從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法

2023-10-10 18:58:14

專利名稱：從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法
技術領域：
本發明涉及從天然產物中製備活性成分的方法，具體地說，涉及從茶葉中 提取甲基化兒茶素的工藝方法。
背景技術：
二十世紀卯年代末期，日本科學家最早成功從臺灣凍頂烏龍茶中分離鑑定 出兩種具有抗過敏功能的新型兒茶素衍生物，經分離、純化後鑑定證明其分子
結構分別為(一)-表沒食子兒茶素3-0(3-0-甲基欣食子酸酯(C-l)和(一)-表沒食亍 兒茶素3-0(4-0-甲基)沒食子酸酯(C-2)。為白色粉末狀物質，易溶於水和有機溶 劑，其結構式如式(1)所示
(1)formula see original document page 5
EGCG3〃 Me禾3EGCG4〃 Me對抗過敏，尤其是抗花粉症過敏具有非常顯著 的功效。花粉症是變態反應中最具代表性的，其發病率逐年升高，尤其是二十 世紀八十年代以後其發病率迅速升高，己經成為世界性衛生問題。WHO於1997 年將之列為"二十一世紀重點研究和預防的疾病"。但是，甲基化兒茶素僅在極
少數的中葉種茶樹品種中存有，所以該項研究受到日本業界高度重視，小川制 藥、太陽製藥、三井農林等幾大公司均投以重金，加緊秘密研發。因甲基化兒 茶素對治療花粉過敏等過敏反應症有極其顯著的效果，抑制小鼠皮膚被動過敏
反應的效果是EGCG的兩倍，已被視為人們期待已久的抗過敏症材料。隨著甲
基化兒茶素的功能研究逐歩得到權威機構的認可，其相關方面的研究也逐步得 到國際學術機構的高度重視。目前，甲基化兒茶素的提取與分離純化技術的前
沿研究主要集中在日本，受商業秘密的保護，甲基化EGCG的提取與分離純化 技術方法尚未見到報導。
目前，工業化提取兒茶素的方法主要是溶劑萃取法和離子沉澱法，溶劑萃 取法是目前最廣泛採用的方法，該方法工藝成熟穩定，提取率較高，但生產時 使用多種有機溶劑，且用量大，有些甚至是有毒溶劑(如氯仿)，因而很難為食品 和醫藥等行業所接受。離子沉澱法減少了有機溶劑的使用量，生產的兒茶素純 度高，但工藝操作要求較高，需嚴格控制pH值，否則兒茶素可能會氧化，同 時，工藝中大量使用酸鹼液，廢渣處理量大，容易造成環境汙染。其次，還有
幾種提取技術正處於試驗階段(1)超臨界流體萃取技術，該技術是一種新型
的提取天然物質的分離技術，具有低能耗、無汙染、高分離能力、質量好、速度 快等優點，這些特點迎合崇尚純天然的發展潮流，但設備要求高，一次性投資大,
對於提取兒茶素來說，超臨界<:02提取效果不是很好，而超臨界萃取劑、助溶劑 在超臨界狀態下的溶解度等研究尚未成熟，因此很難進入規模化大生產；(2)吸 附樹脂法提取兒茶素工藝簡單，能耗少，樹脂再生容易，可反覆利用，提取效 率高，提取過程無汙染，符合環保要求，條件溫和，不會破壞兒茶素活性，具有 良好的發展前景。但關鍵問題在於怎樣找到一種對兒茶素吸附能力強、解吸容
易的樹脂。兒茶素單體製備方法主要有凝膠層析法、HPLC製備以及高速逆流色 譜法等技術,前兩種技術操作繁瑣、耗時長、設備材料昂貴，高速逆流色譜則具有 適應性好、操作簡單、回收率高、重現性好、分離效率高、分離量大等特點，因 而具有良好的應用和開發價值。

發明內容
本發明的目的在於提供一種從茶葉中提取、分離、純化甲基化兒茶素的工 藝方法，以得到高純度的甲基化兒茶素。
為實現上述目的，本發明的技術方案如下
製備步驟1、先將茶鮮葉蔞凋5 12小時，進行滾筒殺青處理，然後在80 12(TC條件下乾燥，經粉碎機製成顆粒大小為60 80目的茶粉。
製備歩驟2、用茶粉和60 80%乙醇溶液同時置於提取罐中進行固液萃取， 萃取溫度為70 90°C，時間為30 120分鐘，料液比為1:3 1:10，過濾，濾渣 反覆萃取2 5次；參照茶葉中茶多酚的提取方法進行初歩提取，茶多酚的提取 方法一般採用水提法、乙醇提取法、丙酮提取法、酸液提取法。其中水提法提 取率不高，而且沸點較高，不能採用連續回流的方法進行提取，同時會給隨後 的濃縮過程帶來困難，因此不可取；丙酮提取法提取的多酚提取率較高，但是 相對成本較高、毒性較大，不可取；酸液提取法可以提高多酚的提取率，但其 易使多酚分子降解，不能真實地反應材料中的多酚成分。乙醇價廉易得，無毒， 選擇性好，提取液易於濃縮、乾燥，可以回收再利用，通過綜合考慮各個因素， 本發明採用乙醇作為提取劑進行提取。
製備步驟3、合併所有萃取液後進行濃縮，濃縮液和石油醚溶液按體積比 1:1 1:2混合後，進行液液萃取，時間為5 30分鐘，反覆操作2 5次；用石 油醚萃取去除萃取液中葉綠素和脂溶性成分雜質。
製備步驟4、將所得萃餘液再與乙酸乙酯按體積比為1:1 1:2混合，進行液 液萃取，時間為5 30分鐘，反覆操作2 5次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃 縮液，濃縮液在60 10(TC條件下乾燥，得甲基化幾茶素粗提物乾粉A;乙酸乙 酯對多酚類物質溶解性較強，經過乙酸乙酯萃取後，多酚類物質的含量進一步 富集，純化後多酚物質的質量分數可以達到80%左右，對下一步提取分離的效 果顯著提高。
製備步驟5、用經預處理過的20 50目粗聚醯胺樹脂裝進層析柱，將甲基 化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂按重量比1:1 3.5:1充分混勻，裝入層 析柱，然後用20~95%的乙醇洗脫，流速為0.5 lBV/h，收集洗脫液，濃縮，在 60 10(TC條件下乾燥得甲基化兒茶素粗提物乾粉B;利用粗聚醯胺樹脂初步去 除茶多酚中與甲基化兒茶素化學性質差異較大的雜質。
製備步驟6、用經預處理過的60 200目細聚醯胺樹脂裝進層析柱，將甲基 化兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂按重量比1:1 3.5:1充分混勻，裝入層 析柱，用甲醇和三氯甲垸按體積比為1:1 4:1的洗脫液進行洗脫，流速為0.1 0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，在60 10(TC條件下乾燥，得甲基化兒茶素粗品； 利用細聚醯胺樹脂進一步去除茶多酚中與甲基化兒茶素化學性質差異較大的雜 質。
製備步驟7、用水和甲醇按體積比7:2 5:2混合，配置混合液A，用乙酸乙 酯和正己烷按體積比6:1 10:1，配製混合液B，將混合液A和混合液B均勻混 合，充分飽和後，靜置6 12h，取上相作為固定相，下相作為流動相；將甲基 化兒茶素粗品，用流動相配製成0.5 2mg/mL的溶液M，將固定相推進逆流色
譜的螺旋管柱中，調節轉速為正轉600 800 r / min，以1 2 mL / min的流速 將流動相泵入，待機器穩定後將溶液M注入逆流色譜，用分布收集器進行收集， 將所有含有甲基化兒茶素的收集液合併、濃縮後，濃縮液在60 10(TC條件下幹 燥，得甲基化兒茶素純品。
所述製備步驟3、製備步驟4、製備步驟5、製備步驟6和製備歩驟7的濃 縮條件是溫度為20 65°C，負壓為0.06 0.1MPa。
所述粗聚醯胺樹脂樹脂和細聚醯胺樹脂樹脂的預處理方法如下歩驟1、 Z 醇浸泡將樹脂浸泡在90 95%的乙醇中，不時用玻璃棒攪拌，使樹脂和乙醇 充分的接觸、溶脹， 一般為24h。以便從中趕出空氣並對樹脂進行浮選；步驟2、 乙醇衝洗將浸泡了 24h後的樹脂溼法上柱，再用90 95%的乙醇衝洗，直至 流出液清亮無混濁，蒸乾無殘留物為止；步驟3、 3%的氫氧化鈉衝洗以2BV、 3%的氫氧化鈉衝洗樹脂，並浸泡4h，然後用蒸餾水衝洗至中性；歩驟4、 5% 的檸檬酸衝洗以2BV、 5%的檸檬酸衝洗樹脂，並浸泡4小時，然後用蒸餾水 衝洗至中性。粗聚醯胺樹脂樹脂和細聚醯胺樹脂樹脂也可以採用其他預處理方 法。
所述製備步驟4中通過以下方法使兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂充 分混勻先將兒茶素粗提物乾粉A全部溶於甲醇製成溶液，在80 10(TC加熱 條件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚醯胺樹脂直到兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯 胺樹脂充分混勻。
所述製備步驟5中通過以下方法使兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂充 分混勻先將兒茶素粗提物乾粉B全部溶於甲醇製成溶液，在80 10(TC加熱條 件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚醯胺樹脂直到兒茶素粗提物千粉B與細聚醯胺樹脂充分混勻。
所述製備步驟2、製備步驟3、製備步驟4、製備步驟5和製備步驟6的濃 縮條件是溫度為20 65°C，負壓為0.06 0.1MPa。
所述製備步驟1的過濾採用80 200目的濾網進行負壓抽濾或離心過濾。
所述製備步驟4和製備步驟5中的層析柱為中壓層析柱，該層析柱的柱長 30 100cm，柱直徑5 100cm，柱壓0.1 5MPa。
所述製備步驟6中，固定相以9.99 ml/min的流速泵入管路中，甲基化兒 茶素粗品溶於流動相後，然後超聲溶解均勻、過濾即得溶液M。由首端向尾端 洗脫，然後泵入流動相進行洗脫，當流動相流出色譜分離柱時，調整紫外檢測 器零點，並在254nm下連續檢測，記錄儀同步記錄，用自動部分收集器收集下 相洗脫液，根據譜峰收集樣品。
本發明的優點
(1) 首先在國內建立了甲基化兒茶素的提純工藝，得到純度90%以上的甲 基化兒茶素；
(2) 本發明採用高速逆流色譜(HSCCC)製備工藝，相比於高效液相色譜 (HPLC)製備工藝，高速逆流色譜不需要固體支撐體，克服了固相載體帶來的
樣品吸附、損失、汙染和峰形拖尾等缺點。且高速逆流色譜具有製備量大，綜 合成本低，易於工業推廣等優點。
(3) 浸提過程中選用乙醇做溶劑，成本低，安全性能好，汙染低，易於
回收；


圖1為甲基化兒茶素標樣的HPLC圖譜；
圖2為本發明實施例1所製得產品的HPLC圖譜；
圖3為本發明實施例2所製得產品的HPLC圖譜； 圖4為本發明實施例3所製得產品的HPLC圖譜；
具體實施例方式
下面結合實施例進一步對本發明加以說明 本發明的製備步驟如下
(1) 樣品製備採摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風條件下，在萎凋室中， 用萎凋篩萎凋5 12小時後，進行滾筒殺青處理，然後在80 12(TC條件下，用 烘乾機乾燥，將茶葉用粉碎機粉碎成60 80目粉末；
(2) 乙醇提取用茶粉與60 80%乙醇溶液同時置於提取罐中進行固液萃 取，萃取溫度為70 90。C，時間為30 120分鐘，料液比為1:3 1:10，用真空 抽濾機進行抽濾，濾渣反覆萃取2 5次；
(3) 粗提液的純化合併所有萃取液後進行在濃縮罐中進行真空濃縮，濃
縮液和石油醚溶液按體積比1:1 1:2混合，在萃取罐中進行液液萃取，時間為 5 30分鐘，反覆操作2 5次，以去除葉綠素和脂溶性成分；
(4) 乙酸乙酯進行萃取將所得萃餘液再與乙酸乙酯按體積比為1:1 1:2 混合，在萃取罐中進行液液萃取，時間為5 30分鐘，反覆操作2 5次，所得 萃取液用真空抽濾機進行抽濾，在溫度為20 65。C，負壓為0.06 0.1MPa真空 濃縮，得濃縮液，濃縮液在60 10(TC條件下經真空乾燥箱乾燥，得甲基化兒茶 素粗提物乾粉A;
(5) 粗聚醯胺初步分離、純化 a粗聚醯胺樹脂的預處理
步驟1、乙醇浸泡..將樹脂浸泡在90 95%的乙醇中，不時攪拌，使樹脂
和乙醇充分的接觸、溶脹， 一般為24h。以便從中趕出空氣並對樹脂進行浮選。 步驟2、乙醇衝洗將浸泡了 24h後的樹脂上柱，再用90 95%的乙醇衝
洗，直至流出液清亮無混濁，蒸乾無殘留物為止。
步驟3、 3%的氫氧化鈉衝洗以2BV、 3%的氫氧化鈉衝洗樹脂，並浸泡
4h，然後用蒸餾水衝洗至中性。
步驟4、 5%的檸檬酸衝洗以2BV、 5%的檸檬酸衝洗樹脂，並浸泡4小時，
然後用蒸餾水衝洗至中性。
b按幹法裝柱法，用經預處理過的20 50目粗聚醯胺樹脂裝進層析柱，先 將兒茶素粗提物乾粉A全部溶於甲醇製成溶液，在80 10(TC加熱條件下，邊 加入溶液，邊攪拌粗聚醯胺樹脂直到兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂充分 混勻，甲基化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂的重量比為1:1 3.5:1。裝入 層析柱，然後用20 95%的乙醇洗脫，流速為0.5 lBV/h，收集洗脫液，在溫度 為20 65。C，負壓為0.06 0.1MPa的條件下用濃縮罐真空濃縮，在60 100。C 條件下經真空乾燥箱經乾燥得甲基化兒茶素粗提物乾粉B; (6)細聚醯胺分離、純化 a細聚醯胺的預處理預處理工藝同粗聚醯胺樹脂的預處理-， b按幹法裝柱法，用經預處理過的20 50目粗聚醯胺樹脂裝進層析柱，先 將兒茶素粗提物乾粉B全部溶於甲醇製成溶液，在80 100。C加熱條件下，邊加 入溶液，邊攪拌粗聚醯胺樹脂直到兒茶素粗提物千粉B與細聚醯胺樹脂充分混 勻，甲基化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂的重量比為1:1 3.5:1，裝入層 析柱，然後用20 95%的乙醇洗脫，流速為0.5 1BV/h，收集洗脫液，在糹顯度為 20 65°C，負壓為0.06 0.1MPa的條件下用濃縮罐濃縮，在60 10(TC條件下 經液噴霧乾燥得得甲基化兒茶素粗品；
(7) 高速逆流色譜純化用水和甲醇按體積比7:2 5:2混合，配置混合液 A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比6: 1 10: 1，配製混合液B，將混合液A和 混合液B混合，充分飽和後，靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動相； 將甲基化兒茶素粗品，用流動相配製成0.5 2mg/mL的溶液M，將固定相推進 逆流色譜的螺旋管柱中，調節轉速為正轉600 800 r/min，以l 2mL/min 的流速將流動相泵入，待機子穩定後進樣，分布收集器進行收集，將所有含有 甲基化兒茶素的收集液合併，在溫度為20 65。C，負壓為0.06 0.1MPa的條件 下用濃縮罐濃縮後，濃縮液噴霧乾燥，得甲基化兒茶素純品。
(8) 甲基化兒茶素的高效液相色譜(HPLC)檢測 HPLC檢測條件KromasilC18柱(200mmX4.6mm id,5um)色譜柱；流動
相A:乙睛，流動相B: O.lmol/L的磷酸二氫鈉;流速1.0ml/min;檢測波長 280nm;靈敏度l.OOOAUFS;柱溫40°C;進樣量lOul。 甲基化兒茶素標樣的HPLC圖譜見圖1。
下面，用具體實施例對本發明進一步加以說明，但是本發明並不限於這些 實施例的任一個或類似實例。 實施例1
採摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風條件下，在萎凋室中，用萎凋篩萎凋5 小時後，進行滾筒殺青處理，然後在8(TC條件下，用烘乾機乾燥，將茶葉用粉 碎機粉碎成60目粉末；按料液比1:3添加60%乙醇到茶粉中，在70。C，萃取30 分鐘，萃取完成後，過濾，濾渣反覆萃取2次，合併所有萃取液後進行濃縮，濃縮液和石油醚溶液按體積比l:l混合，進行液液萃取，時間為5分鐘，反覆操
作2次；將所得萃餘液再與乙酸乙酯按體積比為1:1混合，進行液液萃取，時間 為5分鐘，反覆操作2次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液經乾燥， 得甲基化兒茶素粗提物乾粉A;用經預處理過的20目粗聚醯胺樹脂裝進層析柱， 將甲基化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂按重量比1:1充分混勻，裝入層 析柱，然後用20%的乙醇洗脫，流速為0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，經千燥得 甲基化兒茶素粗提物乾粉B;用經預處理過的60目細聚醯胺樹脂裝進層析柱， 將甲基化兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂按重量比1:1充分混勻，裝入層 析柱，用甲醇和三氯甲烷按體積比為1:1的洗脫液進行洗脫，流速為0.1BV/h， 收集洗脫液，濃縮，乾燥，得甲基化兒茶素粗品；用水和甲醇按體積比7:2混合， 配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比6:1，配製混合液B，將混合液A 和混合液B混合，充分飽和後，靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動 相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配製成0.5mg/mL的溶液M，將固定相推進 逆流色譜的螺旋管柱中，調節轉速為正轉600r / min，以1 mL / min的流速將流 動相泵入，待機子穩定後進樣，分布收集器進行收集，將所有含有甲基化兒茶 素的收集液合併、濃縮後，濃縮液乾燥，得甲基化兒茶素純品。
將得到的兒茶素純品進行HPLC檢測，如圖2，純度為92.1%。
實施例2
採摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風條件下，在萎凋室中，用萎凋篩萎凋8 小時後，進行滾筒殺青處理，然後在10(TC條件下，用烘乾機乾燥，將茶葉用粉 碎機粉碎成70目粉末；按料液比1:6添加70°/。乙醇到茶粉中，在8(TC，萃取60 分鐘，萃取完成後，過濾，濾渣反覆萃取3次，合併所有萃取液後進行濃縮，
濃縮液和石油醚溶液按體積比1:1混合，進行液液萃取，時間為15分鐘，反覆
操作3次；將所得萃餘液再與乙酸乙酯按體積比為1:1混合，進行液液萃取，時 間為15分鐘，反覆操作3次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液經幹 燥，得甲基化兒茶素粗提物乾粉A;用經預處理過的30目粗聚醯胺樹脂裝進層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂按重量比l: l充分混勻， 裝入層析柱，然後用60%的乙醇洗脫，流速為0.8BV/h，收集洗脫液，濃縮，經 乾燥得甲基化兒茶素粗提物乾粉B;用經預處理過的80目細聚醯胺樹脂裝進層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂按重量比2:1充分混勻， 裝入層析柱，用甲醇和三氯甲烷按體積比為2.5:1的洗脫液進行洗脫，流速為 0.3BV/h，收集洗脫液，濃縮，乾燥，得甲基化兒茶素粗品；用水和甲醇按體積 比6:2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比8:1，配置混合液B， 將混合液A和混合液B混合，充分飽和後，靜置分層，取上相作為固定相，下 相作為流動相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配製成1.5mg/mL的溶液M，將 固定相推進逆流色譜的螺旋管柱中，調節轉速為正轉700r/min，以1.5 mL / min的流速將流動相泵入，待機子穩定後進樣，分布收集器進行收集，將所有含 有甲基化兒茶素的收集液合併、濃縮後，濃縮液乾燥，得甲基化兒茶素純品。
將得到的兒茶素純品進行HPLC檢測，如圖3，純度為96.5%。
實施例3
採摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風條件下，在蔞凋室中，用萎調篩萎調5 小時後，進行滾筒殺青處理，然後在120。C條件下，用烘乾機千燥，將茶葉用粉 碎機粉碎成80目粉末；按料液比1:10添加80%乙醇到茶粉中，在90。C，萃取 120分鐘，萃取完成後，過濾，濾渣反覆萃取5次，合併所有萃取液後進行濃縮，
濃縮液和石油醚溶液按體積比l:2混合，進行液液萃取，時間為30分鐘，反覆 操作5次；將所得萃餘液再與乙酸乙酯按體積比為l:2混合，進行液液萃取，時 間為30分鐘，反覆操作5次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液經幹 燥，得甲基化兒茶素粗提物乾粉A;用經預處理過的50目粗聚醯胺樹脂裝進層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂按重量比3.5:1充分混勻， 裝入層析柱，然後用95%的乙醇洗脫，流速為lBV/h，收集洗脫液，濃縮，經 乾燥得甲基化兒茶素粗提物乾粉B;用經預處理過的200目細聚醯胺樹脂裝進層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂按重量比3.5:1充分混勻， 裝入層析柱，用甲醇和三氯甲垸按體積比為4:1的洗脫液進行洗脫，流速為 0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，乾燥，得甲基化兒茶素粗品；用水和甲醇按體積 比5:2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比10:1，配製混合液B， 將混合液A和混合液B混合，充分飽和後，靜置分層，取上相作為固定相，下 相作為流動相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配製成2mg/mL的溶液M，將 固定相推進逆流色譜的螺旋管柱中，調節轉速為正轉800r/min，以2 mL / min 的流速將流動相泵入，待機子穩定後進樣，分布收集器進行收集，將所有含有 甲基化兒茶素的收集液合併、濃縮後，濃縮液乾燥，得甲基化兒茶素純品。 將得到的兒茶素純品進行HPLC檢測，如圖4，純度為93.8%。
權利要求
1.一種從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵在於製備步驟1、先將茶鮮葉萎凋5～12小時，進行滾筒殺青處理，然後在80～120℃條件下乾燥，經粉碎機製成顆粒大小為60～80目的茶粉；製備步驟2、用茶粉和60～80％乙醇溶液同時置於提取罐中進行固液萃取，萃取溫度為70～90℃，時間為30～120分鐘，料液比為1∶3～1∶10，過濾，濾渣反覆萃取2～5次；製備步驟3、合併所有萃取液後進行濃縮，濃縮液和石油醚溶液按體積比1∶1～1∶2混合後，進行液液萃取，時間為5～30分鐘，反覆操作2～5次；製備步驟4、將所得萃餘液再與乙酸乙酯按體積比為1∶1～1∶2混合，進行液液萃取，時間為5～30分鐘，反覆操作2～5次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液在60～100℃條件下乾燥，得甲基化兒茶素粗提物乾粉A；製備步驟5、用經預處理過的20～50目粗聚醯胺樹脂裝進層析柱，將甲基化兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混勻，裝入層析柱，然後用20～95％的乙醇洗脫，流速為0.5～1BV/h，收集洗脫液，濃縮，在60～100℃條件下乾燥得甲基化兒茶素粗提物乾粉B；製備步驟6、用經預處理過的60～200目細聚醯胺樹脂裝進層析柱，將甲基化兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混勻，裝入層析柱，用甲醇和三氯甲烷按體積比為1∶1～4∶1的洗脫液進行洗脫，流速為0.1～0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，在60～100℃條件下乾燥，得甲基化兒茶素粗品；製備步驟7、用水和甲醇按體積比7∶2～5∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比6∶1～10∶1，配製混合液B，將混合液A和混合液B均勻混合，充分飽和後，靜置6～12h，取上相作為固定相，下相作為流動相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配製成0.5～2mg/mL的溶液M，將固定相推進逆流色譜的螺旋管柱中，調節轉速為正轉600～800r/min，以1～2mL/min的流速將流動相泵入，待機器穩定後將溶液M注入逆流色譜，用分布收集器進行收集，將所有含有甲基化兒茶素的收集液合併、濃縮後，濃縮液在60～100℃條件下乾燥，得甲基化兒茶素純品；所述製備步驟3、製備步驟4、製備步驟5、製備步驟6和製備步驟7的濃縮條件是溫度為20～65℃，負壓為0.06～0.1MPa。
2. 按照權利要求1所述的從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵 在於所述粗聚醯胺樹脂樹脂和細聚醯胺樹脂樹脂的預處理方法如下歩驟1、乙醇浸泡將樹脂浸泡在90 95%的乙醇中，不時攪拌，使樹脂 和乙醇充分的接觸、溶脹， 一般為24h。以便從中趕出空氣並對樹脂進行浮選；步驟2、乙醇衝洗將浸泡了 24h後的樹脂溼法上柱，再用90 95%的乙 醇衝洗，直至流出液清亮無混濁，蒸乾無殘留物為止；步驟3、 3%的氫氧化鈉衝洗以2BV、 3%的氫氧化鈉衝洗樹脂，並浸泡 4h，然後用蒸餾水衝洗至中性；步驟4、 5%的檸檬酸衝洗以2BV、 5%的檸檬酸衝洗樹脂，並浸泡4小 時，然後用蒸餾水衝洗至中性。
3. 按照權利要求1所述的從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵 在於所述製備步驟5中通過以下方法使兒茶素粗提物乾粉A與粗聚醯胺樹脂 充分混勻先將兒茶素粗提物乾粉A全部溶於甲醇製成溶液，在80 100。C加熱條件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚醯胺樹脂直到兒茶素粗提物乾粉A與粗聚 醯胺樹脂充分混勻。
4. 按照權利要求1所述的從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵 在於所述製備步驟6中通過以下方法使兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂充分混勻先將兒茶素粗提物乾粉B全部溶於甲醇製成溶液，在80 10(TC加熱 條件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚醯胺樹脂直到兒茶素粗提物乾粉B與細聚醯胺樹脂充分混勻。
5. 按照權利要求1所述的從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵 在於所述製備歩驟2的過濾採用80 200目的濾網進行負壓抽濾或離心過濾。
6. 按照權利要求1所述的從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵 在於所述製備步驟5和製備歩驟6中的層析柱為中壓層析柱，該層析柱的豐主 長30 100cm，柱直徑5 100cm，柱壓0.1 5MPa。
7. 按照權利要求1所述的從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，其特徵 在於所述製備步驟7中〖固定相以9.99 ml/min的流速泵入管路中，甲基化 兒茶素粗品溶於流動相後，然後超聲溶解均勻、過濾即得溶液M;由首端向尾 端洗脫，然後泵入流動相進行洗脫，當流動相流出色譜分離柱時，調整紫外檢 測器零點，並在254nm下連續檢測，記錄儀同步記錄，用自動部分收集器收集 下相洗脫液，根據譜峰收集樣品。
全文摘要
一種從茶葉中製備甲基化兒茶素的工藝方法，茶粉末先經乙醇提取，再經石油醚萃取以去除葉綠素和脂溶性成分，然後經乙酸乙酯萃取得甲基化兒茶素粗提物乾粉A，再經粗聚醯胺樹脂和細聚醯胺樹脂分離純化，得甲基化兒茶素粗品，最後經高效逆流色譜進一步提純，得甲基化兒茶素純品。本發明首先在國內建立了甲基化兒茶素的提純工藝，得到較高純度的甲基化兒茶素；而且本發明採用高速逆流色譜(HSCCC)製備工藝，相比於高效液相色譜(HPLC)製備工藝，高速逆流色譜不需要固體支撐體，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、汙染和峰形拖尾等缺點。且高速逆流色譜具有製備量大，綜合成本低，易於工業推廣等優點。
文檔編號C07D311/00GK101177422SQ20071009311
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月7日 優先權日2007年12月7日
發明者堅 楊, 童華榮, 羅正飛, 謝進平, 龔正禮 申請人:西南大學