用限制性核酸內切酶克服滯後汙染的聚合酶鏈式反應方法
2023-10-18 18:45:19
專利名稱：用限制性核酸內切酶克服滯後汙染的聚合酶鏈式反應方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術，特別是涉及防止滯後汙染的聚合酶鏈式反應方法。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(PCR)是一種快捷、高效的擴增特定DNA的方法，經過30個左右的循環目標基因片段被擴增上億倍。由於擴增產物和樣品中的原始目標基因均可作為擴增的模板，痕跡量的PCR反應液滯後汙染會造成比樣品交叉汙染嚴重得多的麻煩。克服滯後汙染的方法包括物理防範措施(J.L.Hartley等，PCR-Methods and-applications，1993，3S10-S14)和各種化學和生物化學方法。M.C.Longo等(Gene，1990，93125-128)用dUTP取代天然核苷酸dTTP作為反應的底物，使滯後擴增產物可被脫氧尿嘧啶糖苷酶(UDG)所分解。該方法得到了廣泛認可，但擴增產物帶有大量非天然核苷酸PCR產物不適宜用於克隆等操作。F.M.DeFilippes(BioTechniques，1991，1026-29)和B.Furrer等(Nature，1990，346324)分別用核酸酶和限制性內切酶來克服滯後汙染，但所用酶沒有專一性除了分解擴增產物也會分解樣品中的原始核酸模板。本發明提供了通過引物設計和採用特定的限制性內切酶來減少和消除滯後汙染的簡單有效的方法，可用於臨床檢測擴增產物也可用於克隆等分子生物學研究。
發明內容
本發明所要解決的技術問題本發明提供一種克服滯後汙染的PCR方法，以填補目前缺乏通過引物設計和特定限制性核酸內切酶方法解決滯後汙染問題的空白，解決現有克服滯後汙染技術中需要採用非天然核苷酸底物和擴增產物無法進行克隆的缺陷。
發明構思限制性核酸內切酶切割核酸的部位通常在其識別順序的內部或一側，但已報導和商品化的限制性內切酶中有少數酶，他們切割核酸的部位在識別順序的上遊4-20個鹼基。如果在引物的5』端通過引進錯配鹼基或加一段非基因專一順序，可在擴增產物內構建一個上述限制性內切酶的識別順序，而原始目標基因的內部不存在這種識別順序。PCR反應前用酶處理反應液可使滯後汙染擴增產物中本來與引物互補的部位被切割約4-20個核苷酸。即使在相當低的退火溫度下引物也不會與這種已被「斷臂」的擴增增產物退火，使汙染擴增產物的擴增流產其幹擾被消除。由於原始模板不含識別順序，限制性核酸內切酶處理對引物與原始模板的退火沒有任何影響。
技術方案本發明提供一種能克服滯後汙染的聚合酶鏈式反應方法，其反應液成份包括4種脫氧核糖核苷酸、DNA聚合酶、緩衝液、Mg離子、模板核酸和一對引物，在引物的5』端帶有一類限制性核酸內切酶的識別順序，這類內切酶的切割部位在其識別順序的上遊4-20個鹼基(見表1)，PCR反應步驟依次包括(1)用限制性內切酶處理PCR反應液；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環進行合成反應；表1切割部位在識別順序上遊9-20鹼基的部份限制性核酸內切酶
用人工方法，藉助引物設計軟體(Oligo6.0由Molecular BiologyInsights，Inc.出品)或使用軟體完全自動化方法得高嚴謹性的引物對，然後在引物的5』端引進上述限制性內切酶識別順序，並驗核在擴增產物內部沒有該內切酶的識別順序。限制性內切酶識別順序設計在正引物或反引物，或同時設計在正引物和反引物。
當同時設計在正引物和反引物時，正反引物的限制性核酸內切酶的識別順序可以相同或不相同。在正引物或反引物上可設計一個，二個或二個以上限制性核酸內切酶識別順序，其識別順序可以相同或不相同。
限制性內切酶識別順序位於引物3』端數起的第8-40鹼基，優選第12-25鹼基。
在配製PCR反應液時加入限制性核酸內切酶，PCR反應前在酶作用的最適溫度通常為37℃下保溫20-60分鐘，然後升溫變性開開始常規PCR程序。
有益效果1，引物對的區域可以按常規方法選擇或者尋找，沒有特定限制，引入錯配鹼基在引物的5』端，對PCR沒有影響。
2，滯後汙染的擴增產物經酶分解後完全失去作為模板的功能，即使在低退火溫度等非嚴謹的擴增條件下也不產生幹擾。
3，PCR反應液和引物不含任何非天然核苷酸，PCR反應的各項特性與標準PCR保持一致。
4，PCR擴增產物不含任何非天然核苷酸，擴增產物可用於克隆和分子雜交等。
具體實施例方式
實施例1實施例1在正引物引進一個限制性內切酶識別順序，目標基因分別為人beta-2腎上腺素受體基因(美國國家生物信息中心基因庫編號M15169)和人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(美國國家生物信息中心基因庫編號XM_006959)。引物順序和特性示於表2和3。粗體字為限制性核酸內切酶識別順序，粗體字和下劃線為引進的錯配鹼基，下劃線隔開的為內切酶的切割部位。
表2實施例1引物順序
表3實施例1引物特性及與不同模板的結合強度
由此可見，正引物的5』端引進限制性核酸內切酶識別順序後，正引物與被內切酶分解後的擴增產物的匹配鹼基數均小於10，二者之間不可能再發生退火，滯後汙染擴增產物的幹擾被完全消除。
實施例2實施例2在正引物和反引物中各引進二個限制性內切酶識別順序，目標基因為人beta肌動球蛋白基因(美國國家生物信息中心基因庫編號BC016045)，引物順序和特性示於表4和5。粗體字為限制性內切酶識別順序，粗體字和下劃線為引進的錯配鹼基，下劃線隔開的為內切酶的切割部位。
表4實施例2引物順序
表5實施例2引物特性及與不同模板的結合強度
用Clontech公司的Advantage-2-PCR試劑盒以人基因組DNA為模板進行擴增。每管反應體積25微升，引物濃度0.4uM。PCR程序為首次變性94℃1分鐘，循環變性94℃10秒鐘，退火和延伸70℃1分半鐘，共32循環。反應結束後用電泳和染色方法檢測得到長度為172鹼基擴增片段。用Biolabs公司的限制性內切酶Acul和Fokl在37℃與反應液保溫1小時，電泳結果得到長116鹼基的內切酶分解片段。分離提純該分解片段稀釋後作為核酸模板在同樣條件下進行PCR，結果沒有目標產物的條帶出現說明用酶解方法可消除滯後汙染擴增產物的幹擾。在PCR反應前用上述二種酶作同樣處理，反應結束依然得到172鹼基擴增片段，說明限制性核酸酶不影響正常核酸模板的擴增。
權利要求
1，一種能克服滯後汙染的聚合酶鏈式反應方法，其步驟依次包括(1)用限制性內切酶處理PCR反應液；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環進行合成反應；其特徵在於通過在引物中導入錯配鹼基在擴增產物中構建原始目標基因所不含有的限制性核酸內切酶識別順序，且該限制性核酸內切酶切割核酸的部位在其識別順序的上遊4-20鹼基。
2，根據權利要求1所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於限制性內切酶識別順序位於引物3』端數起的第8-40鹼基。
3，根據權利要求2所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於限制性內切酶識別順序位於引物3』端數起的第12-25鹼基。
4，根據權利要求1-3中任一項所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於在正引物、或反引物、或正反引物同時引進錯配鹼基。
5，根據權利要求1-3所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於在引物內引進錯配從而在擴增產物內構建一個以上的限制性核酸內切酶識別順序。
6，根據權利要求4所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於當同時設計在正引物和反引物時，正反引物的限制性核酸內切酶的識別順序可以相同或不相同。
全文摘要
本發明提供一種用限制性內切酶克服滯後汙染的PCR方法。在引物的5』端引進錯配鹼基使之在擴增產物中構建一個限制性核酸內切酶的識別順序，且這類內切酶切割核酸部位在其識別順序的上遊4－20鹼基。本發明提供的方法簡單可靠，能廣泛用於PCR臨床診斷有效克服滯後汙染所造成的嚴重弊端。本發明方法擴增產物不含任何非天然核苷酸可用於PCR克隆等分子生物學研究所需。
文檔編號C12P19/00GK1718736SQ20041002579
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月7日 優先權日2004年7月7日
發明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱 申請人:徐定邦, 徐文慧