一種組織工程化牙髓-牙本質複合體的製作方法

2023-10-10 06:11:04 1

一種組織工程化牙髓-牙本質複合體的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種組織工程化牙髓-牙本質複合體，所述組織工程化牙髓-牙本質複合體由PDGF-BB基因修飾的牙髓幹細胞構建，通過以下方法製備獲得：(1)PDGF-BB基因轉染體外分離培養的牙髓幹細胞；(2)將步驟(1)得到的產物負載於生物支架材料構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。本發明的優點在於：PDGF-BB不僅可以促進牙髓幹細胞的增殖、成牙分化以及成血管誘導因子的分泌，還可以促進幹細胞的募集以加速牙再生，在裸鼠皮下異位成牙模型中，PDGF-BB修飾牙髓幹細胞的實驗組中新生的牙本質量明顯增多。本發明驗證了PDGF-BB修飾牙髓幹細胞在牙髓-牙本質複合體再生的應用優勢，為牙再生這一難題提供了新的治療方法。
【專利說明】一種組織工程化牙髓-牙本質複合體
【技術領域】
[0001]本發明涉及牙再生領域，具體地說，涉及一種roGF-BB基因修飾的牙髓幹細胞構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。
【背景技術】
[0002]不可復性牙髓炎是臨床上的常見病和多發病，目前根管治療是該疾病的常規治療方法，但是牙髓組織的徹底清除將嚴重影響牙齒的營養供應和正常的代謝活動，牙齒脆性加大而容易折裂。幸運的是，以幹細胞為基礎的牙髓-牙本質再生技術應運而生。從脫落乳牙、正畸拔牙和阻生智齒等牙齒中分離的牙髓幹細胞為牙髓-牙本質再生提供了理想的種子細胞。然而，牙髓腔主要通過狹窄的根管-根尖孔與自體組織相連通，這也是牙髓腔營養供應的主要通道，該生理解剖特點給牙髓-牙本質再生帶來了極大困難，另外，牙髓幹細胞本身的成牙本質能力還有待提高，有報導通過基因修飾的手段有望改善牙髓-牙本質再生效果，但尚未尋得理想的修飾基因。
[0003]TOGF-BB作為強有力的促有絲分裂因子，是傷口癒合和組織修復過程中的主要調控蛋白是一個多功能誘導因子，除了促增殖作用外，它還具有明顯的血管化誘導作用、促進牙周組織和骨再生的作用以及強大的幹細胞募集能力。為此，通過TOGF-BB基因修飾的途徑提高牙髓幹細胞的增殖、成牙分化、成血管誘導以及幹細胞募集等能力將有助於提高牙再生效果。該 方面研究尚未見文獻報導。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種TOGF-BB基因修飾的牙髓幹細胞構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。
[0005]本發明的第二個目的在於提供一種I3DGF-BB基因修飾的牙髓幹細胞構建組織工程化牙髓-牙本質複合體的製備方法。
[0006]本發明的第三個目的在於提供TOGF-BB基因修飾牙髓幹細胞在構建組織工程化牙髓-牙本質複合體中的應用。
[0007]為實現本發明第一個目的，本發明公開以下技術方案:一種組織工程化牙髓-牙本質複合體，其特徵在於，所述組織工程化牙髓-牙本質複合體由TOGF-BB基因修飾的牙髓幹細胞構建，通過以下方法製備獲得:
[0008](I) PDGF-BB基因轉染體外分離培養的牙髓幹細胞；
[0009](2)將步驟(1)得到的產物負載於生物支架材料構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。
[0010]作為一個優選方案，步驟(1)中使用慢病毒介導roGF-BB基因的轉染。使用慢病毒介導TOGF-BB的轉染，可以維持TOGF-BB的長期高效表達，也規避了蛋白使用所遇到的價格昂貴、無法維持長期作用效果等弊端。
[0011]為實現本發明第二個目的，本發明公開以下技術方案:一種組織工程化牙髓-牙本質複合體的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
[0012](I)PDGF-BB基因轉染體外分離培養的牙髓幹細胞；
[0013](2)將步驟(1)得到的產物負載於生物支架材料構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。
[0014]作為一個優選方案，步驟(1)中使用慢病毒介導I3DGF-BB基因的轉染。
[0015]為實現本發明第三個目的，本發明公開以下技術方案:H)GF-BB基因修飾牙髓幹細胞在構建組織工程化牙髓-牙本質複合體中的應用。
[0016]本發明的優點在於:使用TOGF-BB轉染牙髓幹細胞，不僅明顯促進了細胞的增殖，使得在更短的時間內獲得足夠數量的種子細胞，PDGF-BB還促進了牙髓幹細胞的成牙分化，增強了細胞的成牙能力，PDGF-BB轉染的牙髓幹細胞可以分泌更多的成血管誘導因子，對於快速恢復牙髓腔內的營養供應至關重要，同時TOGF-BB還可以募集更多的幹細胞以更好更快地促進牙再生。另外，使用慢病毒介導I3DGF-BB的轉染，可以維持I3DGF-BB的長期高效表達，也規避了蛋白使用所遇到的價格昂貴、無法維持長期作用效果等弊端。本發明驗證了PDGF-BB修飾牙髓幹細胞在牙髓-牙本質複合體再生中的應用優勢，為牙再生這一難題提供了新的治療方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為人牙髓幹細胞的培養與鑑定。(A-D)牙髓組織的取出以及長梭形的牙髓幹細胞從組織塊中爬出 ；(E)流式細胞儀鑑定人牙髓幹細胞表面幹細胞標誌物的表達情況；(F)人牙髓幹細胞成脂誘導分化，油紅O染色；(G)人牙髓幹細胞成軟骨誘導分化，阿利新藍染色；(H)人牙髓幹細胞成骨誘導分化，茜素紅染色。
[0018]圖2為Lent1-PDGF對人牙髓幹細胞轉染情況。(A)轉染後3天，螢光顯微鏡下觀察綠色螢光表達；(B)流式細胞儀檢測Lent1-PDGF的轉染效率；(C)細胞轉染Lent1-PDGF後的增殖情況；(D)免疫螢光檢測細胞內TOGF的表達情況；(E)RT-PCR檢測細胞轉染Lent1-PDGF後PDGF-BB基因表達情況；(F)Western Blot檢測細胞轉染Lent1-PDGF後PDGF-BB蛋白表達情況；(G) EI i sa檢測細胞轉染Lent 1-PDGF後分泌TOGF-BB蛋白情況(**ρ〈0.01)。
[0019]圖3為Lent1-PDGF促進人牙髓幹細胞的成牙分化情況。(A)細胞在轉染Lent1-PDGF後3、7、14和21天時的VEGF、OCN、DMP-1和DSPP基因表達情況；(B)細胞在轉染Lent1-PDGF後3、7、14和21天時的VEGF和DSPP蛋白表達水平；(C)Western Blot檢測的半定量結果；(D)細胞在轉染Lent1-PDGF後7和14時的ALP染色和半定量結果(**ρ〈0.01)。
[0020]圖4為TOGF的體外募集能力檢測。㈧I3DGF-BB激活P13K/Akt信號通路；(B)LY294002可以抑制TOGF-BB激活PI3K/Akt信號通路；(C) Transwell小室細胞遷移情況；(D)細胞計數結果(**ρ〈0.01)。
[0021]圖5為人牙髓幹細胞體內募集實驗。「DAPI」所示經DAPI染料標記的細胞核；「Dil」所示經CM-Dil染料標記的人牙髓幹細胞，即所募集的細胞。
[0022]圖6為異位成牙的組織學和免疫組化檢測結果。(A-D)HE染色結果；(E)新生礦化組織百分比；(F-H)新生礦化組織免疫組織化學檢測結果。【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
[0024]實施例1.PDGF-BB對人牙髓幹細胞(hDPSCs)體外生物活性的影響
[0025]步驟一、人牙髓幹細胞的分離培養及鑑定
[0026]臨床收集正畸需求或阻生齒拔除牙齒，用無菌生理鹽水將離體牙齒表面的血衝洗乾淨；用牙科裂鑽在牙齒頸部切割一圈，便於牙髓腔的暴露；用拔髓針輕輕將牙髓組織取出，操作輕柔，儘量避免損傷組織；將取出的牙髓組織用PBS衝洗兩次，用無菌眼科剪將其剪至約IXlmm大小的組 織塊，用消毒蓋玻片將組織塊覆蓋，防止組織塊漂浮。然後加入含20%胎牛血清的DMEM培養液進行培養。每三天半量換液。待hDPSCs從組織塊爬出至60% -80%融合時，胰蛋白酶消化，1:1傳代培養。傳代後，用含10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養。採用流式細胞術檢測P3代hDPSCs表面抗原⑶31，⑶34，⑶90，⑶105分子。紅色螢光(PE)標記⑶31，⑶105，及⑶34，綠色螢光(FITC)標記⑶90。並進一步進行成骨、成軟骨和成脂三向分化鑑定。
[0027]實驗結果見圖1，牙髓組織塊培養約7天左右，成功從牙髓組織爬出，原代牙髓幹細胞形態類似成纖維細胞，呈長梭形(圖1D)。P3代收集後進行流式檢測，結果顯示hDPSCs幾乎不表達造血系統所特有的標記物⑶31，⑶34，表達率分別僅為3.6%，3.1%。而間充質幹細胞所特有的表面標記物⑶90及⑶105表達率分別高達71.9%,96.4% (圖1E)。在不同的誘導培養條件下，hDPSCs可以向脂肪細胞，軟骨細胞，成骨細胞方向分化(圖1F-H)。
[0028]步驟二、人牙髓幹細胞轉染I3DGF-BB慢病毒顆粒(Lent1-PDGF)
[0029](I)利用 Gateway 技術構建 pLV.EX3d.P/puro_EFlA>PDGFB>IRES/eGFP 及 pLV.EX3d.P/puro-EFlA>Lacz>IRES/eGFP慢病毒載體，轉染293FT細胞製取病毒液。轉染後24h換液，48h後收集培養上清進行濃縮。換液後繼續培養，72h後再次收集濃縮。將收集的病毒分裝置於_80°C保存、備用。
[0030](2)P2代hDPSCs接種在IOcm培養皿或六孔板中，培養24小時候後，融合度達70% -80%細胞狀態良好。將病毒液(5X107TU/ml)加入培養液中，37°C，5% CO2條件下培養培養過夜。第二天吸去原有培養液，加入新鮮10% FBS的DMEM培養液。轉染第三天後，螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白的表達，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞轉染效率。
[0031](3)免疫螢光檢測I3DGF-BB基因的表達。病毒轉染72h後，4 %多聚甲醛固定15min，Triton X-1OO處理細胞30min，10 %山羊血清封閉I小時，PBS清洗3次。PDGF-BB (1:200) 一抗孵育4°C過夜，然後孵育紅色螢光二抗，37°C，lh。DAPI處理細胞核5分鐘，PBS洗3次。螢光顯微鏡下觀察。
[0032](4) Real-time PCR檢測 PDGF-BB 的表達。病毒轉染後，在 3，7，14，21 天利用 Trizol試劑分別收集各組樣品的總RNA，檢測TOGF-BB基因的表達情況。
[0033](5) Western Blot檢測TOGF-BB的表達。病毒轉染後，在3，7，14，21天不同時間點收集細胞總蛋白，檢測I3DGF-BB蛋白的表達情況。
[0034](6)酶聯免疫法(Elisa)檢測細胞外分泌的TOGF-BB。病毒轉染後，於3，7，14，21天收集細胞培養上清，採用酶聯免疫法(Elisa)檢測上清中I3DGF-BB蛋白的含量。[0035]實驗結果見圖2，Lent1-PDGF和Lent1-LacZ (對照組)病毒轉染hDPSCs後，第三天螢光顯微鏡下觀察到綠色螢光表達(圖2A);流式細胞儀檢測病毒轉染效率，結果顯示轉染效率高達80%以上(圖2B)。免疫螢光觀察結果提示Lent1-PDGF組TOGF-BB表達上升明顯(圖2D)。病毒轉染後，Real-time PCR檢測hDPSCs中TOGF-BB基因的表達，病毒轉染後，於3，7，14，21天不同時間點，提取細胞RNA檢測TOGF-BB的表達，結果顯示病毒轉染後，PDGF-BB能夠持續穩定的表達(圖2E)。為了進一步在蛋白表達水平驗證I3DGF-BB的表達，於轉染後3，7，14，21天提取細胞蛋白質檢測其表達，結果證明病毒轉染後，PDGF-BB蛋白水平也呈現穩定高表達(圖2F)。Elisa檢測細胞上清中I3DGF-BB的含量，證明TOGF-BB基因轉染牙髓幹細胞後，牙髓幹細胞能夠持續分泌PDGF-BB蛋白因子(圖2G)。
[0036]步驟三、PDGF-BB促進人牙髓幹細胞的增殖
[0037]Lent1-PDGF轉染的hDPSCs以5X IO3/孔的細胞密度接種於96孔板中，於37°C、5% CO2培養箱培養。接種後1、3、5、7天不同時間點檢測細胞增殖情況。檢測時，每孔加入20 μ I MTT液，孵育4小時後吸去板內原有液體，每孔加入200 μ I 二甲基亞碸(DMSO)，振蕩15min,使結晶充分溶解。酶標儀0D490nm檢測吸光度值，分析細胞增殖情況。
[0038]結果顯示hDPSCs過表達TOGF-BB能夠促進其增殖活性(圖2b)。第I天，三組吸光度沒有明顯差異，在第3、5、7天時，Lent1-PDGF組吸光度值明顯高於Lent1-LacZ與Control (即未轉染病毒的hDH)Cs)兩對照組。說明Lent1-PDGF病毒轉染後，能夠促進hDPSCs的增殖。
[0039]步驟四、PDGF-BB促進人牙髓幹細胞的分化
[0040](I) Real-time PCR檢測成血管/成牙相關基因的表達
[0041]病毒轉染後，在3、7、14、21天利用Trizol試劑分別收集各組樣品的總RNA，檢測相關基因的表達。紫外分光光度計260nm和280nm下測定提取RNA的濃度及純度，根據逆轉錄試劑盒說明，合成cDNA。之後進行PCR檢測牙本質基質蛋白(dentin matrixprotein-1, DMP-1)、牙本質誕憐蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、骨鈣素(osteocalcin, 0CN)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)相關基因的表達。以管家基因磷酸甘油醒脫氫酶(glyceraldehyde phosphatedehydrogenase, GAPDH)作為內參。引物序列見下表,CT值代表Real-time PCR結果。最後根據公式:2- Λ Λ CT計算出基因的相對表達量。
[0042]
【權利要求】
1.一種組織工程化牙髓-牙本質複合體，其特徵在於，所述組織工程化牙髓-牙本質複合體由roGF-ΒΒ基因修飾的牙髓幹細胞構建，通過以下方法製備獲得: (1)PDGF-BB基因轉染體外分離培養的牙髓幹細胞； (2)將步驟(1)得到的產物負載於生物支架材料構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。
2.根據權利要求1所述的一種組織工程化牙髓-牙本質複合體，其特徵在於，步驟(1)中使用慢病毒介導I3DGF-BB基因的轉染。
3.權利要求1所述的組織工程化牙髓-牙本質複合體的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)PDGF-BB基因轉染體外分離培養的牙髓幹細胞； (2)將步驟(1)得到的產物負載於生物支架材料構建組織工程化牙髓-牙本質複合體。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，步驟⑴中使用慢病毒介導TOGF-BB基因的轉染。
5.PDGF-BB基因修飾牙髓幹細胞在構建組織工程化牙髓-牙本質複合體中的應用。
【文檔編號】A61K6/02GK104000737SQ201410255589
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】張文杰, 張茂林, 蔣欣泉, 張志願 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院