皮石斛的培養方法所 帶來的生根緩慢、成活率不高的問題，所培育出的鐵皮石斛組培苗較未添加天然有機物的 培養基培育出的苗株粗度、高度、葉片數均有增加且對根系有良好的促進作用，使鐵皮石斛 的組培苗繁殖得到有效地提高，進而促進鐵皮石斛的產業化生產。
[0027] (2)本發明的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其操作簡便，生產周期短，種苗成 活率高，培養基配置方便，營養豐富，且培養條件簡單，便於管理，為大規模培育出優質鐵皮 石斛苗提供便利。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例對本發明進行詳細的描述，但它們不是對本發明的進一步限制。
[0029] 實施例1
[0030] 本實施例的一種鐵皮石斛組培苗培養基，該培養基包括外植體誘導培養基、增殖 繼代培養基和生根培養基，其中：所述的外植體誘導培養基用於散播鐵皮石斛果莢內的種 子，誘導種子萌發形成胚芽；所述的胚芽增殖繼代培養用於轉接胚芽並進行培養，得到鐵皮 石斛幼苗；所述的生根培養基用於轉入鐵皮石斛幼苗並進行培養，得到鐵皮石斛壯苗。
[0031] 具體在本實施例中，外植體誘導培養基、增殖繼代培養基和生根培養基具體如下： 外植體誘導培養基以MS培養基作為基本培養基，在基本培養基中添加瓊脂5. 5g/L，白糖 3〇g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉67g/L，自製有機液肥2g/L，滅菌劑2. 5ml/L。本實施例中外植 體誘導培養基的製備過程具體如下：（1)、根據MS培養基的成分及用量稱取藥品，使其充分 溶解，並按相應濃度依次取用。（2)、在MS培養基中按所需來加入各類物質，其分別為：瓊 脂5. 5g/L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉67g/L，自製有機液肥2g/L，滅菌劑2. 5ml/L，其 中：本實施例中的香蕉是指香蕉泥，該香蕉泥是將香蕉去皮，稱重後放於料理機中加水打成 香蕉泥；在MS培養基中加入各類物質的具體過程為：蒸餾水加熱燒開，取蒸餾水溶解白糖 後，加入瓊脂並攪拌，待其完全熔化，將活性炭、香蕉泥、自製有機液肥、滅菌劑、基本培養基 一齊加入，用pH試紙測pH值，並用0. lmol/L的NaOH或HCI調節pH值為5. 8,最後加水定 容至所需體積。（3)、將配好的外植體誘導培養基灌裝於培養瓶中，然後用瓶蓋封口，放入高 壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時間為10?40min均可，將滅過菌 好的培養基置於冷凝室，觀察無汙染後即可用於接種。本實施例中的外植體誘導培養基中 沒有添加植物生長調節劑，目的就是要改善細胞和組織增殖與分化的環境，本實施例中的 外植體誘導培養基採用天然的香蕉泥和特定的自製有機液肥能夠促進細胞和組織的增殖 與分化，既安全又環保。作為本發明中關鍵的技術改進，本實施例中自製有機液肥中的微量 元素多樣，能夠更均衡的利於植物生長，為提高鐵皮石斛組培苗的繁殖係數及移栽成活率 提供了保證。此外，白糖為細胞呼吸代謝提供底物和能量，它比葡萄糖價格便宜得多，節約 成本。
[0032] 本實施例中的增殖繼代培養基以MS培養基作為基本培養基，在基本培養基中添 加瓊脂6g/L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，滅菌劑2. 5ml/L。本實施例中增殖繼代 培養基的製備過程具體如下：（1)、根據MS培養基的成分及用量稱取藥品，使其充分溶解， 並按相應濃度依次取用。（2)、在MS培養基中按所需來加入各類物質，其分別為：瓊脂6g/ L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，滅菌劑2. 5ml/L，其中：本實施例中的香蕉是指香 蕉泥，該香蕉泥是將香蕉去皮，稱重後放於料理機中加水打成香蕉泥；在MS培養基中加入 各類物質的具體過程為：蒸餾水加熱燒開，取蒸餾水溶解白糖後，加入瓊脂並攪拌，待其完 全熔化，將活性炭、香蕉泥、滅菌劑、基本培養基一齊加入，用pH試紙測pH值，並用0. lmol/ L的NaOH或HCI調節pH值為5. 8,最後加水定容至所需體積。（3)、將配好的增殖繼代培 養基灌裝於培養瓶中，然後用瓶蓋封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，其滅菌溫度為120? 126°C，滅菌時間為10?40min均可，將滅過菌好的培養基置於冷凝室，觀察無汙染後即可 用於接種。本實施例中的增殖繼代培養基沒有添加植物生長調節劑，而用天然的香蕉泥作 為營養成分，採用本實施例特定的增殖繼代培養基，能夠在沒有植物生長調節劑的情況下 保證鐵皮石斛組培苗的培養過程。此外，本實施例中增殖繼代培養基添加活性炭用於吸附 培養過程中產生的部分有毒物質，且增加通氣度，利於髮根。
[0033] 本實施例中的生根培養基以自制母液作為基本培養基，在基本培養基中添加瓊脂 6g/L，白糖20g/L，活性炭0? 5g/L，香蕉50g/L，自製天然有機液肥1. 5g/L，滅菌劑2. 5ml/ L。本實施例中生根培養基的製備過程具體如下：（1)、根據自製母液的成分及用量稱取各組 分，使其充分溶解，並按相應濃度依次取用。（2)、在自製母液中按所需來加入各類物質，其 分別為：瓊脂6g/L，白糖20g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，自製天然有機液肥1. 5g/L，滅 菌劑2. 5ml/L，其中：本實施例中的香蕉是指香蕉泥，該香蕉泥是將香蕉去皮，稱重後放於 料理機中加水打成香蕉泥；在自製母液中加入各類物質的具體過程為：蒸餾水加熱燒開， 取蒸餾水溶解白糖後，加入瓊脂並攪拌，待其完全熔化，將活性炭、香蕉泥、自製天然有機液 月巴、滅菌劑、基本培養基一齊加入，用pH試紙測pH值，並用0. lmol/L的NaOH或HCI調節pH 值為5. 8,最後加水定容至所需體積。（3)、將配好的生根培養基灌裝於培養瓶中，然後用瓶 蓋封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時間為10?40min 均可，將滅過菌好的培養基置於冷凝室，觀察無汙染後即可用於接種。本實施例中生根培養 基中添加的香蕉泥對根系有良好的促進作用，且通過其它特定的組分作為配合，利用本發 明特定的生根培養基配方能夠顯著促進根系生長，尤其是其中的自製天然有機液肥為後續 對成活率的保證起到了關鍵作用。此外，本實施例通過添加滅菌劑，降低了汙染率。
[0034] 關於本實施例中自製天然有機液肥具體說明如下，外植體誘導培養基和生根培 養基中添加的自製天然有機液肥配方相同，該自製天然有機液肥的配方具體如下：生麩 3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、水50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、紅糖 6000g、海帶3000g、五花肉500g、魚骨粉500g、雞蛋6個。本實施例中自製天然有機液肥的 製作過程為：(a)將海帶曬乾後打成粉；(b)按照上述配方將所有物料全部倒入肥桶混合攪 拌並密閉封存，其中：本實施例中的米糠為細米糠，生麩由豆餅和花生麩組成，且豆餅：花 生麩=1:1 (質量比），乳酸菌即為酸牛奶；（c)每日早晚各攪拌一次，具體可以是早上8:00 和晚上18:00各攪拌一次；(d)待50?60天後發酵腐熟，無臭味，即可使用。本實施例配置 的特定自製天然有機液肥由八十幾種天然微量元素含鈣、鎂、硫、銅、鐵、鑰、錳、鋁、硼、鋅、 鉛、鉀、鈉、磷、維生素B1、維生素C、葉綠素、胡蘿蔔素等組成。發明人經過十餘年的研究發 現，採用這種自製天然有機液肥能夠用於植物生長期使用，補充植物生長階段所需的營養 元素，使其得到均衡的養分，更全面的促進生長，並提高植物抗病能力，以此改善組培苗的 質量，促進根系與葉片的生長，提高了移栽成活率，這是本發明能夠實現的關鍵所在。
[0035]關於本實施例中自製母液具體說明如下，自製母液的配方具體為：硫酸銨0. 46g/ L、氯化鈣0? 17g/L、肌醇0? lg/L、硝酸鉀2. 83g/L、硫酸亞鐵0? 03g/L、1-萘乙酸2mg/L、磷酸 二氫鉀0. 4g/L、硫酸鎂0. 19g/L。本實施例在生根培養基沒有採用MS培養基作為基本培養 基，而採用自製母液作為基本培養基是本發明的關鍵所在。本實施例中的自製母液中添加 的1-萘乙酸可以用於誘導不定根的生長，且植物在不同的生長發育階段對無機鹽的需求 不同，故按此比例自製母液能夠滿足不同的生長發育階段對無機鹽的需求。本實施例採用 自製母液提高了鐵皮石斛組培苗的品質及種苗移栽成活率，從而解決鐵皮石斛產業化生產 中的關鍵技術難點。
[0036] 採用本實施例的鐵皮石斛組培苗培養基進行培養，鐵皮石斛組培苗的培養方法具 體步驟為：
[0037]步驟一、種子的誘發及培養：選取顆粒飽滿、無病蟲害的鐵皮石斛果莢作為外植 體，在超淨工作檯上對其進行初步修剪，用75%乙醇溶液衝洗3遍，再用95%乙醇溶液衝洗 1遍，濾幹水分。用無菌刀切開鐵皮石斛果莢，將果莢內的種子散播在外植體誘導培養基上， 誘導種子萌發，將外植體誘導培養基置於培養架上，培養溫度為23?25°C均可，光照時間 為12小時/天，光照強度1500LX條件下培養30?45天，種子萌發形成胚芽；
[0038]步驟二、胚芽增殖繼代培養：將步驟一中形成的胚芽轉接於增殖繼代培養基上進 行培養，將增殖繼代培養基放在培養室中，培養溫度為23?25°C均可，光照時間為12小時 /天，光照強度1800?2000LX條件下培養80?90天，得到鐵皮石斛幼苗；
[0039]步驟三、生根苗的培養：將步驟二中得到的鐵皮石斛幼苗轉入到生根培養基上，對 其進行培養，培養溫度為25?26°C均可，光照時間為12小時/天，光照強度1800?2000Lx 條件下培養1〇〇?120天，得到鐵皮石斛壯苗；
[0040] 步驟四、移栽：將步驟三進行生根培養後的鐵皮石斛壯苗進行煉苗後移栽。
[0041] 本實施例培養的鐵皮石斛組培苗具體情況見表1，由此可以證明本實施例通過向 鐵皮石斛組培苗的培養基中添加天然有機物，以此改善組培苗的質量，促進根系與葉片的 生長，提高了鐵皮石斛組培苗的品質及種苗移栽成活率，從而解決鐵皮石斛產業化生產中 的關鍵技術難點。
[0042] 表1實施例1-3的鐵皮石斛組培苗具體情況
[0043]

【權利要求】
1. 一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其特徵在於，其步驟為： 步驟一、種子的誘發及培養 選取鐵皮石斛果莢作為外植體，用無菌刀切開鐵皮石斛果莢，將果莢內的種子散播 在外植體誘導培養基上，誘導種子萌發，將外植體誘導培養基置於培養架上，培養溫度為 23?25°C，光照時間為12小時/天，光照強度1500LX條件下培養30?45天，種子萌發形 成胚芽； 步驟二、胚芽增殖繼代培養 將步驟一中形成的胚芽轉接於增殖繼代培養基上進行培養，將增殖繼代培養基放在培 養室中，培養溫度為23?25°C，光照時間為12小時/天，光照強度1800?2000Lx條件下 培養80?90天，得到鐵皮石斛幼苗； 步驟三、生根苗的培養 將步驟二中得到的鐵皮石斛幼苗轉入到生根培養基上，對其進行培養，培養溫度為 25?26°C，光照時間為12小時/天，光照強度1800?2000Lx條件下培養100?120天， 得到鐵皮石斛壯苗； 步驟四、移栽 將步驟三進行生根培養後的鐵皮石斛壯苗進行煉苗後移栽。
2. 根據權利要求1所述的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其特徵在於，步驟一中的 外植體誘導培養基以MS培養基作為基本培養基，在基本培養基中添加瓊脂5?9g/L，白糖 28?30g/L，活性炭0? 5?0? 6g/L，香蕉65?75g/L，自製有機液肥1. 5?2g/L，滅菌劑 1. 5?2. 5ml/L，外植體誘導培養基的pH為5. 4?5. 8,對上述的外植體誘導培養基進行滅 菌操作，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時間為10?40min。
3. 根據權利要求1所述的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其特徵在於，步驟二中的 增殖繼代培養基以MS培養基作為基本培養基，在基本培養基中添加瓊脂5?9g/L，白糖 30?32g/L，活性炭0? 48?0? 5g/L，香蕉45?50g/L，滅菌劑1. 5?2. 5ml/L，增殖繼代培養 基的pH為5. 4?5. 8,對上述的增殖繼代培養基進行滅菌操作，其滅菌溫度為120?126°C， 滅菌時間為10?40min。
4. 根據權利要求2所述的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其特徵在於，步驟三中的 生根培養基以自制母液作為基本培養基，在基本培養基中添加瓊脂5?9g/L，白糖20? 22g/L，活性炭0? 5?0? 55g/L，香蕉50?55g/L，自製天然有機液肥1. 5?1. 8g/L，滅菌劑 1. 5?2. 5ml/L，生根培養基的pH為5. 4?5. 8,對上述的生根培養基進行滅菌操作，其滅菌 溫度為120?126°C，滅菌時間為10?40min。
5. 根據權利要求4所述的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其特徵在於，所述的外植 體誘導培養基和生根培養基中添加的自製天然有機液肥配方相同，該自製天然有機液肥 的配方具體如下：生麩3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、水50000g、米糠3000g、酵母菌 500g、磷肥500g、紅糖6000g、海帶3000g、五花肉500g、魚骨粉500g、雞蛋6個。
6. 根據權利要求4或5所述的一種鐵皮石斛組培苗的培養方法，其特徵在於，所述的生 根培養基中的自製母液的配方具體為：硫酸銨〇.46g/L、氯化鈣0. 17g/L、肌醇0. lg/L、硝酸 鉀2. 83g/L、硫酸亞鐵0? 03g/L、1-萘乙酸2mg/L、磷酸二氫鉀0? 4g/L、硫酸鎂0? 19g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK104429973SQ201410828043
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優先權日:2014年12月25日
【發明者】鄭毓華, 於太和, 周道陽 申請人:安徽同創現代農業投資發展有限公司