針對人腸道病毒的抗原及疫苗的製作方法

2023-10-10 17:34:09

針對人腸道病毒的抗原及疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種製造小核糖核酸病毒科的病毒衍生的免疫活性抗原的物質及方法。本發明的小核糖核酸病毒抗原可以為能夠用作治療法的一環，或為了預防小核糖核酸病毒的感染而施用於受試者的疫苗的形式。本發明的小核糖核酸病毒抗原也可以是能夠在為了預防腸道病毒感染而施用的疫苗中使用的免疫原性組合物的形式。本發明還涵蓋包括人腸道病毒A、人腸道病毒B、人腸道病毒C及人腸道病毒D的抗原的免疫原性組合物和以預防腸道病毒感染為目的的作為疫苗的用途。
【專利說明】針對人腸道病毒的抗原及疫苗

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種小核糖核酸病毒科的病毒，尤其涉及一種可有效地預防和治療由 該病毒引起的感染的抗原和疫苗。

【背景技術】
[0002] 小核糖核酸病毒是成為一些常見疾病的原因的各種病毒科的總稱。在小核糖核酸 病毒科中，腸道病毒屬的病毒均具有密切的關係，所引發的常見疾病尤其多。
[0003] 每年全球有數百萬人感染腸道病毒屬的病毒，並且在受感染者的呼吸道分泌物 (例如唾液、痰液或鼻涕等）和糞便中能夠經常發現的腸道病毒感染腸道，但"腸道病毒 (ENTEROVIRUS) "這個名稱的詞源出於"enteric (腸的）"。從歷史上看，說起腸道病毒即脊 髓灰質炎病毒所引起的最嚴重的疾病當屬脊髓灰質炎。能夠引發人類疾病的非脊髓灰質炎 病毒有62種，其中23種為柯薩奇A病毒,6種為柯薩奇B病毒,28種為埃可病毒,5種為其 他腸道病毒。脊髓灰質炎病毒與柯薩奇病毒和埃可病毒同樣地，通過糞口途徑傳播。感染 引起的症狀範圍廣泛，包括輕微的呼吸道疾病（感冒），手足口病，急性出血性結膜炎，無菌 性腦膜炎，心肌炎，嚴重的新生兒敗血症樣疾病，急性弛緩性麻痺等。
[0004] 在小核糖核酸病毒中，腸道病毒代表著作為基因組具有單股正鏈的RNA為特徵 的，多種多樣的小RNA病毒群的屬。由如下可知所有腸道病毒包含由約7500個鹼基構成的 基因組，並且因較低的複製保真度和頻繁的重組而突變率非常高。感染宿主細胞後，基因組 通過非帽依賴性翻譯而被翻譯成單一的多聚蛋白。該蛋白質通過由病毒編碼的蛋白酶被切 割成結構衣殼蛋白和非結構蛋白，這些蛋白質主要參與複製病毒。
[0005] 腸道病毒與多種人類疾病和哺乳動物的疾病有關。血清學的研究基於抗體中和試 驗，區分有66種人腸道病毒血清型。另外，基於變體菌株之間的減少交叉中或不可逆交叉 中和（reduced or nonreciprocal cross-neutralization)，在血清型中對抗原變體進行 了追加性的定義。腸道病毒最初以人和動物的病因為基準分為脊髓灰質炎病毒、柯薩奇A 病毒（CA)、柯薩奇B病毒（CB)及埃可病毒這4組，但很快就意識到屬不同組的病毒的生物 學特性顯著地重疊。
[0006] 腸道病毒屬包括以下十種：
[0007] ?牛腸道病毒
[0008] ?人腸道病毒A
[0009] ?人腸道病毒B
[0010] ?人腸道病毒C
[0011] ?人腸道病毒D
[0012] ?人鼻病毒A
[0013] ?人鼻病毒B
[0014] ?人鼻病毒C
[0015] ?豬腸道病毒B
[0016] ?猴腸道病毒A
[0017] 上述10種病毒具有多種血清型，例如：
[0018] 腸道病毒血清型的 HEV71、EV-76、EV-89、EV-90、EV-91、EV-92 及柯薩奇病毒 A16 是在人腸道病毒A中發現的。
[0019] 血清型柯薩奇病毒B1 (CV-B1)、CV-B2、CV-B3、CV-B4、CV-B5 (包括豬水泡病病毒 [SVDV])、CV-B6、CV-A9、埃可病毒 1 (E-1 ;包括 E-8)、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-9 (包 括 CV-A23)、Ε-11、Ε-12、Ε-13、Ε-14、Ε-15、Ε-16、Ε-17、Ε-18、Ε-19、Ε-20、Ε-21、Ε-24、Ε-25、 E-26、E-27、E-29、E-30、E-31、E-32、E-33、腸道病毒 B69 (EV-B69)、EV-B73、EV-B74、EV-B75、 EV-B77、EV-B78、EV-B79、EV-B80、EV-B81、EV-B82、EV-B83、EV-B84、EV-B85、EV-B86、EV-B87、 EV-B88、EV-B93、EV-B97、EV-B98、EV-B100、EV-B101、EV-B106、EV-B107、EV-B110 (源自黑猩 猩）及猴腸道病毒SA5是在人腸道病毒B中發現的。
[0020] 血清型 EV-95、EV-96、EV-99、EV-102、EV-104、EV-105 及 EV-109 是在人腸道病毒 C中發現的。
[0021] 血清型EV-68、EV-70、EV-94是在人腸道病毒D中發現的。
[0022] 脊髓灰質炎病毒血清型的PV-1、PV-2、PV_3是在人腸道病毒C中發現的。
[0023] 腸道病毒感染引發的疾病包括脊髓灰質炎，其是因腸道病毒感染引發的疾病中最 顯著的疾病。然而，腸道病毒感染最常見的表現為非特異性發熱性疾病。
[0024] 腸道病毒是兒童無菌性腦膜炎最常見的原因。在美國的30000至50000人的腦膜 炎患者因腸道病毒而發病。腦炎作為腸道病毒感染的徵候是一種罕見的事例，但發現當它 發生時最頻繁地引發腦炎的腸道病毒是埃可病毒9。
[0025] 由腸道病毒引起的胸膜痛的特點是伴有胸部和腹部的發熱的陣發性劇烈疼痛，有 時還伴有噁心、頭痛及嘔吐。
[0026] 心包炎和/或心肌炎通常是由腸道病毒引起的。還報告有心律不齊，心臟衰竭，心 肌梗塞等症狀。
[0027] 急性出血性結膜炎也是腸道病毒能夠引發的疾病。
[0028] 手足口病是一種因感染柯薩奇病毒A或HEV71而引發的兒童疾病中最常見的疾 病。
[0029] 2007年度的一項研究表明，腸道病毒相關的急性呼吸道或消化道感染可能成為慢 性疲勞症候群的主要原因。
[0030] 包括HEV71、脊髓灰質炎病毒和柯薩奇病毒A16的腸道病毒屬的成員均具有單鏈 的正鏈RNA基因組。
[0031] 該RNA基因組具有編碼多聚蛋白P1的單一的開放閱讀框，多聚蛋白P1包括衣殼 蛋白VP4、VP2、VP3、VP1及將多聚蛋白P1裂解成包括單獨的衣殼蛋白VP1、VP3及VP0的病 毒蛋白酶3C和3CD的非結構蛋白。VP0最終被裂解成VP2和VP4。衣殼蛋白可組裝成病毒 樣顆粒（VLP)。
[0032] 人腸道病毒71 (HEV71)和柯薩奇病毒A16是作為手足口病（HFMD)的主要病原體 而被廣泛知曉的腸道病毒血清型。HEV71有時與各種中樞神經系統疾病有關。1969年在加 利福尼亞州，以神經系統疾病的患者為對象進行的研究中，對HEV71進行分離及表徵的案 例首次獲得成功。迄今為止，有關HEV71感染的宿主反應的分子機制還知之甚少，但一直被 認為與編碼趨化因子的mRNA、參與分解蛋白的蛋白質、補體蛋白質及促凋亡蛋白有關。
[0033] 手足口病（HFMD)是人柯薩奇病毒A16(CVA16)、柯薩奇病毒AIO(CVAIO)及人腸道 病毒A71(HEV71)等人腸道病毒A群（小核糖核酸病毒科）造成的常見的自限性兒童疾病。 雖然病毒排洩於糞便中，但在咽部分泌物中也能夠檢測出來。多以兒童之間的接觸和環境 汙染為渠道而傳染。該疾病以急性發熱為特徵，伴有手掌、腳掌、臀部和膝蓋的皮疹或口腔 黏膜的小水泡等。通常，症狀經7?10天左右就會自然消失。患HFMD的兒童的僅一小部 分發展為嚴重疾病。
[0034] 表現為腦膜炎，腦炎，急性弛緩性麻痺，肺水腫和心力衰竭等症候群，主要與神經 系統和心血管系統有關的重症疾病通常只以HEV71感染髮病。在亞太地區最致命的神經系 統症候群是腦幹腦炎，其死亡率達40?80%。患重症HFMD的兒童需要幾個月的時間來恢 復，並且在某些情況下，神經損害可能是永久性的。目前，還沒有針對HFMD的具體的抗病毒 治療方法和防止除小兒麻痺症以外的其他的腸道病毒感染的疫苗。
[0035] 1969年在加利福尼亞州，HEV71首次從因腦炎死亡的患兒分離成功，並於1974年 首次報導。此後，雖然HEV71在全世界陸續被發現，但最近隨著HEV71的致病形式在各地域 出現，HFMD在亞洲區域性流行的可能性提高。死亡率很高的HFMD首次大量爆發是於1997 年在馬來西亞的沙撈越。與疫情相關的病毒則是HEV71。臺灣在1998年發生流行性疾病時， 曾出現129106例HFMD病症及405種重大疾病，並有78人死亡。新加坡於2000年?2001 年期間報告有9000例的流行病發病。共有7人死亡。之後，新加坡每2?3年反覆被流行 性疾病的發生所困擾。2008年的頭8個月間新加坡報導的HFMD的發病案例為19530例，一 人死亡。從那時起不僅是新加坡，泰國、馬來西亞、臺灣、日本、韓國和越南也定期報導出大 量HEV71疫情。
[0036] 中國於2007年報告了 83344例的發病案例，並有17人死亡。2008年疫情從安徽 省阜陽市爆發並蔓延至中國各地。新聞媒體對此次疫情進行了廣泛報導，並著重報導了家 長對子女健康問題的憂慮及衛生部門為了阻斷傳播鏈而關閉學校和託兒所等帶來的社會 混亂。此後，中國每年都有疫情爆發。
[0037] 關於屬小核糖核酸病毒科的其他病毒造成的疾病，脊髓灰質炎自古以來就是僅在 人類之間自然感染和流行而發生的傳染性疾病。在發展中國家每年仍有很多人感染脊髓灰 質炎。因此，根除脊髓灰質炎是一個持續的課題。
[0038] 脊髓灰質炎病毒在過去被分類為屬小核糖核酸病毒科的腸道病毒屬的種類。然 而，現在脊髓灰質炎病毒種類已被腸道病毒屬排除在外。脊髓灰質炎病毒被列入血清型， 即分類為人脊髓灰質炎病毒1 (PV-1)、人脊髓灰質炎病毒2 (PV-2)以及人脊髓灰質炎病毒 3 (PV-3)，並且，作為屬於小核糖核酸病毒科腸道病毒屬的人腸道病毒C種的亞型所認知。 2008年腸道病毒屬中的模式種由脊髓灰質炎病毒變更為人腸道病毒C。
[0039] 人腸道病毒C種的亞型，即PV-1、PV-2、PV_3的特徵為各自具有略微不同的衣殼蛋 白。衣殼蛋白決定細胞受體特異性和病毒的抗原性。PV-1是自然界中最常見的形式，然而 上述3亞型傳染率均非常高，有可能成為影響脊髓而引發脊髓灰質炎的原因。
[0040] 人類腸道病毒C引起的感染一直被視為一個嚴重的問題。大規模預防接種時使用 滅活的全病毒疫苗且至今有效。能夠通過索爾克（Salk)所開發的方法製造的滅活的脊髓 灰質炎疫苗已獲得良好的結果，並且在各方面進行了改善。通常，這種疫苗含有滅活脊髓灰 質炎病毒的Mahoney、MEFl及Saukett菌株的混合物。
[0041] 儘管作為減毒口服脊髓灰質炎疫苗製造並使用減毒人腸道病毒C，但是減毒人腸 道病毒C蘊藏著在接種對象的體內或通過與病毒整體的接觸而使致病性（癱瘓型神經毒 力）復發的危險性。因此，需要開發一種徹底去除致病性的安全有效的脊髓灰質炎疫苗。
[0042] 與所有的其他腸道病毒一樣，4種不同的人腸道病毒C的外殼多肽/衣殼多肽被指 定為VP1、VP2、VP3及VP4。它們參與形成正二十面體病毒的衣殼。據說在通常情況下使用 人腸道病毒C的各多肽進行免疫接種的結果，分離多肽無法在人類和動物的體內增加中和 抗體（Meloen，et al.，J. Gen. Virol.，45 :761-763,1979)。
[0043] 美國專利第4508708號指出，脊髓灰質炎病毒和手足口病病毒的各多肽，即VP1、 VP2、VP3及VP4不具有在人和動物的體內增加中和抗體的功能，手足口病病毒的各多肽中 僅VP1具備這種功能。另外，美國專利第4508708號明示，在人腸道病毒C2型MEF1病毒顆 粒的VP1、VP2及VP3多肽中，只有VP3具有中和抗體的誘導功能，但抗體滴度較低。然而，發 現VP1、VP2及VP3隻能在使用相當於選擇性地抑制小核糖核酸病毒的複製的大範圍的抗病 毒物質的阿立酮進行疫苗接種的情況下誘導中和抗體（Langford, et al.，Antimicrobial Agents and Chemotherapy28 :578-580,1985)〇
[0044] 因此，要解決的問題是不使用抗病毒性化合物而製造一種提供針對人腸道病毒感 染的保護性免疫的有效的疫苗的方法。作為需要保護性免疫的人腸道病毒，例如可以舉出 包括柯薩奇病毒A16及人腸道病毒71的人腸道病毒A ;包括柯薩奇病毒B血清型、埃可病 毒及腸道病毒血清型的人腸道病毒B ;包括人脊髓灰質炎病毒1、人脊髓灰質炎病毒2及人 脊髓灰質炎病毒3的人腸道病毒C ;以及包括EV68的人腸道病毒D。
[0045] 為了實現本發明的目的，本領域技術人員將疫苗理解為包含由一個以上的病原性 生物衍生的抗原，且施用於患者或動物時，對於來自所述或與其有關的病原性生物的感染 帶來主動免疫和預防效果（即產生保護性免疫效果）的預防用物質或治療用物質。
[0046] 此外，認為本領域技術人員對於保護性免疫應該非常了解，總之，保護性免疫至少 是指使病毒中和的中和抗體和/或T細胞免疫反應的誘導或誘發。
[0047] 已知在疫苗領域中，有關病原體衍生的抗原是否會誘導保護性免疫的問題尚不明 石角。Ellis (Chapter29of Vaccines, Plotkin, et al. (eds)WB Saunders, Philadelphia, at page571，1998)在"開發疫苗時的問題的關鍵在於特定本身可以誘導生成保護性抗體的病 毒或微生物病原體的蛋白質成分，…從而保護宿主不受病原體的攻擊"中充分例證了這個 問題。
[0048] 作為針對小核糖核酸病毒的疫苗的改進方法，嘗試了能夠誘導與由滅活全病毒疫 苗生成的抗體同樣的保護性抗體的，模擬病毒的衣殼結構或其組成要件的方法。這種方法 從一開始就完全沒有病原性復發的可能性，因此比死毒/滅活/減毒疫苗更加安全。
[0049] 所有小核糖核酸病毒共享包括P1基因內的4個結構基因，即VP1、VP2、VP3、VP4， VP4的相同的基因組結構。VP4和VP2 -同被表達為VP0以及3C及3D基因中的病毒蛋白 酶。裂解病毒蛋白酶P1基因，從而病毒組裝成腸道病毒的病毒樣顆粒（VLP)，病毒衣殼粒、 複合物和/或抗原。
[0050] 作為用於預防和治療包括HEV71感染的腸道病毒感染的疫苗的基礎，曾提出有使 用包括作為腸道病毒的主要衣殼蛋白的VP1的亞單位疫苗的方法（Wu，et al.，2001)，但成 果一般。
[0051] 關於針對腸道病毒感染的預防方法，從據說能夠誘導保護性抗體的死病毒疫苗的 觀點接近的方法是最容易想到的。然而，現狀是由於病毒滴度過低，製造這種腸道病毒疫苗 是接近冒險的行為。
[0052] 本發明涉及一種含有小核糖核酸病毒科的抗原性外殼蛋白/衣殼蛋白，且不具有 有助於神經毒力的病毒RNA的疫苗。本發明的疫苗作為抗原能夠相對於腸道病毒誘導中和 抗體，且包括指定為多肽P1或VP0,或者VP1、VP2、VP3和/或VP4的衣殼蛋白（VP's)，或者 它們的免疫活性片段或生物活性片段。
[0053] 本發明涉及一種疫苗，其由小核糖核酸病毒抗原以1種以上的小核糖核酸病毒多 肽，尤其是作為人腸道病毒多肽的VP2、VP3或VP0、其免疫原性片段和/或抗原決定簇的形 式被表達。小核糖核酸病毒多肽可以通過使用人腸道病毒的胺基酸序列或核酸序列的DNA 重組技術或化學合成來獲得。


【發明內容】

[0054] -種疫苗，其特徵在於，所述疫苗包括由選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4及其免疫活 性片段中的1種以上的人腸道病毒多肽構成的1種以上的免疫活性抗原。
[0055] -種疫苗，其特徵在於，例如所述疫苗誘導針對人腸道病毒的保護性免疫反應和/ 或中和免疫反應。
[0056] -種疫苗，其特徵在於，例如所述人腸道病毒選自人腸道病毒A、人腸道病毒B、人 腸道病毒C及人腸道病毒D。
[0057] -種疫苗，其特徵在於，例如所述人腸道病毒A選自人腸道病毒71 (HEV71)和柯薩 奇病毒A16,所述人腸道病毒B選自柯薩奇病毒B和埃可病毒，所述人腸道病毒C選自人脊 髓灰質炎病毒1、人脊髓灰質炎病毒2及人脊髓灰質炎病毒3,所述人腸腸道病毒D為EV68。
[0058] -種疫苗，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP0多肽。
[0059] -種疫苗，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
[0060] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
[0061] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
[0062] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述疫苗包括選自1種以上的腸道病毒種類或血清 型的多肽。
[0063] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述腸道病毒種類或血清型可以是選自HEV71和柯 薩奇病毒A16的人腸道病毒A。
[0064] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述腸道病毒種類或血清型可以是選自PV-1、PV-2 及PV-3的人腸道病毒C。
[0065] 一種疫苗，其特徵在於，例如1種以上的免疫活性抗原為病毒樣顆粒、衣殼粒、復 合物和/或聚集體的形式，所述1種以上的免疫活性抗原包括選自VPO、VP1、VP2、VP3、VP4 及其免疫活性片段的1種以上的人腸道病毒多肽。
[0066] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP0多肽。
[0067] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
[0068] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
[0069] 一種疫苗，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
[0070] -種針對腸道病毒感染對受試者實施疫苗接種的方法，其特徵在於，所述方法包 括對所述受試者施用有效量的由包括選自VPO、VP1、VP2、VP3、VP4及其免疫活性片段的1 種以上的人腸道病毒多肽的1種以上的免疫活性抗原構成的疫苗，所述有效量是對所述受 試者施用疫苗時能夠有效地誘導針對人腸道病毒的保護性免疫反應和/或中和免疫反應 的程度量。
[0071] 一種方法，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP0多肽。
[0072] -種方法，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
[0073] -種方法，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
[0074] -種方法，其特徵在於，例如所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
[0075] -種方法，其特徵在於，例如1種以上的免疫活性抗原為病毒樣顆粒、衣殼粒、復 合物和/或聚集體的形式，所述1種以上的免疫活性抗原包括選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4 及其免疫活性片段的1種以上的人腸道病毒多肽。
[0076] -種方法，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP0多肽。
[0077] -種方法，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
[0078] -種方法，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
[0079] -種方法，其特徵在於，例如所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
[0080] 一種方法，其特徵在於，例如所述疫苗包括選自1種以上的腸道病毒種類或血清 型的多肽。
[0081] 一種方法，其特徵在於，例如腸道病毒的所述種類或血清型可以是選自HEV71和 柯薩奇病毒A16的人腸道病毒A。
[0082] 一種方法，其特徵在於，例如腸道病毒的所述種類或血清型可以是選自PV-UPV-2 及PV-3的人腸道病毒C。
[0083] 一種表達盒，其特徵在於，包括與編碼人腸道病毒P1多肽的核酸可操作地結合的 啟動子、內部核糖體進入位點（IRES)、和編碼人腸道病毒3CD蛋白酶的核酸。
[0084] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述多肽是人腸道病毒P1。
[0085] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述人腸道病毒3⑶蛋白酶對所述人腸道病毒P1 多肽進行處理。
[0086] 一種表達盒，其特徵在於，例如經處理的所述人腸道病毒P1多肽協助形成病毒樣 顆粒、衣殼粒、複合物和/或聚集體。
[0087] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述人腸道病毒P1多肽包括選自VPO、VP1、VP2、 VP3、VP4及其免疫活性片段的多肽的組合。
[0088] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述人腸道病毒選自人腸道病毒A和人腸道病毒 C〇
[0089] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述人腸道病毒A選自HEV71和柯薩奇病毒A16。
[0090] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述人腸道病毒C選自人脊髓灰質炎病毒 1 (PV-1)、人髓灰質炎病毒2 (PV-2)及人脊髓灰質炎病毒3 (PV-3)。
[0091] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述IRES是由腦心肌炎病毒（EMCV)衍生的。
[0092] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述腦心肌炎病毒（EMCV)衍生的所述IRES已進行 基因改造，IRES活性已降低。
[0093] -種表達盒，其特徵在於，例如所述EMCV衍生的所述IRES通過向JK區段A6的分 支環加入一個核苷酸（A7)來進行基因改造。
[0094] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述IRES是由人腸道病毒衍生的。
[0095] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子為真核生物啟動子。
[0096] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述真核生物啟動子是多角體蛋白啟動子。
[0097] -種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、EMCV IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0098] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述EMCV IRES通過突變降低IRES活性。
[0099] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、 HEV71IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0100] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子與對人腸道病毒A的P1多肽、人腸道病 毒C IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶進行編碼的核酸可操作地結合。
[0101] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子與編碼人腸道病毒c的P1多肽、人腸道 病毒C IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0102] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、 HEV71IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0103] 一種表達盒，其特徵在於，例如所述啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、EMCV IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0104] 一種疫苗的製造方法，其特徵在於，將VLP表達盒導入宿主細胞，在能夠生成所述 表達盒的多肽的期間，培養所述宿主細胞，通過所述宿主細胞和/或培養上清液回收人腸 道病毒多肽。
[0105] -種方法，其特徵在於，例如所述宿主細胞是真核細胞。
[0106] 一種方法，其特徵在於，例如所述真核細胞選自昆蟲細胞，哺乳動物細胞株及酵母 細胞。
[0107] 一種方法，其特徵在於，例如所述昆蟲細胞選自草地夜蛾、粉紋夜蛾、果蠅及源自 白紋伊蚊的蚊子細胞。
[0108] 一種方法，其特徵在於，例如所述哺乳動物細胞株選自CHO、HEK293、COS-1、HeLa、 Vero 及 NIH3T3。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0109] 圖 1 表示 HEV71 的 VLP 表達盒[P1+IRES+3CD]及 pSNOl 質粒。
[0110] 圖 2 表示 HEV71 的 VLP 表達盒[P1+IRES+3C]及 pSN03 質粒。
[0111] 圖3表示在SN07感染Sf9細胞的上清液中的VP1的表達。
[0112] 圖4表示在上清液和裂解液這兩者中的已處理的VP1。
[0113] 圖5表示基於lOOkDa的截留分子量（MWC0)膜的超濾後的滯留物中的VP1及VP0。
[0114] 圖6表示生成中和抗體的免疫接種方案。
[0115] 圖7表示在3個取出後的經過時間中，從VP0(箭頭）的多克隆兔抗血清探測的免 疫印跡。
[0116] 圖8表示從以SN07感染Sf9細胞的上清液中的低聚抗原接受免疫接種的小鼠取 出的混合中和血清。在ELISA法中對於重組VP2顯示出了高滴度。
[0117] 圖9表示從以SN07感染Sf9細胞的上清液中的低聚抗原接受免疫接種的小鼠取 出的混合中和血清。與VP1相比，與VP2和VP0更牢固地結合。
[0118] 圖 10 表示 EMCV 基因組的 EMCV IRES 區域（SEQ ID NO :1)。
[0119] 圖11表示EMCV起始密碼子與3CD蛋白酶編碼序列的輸出幀：天然IRES序列（SEQ ID NO :2)與突變IRES序列（SEQ ID NO :3)的比較。
[0120] 圖 12 表示質粒 pSN01-Ml。
[0121] 圖 13 表示質粒 pSN01-M2。
[0122] 圖 14 表示質粒 pSN01-M3。
[0123] 圖15表不用於HEV71VLP的表達的不同設計的重組杆狀病毒的表達的比較。
[0124] 圖 16 表不質粒 pFastBac?HT。
[0125] 圖17表示對人腸道病毒A及人腸道病毒C的抗原融合蛋白的原核表達構建體。
[0126] 圖18表示來自從以SN07餘量接受免疫接種的小鼠取出的混合中和血清的抗體。 與HEV71VLP的所有組成要件結合。
[0127] 圖19表示HEV71VLP的表徵，是來自培養上清液的HEV71VLP的沉降。
[0128] 圖20表示親和柱（AFC)的純化HEV71VLP的分析。
[0129] 圖21表示AFC純化HEV71VLP的電子顯微鏡照片。
[0130] 圖22表不人腸道病毒C (脊髓灰質炎病毒-PV)的VLP表達。
[0131] 圖23表示脊髓灰質炎病毒的VLP VP3-VP1的ELISA。
[0132] 圖24表示具有HEV71-IRES及HEV713CD蛋白酶的HEV71VLP表達盒。
[0133] 圖25表示具有PV-IRES及HEV713CD蛋白酶的HEV71VLP表達盒。

【具體實施方式】
[0134] 本發明提供一種病毒，該病毒為從用於防止和/或治療小核糖核酸病毒感染的 免疫原性組合物和/或作為疫苗從小核糖核酸病毒科的病毒獲得的，抗原的病毒樣顆粒 (VLP)、病毒衣殼粒、聚集體及複合物。代表性的例子包括腸道病毒，柯薩奇病毒和脊髓灰質 炎病毒等。
[0135] 本發明的另一方式提供一種誘導中和抗體的病毒蛋白質，例如P1蛋白或小核糖 核酸病毒的VP0蛋白、VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和/或VP4蛋白的組合，或其免疫活性 片段或生物活性片段。本發明還包括由上述病毒蛋白質和/或其片段構成的融合蛋白，該 融合蛋白為誘導具有保護性免疫的中和抗體的生成的，免疫活性或生物活性蛋白。
[0136] 在實施方式中，腸道病毒的抗原可以是腸道病毒的外殼蛋白/衣殼蛋白的組合， 或其免疫活性片段。該病毒的外殼蛋白/衣殼蛋白可以是VP0、VP1、VP2、VP3和/或VP4蛋 白中的任一組合，也可以採取病毒樣顆粒（VLP)、衣殼粒、複合物和/或聚集體中的任一形 式。該組合可以以融合蛋白的形式存在。
[0137] 本發明的又一方式，包括生成小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒（VLP)、衣殼粒、復 合物和/或聚集體的方法。該方法包括以下步驟：（i )構建一種與啟動子可操作地結合的 表達盒，該啟動子由對小核糖核酸病毒的蛋白質，例如P1蛋白或小核糖核酸病毒的VP0蛋 白、VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和/或VP4蛋白的組合分別進行編碼的1種以上的核酸構 成，所述蛋白質與內部核糖體進入位點（IRES)可操作地結合，該IRES與3C或3CD蛋白酶 可操作地結合的步驟，（ii )以該表達盒對適合的宿主細胞進行轉染或轉化的步驟，（iii) 表達表達盒所包含的核酸後，在通過細胞在生成病毒樣顆粒（VLP)和/或衣殼粒和/或抗 原的條件下培養該宿主細胞的步驟。
[0138] 得到核酸或重組DNA分子，並由此可以將編碼柯薩奇病毒A16、HEV71、人腸道病毒 C (人脊髓灰質炎病毒PV1、PV2和/或PV3)、EV68或任何其他小核糖核酸病毒的蛋白質及 蛋白酶的開放閱讀框，通過使用補充柯薩奇病毒A16、HEV71、人腸道病毒C或任何其他小核 糖核酸病毒的核酸序列的適當設計的引物的PCR擴增來進行擴增。合適的引物可以使用以 往的技術根據能夠從包括柯薩奇病毒A16、HEV71、人腸道病毒C或任何其他小核糖核酸病 毒的腸道病毒得到的核酸序列進行設計。完整的基因組序列能夠從GenBank得到，另外，可 訪問美國國立生物技術信息中心（NCBI)。
[0139] 在實施方式中，小核糖核酸病毒P1蛋白或其他腸道病毒P1蛋白表達為多肽。接 著，該多肽由3C或3CD蛋白酶裂解成VP0、VP1及VP3病毒蛋白或其免疫活性片段或生物活 性片段。腸道病毒蛋白誘導針對腸道病毒的中和抗體。該VP0蛋白可進一步裂解成誘導針 對腸道病毒的中和抗體的VP2蛋白和VP4蛋白或其免疫活性片段或生物活性片段。也可使 病毒蛋白質自組裝成腸道病毒蛋白質的VLP、衣殼粒和/或聚集體。另外，該蛋白酶基因可 被包括在VLP表達盒的相同的DNA重組分子或不同的DNA重組分子中，和/或可以從不同 的啟動子或翻譯元件表達。
[0140] 構建VLP表達盒的重組DNA分子及核酸，由此，可以將編碼小核糖核酸的結構蛋白 或蛋白酶的開放閱讀框通過使用補充柯薩奇病毒的核酸序列的適當設計的引物的PCR擴 增來進行擴增。
[0141] 在另一實施方式中，該重組DNA分子可編碼具有至少2種腸道病毒的結構蛋白或 其一部分的融合蛋白。該蛋白質表達為單一多肽抗原。
[0142] 本發明包括提供腸道病毒的結構蛋白（P1區域）和針對蛋白酶（3CD)的基因序列 的VLP表達盒。該遺傳序列是為了將P1蛋白切割成病毒外殼的蛋白質所必須的。通過切 割使腸道病毒VLP進行自組裝。該表達盒是雙順反子載體，其使用位於針對腸道病毒的P1 蛋白的核酸編碼序列的上遊的啟動子。在編碼P1蛋白質的順反子的下遊具有內部核糖體 進入位點（IRES)序列，接著是包含編碼3CD蛋白酶的核苷酸序列的順反子。
[0143] P1區域和3⑶蛋白酶的表達從單一雙順反子信使進行，其中，3⑶蛋白酶基因在 IRES的控制下實施帽非依賴方式翻譯。蛋白酶3⑶的表達稍有毒性，因此有可能導致宿主 細胞的過早死亡。由此，降低了腸道病毒衣殼蛋白和VLP的產率。也可以以高水平維持來 自表達盒的P1蛋白的表達的同時，降低蛋白酶的活性。通過將包括突變型的各種IRES和 IRES序列插入表達盒，從而以能夠無細胞毒性地，適當地切割P1的方式，控制3⑶蛋白酶 的表達/活性，並特定有效的IRES。為了高效生產VLP，對在來自不同的病毒種或血清型的 IRES的控制下表達的具有完整P1編碼序列和完整3CD蛋白酶編碼序列的重組杆狀病毒進 行了測試。
[0144] 例如，本發明的表達盒可包含啟動子，該啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、 EMCV IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0145] 本發明的表達盒可包含啟動子，該啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、人腸道 病毒C IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0146] 本發明的表達盒可包含啟動子，該啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、 HEV71IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0147] 此外，本發明的表達盒可包含啟動子，該啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、 EMCV IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
[0148] 此外，通過包含有效IRES的表達盒中的3⑶蛋白酶的截斷及突變，能夠實現VLP 的最大產量。例如，作為GenBank登錄號DQ341362. 1的胺基酸1671號的HEV71的3C蛋白 酶的甘氨酸，通過針對突變HEV713C的表達的位點定點誘變和後續的HEV71P1多肽的切割 來轉換為丙氨酸。
[0149] 與將來自表達盒的蛋白質的表達及活性提高至高水平的目標相關的本領域的一 般性知識相反，實施方式中，本發明成功降低蛋白質的活性來實現了最高蛋白質產量。降低 活性的IRES或3C蛋白酶核酸的突變意外地增加了腸道病毒的衣殼蛋白和VLP的產量。
[0150] 表達盒可以被克隆到合適的載體中，並轉染/轉化為與預防由包括腸道病毒的小 核糖核酸病毒引起的感染的疫苗用抗原的表達/純化有關的適合的宿主細胞。
[0151] 編碼小核糖核酸病毒抗原的表達盒可包括能夠轉染到真核宿主細胞，並可以在適 合的生長條件下表達的質粒。適合的真核表達系統是本領域技術人員已知的，並且包括誘 導型表達系統和適合的真核宿主細胞。
[0152] 包含本發明的表達盒的哺乳動物細胞表達載體包括可被瞬時轉染到宿主細胞及 細胞株的載體。另外，哺乳動物細胞表達載體可以是以轉染後的宿主細胞內穩定地維持的 載體。
[0153] 並且，哺乳動物細胞的表達載體可包括穩定地或瞬時轉染到哺乳動物宿主細胞或 細胞株的載體。其中，作為試驗對象的蛋白質的表達通過在培養基中添加誘導劑來誘導。 哺乳動物宿主細胞和細胞株包括，例如CH0、HEK293、C0S-l、HeLa、Vero及NIH3T3細胞。另 夕卜，作為其他的真核宿主細胞也可以包括酵母細胞或其他的哺乳動物細胞株。
[0154] 表達盒可以包含在可轉染到宿主細胞的重組病毒中。能夠用於這一目的適合的 病毒包括杆狀病毒、牛痘、辛德畢斯病毒、SV40、仙臺病毒、逆轉錄病毒和腺病毒。適合的宿 主細胞可以包括與上述病毒具有相容性的宿主細胞，可以包括例如草地夜蛾（例如Sf9細 胞）、粉紋夜蛾、CH0細胞、雞胚成纖維細胞、BHK細胞、人SW13細胞、果蠅及源自白紋伊蚊的 蚊子細胞等昆蟲細胞。
[0155] 包括腸道病毒核酸的表達盒可以通過本領域技術人員已知的方法引入到適合的 宿主細胞中。宿主細胞在允許腸道病毒的基因及蛋白質的表達的條件下被生長和培養。
[0156] 編碼誘導針對腸道病毒的中和抗體的腸道病毒的VP2蛋白或其免疫活性片段或 生物活性片段的基因可被插入在含有合適的啟動子的質粒中，並表達於宿主細胞中。為了 用作疫苗或用於診斷用途，根據免疫原性組合物分離/利用所生成的腸道病毒的VP2蛋白。
[0157] 編碼誘導針對腸道病毒的中和抗體的腸道病毒的VP4蛋白或其免疫活性片段或 生物活性片段的基因可被插入在含有合適的啟動子的質粒中，並表達於宿主細胞中。為了 用作疫苗或用於診斷用途，根據免疫原性組合物分離/利用所生成的腸道病毒的VP4蛋白。
[0158] 編碼誘導針對腸道病毒的中和抗體的腸道病毒的VP0蛋白或其免疫活性片段或 生物活性片段的基因可被插入在含有合適的啟動子的質粒中，並表達於宿主細胞中。為了 用作疫苗或用於診斷用途，根據免疫原性組合物分離/利用所生成的腸道病毒的VPO蛋白。
[0159] 編碼腸道病毒的VP0蛋白的基因可以與合適的啟動子可操作地結合，並插入到質 粒中。該質粒表達結合有合適的啟動子的腸道病毒蛋白酶以提供雙重的重組質粒。該雙重 重組質粒可以最終表達在真核細胞表達系統或原核細胞表達系統中。
[0160] 用於腸道病毒多肽抗原的表達及對基因克隆的合適的載體包括粘粒或質粒。合適 的表達系統包括本領域技術人員已知的包括原核生物表達系統和大腸桿菌，通過用於表達 原核細胞內的蛋白質的粘粒或質粒進行轉化的原核宿主細胞。
[0161] 另外，合適的表達系統包括本領域技術人員已知的真核表達系統和通過用於表達 各種真核宿主細胞及細胞系中的蛋白質的質粒進行轉化的真核宿主細胞。
[0162] 此外，腸道病毒的多肽抗原可通過那些本領域技術人員已知的方法從宿主細胞或 培養物上清液中獲得。
[0163] 腸道病毒VLP、衣殼粒、抗原及其免疫活性要件和/或其聚集體可通過本領域技術 人員已知的適合的純化方法，從轉染和/或轉化的宿主細胞或宿主細胞培養基、上清液及 裂解液獲得。釋放到培養基中的蛋白質的分離是獲得腸道病毒VLP、衣殼粒、抗原和/或聚 集體的一種簡便的方法。腸道病毒VLP、衣殼粒、抗原及其免疫活性要件和/或聚集物可通 過本領域技術人員已知的方法進一步進行濃縮/純化。
[0164] 本發明的另一方式包括一種含有小核糖核酸抗原的疫苗，該疫苗包括腸道病毒的 抗原、VLP和/或衣殼粒與抗原性佐劑（adjuvant)的組合等。可將小核糖核酸病毒的抗原、 其免疫活性片段、VLP和/或衣殼粒與改良型痘苗病毒、免疫刺激複合物（ISC0MS)、明礬、氫 氧化鋁、磷酸鋁、弗氏不完全或完全佐劑、Quil A及其它皂苷或作為Vanselow(1987)S. Vet. Bull. 57881-896的實施例中記載的其他抗原性佐劑等適合的抗原性佐劑組合來使用。
[0165] 本說明書中使用的術語"磷酸鋁"及"氫氧化鋁"包括適合作為疫苗的佐劑的氫氧 化鋁或磷酸鋁的所有形式。
[0166] 此外，小核糖核酸病毒的抗原可通過基於能夠得到人脊髓灰質炎病毒的核酸或蛋 白質序列的多肽化學合成或化學合成來製備。
[0167] 在一方式中，本發明提供包含1種以上的人腸道病毒C抗原的疫苗。如本說明書 中引用的"脊髓灰質炎病毒抗原"或"人腸道病毒C抗原"這種表達是指能夠刺激針對人腸 道病毒C的中和抗體的任何抗原。病毒抗原可以包括外殼蛋白/衣殼蛋白或其片段、抗原 決定簇和/或其他人腸道病毒C的蛋白質。
[0168] 本發明的另一方式涉及包括將單人腸道病毒C的外殼蛋白/衣殼蛋白作為抗原 的，人腸道病毒C的亞單位疫苗。更具體地而言，本發明涉及一種疫苗，該疫苗作為抗原包 括人腸道病毒C的VP2外殼蛋白/衣殼蛋白，或其免疫原性片段。
[0169] 本發明的另一方式包括一種疫苗，該疫苗包括包含人腸道病毒C的VP1、VP2、VP3 和/或VP4或VP0蛋白的人腸道病毒C的病毒樣顆粒（VLP)、衣殼粒、複合物和/或聚集體。
[0170] 獲得重組DNA分子，由此可以通過使用補充人腸道病毒C的核酸序列的適當設計 的引物的PCR擴增獲得包含編碼人腸道病毒C的結構蛋白或蛋白酶的開放閱讀框的核酸。 合適的引物可以根據從人腸道病毒的C得到的核酸序列，例如其完整的基因組序列，使用 以往的技術進行設計。完整的基因組序列可在GenBank中獲得，此外，可以訪問美國國立生 物技術信息中心（NCBI)。針對人腸道病毒C的完整基因組、脊髓灰質炎病毒I型基因組的 登錄號為V01149和V01150。
[0171] 本發明的表達盒可以包括編碼人腸道病毒C的P1多肽的核酸。P1多肽通過在表 達盒的IRES的控制下被翻譯的3CD蛋白酶被切割，並生成VP1、VP3和/或VP0多肽。VP0、 VP1和VP3的組合自組裝成病毒樣顆粒。
[0172] 人腸道病毒C的多肽抗原可以包括作為進一步切割VP0而獲得的生成物的人腸道 病毒C的外殼VP2蛋白/衣殼蛋白VP2與其他脊髓灰質炎病毒VPO、VP1、VP3和/或VP4外 殼蛋白/衣殼蛋白的組合。人腸道病毒C的外殼蛋白/衣殼蛋白的組合可採取病毒樣顆粒 (VLP)、衣殼粒、複合物和/或聚集體的形式。
[0173] 編碼人腸道病毒C的外殼蛋白/衣殼蛋白VP2的基因可被插入到含有合適的啟動 子的質粒中，並表達在宿主細胞中。由於該蛋白質用作疫苗，因此基於免疫原性組合物被 分離。此外，編碼人脊髓灰質炎病毒的VP2蛋白的基因可被插入到含有合適的啟動子的質 粒中，並表達在宿主細胞中，由於該蛋白質用作疫苗，因此基於免疫原性組合物被分離/利 用。
[0174] 編碼人腸道病毒C的外殼蛋白/衣殼蛋白VP4的基因可被插入到含有合適的啟動 子的質粒中，並表達在宿主細胞中。由於該蛋白質用作疫苗，因此基於免疫原性組合物被 分離。此外，編碼人脊髓灰質炎病毒的VP4蛋白的基因可被插入到含有合適的啟動子的質 粒中，並表達在宿主細胞中，由於該蛋白質用作疫苗，因此基於免疫原性組合物被分離/利 用。
[0175] 編碼人腸道病毒C的外殼蛋白/衣殼蛋白質VP0基因可被插入到含有合適的啟動 子的質粒中，並表達在宿主細胞中。由於該蛋白質用作疫苗，因此基於免疫原性組合物被 分離。此外，編碼人脊髓灰質炎病毒的VP0蛋白的基因可被插入到含有合適的啟動子的質 粒中，並表達在宿主細胞中，由於該蛋白質用作疫苗，因此基於免疫原性組合物被分離/利 用。
[0176] 本發明包括包含由人腸道病毒C的VPO、VP1、VP2、VP3、VP4多肽及免疫活性片段 中的1個以上構成的1種以上的免疫活性抗原的疫苗。該疫苗誘發針對人的腸道病毒的保 護性免疫反應和/或中和免疫反應。
[0177] 在實施方案中，表達盒主要由編碼人腸道病毒C的P1多蛋白的核酸、IRES及IRES 的翻譯控制下的腸道病毒的3CD蛋白酶構成。該蛋白酶將人腸道病毒C的P1多蛋白裂解 成結構衣殼蛋白。
[0178] 在另一方式中，本發明提供一種疫苗，該疫苗包括從包含VP2、VP4和/或VP0蛋 白，和/或生物活性片段或免疫活性片段的P1多蛋白衍生的人腸道病毒A抗原。人腸道病 毒A抗原可源自HEV71和/或柯薩奇病毒A16。HEV71抗原可以是單人腸道病毒外殼蛋白 /衣殼蛋白。尤其，HEV71抗原可以是通過對人施用來誘導免疫反應的HEV71的P1多蛋白、 VP4、VP2或VP0多肽，或其片段。
[0179] 在實施方案中，人腸道病毒A抗原可以是人腸道病毒A的外殼蛋白/衣殼蛋白，或 其免疫活性片段的組合。例如，人腸道病毒A抗原可包括脊髓灰質炎病毒的VP2蛋白與選 自VP1、VP3和/或VP4多肽的其他脊髓灰質炎病毒的外殼蛋白/衣殼蛋白的組合。VP2多 肽與其他脊髓灰質炎病毒的外殼蛋白/衣殼蛋白的組合可以採取病毒樣顆粒（VLP)、衣殼 粒、複合物和/或聚集體的形式。另外，該組合也可以以融合蛋白的形式存在。
[0180] 更具體而言，本發明涉及一種疫苗，該疫苗包括人腸道病毒A的VP2外殼蛋白/衣 殼蛋白，或其免疫原性片段來作為抗原。
[0181] 本發明的另一方式包括一種疫苗，該疫苗包含由人腸道病毒A的VP 1、VP2、VP3和 /或VP4,或VP0蛋白構成的人腸道病毒A的病毒樣顆粒（VLP)和/或衣殼粒。
[0182] 獲得重組DNA分子，由此能夠通過使用補充人腸道病毒A的核酸序列的適當設計 的引物的PCR擴增來對所得到編碼人腸道病毒A的結構蛋白和/或蛋白酶的開放閱讀框進 行擴增。合適的引物根據能夠從HEV71獲得的核酸序列，使用以往的技術進行設計。針對 HEV71的完整基因組序列的登錄號為DQ341362, AB204852, AF302996和AY465356。
[0183] 獲得重組DNA分子，由此能夠通過使用補充人腸道病毒A的核酸序列的適當設計 的引物的PCR擴增來對編碼人腸道病毒A的P1、VP 1、VP2、VP3和/或VP4或VP0蛋白和免 疫活性片段及蛋白酶的開放閱讀框進行擴增。
[0184] 本發明的一方式中，人腸道病毒A的P1蛋白被表達並形成多聚蛋白或多肽，接著 多聚蛋白或多肽由3C或3⑶蛋白酶裂解成VPO、VP1和VP3蛋白。VP0蛋白可進一步裂解 成VP2及VP4蛋白。可使腸道病毒的蛋白質自組裝成腸道病毒的蛋白質的VLP、衣殼粒、復 合物和/或聚集體。另外，非結構基因和蛋白酶基因可被包含在相同的DNA重組分子或不 同的DNA重組分子中和/或根據不同的啟動子和翻譯元件來表達。
[0185] 本發明的表達盒可以包括編碼人腸道病毒A的P1多肽的核酸。P1多肽由在表達 盒的IRES的控制下被翻譯的3CD蛋白酶切割（裂解），並生成VP1、VP3及VP0多肽及其免 疫活性片段。VP0、VP1及VP3多肽的組合可以自組裝成病毒樣顆粒。
[0186] 編碼人腸道病毒A的VP2蛋白或其免疫活性片段的基因可被插入到含有合適的啟 動子的質粒中，並表達在宿主細胞中。由於HEV71的VP2蛋白用作疫苗或用於診斷用途，因 此可基於免疫原性組合物被分離/利用。
[0187] 編碼人腸道病毒A的VP4蛋白或其免疫活性片段的基因可被插入到含有合適的啟 動子的質粒中，並表達在宿主細胞中。由於被分離的VP4蛋白用作疫苗或用於診斷用途，因 此可基於免疫原性組合物被分離/利用。
[0188] 編碼人腸道病毒A的VP0蛋白或其免疫活性片段的基因可被插入到含有合適的啟 動子的質粒中，並表達在宿主細胞中。由於被分離的VP0蛋白用作疫苗或用於診斷用途，因 此可基於免疫原性組合物被分離/利用。
[0189] 編碼人腸道病毒A的VP0蛋白或其免疫活性片段的基因可與合適的啟動子可操作 結合併插入到質粒中。該質粒表示與合適的啟動子結合的人腸道病毒A的蛋白酶，並提供 雙重的重組質粒。該雙重重組質粒最終可以被表達在真核細胞表達系統或原核細胞表達系 統中。
[0190] 包含在表達盒中的人腸道病毒A的基因及核酸可以通過本領域技術人員已知的 方法被引入到適合的宿主細胞中。宿主細胞在允許人腸道病毒A基因及蛋白質的表達的條 件下被生長培養。
[0191] 本發明包括包含由人腸道病毒A的VPO、VP1、VP2、VP3、VP4多肽及其免疫活性片 段中的1個以上構成的1種以上的免疫活性抗原的疫苗。該疫苗誘發針對人的腸道病毒的 保護性免疫反應和/或中和免疫反應。
[0192] 在一實施方案中，表達盒主要由編碼人腸道病毒A的P1多蛋白的核酸、IRES及 IRES的翻譯控制下的腸道病毒的3CD蛋白酶構成。該蛋白酶將腸道病毒的P1多蛋白切割 成腸道病毒的結構衣殼蛋白。該結構蛋白可採取VLP、衣殼粒、複合物和/或聚集體的形式。
[0193] 實際上，本說明書所述的1種以上的腸道病毒的蛋白質的表達提供一種誘導抗體 的抗原。該抗體為功能性抗體，且能夠以高滴度中和選自HEV71、柯薩奇病毒A16、人腸道病 毒C或其它小核糖核酸病毒的腸道病毒。
[0194] 1種以上的腸道病毒的蛋白質的表達表示VP2和/或VP0多肽含有通過中和抗血 清識別的表位。
[0195] 這些功能性抗體意外地比起腸道病毒VP1多肽，與VP2及VP0多肽更牢固地結合。 VP1多肽在本領域中已知為主要用於生成中和抗體的衣殼蛋白，因此VP2多肽在用於生產 針對HEV71感染的中和抗體時起到重要的作用，這是出乎意料的。
[0196] 因此，令人驚訝的是，在腸道病毒的衣殼蛋白中，VP2多肽在生成針對腸道病毒 感染的中和抗體時，起到顯性表位或抗原決定簇的功能。HEV71的VP2多肽單獨或與其它 HEV71的衣殼蛋白，例如VP0多肽組合，作為誘導針對HEV71的中和抗體的主要抗原發揮作 用。
[0197] 在本發明的一方式中，以預防腸道病毒感染為目的的預防性疫苗接種期待使用如 下疫苗，即將人腸道病毒的VP0和/或VP2結構蛋白引入免疫原性組合物中的疫苗。免疫 原性組合物或疫苗可以包含包括HEV71及柯薩奇病毒A16的從人腸道病毒A衍生的VP0或 VP2結構蛋白或其組合。免疫原性組合物可施用於受試者，以誘導針對人腸道病毒的中和抗 體。免疫原性組合物可被包括在為了預防由HEV71和/或柯薩奇病毒A16等人腸道病毒A 引起的手足口病而施用於受試者的疫苗中。
[0198] 在本發明的另一方式中，以以下目的提供了治療性疫苗，即預防和/或緩解HEV71 和/或柯薩奇病毒A16感染引起的併發症，例如表現為腦膜炎，腦炎，急性弛緩性麻痺，肺水 腫和心臟衰竭等症候群的神經系統或心血管併發症。
[0199] 在本發明的一方式中，以預防腸道病毒感染為目的的預防性疫苗接種期待使用如 下疫苗，即包括人腸道病毒C的VP0或VP2結構蛋白，例如PV1、PV2、PV3結構蛋白或它們的 組合，或者其生物活性片段或免疫活性片段進行組合的疫苗。免疫原性組合物可包括在為 了預防由包含PV1、PV2、PV3的人腸道病毒C引發的脊髓灰質炎而施用於受試者的疫苗中。
[0200] 此外，免疫原性組合物或疫苗可以包括由人腸道病毒C和人腸道病毒A這兩者衍 生的抗原的組合。
[0201] 參考附圖中的圖示對本發明的各實施方式進行說明。在這些實施方式中，例示舉 出腸道病毒的VLP、衣殼粒、抗原及聚集體以及DNA重組分子的特定構建體。
[0202] 能夠得出生成中和抗體時腸道病毒的VP2多肽非常重要的結論。可以說VP2多肽 足以製作應對由人腸道病毒A的HEV71及柯薩奇病毒A16 ;人腸道病毒C的1型、2型、3型； 及人腸道病毒D的EV68等的小核糖核酸病毒感染的疫苗。
[0203] 在本發明的一方式中，以預防小核糖核酸病毒感染為目的的預防性疫苗接種期待 用於將病毒的至少VP0和/或VP2及VP4結構蛋白引入免疫原性組合物中的疫苗中。免疫 原性組合物可以施用於受試者，以誘導針對小核糖核酸病毒的中和抗體。免疫原性組合物 可以被包括在施用於受試者的預防小核糖核酸病毒感染為目的的疫苗中。
[0204] 在本發明的另一方式中，提供一種治療性疫苗：以預防和/或緩解小核糖核酸病 毒感染引發的併發症，例如，表現為腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫和心臟衰竭等綜 合徵的神經系統或心血管系統的併發症。
[0205] 在本發明的又一方式中，提供一種作為藥物來使用的基於本發明的疫苗組合物。
[0206] 在又一方式中，本發明提供一種包含腸道病毒VP0和/或VP2和/或VP4抗原的2 價疫苗或多價疫苗。例如，可結合人腸道病毒A的VP0和/或VP2和/或VP4抗原。此外， 從不同的血清型獲得的人腸道病毒A的上述抗原，即可將從柯薩奇病毒A16及HEV71衍生 的抗原與例如針對人手足口病的疫苗進行組合。
[0207] 能夠由本說明書中記載的表達盒生成2價疫苗或多價疫苗的腸道病毒抗原。腸道 病毒抗原可以為病毒樣顆粒、衣殼粒、複合物和/或聚集體的形式。
[0208] 在又一方式中，本發明提供了一種包含腸道病毒抗原的2價疫苗或多價疫苗。該 抗原在白喉（D)、破傷風（T)、百日咳（P)、b型流感嗜血桿菌（Hib)、A型肝炎（HA)、B型肝 炎（HB)及人腸道病毒71型等病原體中的1個以上的病原體提供免疫力。
[0209] 在兒科疫苗中，也可包括具有兼容性的其他抗原，例如，已知有效預防B型腦膜 炎、A型腦膜炎、C型腦膜炎及中耳炎的抗原。
[0210] 小核糖核酸病毒抗原在各疫苗的劑量中的量應選擇能夠誘發免疫保護反應，而不 會伴有在接種疫苗的受試者中經常出現的不良副作用的量。所述量根據被採用的免疫原而 變化。在特定疫苗中的最佳量可通過包括觀察受試者的抗體滴度及其它反應的一系列的標 準研究來確定。在最初的疫苗接種中，為了提供免疫保護反應，可間隔最佳時間間隔而施用 2?3個劑量的疫苗。
[0211] 因此，本發明提供一種預防人感染小核糖核酸病毒的方法。該方法包括：以基於上 述的本發明的方式中的1個方式的疫苗的免疫有效劑量對有需要的受試者實施治療的方 法。
[0212] 在本說明書和權利要求中，下述術語視為具有如下含義。
[0213] "抗體"是指生成具有由抗原（免疫原）在人或其它動物的體內誘發的特定的氨基 酸序列的B淋巴樣細胞的免疫球蛋白分子。該分子的特徵為與抗原進行具體反應。
[0214] "抗體反應"或"體液免疫反應"是指一種由B淋巴樣細胞生成的抗體根據抗原刺 激分泌到血液和/或淋巴液中的類型的免疫反應。在正常發揮功能的的免疫反應中，抗體 在細胞（例如病原體）的表面上與抗原特異性結合，且標記為由吞噬細胞和/或補體介導 機制所破壞的細胞。
[0215] "抗原"是指與適合的細胞接觸的結果，誘發敏感性反應和/或免疫反應，在致敏受 試者的體內或體外與抗體和/或免疫細胞明顯反應的物質。
[0216] "表位"是指複合物抗原分子上的抗原決定簇的最簡單的一種形式。這相當於通過 免疫球蛋白或T細胞受體被識別的抗原的特定部位。
[0217] "融合蛋白"是指通過組合由不同的腸道病毒的結構蛋白衍生的2個以上的基因序 列製成的多肽的表達而形成的蛋白質抗原。
[0218] "免疫活性片段"或"生物活性片段"是指誘導針對腸道病毒的中和抗體的腸道 病毒的結構蛋白的片段。因此，在本發明的上下文中，為了實現特異性免疫反應，免疫活性 片段更優選為了誘導呈現在生物體的免疫系統中，並預防性保護有機體免受腸道病毒的感 染。
[0219] 中和抗體的免疫反應是指識別免疫系統的特異性細胞呈現異源蛋白、多肽或表 位，並開始特異性免疫反應。
[0220] 在實施方式中，根據本發明的疫苗抗原可誘導保護性免疫反應。本說明書中使用 的"保護性免疫反應"和/或"中和免疫反應"等術語是指疫苗受試者抵抗或保護自身免受 作為接種疫苗的原因的基於致病因子的感染的方法。
[0221] "細胞反應"或"細胞宿主反應"是指一種以特定的輔助性和殺傷性T細胞為介質 進行的，能夠直接排除病毒感染或癌細胞的免疫反應。
[0222] "抗原呈遞細胞"是指主要負責處理抗原及呈遞至淋巴細胞的抗原誘導事件的輔 助細胞。抗原呈遞細胞（APC)與抗原的相互作用在淋巴細胞遭遇抗原分子並對其進行識 別激活這一點在免疫誘導中是一個非常重要的步驟。作為APC可以舉出巨噬細胞、郎格罕 氏-樹突狀細胞、濾泡樹突細胞及B細胞。
[0223] "B細胞"是指一種生成與抗原相互作用的免疫球蛋白或抗體的淋巴細胞。
[0224] "細胞毒性T淋巴細胞"是指一種生成病毒抗原，且能夠破壞感染了外來細胞和傳 染性病原體的宿主細胞的特殊的淋巴細胞。
[0225] "主要包括"是指除必不可少的成分外，組合物內還可以存在其它成分，但即使存 在其他成分，組合物的本質性的，基本的和/或新的特性也不會因該存在而受到影響。
[0226] "可操作地結合"是指所記載的成分彼此具有能夠相互發揮預期的功能的關係。 例如，啟動子以能夠生成單順反子信使RNA、單個雙順反子信使RNA或單個多順反子信使 RNA(mRNA)的方式組合，該啟動子與順反子的，或1個以上的順反子的核酸"可操作地結 合"。信使RNA的蛋白質表達可以根據核酸序列的轉錄元件/翻譯元件來調整。IRES序列 在比順反子更靠上遊（5'）側的方向被插入到表達盒中是指，S卩，順反子的核酸與IRES序列 結合，以使順反子mRNA的翻譯在IRES的控制下被調整。
[0227] 如附圖所示對本發明的各種實施方式進行說明。在這些實施方式中，例示舉出小 核糖核酸病毒的VLP、衣殼粒、抗原及聚集體以及DNA重組分子的特異性構建體。
[0228] 實施例1.有關HEV71的VLP表達盒及載體的說明。
[0229] 可以通過本領域周知的方法來構建表達盒。
[0230] 1. 1HEV71 的 VLP 表汰盒「P1+IRES+3CD1
[0231] 特徵:
[0232] 盒尺寸：5172bp
[0233] prPS :痘病毒合成的強早期/晚期啟動子，43bp
[0234] P1 :來自EV71-SB12736-SAR-03的P1蛋白的編碼序列
[0235] 添加（GenBank登錄號：DQ341362)終止密碼子
[0236] 2588bp
[0237] IRES :內部核糖體進入位點，585bp
[0238] 3CD :來自EV71-SB12736-SAR-03的，C及D的P3蛋白的編碼序列
[0239] 添加（GenBank 登錄號：DQ341362)ATG
[0240] 起始密碼子和終止密碼子，1940bp
[0241] Pac I :稀有切割限制酶（Rare cutters)、使盒被克隆到pSNXOl
[0242] (MVA del3 整合載體）
[0243] 盒被克隆到pD0NR221網關條目載體（Invitrogen公司），以生成pSNOl。
[0244] 有關表達盒和pSNOl質粒的不意圖參考圖1。
[0245] 1. 2HEV71 的 VLP 表汰盒「P1+IRES+3C1
[0246] 特徵:
[0247] 盒尺寸：3773bp
[0248] prPS :痘病毒合成的強早期/晚期啟動子，43bp
[0249] P1 :來自EV71-SB12736-SAR-03的P1蛋白的編碼序列
[0250] 添加（GenBank登錄號：DQ341362)終止密碼子
[0251] 2588bp
[0252] IRES :內部核糖體進入位點，585bp
[0253] 3CD :來自EV71-SB12736-SAR-03的，C的P3蛋白的編碼序列
[0254] 添加（GenBank 登錄號：DQ341362)ATG
[0255] 起始密碼子和終止密碼子，551bp
[0256] Pac I :稀有切割限制酶（Rare cutters)、使盒被克隆到pSNXOl
[0257] (MVA del3 整合載體）
[0258] 盒被克隆到pD0NR221網關條目載體（Invitrogen公司），以生成pSN03。
[0259] 有關表達盒和pSN03質粒的不意圖參考圖2。
[0260] 1. 3何括插入HEV71「P1+IRES+3CD1或「P1+IRES+3C1的獲得重糹目杆狀病毒的方法
[0261] HEV71 的 P1+3CD 的源材料是 pSNOl，P1+3C 是 pSN03。其目的是按照 Invitrogen 公司BAC-T0-BAC?」手冊（2009)的指示，通過使用了 LR CL0NASE?的attL/aaR體外重組，將 HEV71-VLP盒從pSNOl及pSN03 (輸入向量）引進杆狀病毒表達質粒pDEST8 (目標載體）。
[0262] 由此，構成兩個重組反應。
[0263] 生成 pSNOl (EV71-P1+3CD) XpDEST8 :pSN07
[0264] 生成 pSN03 (EV71-P1+3C) XpDEST8 :pSN08
[0265] 使用 pSN07 和 pSN08,通過 DHlObac 的轉化，以如 Invitrogen 公司 BAC-TO-BAC? 手 冊所記載的方式生成重組杆狀病毒bacSN07和bacSNOS。通過對重組杆粒進行向Sf9細胞 的轉染來拯救重組杆狀病毒的SN07和SN08。重組杆狀病毒的SN07和SN08被用於進一步 進入於6個孔板中的感染Sf9細胞來評估被切割的衣殼蛋白的表達。對VP1使用特異的多 克隆兔抗血清，在從感染了重組杆狀病毒的Sf9細胞獲得的裂解液及上清液的免疫印跡中 特定VP1蛋白。
[0266] 1. 4感染了 SN07的Sf9細朐的h.清液中的VP1的表汰
[0267] 感染Sf9細胞的上清液為從感染後的第3天到第7天每日採取的上清液。將蛋 白質分解在12%的SDS-PAGE，並轉移至硝酸纖維素膜之後，將其用多克隆兔抗VP1抗血清 (1:4000稀釋率）檢查一夜，然後以HRP偶聯兔抗（1:1000稀釋率）在室溫下檢查1小時。 接著使用TMB實施免疫印跡法。將其結果示於圖3。可知HEV71的VP1被切割，從感染後的 第3天及第4天的上清液可以觀察到蛋白質的表達，之後，VP1的表達量逐漸減少。通過感 染Sf9細胞，重組杆狀病毒的SN07生成能夠在上清液中發現的抗原。
[0268] 實施例2.上清液和裂解液這兩者中切割完成的VP1。
[0269] 用包括SN07、SN08、對照組的控制杆狀病毒bac⑶S及模擬感染的不同的重組杆狀 病毒株，使Sf9細胞以感染複數（Μ0Ι) 10被感染。感染後的第3天和第4天獲得上清液和 裂解液，並使用兔抗VP1抗血清（1:4000稀釋），通過免疫印跡法評估蛋白質的表達，並對 由SN07及SN08生成的蛋白質的產量進行比較。如圖4所示，在感染後的第3天和第4天 這兩天，在上清液及裂解液這兩者中，表達構建體SN07產生比表達構建體SN08更多的裂解 VP1。
[0270] 實施例3. VP1和VP0存在於基於100kD的截留分子量（MWC0)膜的超濾後的滯留 物中。
[0271] 將來自在感染後的第3天感染SN07的Sf9細胞的上清液淨化，並使其與lOOkDa 的MWC0 -同通過AMfCON?過濾器（Millipore公司）。對滯留物進行測試，並確認已切割的 VP1和VP0的存在。VP1的分子量為約33kDa、VP0的分子量為約36KDa，因此認為這些蛋白 質只能以低聚物的形式殘留於滯留物中。如圖5所示，這些抗原殘留在通過lOOkDa的MWC0 超濾器的上清液的滯留物中。這表明該抗原與低聚形式相關聯。因此，能夠得出如下結論， 即VP1和VP0被切割，且與其他衣殼蛋白低聚關聯。
[0272] 實施例4.當對小鼠接種該滯留物時，誘導針對HEV71的較強的中和抗體。
[0273] 將感染實施例3中製造的SN07的Sf9的上清濃縮物對2組遠交小白鼠進行接種。 所用的免疫接種方案示於圖6。
[0274] 如表1所示，經免疫接種所有小鼠產生了中和HEV71的抗體。對小鼠進行接種時 使用的滯留物誘導了針對HEV71的強中和抗體。
[0275] 表1.針對HEV71的中和抗體
[0276]

【權利要求】
1. 一種疫苗，其特徵在於， 所述疫苗包括由選自％0、￥?1、￥?2、￥?3、￥?4及其免疫活性片段中的1個以上的人腸 道病毒多肽構成的1種以上的免疫活性抗原。
2. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述疫苗誘導針對人腸道病毒的保護性免疫反應和/或中和免疫反應。
3. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述人腸道病毒選自人腸道病毒A、人腸道病毒B、人腸道病毒C及人腸道病毒D。
4. 根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於， 所述人腸道病毒A選自人腸道病毒71 (HEV71)和柯薩奇病毒A16,所述人腸道病毒B選 自柯薩奇病毒B和埃可病毒，所述人腸道病毒C選自人脊髓灰質炎病毒1、人脊髓灰質炎病 毒2及人脊髓灰質炎病毒3,所述人腸道病毒D為EV68。
5. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VPO多肽。
6. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
7. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
8. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
9. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 所述疫苗包括選自1種以上的腸道病毒種類或血清型的多肽。
10. 根據權利要求9所述的疫苗，其特徵在於， 所述腸道病毒種類或血清型可以是選自HEV71和柯薩奇病毒A16的人腸道病毒A。
11. 根據權利要求9所述的疫苗，其特徵在於， 所述腸道病毒種類或血清型可以是選自PV-UPV-2及PV-3的人腸道病毒C。
12. 根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於， 1種以上的免疫活性抗原為病毒樣顆粒、衣殼粒、複合物和/或聚集體的形式，所述1種 以上的免疫活性抗原包括選自VPO、VP1、VP2、VP3、VP4及其免疫活性片段的1種以上的人 腸道病毒多肽。
13. 根據權利要求12所述的疫苗，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP0多肽。
14. 根據權利要求12所述的疫苗，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
15. 根據權利要求12所述的疫苗，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
16. 根據權利要求12所述的疫苗，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
17. -種針對腸道病毒感染對受試者實施疫苗接種的方法，其特徵在於， 所述方法包括對所述受試者施用有效量的由包括選自VPO、VP1、VP2、VP3、VP4及其免 疫活性片段的1種以上的人腸道病毒多肽的1種以上的免疫活性抗原構成的疫苗，所述有 效量是對所述受試者施用疫苗時能夠有效地誘導針對人腸道病毒的保護性免疫反應和/ 或中和免疫反應的程度量。
18. 根據權利要求17所述的方法，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VPO多肽。
19. 根據權利要求17所述的方法，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
20. 根據權利要求17所述的方法，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
21. 根據權利要求17所述的方法，其特徵在於， 所述疫苗包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
22. 根據權利要求17所述的方法，其特徵在於， 1種以上的免疫活性抗原為病毒樣顆粒、衣殼粒、複合物和/或聚集體的形式，所述1種 以上的免疫活性抗原包括選自VPO、VP1、VP2、VP3、VP4及其免疫活性片段的1種以上的人 腸道病毒多肽。
23. 根據權利要求22所述的方法，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP0多肽。
24. 根據權利要求22所述的方法，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP2多肽。
25. 根據權利要求22所述的方法，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP3多肽。
26. 根據權利要求22所述的方法，其特徵在於， 所述病毒樣顆粒包括免疫活性腸道病毒VP1多肽。
27. 根據權利要求17所述的方法，其特徵在於， 所述疫苗包括選自1種以上的腸道病毒種類或血清型的多肽。
28. 根據權利要求27所述的方法，其特徵在於， 所述腸道病毒種類或血清型可以是選自HEV71和柯薩奇病毒A16的人腸道病毒A。
29. 根據權利要求27所述的方法，其特徵在於， 所述腸道病毒種類或血清型可以是選自PV-UPV-2及PV-3的人腸道病毒C。
30. -種表達盒，其特徵在於， 包括與編碼人腸道病毒P1多肽的核酸可操作地結合的啟動子、內部核糖體進入位點 (IRES)、和編碼人腸道病毒3CD蛋白酶的核酸。
31. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述多肽是人腸道病毒P1。
32. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述人腸道病毒3⑶蛋白酶對所述人腸道病毒P1多肽進行處理。
33. 根據權利要求32所述的表達盒，其特徵在於， 經處理的所述人腸道病毒P1多肽協助形成病毒樣顆粒、衣殼粒、複合物和/或聚集體。
34. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述人腸道病毒P1多肽包括選自％0、￥?1、￥?2、￥?3、￥?4及其免疫活性片段的多肽的 組合。
35. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述人腸道病毒選自人腸道病毒A和人腸道病毒C。
36. 根據權利要求35所述的表達盒，其特徵在於， 所述人腸道病毒A選自HEV71和柯薩奇病毒A16。
37. 根據權利要求35所述的表達盒，其特徵在於， 所述人腸道病毒C選自人脊髓灰質炎病毒1 (PV-1)、人髓灰質炎病毒2 (PV-2)及人脊髓 灰質炎病毒3 (PV-3)。
38. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述IRES是由腦心肌炎病毒（EMCV)衍生的。
39. 根據權利要求38所述的表達盒，其特徵在於， 所述腦心肌炎病毒（EMCV)衍生的所述IRES已進行基因改造，IRES活性已降低。
40. 根據權利要求39所述的表達盒，其特徵在於， 所述EMCV衍生的所述IRES通過向JK區段A6的分支環加入一個核苷酸（A7)來進行 基因改造。
41. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述IRES是由人腸道病毒衍生的。
42. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子為真核生物啟動子。
43. 根據權利要求42所述的表達盒，其特徵在於， 所述真核生物啟動子是多角體蛋白啟動子。
44. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、EMCV IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶 的核酸可操作地結合。
45. 根據權利要求44所述的表達盒，其特徵在於， 所述EMCV IRES通過突變降低IRES活性。
46. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、HEV71IRES及人腸道病毒A的3⑶蛋白酶 的核酸可操作地結合。
47. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子與編碼人腸道病毒A的P1多肽、人腸道病毒C IRES及人腸道病毒A的3CD 蛋白酶的核酸可操作地結合。
48. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、人腸道病毒C的IRES及人腸道病毒C的 3⑶蛋白酶的核酸可操作地結合。
49. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、HEV71IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶 的核酸可操作地結合。
50. 根據權利要求30所述的表達盒，其特徵在於， 所述啟動子與編碼人腸道病毒C的P1多肽、EMCV IRES及人腸道病毒C的3⑶蛋白酶 的核酸可操作地結合。
51. -種疫苗的製造方法，其特徵在於， 將權利要求30所述的表達盒導入宿主細胞， 在能夠生成所述表達盒的多肽的期間，培養所述宿主細胞， 通過所述宿主細胞和/或培養上清液回收人腸道病毒多肽。
52. 根據權利要求51所述的方法，其特徵在於， 所述宿主細胞是真核細胞。
53. 根據權利要求52所述的方法，其特徵在於， 所述真核細胞選自昆蟲細胞，哺乳動物細胞株及酵母細胞。
54. 根據權利要求53所述的方法，其特徵在於， 所述昆蟲細胞選自草地夜蛾、粉紋夜蛾、果蠅及源自白紋伊蚊的蚊子細胞。
55. 根據權利要求53的方法，其特徵在於， 所述哺乳動物細胞株選自CHO、HEK293、COS-1、HeLa、Vero及NIH3T3。
【文檔編號】A61K39/135GK104093420SQ201280066026
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年11月1日 優先權日:2011年11月3日
【發明者】M·J·卡多薩, M·F·加米盧丁, S·B·哈米德 申請人:森提耐斯特治療公司