一種可吸收甲殼素基複合補片及其應用的製作方法

2023-10-10 12:18:49 1

本發明涉及一種生物補片，特別是涉及一種可吸收甲殼素基複合補片及其應用，屬於生物醫用材料領域。

背景技術：

疝是普外科常見疾病，主要由臟器或組織連同腹膜壁層，由腹壁缺損或薄弱點向體表突出形成，如股溝疝、切口疝、造口疝等，一般不能自愈。無張力疝氣修補手術是近年來應用最為廣泛的疝氣治療方法，採用開放手術或腹腔鏡手術進行腹壁疝修補，將在腹壁缺損部位向體表突出的臟器還納回腹腔，再將補片置於所述腹壁缺損處，並縫合固定。目前常用的聚丙烯補片、聚酯補片等非降解合成高分子補片，是由聚丙烯纖維、聚酯纖維等合成材料編織的網狀結構，具有較好的抗拉性和抗張強度。但聚丙烯等化學高分子補片由於化學惰性，其在體內長期存在時與機體組織的生長修復不匹配，造成部分患者產生異物感或者疼痛。同時聚丙烯等化學高分子補片與內臟組織接觸，易引起較嚴重的腹腔粘連，甚至可能侵蝕腸壁，引起腸瘻，增加患者的痛苦，甚至需要二次手術取出。由於不可吸收補片在臨床應用中出現的長期異物反應，導致術後感染、腸粘連等併發症，一直是臨床腹壁疝修補的難題。研究者採用了在合成高分子補片表面進行可降解材料塗層，如表面塗層殼聚糖、膠原、絲素蛋白等，或者將合成高分子補片與可降解材料進行複合，如與殼聚糖膜、膠原膜等複合，用可降解材料對合成高分子補片進行修飾，研製部分可降解補片，以減少合成高分子補片存在的術後感染、腸粘連問題。但由於聚丙烯等非降解材料的長期存在，仍然存在物理刺激引起的無菌炎症，同時與機體組織的生長修復不匹配等問題。因此，可降解外科補片研究受到廣泛關注，如生物源性脫細胞基質補片，但生物源性補片往往降解速度快，力學強度低，甚至可能產生免疫原性反應，其中降解時間和力學強度與腹壁缺損、疝修補速率不匹配，因此目前還沒有一種理想的補片可以用於治療腹壁缺損。

有文獻（任旺，新型可吸收補片修補大鼠腹壁缺損的實驗研究，泰山醫學院碩士學位論文，2014年4月1日）報導了採用殼聚糖纖維編織補片進行大鼠腹壁缺損修補的研究結果，研究結果顯示，殼聚糖纖維編織補片植入後膠原纖維增生較多，能夠滿意修補腹壁缺損，但與已在臨床普遍使用的生物補片和聚丙烯補片相比，殼聚糖纖維編織補片炎性反應重且內臟粘連明顯，還需進一步改進降低炎性反應以提高生物相容性。

機體腹壁缺損修補、疝修補過程大致可以分為手術修補的急性炎症期和手術恢復後的慢性生理修補期。手術後的急性炎症期機體處於免疫失調和強烈的炎症反應過程，導致組胺、5-羥色胺、舒緩激肽等炎性因子釋放，毛細血管的通透性增大，富含纖維蛋白的血漿液滲出，纖維蛋白沉積粘附於腹腔其他組織，形成早期腹腔粘連。因此，對於急性期，降低機體炎症反應是降低腹腔粘連的重要措施，同時也加快啟動損傷組織的生理癒合修復。手術恢復後的慢性生理修補期，主要是組織細胞的生長和細胞外基質合成，重構生理組織。因此，對於慢性生理修補期，促進組織細胞生長和細胞外基質合成措施非常重要。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種可吸收甲殼素基複合補片及其應用，旨在腹壁缺損修補、疝修補手術後降低急性期炎症反應，降低腹腔粘連，促進組織細胞生長和胞外基質合成，加速生理修補期腹壁缺損修補，補片在完成腹壁缺損修補後降解吸收，不在體內存留，從而彌補現有技術的上述不足。

為實現上述目的，本發明採用以下技術方案予以實現：

一種可吸收甲殼素基複合補片，其特徵是由具有表面塗層的甲殼素基纖維或線組成的網片；所述的甲殼素基纖維或線，分子結構的主鏈是多聚氨基葡萄糖，並含有醯基基團和親水性基團，該纖維/線不溶於水；所述的表面塗層，是水溶性氨基聚糖塗層；所述的網片，是甲殼素基纖維或線經過編織、機織、針織、鉤織等工藝製成的網片。

所述的醯基基團是乙醯基、丙醯基、丁醯基、己醯基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基、棕櫚醯基以及其它脂肪族或芳香族醯基基團中的一種或幾種，醯基基團的總摩爾百分含量大於或等於70%，即分子結構中含有的醯基基團的摩爾數量與氨基葡萄糖糖單元的摩爾數量的百分比大於或等於70%；所述的親水性基團，其特徵是羧甲基、羧乙基、羧丙基、羥乙基、羥丙基、琥珀醯基、磺酸基、季銨基或其它親水性基團中的一種或幾種，親水性基團的總摩爾百分含量小於30%，即分子結構中含有的親水性基團的摩爾數量與氨基葡萄糖糖單元的摩爾數量的百分比小於30%；所述的水溶性氨基聚糖，是肝素、硫酸軟骨素、透明質酸、羧甲基殼聚糖、羧甲基甲殼素、羥乙基殼聚糖、羥乙基甲殼素、羥丙基殼聚糖、羥丙基甲殼素、羥丁基殼聚糖、羥丁基甲殼素、黃酸化殼聚糖、黃酸化甲殼素、琥珀醯殼聚糖、殼聚糖季銨鹽中的一種或幾種，或本領域技術人員能夠製備的其它水溶性氨基聚糖。

上述可吸收甲殼素基複合補片用作醫療器械或醫用材料。

上述可吸收甲殼素基複合補片用於腹壁缺損修補材料，特別用於臨床疝修補材料。

本發明的可吸收甲殼素基複合補片在材料選擇上是經過嚴格的實驗選擇。本發明的可吸收甲殼素基複合補片具有水溶性氨基聚糖塗層，這些水溶性氨基聚糖在分子結構上與細胞外基質糖胺聚糖的分子結構具有結構相似性，可以被組織細胞吸收利用，本發明的實驗證明這些糖胺聚糖具有降低術後炎症反應，降低炎症因子釋放，降低腹腔粘連的作用；實驗還證明這些水溶性氨基聚糖具有促進成纖維細胞生長，促進上皮細胞生長作用，加快術後損傷組織的修復。因此，本發明的可吸收甲殼素基複合補片，在腹壁缺損修補手術中植入缺損的腹壁後，補片上的水溶性氨基聚糖在修補手術的急性炎症期快速被機體受損部位的組織細胞吸收利用，降低炎症反應，降低炎症因子釋放，降低腹腔粘連發生，同時促進細胞生長，加快啟動術後損傷組織的修復。

本發明的可吸收甲殼素基複合補片中的甲殼素基纖維/線的醯基基團總摩爾百分含量大於或等於70%，親水性基團的總摩爾百分含量小於30%，是基於該纖維/線不能溶解於水、延長降解時間、增加組織相容性、與腹壁缺損修補匹配，而做出的選擇。醯基基團總摩爾百分含量大於或等於70%的甲殼素基纖維/線不溶於水，同時由於醯基化從而增加了纖維/線的力學強度，其力學強度增加40%以上，同時也延長了其在體內的降解時間，補片在體內48周大部分降解。力學強度的增加，以及降解時間的延長，有利於本發明的可吸收甲殼素基補片與腹壁缺損修補的匹配，有利於其與組織生長的匹配，增加舒適感，在腹壁缺損修復過程中逐漸降解。親水性基團的總摩爾百分含量小於30%的甲殼素基纖維/線也不溶於水，同時由於少量的親水性基團的存在，增加了甲殼素基纖維/線與機體組織的相容性，減少異物感，有利於損傷組織的修復。本發明的可吸收甲殼素基複合補片中的甲殼素基纖維/線，在腹壁缺損修補手術後的生理修補期逐漸降解成氨基單糖和氨基寡糖，被局部組織細胞吸收利用，從而促進局部組織細胞的生長，促進腹壁缺損修補。

因此，本發明的可吸收甲殼素基複合補片在腹壁缺損修補、疝修補手術中植入腹壁內，可在術後降低急性期炎症反應，降低腹腔粘連，同時促進組織細胞生長和胞外基質合成，加速生理修補期腹壁缺損修補，補片在腹壁缺損修補後逐漸降解，降解物被局部組織細胞吸收利用，進一步促進腹壁缺損修補，完全降解後不在體內存留，機體沒有異物存在。

具體實施方式

下面通過具體實施例詳細說明本發明。

實施例1：含不同醯基化基團和親水基團的甲殼素基纖維的水溶性測試

不同醯基化基團含量和親水基團含量的甲殼素基纖維購買自青島舜博生物技術研究所，通過實驗測試了這些不同的甲殼素基纖維的水溶性，結果如表1。從表1中可以看出，當甲殼素基纖維的醯基基團的摩爾百分含量大於或等於68.5%時，並且親水性基團的摩爾百分含量小於或等於30.9%時，甲殼素基纖維遇水不溶解。

表1.甲殼素基纖維的水溶性比較

實施例2：甲殼素基纖維與殼聚糖纖維的力學強度比較

分別剪取重量相當的5段長度為10cm的甲殼素基纖維3（含乙醯基68.5%）、甲殼素基纖維5（含丙醯基73.8%，含羥丙基10.3%），剪取5段長度為10cm的殼聚糖纖維（購買於青島舜博生物技術研究所，含乙醯基2.5%），在電子拉力機上測試甲殼素基纖維和殼聚糖纖維的斷裂強度。測定結果顯示，甲殼素基纖維4的平均斷裂強度為14.5n，甲殼素基纖維5的平均斷裂強度為15.2n，殼聚糖纖維的平均斷裂強度為10.3n，表明甲殼素基纖維的斷裂強度高於殼聚糖纖維的斷裂強度。進一步的實驗表明，在親水性基團摩爾百分含量小於30%時，甲殼素基纖維的斷裂強度隨醯基基團含量的增加而增加。

實施例1、實施例2表明甲殼素基纖維含醯基基團摩爾百分含量大於或等於70%時，並含親水性基團摩爾百分含量小於30%時，甲殼素基纖維遇水不溶解；甲殼素基纖維的斷裂強度高於殼聚糖纖維，且甲殼素基纖維的斷裂強度隨醯基基團含量的增加而增加。這些性質表明本發明的甲殼素基纖維/線適於用於可吸收補片製備的原材料。

實施例3：水溶性氨基聚糖促進細胞生長實驗

分別以硫酸軟骨素（購買於青島九龍生物醫藥有限公司）、羧甲基甲殼素、羥乙基殼聚糖（購買於青島弘海生物技術有限公司）為實驗材料，體外培養l929成纖維細胞，評價3種親水性氨基聚糖對細胞生成的影響。將對數生長期的l929細胞經胰酶消化，用dmem培養基調節細胞濃度至2.0×104個/ml，接種於96孔細胞培養板，於co2培養箱（37℃，5%co2）中培養24h後，換液，以不含水溶性氨基聚糖的培養孔為對照組，含不同濃度水溶性氨基聚糖（濃度分別為10、50、100、250、500μg/ml）的培養孔為實驗組，細胞培養至48h時觀察細胞生長情況，並用mtt法在酶標儀492nm下測定各孔吸光值，計算細胞增值率。

實驗結果顯示，細胞培養48h時，對照組和實驗各組細胞形態呈梭形，貼壁良好，生長旺盛，細胞狀態良好；實驗各組的細胞密度明顯大於對照組，細胞增值率如表2，可見3種氨基聚糖都具有促進成纖維細胞生長的作用。

表2.氨基聚糖對細胞生長的影響

實施例3表明本發明的水溶性氨基聚糖具有促進成纖維細胞生長的作用。上述水溶性氨基聚糖在分子結構上與細胞外基質糖胺聚糖的分子結構具有相似性，可以被組織細胞吸收利用，促進纖維細胞生長，加快術後損傷組織的修復，因此適於用於可吸收補片塗層的原材料。

實施例4：親水性氨基聚糖抑制大鼠術後炎症因子釋放實驗

實驗以大鼠為實驗動物，體重200±20g，實驗分為4組，陰性對照組，羧甲基甲殼素組，硫酸軟骨素組，透明質酸組，每組12隻大鼠，雌雄各半。大鼠麻醉下沿腹部中線製備了開腹4cm手術模型，在關腹縫合前，按分組分別將100mg的羧甲基甲殼素、硫酸軟骨素、透明質酸撒在手術切開處，陰性對照組不使用氨基聚糖，手術線縫合關腹。分別於術後3h、6h各組取4隻大鼠尾靜脈取血，用試劑盒測定血清5-羥色胺、舒緩激肽含量，結果見表3。實驗結果表明，本發明的氨基聚糖具有降低炎症因子釋放量的作用，從而降低術後機體的炎症反應。

表3.氨基聚糖對炎症因子釋放的影響

因此，本發明的親水性氨基聚糖可在術後降低急性期炎症反應，從而降低毛細血管的通透性，減少血漿液滲出，降低術後腹腔粘連，因此本發明的親水性氨基聚糖適於用於可吸收補片塗層的原材料。

實施例5：可吸收甲殼素基複合補片的製備

配製重量百分比為2%的透明質酸水溶液100ml，將甲殼素基纖維鉤織網片（含乙醯基15%，丙醯基75%，羥丙基15%，摩爾百分比）10片（規格5cm×5cm）浸入上述透明質素溶液30min，取出網片，60℃加熱乾燥，得甲殼素基複合補片1。配製重量百分比為2%的羧甲基甲殼素、質量百分比為1%硫酸軟骨素的水溶液100ml，將甲殼素基纖維鉤織網片（含丙醯基78.8%，月桂醯基10.5%，摩爾百分比）10片（規格5cm×5cm）浸入羧甲基甲殼素溶液30min，取出網片，60℃加熱乾燥，得甲殼素基複合補片2。

本發明的可吸收甲殼素基複合補片的製備可以有多種方法，一是先在甲殼素基纖維/線的表面進行親水性氨基聚糖塗層，得到的有塗層的纖維/線經過編織、機織、針織、鉤織等工藝製成的網片；二是先將甲殼素基纖維/線經過編織、機織、針織、鉤織等工藝製成的網片，再對網片進行親水性氨基聚糖塗層。編織、機織、針織、鉤織等製備網片技術是成熟技術，這些工藝是現有成熟技術，都可以實現。甲殼素基纖維/線表面的親水性氨基聚糖塗層方法也是本領域技術人員熟悉的方法，如在纖維/線的表面塗層氨基聚糖水溶液後，通過加熱乾燥、自然乾燥等方法，或者將塗層的氨基聚糖進行交聯，在經過乾燥。

實施例6：可吸收甲殼素基複合補片體內降解試驗

以大鼠為試驗動物，手術下將上述可吸收甲殼素基複合補片1、2（裁剪規格5mm×5mm，無菌）分別植入到大鼠背部皮下，在不同時間點解剖觀察降解時間，病理切片he染色觀察組織炎症反應。結果顯示，補片1、2植入皮下2周時均有少量組織炎症，4-10周時周圍組織正常，無明顯炎症反應，補片無降解；12周時出現少量降解，無明顯炎症反應；24周時仍少量降解，可見少量炎症細胞存在；36周時可將補片1、2降解明顯，補片1的降解程度大於補片2，48周時補片1、2大部分降解，有少量炎症細胞出現，總體上炎症反應輕。體內降解結果表明，本發明的可吸收甲殼素基複合補片可在體內降解吸收，降解時間在36周以上，降解過程中炎症反應較輕，具有較好的生物相容性。

實施例7：可吸收甲殼素基複合補片對動物腹壁缺損修補試驗

大鼠132隻，體重200±20g，雌雄各半，實驗分為3組，聚丙烯補片對照組，甲殼素基補片1組，甲殼素基補片2組，每組40隻大鼠，雌雄各半，其餘12隻為正常對照不手術。手術下製作了大鼠腹壁全層缺損模型（缺損10mm×20mm），對照組用聚丙烯補片（裁剪規格15mm×25mm，無菌）對大鼠腹壁缺損進行手術修補，實驗1組用本發明的可吸收甲殼素基複合補片1對大鼠腹壁缺損進行手術修補（裁剪規格15mm×25mm，無菌），實驗2組用本發明的可吸收甲殼素基複合補片2對大鼠腹壁缺損進行手術修補（裁剪規格15mm×25mm，無菌），並在術後1d、3d、7d時，各組取大鼠4隻，以正常大鼠為對照，尾靜脈取血，用試劑盒測定血清中il-1β含量，在術後15d、30d、60d、90d、180d、250d各組處死大鼠4隻，解剖觀察腹壁缺損修補情況。

術後血清il-1β含量測定結果表明，對照組和實驗組1組、2組大鼠血清il-1β的濃度在術後1d均顯著增高，il-1β的濃度均大於4000pg/ml，與正常對照組（小於800pg/ml）有極顯著性差異；術後3d時，實驗1組和實驗2組血清il-1β濃度顯著下降（小於1500pg/ml），而聚丙烯組血清il-1β濃度較實驗組高約2倍（大於3000pg/ml）；術後7d時，實驗1組和實驗2組血清il-1β濃度顯著下降基本恢復至正常水平，而聚丙烯組血清il-1β濃度仍處於高水平狀態（大於2000pg/ml）。本實驗表明，大鼠術後處於較為強烈的炎症反應過程，而本發明的可吸收甲殼素基複合補片具有降低炎症反應程度的作用。

術後腹壁缺損修補觀察結果表明，本發明的可吸收甲殼素基複合補片1、補片2在植入體內腹壁修補術後，15d時材料周圍結締組織增生，可見明顯炎症反應，30d時炎症反應消失，材料與周圍組織交互良好，60d時材料與周圍組織界限模糊，交界處由纖維結締組織銜接良好，有少量腹腔粘連存在，90d時腹壁修補呈半透明狀，180d時材料有降解，修補處厚度與正常腹壁無異，有少量的腹腔粘連存在，術後250d材料完全被新生膠原纖維替代。可吸收甲殼素基複合補片1、補片2對腹壁缺損修補效果相似。聚丙烯補片在植入體內腹壁修補術後，在術後不同時間觀察時，材料在後期（60d以後）體內的異物反應較重，常見傷口周圍纖維結締組織過度增生，傷口處可見大量炎性細胞，腹腔粘連嚴重，聚丙烯材料不發生降解，材料皺縮，有變形。實驗結果說明，本發明的可吸收甲殼素基複合補片對腹壁缺損具有很好的修補效果，材料在體內降解時間與腹壁修補時間匹配，炎症反應輕，與聚丙烯補片比較，可有效減少腹腔粘連。