A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法
2023-10-18 07:04:29 2
專利名稱：：A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法
技術領域：
：本發明涉及一種A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，屬於生物
技術領域：
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背景技術：
：目前A型肝炎滅活疫苗的效力檢測使用小鼠體內相對效力試驗法，檢測基本過程如下(1)將待檢疫苗每批多支混合後作2倍系列稀釋至l:64，試驗同時設立效力試驗參比品作為對照；(2)取1:4、1:16、1:64共3稀釋度接種小鼠，每個稀釋度接種小鼠10隻，每隻腹腔注射1.0ml，4周後採血，分離血清待測；(3)血清抗體測定使用A型肝炎病毒抗體檢測試劑盒測定小鼠血清的抗-HAV抗體；(4)結果計算根據每個稀釋度抗體陽性及陰性的小鼠數，計算陽轉率，採用Reed-Muarch法進行統計分析，計算EDs。；(5)計算待檢樣品與參比品的效力比，作出判定。此方法檢測周期長達30餘天，間接縮短了疫苗的有效期，增加了疫苗庫存壓力，這嚴重影響了疫苗的生產及銷售，且由於在動物體內進行試驗時，會因動物的種屬、窩別、年齡、體重、性別、健康狀況、飼養環境及飼料營養等諸多因素，直接影響到檢測結果的準確性及可靠性，不可避免地影響到檢測的重複性。所以需要對該檢測方法進行改進，使之滿足快速、靈敏、重複性好的要求，這將有利於提高檢測結果的可靠性，進一步保證產品質量。
發明內容本發明的目的在於提供一種A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，以取代傳統的小鼠體內相對效力試驗，解決受試動物所帶來的影響因素多、重複性差、檢定周期長達30餘天的不利因素，減少疫苗庫存量，延長疫苗的有效期，降低檢定成本及勞動強度。本發明通過下列技術方案實現一種A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於經過下列步驟A、將待檢的A型肝炎滅活疫苗及參比的A型肝炎滅活疫苗用常規PBS稀釋液進行不同稀釋度的稀釋；B、將稀釋後的待檢A型肝炎滅活疫苗及參比A型肝炎滅活疫苗分別按不同的稀釋度加入酶標板對應的孔中，每個稀釋度的疫苗分別放2孔，放入量為50150ri/孔，同時在酶標板的孔中加入對照用陽性抗原和陰性抗原，每個抗原各加入2孔，並留空白調零孔，放入溼盒中，於37"C保溫12小時後，洗板35次；C、按50150)4/孔的量，在B步驟的酶標板的各孔中，加入稀釋度為1:5003000的長臂生物素標記HAV抗體使用液，放入溼盒中，於37'C保溫0.51小時後，洗板35次；D、按50150W/孔的量，在C步驟的酶標板的各孔中，加入稀釋度為1:200010000的辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素使用液，放入溼盒中，於37'C保溫0.51小時後，洗板35次；E、在D步驟的酶標板各孔中，分別加入TMB顯色液A和B各50W/孔，混勻，放入溼盒中，37°C保溫1015分鐘；F、按50W/孔的量，在E步驟的酶標板的各孔中加入終止液後置於酶標儀上，在450nm波長下，用空白孔調零後檢測吸光度A值。根據檢測所得A值，進行下列計算-1)以每個稀釋度的兩孔的A值相加得出待檢樣品的反應值L、T2、T3、L和參比品的反應值S,、S2、S3、S4，將各反應值代入下列公式，計算相對效力R值R=D*antilg(IV/W)其中I=lg2=0.301，D=l，V=1/4(T,+T2+T3+T4-S,-S2-S3-S4)，W=l/20((T3—T2+S3—S2)+3(T4—T,+S4—S')〕2)待檢樣品與參比品的相對效力比值r的計算公式如下r=PT/Ps=R.AT/Ps(其中，PT=R.AT)其中PT為待檢品T測得的效價，Ar為待檢品T的標示效價或估計效價，R為測得的效價等反應劑量比值，Ps為參比品的效價。3)結果判斷r》0.85時，體外相對效力試驗合格。所述步驟A所述的不同稀釋度為1:8、1:16、1:32、1:64。所述C步驟的長臂生物素標記HAV抗體經下列方法製備a、按長臂生物素A型肝炎病毒抗體二l:520克分子比的比例，將市購的長臂生物素用注射用水溶解後，與A型肝炎病毒抗體混合，得混合體，於室溫下放置0.51.0小時，或28'C溫度下放置13小時；b、用磷酸緩衝液於28t溫度下透析上述a步驟的混合體並過夜，加等體積甘油混勻，得長臂生物素標記HAV抗體，-2(rC以下保存備用。所述D步驟的辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素為市購產品。所述洗板用PBS洗液在洗板機上洗板或者手工洗板。所述磷酸鹽緩衝液PBS、PBS洗液、PBS稀釋液、碳酸鹽緩衝液、終止液、TMB顯色液A和B、封閉液均為現有技術的常規用液。所述酶標板預先經過下列方法處理1)酶標板包被將純化的HAV-IgG用碳酸鹽緩衝液PBS稀釋至5-20Pg/ml，按50150W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，28。C過夜，洗板35次；2)酶標板封閉按150250Pl/孔的量加入封閉液，28。C過夜，對酶標板進行封閉，洗板35次，晾乾，冰箱保存備用。本發明具有下列優點和效果採用上述方案，徹底取代了傳統的小鼠體內相對效力測試方法，解決了使用動物所帶來的影響因素多、重複性差、檢定周期長達30餘天的不利因素，只需約3.5小時即可完成測試，減少了疫苗庫存量，間接延長了疫苗的有效期，降低了勞動強度，尤其在疫苗緊張時可多生產150-200萬支疫苗，可創產值4500-6000萬元。另外，本發明採用雙平行線生物檢定原理，提出的A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，使HAV病毒含量與相對應A值的對數之間表現出良好的線性回歸，12均在0.97以上；檢測結果表現出較好的穩定性及重複性，因此，是一種方便、快捷、可靠的測試方法。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步描述。實施例1所用A型肝炎滅活疫苗效力試驗參比品S為申請人嚴格按國家標準生產，並經理化及生物學檢驗達標的合格產品，其效價Ps為640EU/ml;待檢的A型肝炎滅活疫苗樣品T也是申請人嚴格按國家標準生產的產品，其標示效價&為640EU/ml。所用溶液如下1、磷酸鹽緩衝液PBS:磷酸氫二鈉58g，磷酸二氫鉀4g,氯化鈉160g，加注射用水至1000ml。2、PBS稀釋液將磷酸鹽緩衝液PBS用注射用水作20倍稀釋。3、PBS洗液將磷酸鹽緩衝液PBS用注射用水作20倍稀釋後，加入0.05%吐溫20。4、碳酸鹽緩衝液無水碳酸鈉1.6g，碳酸氫鈉2.93g，加注射用水至lOOOml。5、終止液濃硫酸54ml，加注射用水至500ml。6、TMB顯色液A:TMB50mg，二甲基亞碸50ml，加注射用水50ml。7、TMB顯色液B:醋酸鈉6g，雙氧水2.5ml，加注射用水至50ml。8、封閉液在1000ml磷酸鹽緩衝液PBS中，加入20克牛血清白蛋白，溶解混勻。9、裂解液20%二乙醇胺1.25ml，10%TritonX1000.2ml，0.Olmol/LPBS(pH7.40)8.55ml。長臂生物素標記HAV抗體的製備1)按長臂生物素A型肝炎病毒抗體=1:10克分子比的比例，將市購的長臂生物素用注射用水溶解後，與A型肝炎病毒抗體混合，得混合體，於室溫下放置0.5小時；2)用磷酸緩衝液PBS於5t溫度下透析上述a步驟的混合體並過夜，加等體積甘油混勻，得長臂生物素標記HAV抗體，-2(TC以下保存備用。酶標板預先經過下列方法製備1)酶標檢測板包被將純化HAV-IgG用碳酸鹽緩衝液稀釋至10Pg/ml，按100W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，5T:過夜，用PBS洗液在洗板機上洗板5次；2)酶標檢測板封閉按200W/孔的量加入封閉液，5'C過夜，對酶標板進行封閉，用PBS洗液在洗板機上洗板5次，晾乾，冰箱保存備用；具體測試1、將A型肝炎滅活疫苗待檢樣品T及A型肝炎滅活疫苗效力試驗參比品S，加入等體積裂解液，室溫下裂解30分鐘；2、將A型肝炎滅活疫苗待檢樣品T和A型肝炎滅活疫苗參比品S分別用PBS稀釋液進行下列稀釋，稀釋度為1:8、1:16、1:32、1:64;3、用微量移液器量將稀釋後的A型肝炎滅活疫苗待檢樣品T及A型肝炎滅活疫苗參比品S從高稀釋度開始依次加入酶標板中，每個稀釋度加2個孔，100W/孔，同時加入抗原陽性、陰性對照各2個孔，設空白調零孔1孑L放入溼盒中，37t:保溫2小時，用PBS洗液洗板5次；4、在上述酶標板的各個孔中加入稀釋度為1:800的生物素標記HAV抗體使用液，100W/孔，放入溼盒中，37'C保溫0.5小時，用PBS洗液洗板5次；5、在上述酶標板的各個孔中加入稀釋度為1:4000的辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素使用液，100W/孔，放入溼盒中，37"C保溫0.5小時，用PBS洗液洗板5次；6、在上述酶標板的各個孔中加入TMB顯色液A、B液各50W/孔，混勻，放入溼盒中，37'C保溫10分鐘；7、在上述酶標板的各個孔中加入終止液，50yl/孔，置於酶標儀上，在450nm波長下，用空白孔調零後測吸光度A值，得表l數據表1tableseeoriginaldocumentpage8陽性對照平均A值(1.845)—陰性對照平均A值(0.055)》0.4本次試驗成立;8、以每個稀釋度2復孔的A值相加作為反應值，將各反應值代入公式，計算效價tableseeoriginaldocumentpage99、相對效力值(R)計算公式R=D*antilg(IV/W)其中I=lg2=0.301，D=l，V=1/4(T,+T2+T3+T4—S「S2—S3—S4)W=l/20〔(T3—T2+S3—S2)+3(^—1+S4—SJ)按公式計算得V=0.590W=0.9247R=lg_'0.192=1.55510、樣品與參比品的相對效力比值(r)計算r=PT/Ps(其中PT=R.AT)=R.AT/Ps=1.555X640(EU/ml)/640(EU/ml)=1.555結果判定r=l.555^0.85，體外相對效力試驗合格。1.檢測樣品含量與反應值的線性關係評價用本發明的方法對A型肝炎病毒抗原進行檢測，以樣品稀釋度(1:81:1024)的對數值為橫座標、相對應A值及A值的對數為縱座標進行直線回歸分析，所有樣品均表現出良好的線性回歸，特別是樣品稀釋度的對數值為橫座標與A值的對數之間具有高度的相關性，其4點法R2(絕對指數)均在0.97以上，平均值為0.990，可以用於建立生物檢定方法。R2如表l所示。2.雙平行線檢測方法的可靠性檢驗根據線性回歸分析結果，取線性最好的4點進行分析，建立雙平行線檢定方法。按統計分析的基本要求，雙平行線(4，4)檢定方法應為直線回歸非常顯著(p<0.01=，偏離平行、二次曲線及反向二次曲線三個參數檢驗均應為不顯著(p〉0.05)。本所建立的4.4復孔檢測法Hl，8)0.01=11.26，8)0.05=5.32即當26時，p<0.01，非常顯著；屍0.05，不顯著。滿足以上條件時驗證通過。對本所建立的效力試驗參比品(批號200501和20060301、20060303、20060303批)滅活疫苗進行三批樣品三人次檢測，對本發明體外相對效力試驗方法進行驗證(表2)，對同批次效力試驗r值分析(表3)，並與常規相對效力試驗結果進行比較，驗證結果顯示本發明體外相對效力試驗方法可以通過可靠性驗證。表1.HAAg含量與A值線性回歸分析比較樣品批號A值均數8點直線R2A值均數對數4點直線R2200603010.9550.977第一次200603020.9580.995檢測結果200603030.9580.9900501標10.9600.995200603010.9430.979第二次200603020.9280.979檢測結果200603030.9470.9920501標20.9510.984200603010.9580.997第三次200603020.9570.998檢測結果200603030.9540.9980501標30.9480.995最大值0.9600.998最小值0.9280.977結果分析平均值0.9510.990S0.0090.008cv1%0.8%注4點為1:8-1:64;8點為1:8-1:1024。本發明體外相對效力試驗進行了3批3人次檢測均通過驗證，其R值在27次檢測結果中，同批次r值CVM分別為20060301:12.32%、20060302:7.69%、20060303:5.48%表明檢測結果穩定重複性較好。所有批次的R值最大為1.43，最小為0.849，平均1.026，標準差為0.169。表2.雙平行線可靠性驗證次批號分回歸偏離平二次曲反二次曲驗證結3.應用效果評價用現有的方法檢測2006年、2007、2008年3年產品，同時與本發明體內相對效力試驗結果進行應用比較(表4)。從表4可以看出，三年樣品體外相對效力試驗r值的標準差及CV值均低於體內相對效力試驗，表明本發明體外相對效力試驗更穩定，重複性更好。200603012006030220060303PFPF2029.16屍<0.011763.17屍<0.01476.107屍0.055.231P>0.050,117P〉0.054.087K>0.054.138/^O.050.427P〉0.050.017/^0.050.011冷0.050.179/^>0.05通過驗證通過驗證通過驗證200603012006030220060303PFPF2086.79屍<0.011646.07屍<0.011930.910.050.111/^>0.050.671Z^X).050.016/^>0.050.065/^>0.050.562/^X).0550.00305通過驗證通過驗證通過驗證200603012006030220060303PFPF1485.07<0.01992.095p<0.01487.286;0.050.001/^0.053.515/^>0.054.096P〉0.050.91P〉0.050.337/^0.050.233/^0.050.114/^X).050.16105通過驗證通過驗證通過驗證第一次檢測結果第一一次檢測結果第三次檢測結果表3同批次效力試驗r值分析tableseeoriginaldocumentpage12表4體外相對效力試驗與體內相對效力試驗r值統計分析tableseeoriginaldocumentpage13綜合22批疫苗體外相對效力待檢品與參比品的相對效力比值(r值)範圍0.801-1.659，平均1.083,建議體外相對效力試驗的判定標準為平均r值±IS值(O.851.30)，即A型肝炎滅活疫苗體外相對效力r值應不低於0.85(r》0.85)。以r》0.85作為判定標準，將15批疫苗用本發明的體外相對效力試驗與體內相對效力試驗同步進行檢驗，結果與體內效力試驗一致，15批疫苗2種方法檢驗全部為合格品(表5)。表52008年疫苗體外相對效力與體內相對效力試驗結果對比批號體內相對效力r體外相對效力r200801011.070.87200802011.110.91200802030.870.96200804010.940.86200804020.850.85200805010.850.86200805030.820.86200807011.100.92200807031.201.11200807051.100.88200807071.200.85200807091.400.96200810010.900.93最大值1.401.11最小值0.820.85平均值1.030.90S0.1760.072cv17.06%8.02%1S+1.2080.9731S-0.8550.8282S+1.3841.0532S-0.6790.75權利要求1、一種A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於經過下列步驟A、將待檢的A型肝炎滅活疫苗及參比的A型肝炎滅活疫苗用常規PBS稀釋液進行不同稀釋度的稀釋；B、將稀釋後的待檢A型肝炎滅活疫苗及參比A型肝炎滅活疫苗分別按不同的稀釋度加入酶標板對應的孔中，每個稀釋度的疫苗分別放2孔，放入量為50～150μl/孔，同時在酶標板的孔中加入對照用陽性抗原和陰性抗原，每個抗原各加入2孔，並留空白調零孔，放入溼盒中，於37℃保溫1～2小時後，洗板3～5次；C、按50～150μl/孔的量，在B步驟的酶標板的各孔中，加入稀釋度為1∶500～3000的長臂生物素標記HAV抗體使用液，放入溼盒中，於37℃保溫0.5～1小時後，洗板3～5次；D、按50～150μl/孔的量，在C步驟的酶標板的各孔中，加入稀釋度為1∶2000～10000的辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素使用液，放入溼盒中，於37℃保溫0.5～1小時後，洗板3～5次；E、在D步驟的酶標板各孔中，分別加入TMB顯色液A和B各50μl/孔，混勻，放入溼盒中，37℃保溫10～15分鐘；F、按50μl/孔的量，在E步驟的酶標板的各孔中加入終止液後置於酶標儀上，在450nm波長下，用空白孔調零後檢測吸光度A值。2、如權利要求l所述的A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於所述步驟A所述的不同稀釋度為1:8、1:16、1:32、1:64。3、A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於所述C歩驟的長臂生物素標記HAV抗體經下列方法製備a、按長臂生物素A型肝炎病毒抗體二l:520克分子比的比例，將市購的長臂生物素用注射用水溶解後，與A型肝炎病毒抗體混合，得混合體，於室溫下放置0.51.0小時，或28匸溫度下放置13小時；b、用磷酸緩衝液於28'C溫度下透析上述a步驟的混合體並過夜，加等體積甘油混勻，得長臂生物素標記HAV抗體，-2(TC以下保存備用。4、A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於所述D步驟的辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素為市購產品。5、A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於所述洗板用PBS洗液在洗板機上洗板或者手工洗板。6、A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於所述磷酸鹽緩衝液PBS、PBS洗液、PBS稀釋液、碳酸鹽緩衝液、終止液、TMB顯色液A和B、封閉液均為現有技術的常規用液。7、A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特徵在於所述酶標板預先經過下列方法處理1)酶標板包被將純化的HAV-IgG用碳酸鹽緩衝液PBS稀釋至5-20Pg/ml，按50150W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，28。C過夜，洗板35次；2)酶標板封閉按150250W/孔的量加入封閉液，28'C過夜，對酶標板進行封閉，洗板35次，晾乾，冰箱保存備用。全文摘要本發明提供一種A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法。徹底取代了傳統的小鼠體內相對效力測試方法，解決了使用動物所帶來的影響因素多、重複性差、檢定周期長達30餘天的不利因素，只需約3.5小時即可完成測試，減少了疫苗庫存量，間接延長了疫苗的有效期，降低了勞動強度，尤其在疫苗緊張時可多生產150-200萬支疫苗，可創產值4500-6000萬元。另外，本發明採用雙平行線生物檢定原理，提出的A型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，使HAV病毒含量與相對應A值的對數之間表現出良好的線性回歸，R2均在0.97以上；檢測結果表現出較好的穩定性及重複性，因此，是一種方便、快捷、可靠的測試方法。文檔編號G01N33/531GK101556285SQ200910094509公開日2009年10月14日申請日期2009年5月22日優先權日2009年5月22日發明者霞宋,華李,蓉楊,超洪,白惠珠,謝忠平,陳洪波,鎧黃,龍潤鄉申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所