一種植物抗逆誘導劑及其應用的製作方法
2023-10-18 11:25:29 3
專利名稱：一種植物抗逆誘導劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物抗逆性誘導劑，具體地說是用殼寡糖誘導植物抗旱、 抗澇、抗凍和抗寒性。
背景技術：
抗逆劑是指施在土壤或作物上能增強作物本身抗逆性的化學物質的總 稱，近年來生產上研究應用得比較多的主要有以下種類。
抗旱劑l.FA旱地龍是以黃腐酸為主要原料精製而成的多功能植物 抗旱生長營養劑和植物抗蒸騰劑，是有旱抗旱保產、無旱促進增產的理想
藥劑。2.6-BA和外源脫落酸(ABA): 6-BA通過調節內源激素水平，阻止水 分脅迫下作物的光合速率、葉綠素含量和葉片水勢的下降，提高RuBP羧化 酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，降低氣孔阻力和MDA含量，從而 減輕水分脅迫下活性氧對細胞膜的傷害，增強作物抗旱性。ABA主要通過 調節內源激素而影響作物抗旱性，是植株體內在逆境條件下產生的主要適 應調節物質。3.ABT生根粉是一種廣譜、高效、無毒的複合型植物生長調 節劑，又稱生根促進劑，其作用機理主要是加快種子萌發，促進種子根的 顯著伸長和葉面積的迅速擴大，有利於形成強大的次生根系，增強植株保 水力，提髙作物抗旱性，達到抗旱節水增產的效果。4. 2， 4-D、乙烯利(CEPA)、 多效唑(CCC)和三唑酮水分脅迫條件下，2， 4. D和CEPA施用改變了作物 體內代謝水平，影響物質合成、積累及轉運等一系列生理生化過程，最終 反映在生長的生物物理參數變化上，影響作物的生長發育。CCC和三唑酮 能調節作物體的內源激素，抑制頂端生長優勢和細胞伸長，促進根系大量 生長，使植株抗旱性顯著增強。5.MFB多功能抗旱劑是以天然甜菜鹼為主 要成分並經科學組配不同植物營養元素研製而成的一種非毒性滲透調節抗 旱劑，其作用機理是能改善作物體內代謝，提高植株體的束縛水含量，維 持較長的綠葉功能期，從而提高作物抗旱性，促進籽粒灌漿，增加作物產 量(張衛星，趙致，廖景容，吳盛黎(2004)作物抗旱劑的應用研究進 展.中國農學通報.20 (6) : 334-339)。
抗澇劑釋氯劑、膜穩定劑、活性氧清除劑及細胞激素等化學調控劑 (抗澇劑)進行調控，可緩解或部分消除淹澇對水稻的不良影響。無論是 在淹澇前還是淹澇後噴施抗澇劑(多德利)，對提高水稻耐淹澇能力都有 較好的效果。
抗凍劑稀土，脫落酸和抗凍蛋白等對植物抗寒抗凍有一定作用。 值得注意的是以上各種抗逆劑能夠提供植物抗性，但不能同時提高植物抗病性。作為植物誘導劑的殼寡糖能夠提高植物抗逆性，包括提高植物 抗病性。來源於甲殼動物殼中的幾丁質和殼聚糖，也是許多真菌細胞壁的
組成成分。其具有多方面的生理功能。幾丁質是N-乙醯氨基葡萄糖通過p-l,4
鍵連接而形成的線性多聚糖，其部分脫乙醯化的產物即為殼聚糖。幾丁質 的溶解性很差,殼聚糖能溶於弱酸中，因此殼聚糖較幾丁質有較多的應用。 殼聚糖不僅能有效的誘導植物抗病性，在田間對作物病害的防治有明顯的 效果，而且對植物病原菌生長有抑制作用。殼聚糖被認為是很有應用潛力 的激發子。但是，由於幾丁質和殼聚糖的水溶性差，限制了它們在農業生 產上的應用。因此，水溶性好的寡糖引起了人們的極大關注。作者所在的 課題組應用酶法降解殼聚糖獲得的殼寡糖有多方面的生理功能。聚糖、寡 糖在植物體中具有信號識別和傳遞的作用，其中有些可以作為一種信號分 子調控植物的生長發育和植物抵抗逆境的防衛反應。有人研究了脫乙醯化 幾丁質(殼聚糖)對作物抗性的影響，發現其抗性酶活性提高(張學昆，
唐章林，諶禾U，李加納(2002).脫乙醯化幾丁質的乙醯化程度對誘導油菜 抗性的影響.中國農業科學35(3): 287-290.)。目前，關於殼寡糖對植物抗 性酶活性影響與植物抗性機制關係的研究在一些真菌、細菌病害上已見報 道(李曙光，白雪芳，杜昱光(2002).殼寡糖的分離分析及其誘抗活性研 究.中國海洋藥物(6) : 1-3.杜昱光，白雪芳，趙小明(2002).殼寡糖對 菸草防禦酶活性及同工酶酶譜的影響中國生物防治18 (2) : 83-86)。
寡聚半乳糖醛酸及殼聚糖能夠誘導西紅柿和鴨蹠草氣孔開度減少(Lee S., Choi H., Suh S， Doo I. S. ,Oh K. Y. ,CHoi E. J. ,Ann T. ,Taylor S. ,Low P.S. and Lee Y(199外Oligogalacturonic Acid and Chitosan Reduce Stomatal Aperture by Inducing the Evolution of Reactive Oxygen Species from Guard Cells of Tomato and Commelina communis. Plant Physiol 121: 147-152.)。殼聚
糖能夠誘導辣椒葉片氣孔開度減小，從而較少水份蒸騰，達到抗旱節水的目 的(MarcoB.，MarkusF.， Gaylon C. S. , Everett N. J. ( 2001). Reduction of transpiration through foliar application of Chitosan. Agric. For. Meteorol. 107: 33, 167-175.)。作者發現殼寡糖與殼聚糖相比,誘導植物抗逆性效果更佳。
發明內容
本發明的目的在於提供一種誘導效果好、無汙染的植物抗逆誘導劑。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為 一種植物抗逆誘導劑，其以殼寡糖溶液為有效活性成份。
所述殼寡糖溶液的濃度為l-100mg/L，最好為50mg/L 75mg/L;所述 殼寡糖溶液採用的溶劑為水或質量濃度為0-0.1%的醋酸；所述殼寡糖的脫 乙醯度>90%，聚合度2-10。
所述殼寡糖溶液用於誘導植物提高其抗逆性，應用時，將殼寡糖溶液 根灌或噴施於作物葉片上，畝噴施量30-50公斤或畝根灌150-300公斤。利用殼寡糖噴施作物葉片誘導其抗逆(抗旱、抗凍抗寒和抗澇)通 過誘導作物不同程度提高抗性酶活性，明顯提高作物脯氨酸含量，氣孔開 度明顯下降，葉綠素含量提高等提高了作物的抗逆性。 本發明具有如下優點
1. 發明人發現殼寡糖能夠誘導作物抗旱。本發明採用殼寡糖誘導作物 抗逆，可視的抗逆結果有力地證明殼寡糖能夠誘導作物提高抗逆性。
2. 殼寡糖既能誘導植物抗病性，又能誘導植物抗旱、抗澇和抗寒，對 環境友好，不汙染環境。
3. 原料豐富，成本較低。其作為新型生物農藥具有廣泛的前景。
4. 本發明外施殼寡糖能提高植物抗性，而且無毒不引起環境汙染，使 用方法簡單。
圖1殼寡糖對油菜抗旱性的影響(噴一次，斷水第9d);
圖2殼寡糖處理油菜抗氧化酶活性的影響；
圖3殼寡糖處理油菜抗氧化酶活性的影響；
圖4殼寡糖處理油菜1次對氣孔開度的影響；
圖5殼寡糖處理油菜3次對氣孔開度的影響；
圖6殼寡糖對低溫脅迫下油菜抗性酶活性的影響；
圖7殼寡糖對低溫脅迫下油菜脯氨酸含量的影響；
圖8殼寡糖對水淹脅迫下油菜抗性酶活性的影響；
圖9殼寡糖與誘導作物抗旱性效果比較。
具體實施例方式
本發明採用的測定方法包括 1.生理
葉綠素含量的測定用丙酮乙醇提取液(V: V=l: l)葉綠素，用分光
光度計分別測A645、 A663，葉綠素aCa(mg'g"^(12.72A66廣2.59A645) V/1000W，葉綠素bCb(mg.g")氣22.88A645—4.67A663)V/1000W，式中八645、 A663分別為葉綠素提取液在663 nm和645 nm處的光密度，V為提取體積(ml)， W為材料乾重(g)。
氣孔開度的測定撕取葉片下表皮，迅速地放入無水乙醇中固定，保 存。把固定好的表皮放在載玻片上，加一滴無水乙醇，蓋上蓋玻片，用顯 微鏡觀察氣孔開度，用顯微測微尺測量氣孔開度。
2、生化 一 提取粗酶液的方法，取l g葉片置於6ml50mmol/L磷酸緩衝液(ph7.8，內 含1XPVP)，在冰浴中研磨提取酶液，勻漿以10000g ， 4。C離心20min，取
上清為粗酶液，-20°(:備用。
按SOD抑制氮藍四唑(NBT)光化還原法測定反應體系中含50 mmol/L磷酸緩衝液，13mmol/L甲硫氨酸，75 pmol/L氮藍四唑(NBT)， 100nmol/L EDTA和4iimol/L核黃素。先在日光燈(4000Lux)下反應10min，然後以黑 暗終止反應，在560nm下比色。以抑制NBT光化還原的50M為一個酶活性單 位。 一
POD活性的測定，反應液中含2.9ml0.05mol/L磷酸緩衝液、1 ml 0.25% 愈創木酚溶液、O.lmL酶液、lml2%H202。連續記錄測定25 。C下460nm吸 光值的變化。
脯氨酸含量測定0.5g葉片，放入具塞試管，加入5 tnl 3%的磺基水楊 酸，沸水浴10min，冷卻後過濾於帶塞玻璃試管中(對照加2ml蒸餾水)，然 後依次加入2ml冰醋酸及4ml酸性茚三酮，蓋上玻璃塞，再次沸水浴60min， 冷卻後加入4ml甲苯，振蕩60s，靜置片刻，用膠頭吸管取上層萃取液於520 nm波長下比色測定。
實施例l
油菜幼苗分別栽種於同樣大小的裝有等量、同土質的盆內，澆以充足 的水後分成36組，
l組為無任何脅迫dH20處理的對照l;
8組葉面噴殼寡糖(殼寡糖的脫乙醯度〉90%，聚合度2-10，畝噴施量 30公斤)濃度分別為0 (對照2) 75mg/L連續噴3天，每天噴施1次， 上述材料進行斷水。處理溫度16-27°C，相對溼度30%-80%，發現葉面 噴50mg/L 75mg/L每天一次或連續噴3天每天噴施1次的提高了作物的 抗旱性；
8組根灌殼寡糖(殼寡糖的脫乙醯度〉90%，聚合度2-10，畝根灌150 公斤)濃度分別為0 (對照2) 75mg/L，連續3天，每天l次，上述材 料進行乾旱處理(土壤含水量為3.31%-6.02%)，溫度16-27°C，相對溼度 30%-80%，發現根灌50 mg/L 75mg/L的提高了作物的抗旱性；
8組葉面噴殼寡糖(殼寡糖的脫乙醯度>90%，聚合度2-10，畝噴施量 30公斤)濃度分別為0 75mg/L後上述材料進行低溫處理(-8°C-0°C)發 現葉面噴50 mg/L 75mg/L 1次的提高了作物的抗凍、抗寒性；
8組葉面噴殼寡糖(殼寡糖的脫乙醯度>90%，聚合度2-10，畝噴施量 30-公斤)濃度分別為0 (對照2) 75mg/L後水淹上述材料葉面噴50 mg/L 75mg/L連續噴3天每天噴施1次的提高了作物的抗澇性。
3組上述材料葉面噴dH20 (對照2) ， 50 mg/L殼寡糖或500mg/L殼聚糖。
分別於取第3、 4片展葉進行抗性酶、游離脯氨酸含量、氣孔開度及葉 綠素含量的測定。發現乾旱脅迫下葉片抗性酶含量不同程度提高，作物脯 氨酸含量明顯提高，氣孔開度減小，葉綠素含量提高。低溫脅迫和水淹脅 迫下，葉片抗性酶含量不同程度提高。一、殼寡糖對油菜抗旱性的影響
用蒸餾水及濃度分別為25mg/L、 50mg/L、 75mg/L的殼寡糖，分別噴3 次(每天一次，連續噴3天)或根灌後，進行斷水試驗，斷水後以上4組幼苗第 3d開始萎蔫，第9d用蒸餾水及濃度為25 mg/L的殼寡糖處理的噴l次及3次的 幼苗嚴重萎蔫，50 mg/L和75 mg/L的殼寡糖處理的噴l次及3次幼苗中度萎蔫 (圖l)。第12d用蒸餾水及濃度為25mg/L的殼寡糖處理的噴l次及3次的幼 苗乾旱死亡，50 mg/L和75 mg/L的殼寡糖處理的噴l次及3次幼苗嚴重蔞蔫。 第19d用濃度為50mg/L和75 mg/L的殼寡糖處理l次及3次的幼苗乾旱死亡。
二、殼寡糖對乾旱脅迫下油菜抗性酶活性的影響
1殼寡糖處理對油菜SOD酶活性的影響
如圖2-2a所示，乾旱脅迫(對照2，對照3)與非脅迫(對照1)相比 其SOD活性明顯下降(P0.05)。
乾旱脅迫下，25mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理(對照2)的相比在第 3d其SOD活性變化不顯著(P0.05)，第6d，第9d其SOD活性顯著提高 (P<0.05)。 50mg/L殼寡糖處理與對照2相比在第3d和第6d SOD活性顯著 下降(P0.05)，第9d其SOD活性明顯提高(P0.05)。 75mg/L殼寡糖處理與 對照2相比第3d其SOD活性變化不明顯，第6d明顯下降，第9d明顯升 高(P0.05)(表2-2a)。
不同濃度殼寡糖處理油菜3次的SOD活性的變化如圖2-2c所示，乾旱 脅迫下，25mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理相比，在第3d其SOD活性顯著 下降；第6d，第9d其SOD活性顯著升高(P0.05)。 50mg/L殼寡糖處理在 第3d顯著下降；第6d，第9d SOD活性顯著升高(P0.05)。 75mg/L殼寡 糖處理其SOD活性在第3d其SOD活性變化不大；第6d，第9d其SOD活 性明顯升高(P〈0.05)。
2殼寡糖處理對乾旱脅迫下油菜POD酶活性的影響
如圖2b所示,乾旱脅迫後油菜幼苗POD活性與非乾旱脅迫相比第3天 略升高，第6d，第9dPOD活性比非乾旱脅迫相比顯著下降(P0.05)。
不同濃度殼寡糖處理油菜一次的POD活性的變化如圖3所示，乾旱脅 迫下，25mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理相比，在第3d其POD活性下降； 第6d，第9d其POD活性升高(P〈0.05)。 50mg/L殼寡糖處理在第3d 、第 6d POD活性顯著下降，第9d其POD活性明顯提高(P0.05)。 75mg/L殼寡 糖處理其POD活性無明顯變化(P0.05)。
不同濃度殼寡糖處理油菜3次的POD活性的變化如圖2d所示，乾旱 脅迫下，25mg/L殼寡糖處理與對照2相比，在第3d、第6d和第9d其POD 活性明顯升高(P0.05)。 50mg/L殼寡糖處理與對照2相比在第3d POD活性 顯著升高；第6d和第9d其POD活性無明顯變化(P0.05)。 75mg/L殼寡 糖處理與蒸餾水處理相比在第3dPOD活性顯著升高；第6d、第9d其POD 活性無明顯變化(P0.05)。Control 1:無任何脅迫，dH20處理；control 2， 25*1， 50*1， 75*1分別 為用dH20及濃度分別為25 mg/L、 50 mg/L和75mg/L的殼寡糖處理l次。 Control 3， 25*3， 50*3， 75*3分別為用4^0及濃度分別為25 mg/L、 50 mg/L 和75mg/L的殼寡糖處理l次/d，連續處理3d。表中數據為三株的平均值。(下 同)
三、 殼寡糖對乾旱脅迫下油菜游離脯氨酸含量的影響
如圖3a所示，乾旱脅迫後油菜幼苗游離脯氨酸含量與非乾旱脅迫顯著 升高(PO,05)。
乾旱脅迫下，25mg/L , 50mg/L ，and 75mg/L殼寡糖處理一次油菜幼苗脯氨酸 含量與對照3相似(P0.05)。
如圖3所示，乾旱脅迫下，25mg/L， 50mg/L， 75mg/L殼寡糖處理與對 照3相比游離脯氨酸不同程度變化，25mg/L， 50mg/L殼寡糖處理3次，在 處理後第3d，第6d和第9d其游離脯氨酸含量與蒸餾水處理相比顯著升高 (P<0.05)。 75mg/L殼寡糖處理3次在第3d、第6d和第9d游離脯氨酸與蒸 餾水處理的相近(P〈0.05)。
四、 殼寡糖對對乾旱脅迫下油菜氣孔開度的影響
1不同濃度殼寡糖處理油菜1次的氣孔開度的變化
如圖4所示。乾旱脅迫後油菜幼苗氣孔開度與非乾旱脅迫相比變化不
乾旱脅迫下，25mg/L， 50mg/L和75mg/L殼寡糖處理1次與蒸餾水處 理相比氣孔開度明顯減小，其氣孔開度在處理後lh最小，僅為蒸餾水處理 的41 % 59 %。殼寡糖處理在第3d氣孔開度與蒸餾水處理的相近。在第 6d，第9d25mg/L， 50mg/L和75mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理相比氣孔開 度減小，並隨濃度提高氣孔開度下降。
2不同濃度殼寡糖處理油菜3次的氣孔開度的變化
圖5所示，25mg/L， 50mg/L和75mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理相比 氣孔開度明顯減小，其氣孔開度在殼寡糖處理在第3d氣孔開度與蒸餾水處 理的相比明顯減小。在第6d，氣孔開度開始回升，第9d25mg/L殼寡糖處 理與蒸餾水處理相比氣孔開度相同，50mg/L和75mg/L殼寡糖處理與蒸餾 水處理相比氣孔開度達到最小，僅為蒸餾水處理處理的51%和24%。
五、 殼寡糖對乾旱脅迫下油菜葉綠素含量的影響 乾旱脅迫後油菜幼苗葉綠素含量與非乾旱脅迫相比明顯減少。 25mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理相比葉綠素含量變化不大。50mg/L
殼寡糖處理1次與蒸餾水處理相比，第3d葉綠素a,葉綠素b含量明顯提 高，分別為蒸餾水處理的2.2和2.3倍，第6d，第9d葉綠素a,葉綠素b含 量變化不大。75mg/L殼寡糖處理與蒸餾水處理相比第3d,第6d葉綠素a,葉 綠素b含量略升高，第9d葉綠素含量變化不大。
25mg/L， 50mg/L和75mg/L殼寡糖處理3次與蒸餾水處理相比，葉綠素a,葉綠素b含量明顯增加，以50mg/L殼寡糖處理效果最佳，處理後第 3d ，第6d葉綠素a,葉綠素b含量明顯提高，處理後第3d葉綠素a,葉綠 素b含量為蒸餾水處理的2.6倍和2.7倍。第9d葉綠素a,葉綠素b含量均 為蒸餾水處理的相比變化不大。25mg/L和75mg/L殼寡糖處理3次與蒸餾 水處理相比第3d ，第6d和第9d葉綠素a，葉綠素b含量一直保持增高趨 勢。
實施例2殼寡糖對低溫脅迫下油菜抗性酶活性的影響
如圖6， 50mg/L和75mg/L殼寡糖處理低溫脅迫下油菜1次和3次在第
3d、 6d和第9dSOD活性顯著提高(P〈0.05)。
殼寡糖對低溫脅迫下油菜脯氨酸含量的影響如圖7， 50mg/L和75mg/L
殼寡糖處理低溫脅迫下油菜1次和3次在第6d脯氨酸含量顯著提高
(P<0.05)。
實施例3殼寡糖對水淹脅迫下油菜抗性酶活性的影響 如圖8， 50mg/L和75mg/L殼寡糖處理低溫脅迫下油菜1次和3次在第 3d、第6d和第9dSOD活性顯著提高(P0.05)。
實施例4殼寡糖與殼聚糖誘導作物抗旱性效果比較 如圖9，葉面噴50mg/L殼寡糖或0.in/。殼聚糖，乾旱脅迫下，殼寡糖誘 導作物SOD活性顯著高於殼聚糖處理的(P0.05)。殼寡糖誘導作物抗旱性效 果明顯好於殼聚糖。
殼寡糖的誘導效果相比，在抗澇、抗寒、抗凍效果均好於殼聚糖。 各實施例中葉面噴施和根灌的效果相似。
權利要求
1. 一種植物抗逆誘導劑，其特徵在於其以殼寡糖溶液為有效活性成份。
2. 按照權利要求1所述植物抗逆誘導劑，其特徵在於所述殼寡糖溶 液的濃度為l-100mg/L。
3. 按照權利要求1或2所述植物抗逆誘導劑，其特徵在於所述殼寡 糖溶液採用的溶劑為水或質量濃度為0-0.1%的醋酸。
4. 按照權利要求1所述植物抗逆誘導劑，其特徵在於所述殼寡糖的脫乙醯度>90%，聚合度2-10。
5. —種權利要求l所述植物抗逆誘導劑的應用，其特徵在於所述殼寡糖溶液用於誘導植物提高其抗逆性，應用時，將殼寡糖溶液根灌或噴施於作物葉片上，畝噴施量30-50公斤或畝根灌150-300公斤。
全文摘要
本發明涉及植物抗逆性誘導劑，其以殼寡糖溶液為有效活性成份。本發明採用殼寡糖誘導作物抗旱、抗澇、抗寒和抗凍的方法，殼寡糖噴施作物葉片或根灌誘導作物抗逆性(抗旱、抗凍抗寒和抗澇)。通過誘導作物葉片不同程度提高抗性酶含量，明顯提高脯氨酸含量，氣孔開度明顯下降，明顯提高葉綠素含量等提高了作物的抗逆性。外施殼寡糖能提高作物抗逆性，而且無毒不引起環境汙染，使用方法簡單。
文檔編號A01N63/00GK101543230SQ200810010789
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月28日 優先權日2008年3月28日
發明者豔 李, 杜昱光, 白雪芳, 趙小明 申請人:中國科學院大連化學物理研究所